CN101151365B - 基因sms02 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新鉴定出的基因,其编码L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及:包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段,所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段,以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用途,其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C的用途。
Description
本发明涉及新鉴定出的基因,其编码L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及:包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段,所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段,以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用途,其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用所述多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C的用途。
维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料,尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。
在过去的70年中,已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的,只除了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化),其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始,就已使用了多种化学改良和技术改良,来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产的发展被概括于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,5th Edition,Vol.A27(1996),pp.547ff中。
维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下进行。因此,可通过发酵工艺,通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从L-山梨糖或D-山梨糖醇起始来生产2-酮基-L-古洛酸(2-KGA,这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C的中间产物),或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株,从D-葡萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-酮基-L-古洛酸。
目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征,例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此,在过去数十年中,人们已在研究更加经济且环保的用微生物转化来制造维生素C的其它方法。
从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来直接生产维生素C已在多种微生物中被报道过,所述微生物例如藻类、酵母和乙酸细菌,其中使用了不同的培养方法。已知能直接生产维生素C的细菌的例子包括,例如,来自Gluconobacter、Gluconacetobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas或Escherichia属的菌株。已知酵母或藻类的例子包括,例如Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces或Chlorella。
能吸收D-山梨糖醇用于生长的微生物通常具有能将该化合物氧化为普遍性的同化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生长的微生物还拥有一种酶——NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶,该酶可将该化合物还原为D-山梨糖醇,D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后,D-果糖成为很多微生物生长的优秀底物。
例如,在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物,属于Acetobacter、Gluconobacter和Gluconacetobacter属)的情况下,这些微生物能将D-山梨糖醇转运进胞质溶胶(cytosol),并通过胞质溶胶中的NAD-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶将其转化为D-果糖。一些个体菌株,例如Gluconobacter oxydans IFO3292和IFO3293还能将L-山梨糖转运进胞质溶胶,并通过胞质溶胶中的NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶将其还原为D-山梨糖醇,D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。在这些细菌中,Embden-Meyerhof-Parnas途径以及三羧酸循环并不具有完全活性,将糖导向中央代谢的主要途径是磷酸戊糖途径。通过磷酸化反应从D-果糖获得的D-果糖-6-磷酸进入磷酸戊糖途径,其被进一步代谢,产生以NAD(P)H形式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧基化合物。
乙酸细菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而为人们公知。这些过程为人们所已知并通常被称为氧化发酵或不完全氧化,它们已被长时间应用于食品和化学工业中,尤其是对醋和L-山梨糖的生产中。已知能用属于Gluconobacter属的菌株从D-山梨糖醇或L-山梨糖进行不完全氧化获得的有用产物是2-KGA。
乙酸细菌通过位于周质空间中、周质膜上以及胞质中的不同脱氢酶来完成这些不完全氧化反应。不同的脱氢酶使用不同的辅助因子,最常见的是用于膜结合酶或周质酶的PQQ和FAD,以及用于胞质酶的NAD/NADP。
虽然这些氧化反应的所有产物都通过外层膜分散回到外界水环境,但是它们中的一些可被主动或被动转运进细胞,并进一步用于与生长和能量形成有关的代谢途径。细胞中,氧化产物可被还原酶多次还原回它们的最初底物,然后被导向回到中央代谢。
在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢中具有活性的蛋白质,尤其是酶和转运蛋白,在本文中被称为涉及山梨糖醇/山梨糖代谢***(Sorbitol/Sorbose Metabolization System)。此类蛋白质在本文中被缩写为SMS蛋白,其在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代谢中发挥作用。
D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢包括:一方面,将这些化合物吸收进胞质溶胶,以及进一步转化为可用于吸收途径的代谢物,所述吸收途径例如Embden-Meyerhof-Parnas途径、磷酸戊糖途径、Entner-Doudoroff途径以及三羧酸循环,它们都涉及对于活的细胞的生长和维持来说必要的全部关键的能量形成和合成代谢反应。另一方面,D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢还包括通过所谓的不完全氧化过程将这些化合物转化为经进一步氧化的产物,例如L-山梨糖酮、2-KGA和维生素C。
本发明的一个目的是提高维生素C生产的产率和/或生产能力。
令人吃惊地,我们发现,SMS蛋白或此类蛋白的涉及对D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮的吸收或转化或具有针对此的活性的亚基在对维生素C的生物技术生产中具有重要作用。
在一种实施方式中,本发明的SMS蛋白选自氧化还原酶[EC1],优选选自在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1],更优选选自以NAD+或NADP+作为受体的氧化还原酶[EC1.1.1]以及具有其它受体的氧化还原酶[EC1.1.99],最优选选自属于[EC1.1.1.1]、[EC1.1.1.15]或[EC1.2.1.-]的酶组的氧化还原酶,或者优选选自在供体的醛或氧代基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.2],更优选地选自以NAD+或NADP+作为受体的氧化还原酶[EC1.2.1]。
此外,本发明的SMS蛋白可选自与膜结合的PQQ依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶、与膜结合的FAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、胞质NAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、NAD(P)依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶(也被称为NADPH依赖性的山梨糖还原酶)、NAD依赖性的木糖醇脱氢酶、NAD依赖性的醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、NAD(P)H依赖性的L-山梨糖还原酶、胞质NADP依赖性的山梨糖酮脱氢酶、胞质NAD(P)H依赖性的L-山梨糖酮还原酶、与膜结合的醛脱氢酶、胞质醛脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶以及SMS中涉及的其它酶构成的组。
特别地,现已发现,具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码的SMS蛋白在对维生素C的生物技术生产中具有重要作用,该核苷酸序列能在优选高度严谨条件下与SEQ ID NO:1所示的序列杂交。现还已发现,通过在能直接生产维生素C的微生物(例如Gluconobacter)中对根据本发明的核苷酸的表达水平进行遗传改变,可很大程度地提高所述微生物对维生素C的直接发酵。
随后,本发明涉及选自下述组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链,所述组由:
(a)编码包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;
(b)包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸;
(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板,并使用根据SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的引物组,通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得;
(d)多核苷酸,其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列,其中,在所述衍生物中,一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代,并且,所述片段或衍生物具有氧化还原酶[EC1]的活性,优选地,具有在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1](SMS02)的活性;
(e)编码氧化还原酶[EC1],优选地,编码在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1](SMS02)的多核苷酸,且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸互补;以及
(f)编码氧化还原酶[EC1],优选地,编码在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶[EC1.1](SMS02)的多核苷酸,且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70%相同,例如85%、90%或95%相同;
构成。
我们发现,本文中描述的SEQ ID NO:2示出的从Gluconobacteroxydans DSM 17078分离的SMS蛋白是特别有用的SMS蛋白,因为看起来其在微生物(特别是细菌,例如乙酸细菌,例如Gluconobacter,Acetobacter和Gluconacetobacter)中的直接维生素C生产中发挥关键作用。因此,本发明涉及编码根据SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸。该蛋白可由SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列编码。本发明因此还涉及包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸。
上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”,以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)针对数据库PRO SW-SwissProt(完全发布版本加上增加的更新)进行搜索。根据这些搜索结果,将根据SEQ ID NO:1的SMS02多核苷酸标注为编码NAD(P)依赖性的山梨糖醇脱氢酶。
可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板,使用合适的寡核苷酸引物(例如根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的核苷酸引物),按照标准PCR扩增技术,通过核酸扩增来获得根据本发明的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体,并通过DNA序列分析对其进行表征。
用于反应的模板可以是通过对从已知包含或怀疑包含根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆和测序,以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。
然后可通过多种已知方法,用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如,可标记扩增出的片段,用其筛选噬菌体或粘粒(cosmid)cDNA文库。或者,经标记的片段可用于筛选基因组文库。
因此,本发明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板,并使用根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物组,通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得。
本发明还涉及下述多核苷酸,其包含编码本文所述的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列,其中,在所述衍生物中,一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代,并且,所述片段或衍生物具有SMS多肽(优选地,SMS02多肽)的活性。
本发明还涉及下述多核苷酸,其编码SMS多肽(优选地,SMS02多肽),其互补链能在严谨条件下与本文定义的多核苷酸互补。
本发明还涉及下述多核苷酸,其与本文定义的多核苷酸至少70%相同,并且其编码SMS多肽;本发明还涉及是上文定义的多核苷酸的互补链的多核苷酸。
本发明还涉及下述微生物,其中,SMS多肽(优选地,SMS02多肽)的活性降低或消失,使得从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率增加。
技术人员将知道如何使SMS蛋白(优选地,SMS02蛋白)的活性降低或消失。这例如可以通过使SMS蛋白(优选地,SMS02蛋白)的比活性减少或消失来完成,或者通过对宿主生物进行遗传修饰来完成,所述遗传修饰以较之野生型生物产生更少或不产生SMS蛋白(优选地,SMS02蛋白)的拷贝的方式来进行。
在下述说明书中,将对达到此目的(即,通过使SMS02蛋白的活性降低或消失,增加从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C的产率和/或产量)的方案进行详细描述。在进行必要修正后,这些方案可应用于其它SMS蛋白。
为获得产生更少拷贝的或不产生SMS02基因和/或蛋白的生物所进行的修饰包括:使用弱启动子,或者对SMS02基因(的部分)或其调控元件加以突变(例如,***、缺失或点突变)。使SMS02蛋白比活性降低或消失也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对SMS02基因(的部分)的突变(例如,***、缺失或点突变)。
本领域中还已知可以通过将SMS02蛋白与特定抑制剂相接触或与能与SMS02蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触,来使给定蛋白质活性降低或消失。为鉴定出此类特定抑制剂,可表达SMS02蛋白,并对存在怀疑能抑制SMS02蛋白活性的化合物时的活性加以测试。可能的抑制用化合物可例如是针对SMS02蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。此类抗体可通过对合适的实验动物进行常规免疫方案来获得。
本发明可以在携带有SMS02基因或其同源体的任何微生物中进行。合适的微生物可选自酵母、藻类和细菌构成的组,它们可以是野生型菌株或通过标准的诱变方法和选择方法获得的突变体菌株以及重组菌株。此类酵母的例子可以是,例如,Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces或Kluyveromyces。此类藻类的例子可以是,例如,Chlorella。此类细菌的例子可以是,例如,Gluconobacter、Acetobacter、Gluconacetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas(例如,Pseudomonas putida)和Escherichia(例如Escherichia coil)。优选的是Gluconobacter或Acetobacter aceti,例如,G.oxydans、G.cerinus、G.frateurii、A.aceti subsp.xylinum或A.aceti subsp.orleanus,优选地,G.oxydans DSM 17078。已按照《布达佩斯条约》,于2005年1月26日将Gluconobacter oxydans DSM17078(以前称作Gluconobacter oxydans N44-1)保藏至Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),Mascheroder Weg lB,D-38124Braunschweig,Germany。
可用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得,例如,DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),Mascheroder Weg1B,D-38124 Braunschweig,Germany、American Type Culture Collection(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108 USA或Culture CollectionDivision,NITE Biological Resource Center,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan(以前是Institue for Fermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi 2-chome,Yodogawa-ku,Osaka 532-8686,Japan)。保存到IFO的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3293、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)IFO3292、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.rubiginosus)IFO3244、Gluconobacter frateurii(以前被称为G.industrius)IFO3260、Gluconobacter cerinus IFO3266、Gluconobacter oxydans IFO3287和Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259,上述这些都于1954年4月5日被保藏;1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和1977年12月8日保藏的Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773。菌株Acetobacter sp.ATCC 15164也是优选细菌的例子,其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus)N44-1是优选细菌的另一个例子,其是菌株IFO3293的衍生物,在Sugisawa et al.,Agric,Biol.Chem.54:1201-1209,1990中对其有所描述。
本发明的微生物可在DNA水平或蛋白质水平上携带其它修饰(见上文所述),只要此类修饰对从底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨糖)直接生产维生素C的产率、产量和/或效率具有直接影响即可。此类其它修饰可以例如影响编码上文所述的SMS蛋白的其它基因,特别是,编码与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶(例如,L-山梨糖酮脱氢酶SNDHai)或与膜结合的PQQ结合D-山梨糖醇脱氢酶的基因。进行此类修饰的方法是本领域已知的,一些例子在本文中有进一步描述。关于用于对维生素C进行直接生产的SNDHai及其核苷酸和氨基酸序列,参见WO2005/017159,其通过引用并入本文。
根据本发明的另一目的,提供了本文定义的多核苷酸或者已用此类多核苷酸进行过遗传工程改造的微生物在生产维生素C中的用途。
本发明还涉及在微生物中表达内源基因的工艺,涉及在微生物中生产上文定义的多肽的工艺,以及生产能产生维生素C的微生物的工艺。所有这些工艺都可包含改变微生物的步骤,其中,本文中使用的“改变”包括下述工艺,该工艺以使得发酵产物的产率和/或生产能力较之野生型生物有所提高的方式来进行“遗传改变”或“改变细胞培养基的组成和/或改变用于培养的方法”。本文中使用的“维生素C的提高的产率”表示较之野生型微生物(即,没有被遗传改变的微生物)而言增加至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%。
术语“遗传工程改造”或“遗传改变”表示对活的生物体中遗传物质结构的科学改变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地,这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程改造或修饰的生物。遗传工程改造可通过本领域已知的多种方法来进行,例如,基因替换,基因扩增,基因打断,使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的生物,例如,经遗传修饰的微生物通常还被称作重组生物,例如重组微生物。
根据本发明的另一方面,提供了用于通过直接发酵生产维生素C的工艺。
特别地,本发明提供了用于直接生产维生素C的工艺,所述工艺包括将底物转化为维生素C。这可例如在包含微生物的培养基中进行,所述微生物可以是静止微生物或生长中的微生物,优选地,静止微生物。
若干种底物可在本发明的工艺(即,用于将给定的底物直接转化为维生素C的工艺,例如上文提到的)中用作为碳源。特别适用的碳源是可以容易地从D-葡萄糖或D-山梨糖醇代谢途径获得的那些,例如,D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸盐/酯、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯,或2,5-二酮基-葡萄糖酸盐/酯。优选地,底物选自,例如,D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮,更优选地,选自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖,以及最优选地,选自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮。在涉及使用微生物进行上述工艺时,术语“底物”和“生产底物”在本文中可互换使用。
在本文中用于使用微生物进行的上述工艺的培养基可以是用于生产维生素C的任何合适的培养基。典型地,该培养基是包含例如盐和(多种)底物,并具有一定pH的水性培养基。其中底物被转化为维生素C的培养基也被称为生产培养基。
本文中使用的“发酵”或“生产”或“发酵工艺”可以是:利用技术人员已知的培养基、条件和方案,使用生长中的细胞或非生长中的所谓静止细胞,这在适合于将合适的底物转化为想要的产物(例如维生素C)的条件下,使用技术人员已知的培养基、条件和方案对所述静止细胞进行培养之后进行。优选地,用静止细胞来生产维生素C。
术语“直接发酵”、“直接生产”、“直接转化”等意指微生物能通过一个或多个生物转化步骤将某底物转化为特定的产物,而无需任何额外的化学转化步骤。例如,术语“将D-山梨糖醇直接转化为维生素C”意在描述下述过程,其中,微生物生产维生素C,并且,其中,D-山梨糖醇作为碳源提供,而无需中间产物化学转化步骤。能直接发酵维生素C的单种微生物是优选的。在允许本文定义的从底物开始的此类转化进行的条件下培养所述微生物。
在关于使用微生物进行上述工艺的方面,应当理解,上述微生物还包括此类菌株的具有同样生理属性的异名(synonym)或基原异名(basonym),其如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义。本文中使用的对微生物的命名是International Committee on Systematicsof Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of theInternational Union of Microbiological Societies官方接受的(在优先权申请的提交日期时),并被其官方出版物International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(IJSEM)所公开。具体的参考文献是Urbance etal.,IJSEM(2001)vol51:1059-1070,以及IJSEM(2001)vol51:1231-1233上的修订通知,其中描述了对作为Ketogulonicigenium vulgare的G.oxydansDSM4025的分类学上的重新归类。
本文中使用的静止细胞指下述微生物的细胞,所述微生物例如是存活但不能活跃生长的,或者是以低的比生长速率生长的,例如,低于0.02h-1的生长速率,优选地,低于0.01h-1。显示出上述生长速率的细胞被称为“静止细胞模式”。
如上所述使用微生物来进行的本发明的工艺可以以不同的步骤或阶段来进行:优选地,在第一个步骤(也被称为步骤(a)或生长阶段)中,于能够生长的条件下对微生物进行培养。通过改变条件来终止该阶段,其中,所述条件改变使得微生物的生长速率降低,导致静止细胞产生,这也被称为步骤(b),接着是用(b)的静止细胞从底物来生产维生素C,这也被称为生产阶段。
使用微生物的上述工艺中进行的生长阶段和生产阶段可在同样的容器中进行,即,仅有一种容器,或在两种或更多的不同容器中进行,在两个阶段之间具有可选的分离步骤。可通过任何合适的手段从细胞中回收得到产生的维生素C。“回收”指,例如,可将维生素C从生产培养基中分离出来。可选地,可对由此产生的维生素C进行进一步加工。
就关于使用微生物进行上述工艺的本发明的目的而言,术语“生长阶段”、“生长步骤”和“生长时期”在本文中可互换使用。这同样适用于“生产阶段”、“生产步骤”、“生产时期”。
进行本发明的使用微生物的上述工艺的一种途径可以是下述工艺,其中:微生物生长于第一容器(所谓的生长容器)中,它们作为静止细胞的来源,细胞中的至少一部分被转移到第二容器(所谓的生产容器)中。生产容器中的条件可以是:使得从生长容器中转移出的细胞变为上文定义的静止细胞的条件。维生素C在第二容器中产生,并从其中被回收。
在关于使用微生物进行上述工艺的方面,在一个方面,生长步骤可在水性培养基中进行,即,补充有用于在需氧条件下生长的合适营养物的生长培养基。培养可以以,例如,分批、补料分批、半连续或连续模式来进行。培养时间可以例如随所用的宿主、pH、温度和营养培养基而变化,其可以为例如:以分批或补料分批模式进行时,大约10小时至大约10天之间,优选为大约1天至大约10天之间,更优选地,大约1至大约5天,这取决于所述微生物。如果细胞以连续模式被培养,驻留时间可以例如为大约2至大约100小时,优选地,大约2至大约50小时,这取决于所述微生物。如果微生物选自细菌,培养可进行于大约3.0至大约9.0的pH下,优选为大约4.0至大约9.0,更优选地,大约4.0至大约8.0,进一步更优选地,大约5.0至大约8.0。如果使用了藻类或酵母,培养可进行于低于大约7.0的pH下,优选低于大约6.0,更优选低于大约5.5,最优选地,低于大约5.0。用于使用细菌进行培养的合适的温度范围可以为,例如,大约13℃至大约40℃,优选地,大约18℃至大约37℃,更优选地,大约13℃至大约36℃,最优选地,大约18℃至大约33℃。如果使用藻类或酵母,用于进行培养的合适的温度范围可以例如为,大约15℃至大约40℃,优选地,大约20℃至大约45℃,更优选地,大约25℃至大约40℃,进一步更优选地,大约25℃至大约38℃,最优选地,大约30℃至大约38℃。用于进行培养的培养基通常可以含有下述营养物作为可被吸收的碳源,例如,甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖和乙醇,优选地,L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、甘油和乙醇;以及含有可消化的氮源,例如,有机物质,例如,蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面包酵母。多种无机物质也可被用作为氮源,例如,硝酸盐和铵盐。此外,生长培养基通常含有无机盐,例如,硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。然后可在与上文所述大致相同的模式、温度和pH条件下,存在例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或D-葡萄糖等底物时,进一步温育使用上述方案获得的细胞,以使得所述细胞将底物直接转化为维生素C。温育可在富含氮的培养基中进行,培养基中含有,例如,有机氮源,例如,蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液,或无机氮源,例如硝酸盐和铵盐,这种情况下,细胞将能够在产生维生素C的同时进一步生长。或者,温育可在氮贫乏的培养基中进行,在这种情况下,细胞将基本不生长,其将处于静止细胞模式,或生物转化模式。在所有情况下,温育培养基还可含有无机盐,例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和氯化钙。
在关于使用微生物进行上述工艺的方面,在生长阶段中,比生长速率例如为至少0.02h-1。对于以分批、补料分批或半连续模式生长的细胞而言,生长速率取决于,例如,生长培养基的组成、pH、温度等。通常,生长速率可以例如在大约0.05至大约0.2h-1的范围内,优选地,在大约0.06至大约0.15h-1的范围内,最优选地,在大约0.07至大约0.13h-1的范围内。
在使用微生物进行的上述方法的另一个方面,可通过在琼脂平板(作为生长容器)上对个别微生物进行培养来提供静止细胞,其中使用了基本上相同的条件,例如,如上所述的培养时间、pH、温度、营养培养基,并添加有琼脂。
在使用微生物进行上述工艺的方面,如果生长和生产阶段进行于两种不同的容器中,那么来自生长阶段的细胞可被收获或浓缩,并转移至第二容器(所谓的生产容器)中。该容器可以含有补充有任何适用的生产底物(可通过细胞被转化为维生素C)的水性培养基。可通过任何合适的操作来收获或浓缩来自生长容器的细胞,所述操作例如,离心、膜横流(membrane crossflow)超滤或微滤、过滤、倾析、絮凝。由此获得的细胞还可以以原始培养液的形式从生长容器转移至生产容器中,而不用被收获、浓缩或洗涤,即,以细胞悬浮液的形式被转移。在一种优选的实施方式中,细胞以细胞悬浮液的形式从生长容器被转移至生产容器,在它们之间没有任何洗涤或分离步骤。
因此,在使用微生物进行的上述工艺的一种优选的实施方式中,上文所述的本发明方法的步骤(a)和(c)不被任何洗涤和/或分离步骤分开。
在使用微生物进行上述工艺的方面,如果生长和生产阶段进行于同样的容器中,细胞可以生长于适当的条件下,以达到理想的细胞密度,接着用含有生产底物的生产培养基来替换生长培养基。此类替换可以例如是,在从容器中收回或收获上清液的同时,并以与之相同的速度,将生产培养基补入到容器中。为将静止细胞保留于容器中,可以使用用于细胞回收或驻留的操作,例如,细胞回收步骤。此类回收步骤,例如包括但不限于如下的方法:使用离心机、过滤器、超滤步骤的膜横流微滤、膜反应器、絮凝或在合适的多孔、非多孔或聚合物基质上的细胞固定。在转移阶段之后,对容器应用下述工艺条件:在此条件下,细胞以如上文定义的静止细胞模式存在,并且,生产底物能有效地转化为维生素C。
在使用微生物进行上述工艺的方面,用于生产步骤中的生产容器中的水性培养基在下文中被称为生产培养基,其可以仅含有将被转化为维生素C的生产底物,或可以含有额外的无机盐,例如,氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾、磷酸钙和碳酸钙。生产培养基还可以含有可消化的氮源,例如有机物质,例如,蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液;以及无机物质,例如,氨、硫酸铵和硝酸钠,其浓度为使得细胞被保持为上文定义的静止细胞模式的浓度。培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生产步骤可以,例如,以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。在补料分批、半连续或连续模式下,来自生长容器和生产培养基的两种细胞都可以以合适的补料速率被连续或间歇地补入到生产容器中。或者,仅生产培养基可被连续或间歇补入到生产容器中,而来自生长容器的细胞被同时转移至生产容器。来自生长容器的细胞可在生产容器中用作为细胞悬浮液,或者可被用作为:例如,在任何固相(例如,多孔或聚合物基质)上絮凝或固定的细胞。生长时期被定义为从底物进入到生产容器中开始,到收获含有维生素C的上清液(即所谓的收获流)之间的时期,该时期可根据,例如,使用的细胞的浓度和种类、pH、温度和营养培养基而变动,其优选在大约2至大约100小时之间。pH和温度可与生长步骤中的pH和温度不同,但应与生长步骤中的基本上相同。
在使用微生物进行上述工艺的一种优选的实施方式中,生产步骤可以以连续模式进行,这意味着,含有来自生长容器的细胞的第一种补料流和含有底物的第二种补料流被连续或间歇补入到生产容器中。第一种流可以仅含有从生长培养基中分离/分开的细胞,或可以含有直接来自生长步骤的细胞悬浮液,即,悬浮于生长培养基中的细胞,而没有任何中间的细胞分离、洗涤和/或分离步骤。在本文中定义的第二种补料流可以包括生产步骤的操作所需要的所有其它补料流,例如,以一种或多种不同的流的形式存在的包含底物的生产培养基、用于稀释的水以及用于控制pH的碱。
在关于使用微生物进行上述工艺的方面,当两种流都连续补料时,第一种流的补料速率与第二种流的补料速率之比可在大约0.01至大约10之间变动,优选地,在大约0.01至大约5之间变动,最优选地,在大约0.02至大约2之间变动。该比例取决于第一种和第二种流中各自的细胞和底物的浓度。
进行本发明的使用微生物的上述工艺的另一种途径可以是:在生长容器中使用一定细胞密度的静止细胞的工艺。通过技术人员已知的方法,于600nm处,细胞密度作为吸收单位(光学密度)被测得。在一种优选的实施方式中,生产步骤中的细胞密度为至少大约10,更优选地,大约10至大约200之间,进一步更优选地,大约15至大约200之间,进一步更优选地,大约15至大约120之间,最优选地,大约20至大约120之间。
在关于使用微生物进行上述工艺的方面,为在生产阶段期间(例如,以连续或半连续模式进行的),以想要的细胞密度将细胞保持于生产容器中,本领域内已知的任何手段都可以使用,例如,通过离心、过滤、微滤的膜横流超滤、倾析、絮凝进行的细胞再利用,通过膜设备进行的细胞驻留,或细胞固定。此外,在生产步骤以连续或半连续模式进行的情况下,从生长容器中连续或间歇补入细胞,生产容器中的细胞密度可被保持于恒定的水平,这例如,通过从生产容器中收获一定量的细胞来进行,所述的量对应于从生长容器中补入的细胞的量。
在关于使用微生物进行上述工艺的方面,从生产容器中回收/收获在所谓的收获流中含有的产生出的维生素C。收获流可以包括,例如,来自生产容器的不含细胞的水溶液或含有细胞的水溶液,其中含有通过生产容器中的静止细胞从生产底物转化得到的维生素C。可通过本领域内已知的任何操作,将仍处于收获流中的细胞与维生素C分开,例如,过滤、离心、倾析、膜横流超滤或微滤、切线流超滤或微滤或死端(dead end)过滤。在该细胞分离操作之后,收获流中基本不含细胞。
在另一个方面,本发明的工艺可组合有将产生的维生素C与收获流中含有的其它组分分离和/或纯化的额外步骤,即,所谓的下游加工步骤。这些步骤可包括技术人员已知的任何手段,例如,浓缩、结晶、沉淀、吸附、离子交换、电渗析、两极膜电渗析和/或反渗透。维生素C可作为游离酸形式或其已知的任何盐的形式被进一步纯化,这是通过下述操作手段来进行的,例如,用活性炭进行处理、离子交换、吸附和洗脱、浓缩、结晶、过滤和干燥。特别地,将维生素C与收获流中其它组分的第一次分离可通过例如下述方法的任何合适的组合或重复来进行,所述方法例如:两区室或三区室电渗析、两极膜电渗析、反渗透或吸附(其进行于,例如,离子交换树脂上或非离子树脂上)。如果获得的维生素C的形式为L-抗坏血酸的盐,将该盐形式转化为游离酸形式可通过例如,两极膜电渗析、离子交换、模拟移动床色谱技术等来进行。上述步骤的组合也可使用,例如,将电渗析和两极膜电渗析组合为一个步骤,以及使用模拟移动床色谱方法的多个离子交换步骤的组合。上述任何方案单独或组合就构成了用于分离和纯化产物(即维生素C)的方便的手段。由此获得的产物还可被进一步分离(例如,通过浓缩、结晶、沉淀、对晶体的洗涤和干燥的方式来进行)和/或进一步纯化(用活性炭处理、离子交换和/或重结晶)。
在一种优选的实施方式中,通过一系列上述下游加工步骤来从收获流中纯化维生素C,而不必在该加工中的任何时刻将其转移到非水性溶液中,即,所有步骤都在水性环境中进行。此类优选的下游加工方案可以包括,例如,通过两区室或三区室电渗析对来自生产容器的收获流进行浓缩,通过两极膜电渗析和/或离子交换将浓缩溶液中以其盐的形式存在的维生素C转化为其酸的形式,通过例如用活性炭、离子交换或非离子树脂进行处理等方法来进行纯化,接着进行进一步的浓缩步骤和结晶。这些晶体可被分离、洗涤和干燥。如果必要的话,晶体还可被重新溶解于水中,用活性炭和/或离子交换树脂对其进行处理,并重结晶。然后可对上述晶体进行分离、洗涤和干燥。
本发明的有利的实施方式通过从属权利要求而显而易见。根据本发明的教导,本领域技术人员将明白本发明的上述和其它方面以及上述和其它实施方式。
通过对从Gluconobacter oxydans DSM 17078获得的基因组克隆进行测序,来测定包含编码SMS02蛋白的SEQ ID NO:1的核苷酸序列的基因的序列。
本发明还涉及编码SEQ ID NO:2所示的SMS02多肽的至少一个生物活性片段或衍生物的多核苷酸。
本文中使用的“生物活性片段或衍生物”表示保留有与SEQ ID NO:2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信号传递活性或抗体反应活性。术语“相同的生物功能”或“功能等同物”在本文中使用时表示蛋白质与SEQ ID NO:2所示的多肽具有基本相同的生物活性,例如,酶活性、信号传递活性或者抗体反应活性。
本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供,优选地,被纯化至均质。
术语“经分离的”表示:物质被移出其原来的环境(例如,如果其天然存在的话,就是天然环境)。例如,活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的,但与天然***中的一些或全部共存物质分开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分,但仍然是经分离的,因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。
本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是这样的DNA或RNA,它们与从中获得该多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两条编码序列(5’末端一条,3’末端一条)并非紧密相邻。因此,在一种实施方式中,核酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码(例如,启动子)序列的一些或全部。术语“经分离的多核苷酸”因此包括,例如,加入到载体中、加入到自主复制质粒或病毒中,或者加入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA,或者作为独立于其它序列的单独分子(例如,通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括是杂合体基因的一部分的重组DNA,所述基因编码基本不含细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学物质(当通过化学方式合成时)的额外多肽。此外,“经分离的核酸片段”是这样的核酸片段:其天然并不作为片段存在,并且将不会在天然状态被发现。
本文中使用的术语“多核苷酸”、“基因”和“重组基因”指可与染色体DNA分离开的、包括编码蛋白质(例如,G.oxydans DSM 17078SMS蛋白)的开放读码框的核酸分子。多核苷酸可包括,例如,SEQ IDNO:1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的区域,所述区域可包括,例如,对于由其获得的多肽的适当表达和稳定来说重要的启动子区域、调控子区域和终止子区域。
基因可包括编码序列、非编码序列(例如,位于基因编码区域3’末端和5’末端的非翻译序列)和调控序列。此外,基因指本文定义的经分离的核酸分子。技术人员还将理解,导致SMS蛋白氨基酸序列的变化的DNA序列多态性可存在于种群(population)中,例如,Gluconobacter oxydans种群中。SMS02基因中的此类遗传多态性可由于天然变异存在于种群的个体间,或者存在于不同种群的细胞中。典型地,此类天然变异可导致SMS02基因核苷酸序列中1-5%的变化度。作为天然变异结果的、并且不会改变SMS蛋白的功能活性的SMS02中的任何以及全部此类核苷酸变异和由此得到的氨基酸多态性也包括在本发明的范围内。
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如,肌苷或磷硫酰核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可用于:例如,制备具有改变的碱基配对能力或增加的对核酸酶的抗性的核酸。
本文中提供的序列信息不应被狭义理解为需要包括进被错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可以很容易地用于从能将给定碳源直接转化为维生素C的重组或非重组微生物(特别是Gluconobacter oxydans,优选地,Gluconobacter oxydans DSM 17078)中分离出完整基因,随后可容易地对该基因进行进一步的序列分析,由此鉴定出测序错误。
除非特别指明,本文中通过对DNA分子进行测序来确定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪(测定的,并且,本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来推测的。因此,如本领域所已知的,对由该自动方法所测定的任何DNA序列而言,本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地,通过自动方法测出的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少大约90%同源,更典型地,至少大约95%至至少大约99.9%相同。通过其它方法,包括本领域内公知的人工DNA测序方法,可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的,测得的核苷酸序列中较之实际序列的单个***或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框位移,使得:从此类***或缺失的点开始,测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
本领域技术人员能鉴定出此类被错误鉴定的碱基,并且知道如何改正此类错误。
根据本发明的核酸分子可以仅包含本发明提供的核酸序列(例如,SEQ ID NO:1示出的序列)的一部分或片段,例如,可用作为探针或引物的片段(例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)或编码根据本发明的蛋白的一部分的片段。从对SMS02基因的克隆测定的核苷酸序列允许产生被设计来鉴定和/或克隆SMS02家族其它成员以及来自其它物种的SMS02同源体的探针和引物。典型地,该探针/引物包含基本纯化的寡核苷酸,其典型地包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大约12或15个、优选大约18或20个、更优选大约22或25个、进一步更优选大约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个连续核苷酸杂交(优选地,在高度严谨条件下杂交)的核苷酸序列区域。
还可通过聚合酶链式反应(PCR),使用基于本文含有的序列信息设计的合成寡核苷酸引物,分离出包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子。
可按照标准PCR扩增技术,用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板,使用合适的寡核苷酸引物,来扩增本发明的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体,并通过DNA序列分析加以表征。
根据本发明的多核苷酸的片段还可包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可作为探针或引物用于PCR反应。
不管其编码功能或非功能多肽,根据本发明的核酸都可用作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有SMS02活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括:(1)从cDNA文库(例如来自除Gluconobacter oxydans外的其它生物)分离编码本发明蛋白的基因或其等位变体,以及(2)用于探测特定细胞中所述蛋白的mRNA的表达的Northern印迹分析,或(3)用于增强和/或提高同源SMS02基因在所述其它生物中的功能或活性。
基于本文提供的核苷酸序列的探针可用于检测编码同样或同源蛋白(例如,其它生物中的)的转录本或基因组序列。可基于其与本文公开的G.xoydans SMS02核酸的同源性,使用G.oxydans DNA或其一部分作为杂交探针,按照标准杂交技术,优选在高度严谨杂交条件下,分离出对应于本发明的G.xoydans SMS 02 DNA的天然变体或非G.oxydans同源体的核酸分子,它们也包括在本发明内。
在优选的实施方式中,探针还包含与其附着的标记基团,例如,标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。
例如,可使用基于本文教导的核苷酸序列设计的两套简并寡核苷酸引物库,进行PCR来分离同源基因序列。
用于反应的模板可以是通过对从已知能表达或怀疑能表达根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆及测序,以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。
然后可通过多种已知方法,用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如,可标记扩增出的片段,用其筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者,经标记的片段可用于筛选基因组文库。
PCR技术还可用于从其它生物分离全长cDNA。例如,可按照标准方案,从合适的细胞或组织来源分离RNA。可在RNA上进行逆转录反应,其中使用与扩增片段的5’最末端具有特异性的寡核苷酸引物,以引导第一链合成。
然后可使用标准的末端转移酶反应,对得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如,用鸟嘌呤),可用RNaseH消化杂交体,然后可(例如,用poly-C引物)引导第二链合成。由此,可容易地分离扩增的片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述,参见,例如上文所述的Sambrook et al.和上文所述的Ausubel et al.。
此外,编码SMS02家族其它成员、具有与根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外,编码来自其它物种的SMS02蛋白、具有与SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。
本发明还涉及经分离的多核苷酸,其可在严谨条件下(优选地,高度严谨条件下)与本发明的多核苷酸(例如,SEQ ID NO:1所示的多核苷酸)杂交。有利地,此类多核苷酸可从能将给定的碳源直接转化为维生素C的微生物(特别是Gluconobacter oxydans,优选地,Gluconobacteroxydans DSM 17078)中获得。
本文中用到的术语“杂交”被用来描述杂交和洗涤,在所述杂交和洗涤条件下,典型地,互相之间同源性为至少约50%、至少约60%、至少约70%、更优选为至少约80%、进一步优选为至少约85%到90%、最优选为至少95%的核苷酸序列保持相互杂交的状态。
在一种实施方式中,本发明的核酸与SEQ ID NO:1所示的核酸序列或其互补序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。
此类严谨杂交条件的一个优选的非限制的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中,大约45℃下杂交,随后在1x SSC、0.1%SDS中,50℃下进行一次或多次洗涤,洗涤优选在55℃下,更优选在60℃下,进一步优选在65℃下进行。
高度严谨条件包括:使用经标记的DNA探针(例如,用地高辛(DIG)标记的DNA探针)在42℃温育数天(例如2-4天),接着在2xSSC和0.1%SDS中于室温下洗一次或多次,以及在65-68℃,于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1x SSC和0.1%SDS中洗一次或多次。特别地,高度严谨条件包括,例如,在溶液中,例如含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)中,或包含50%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02%十二烷基磺酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中,使用地高辛(DIG)标记的DNA探针(例如通过用RocheDiagnostics GmbH,68298Mannheim,Germany的DIG标记***来制备的)在42℃温育2小时至4天,接着在2x SSC和0.1%SDS中,于室温下,洗两次膜,每次5至15分钟,然后在65-68℃,于0.5x SSC和0.1%SDS或0.1x SSC和0.1%SDS中洗两次,每次15-30分钟。
优选地,与本发明的核苷酸序列杂交(优选在高度严谨条件下杂交)的本发明的经分离的核酸对应于天然存在的核酸分子。本文中使用的“天然存在的”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如,编码天然蛋白质)。在一种实施方式中,核酸编码天然的G.oxydans SMS02蛋白。
技术人员知道何种条件适合用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中易于获得关于此类条件的其它指导,例如,在Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.;和Ausubel et al.(eds.),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley & Sons,N.Y.)中。当然,仅与poly(A)序列(例如mRNA的3’末端poly(A)区)或仅与T(或U)残基的互补性延伸区段(stretch)杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中,因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列(例如,实际上是任何双链的cDNA克隆)杂交。
采用典型手段,可以对从其它生物,例如能将给定碳源直接转化为维生素C的微生物(特别是其它Gluconobacter物种)构建的DNA文库进行筛选。
例如,可以通过Southern和/或Northern印迹分析来对Gluconobacter的菌株进行筛选。在探测到与本发明多核苷酸同源的转录本之后,可以利用本领域技术人员公知的标准技术,由分离自合适菌株的RNA来构建cDNA文库。或者,可以使用能与本发明多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。
可使用标准的分子生物学技术以及本文提供的序列信息,来分离本发明的核酸序列,例如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如,可使用标准杂交和克隆技术(例如,Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989所述),使用SEQ ID NO:1所示的核酸分子的全部或一部分作为杂交探针,分离根据本发明的核酸分子。
此外,可通过标准合成技术(例如,使用自动DNA合成仪)来制备对应于本发明的核苷酸序列的寡核苷酸或可与本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸。
术语“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言,在此定义:为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比,本着最优比较的目的(例如,可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口,以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对),对序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同,那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即,%相同性=相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数x100)。优选地,这两条序列长度相同。
技术人员会知道有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如,可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间相同性百分比的确定。在一种优选的实施方式中,使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的相同性百分比,所述算法已被合并到GCG软件包(可从http://www.accelrys.com获得)的GAP程序中,其中使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵,缺口权重为16、14、12、10、8、6或4,长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到:上述的所有不同参数将导致有细微区别的结果,但是使用不同算法时两条序列的总体%相同性不会有显著改变。
在又一种实施方式中,使用GCG软件包(可从http://www.accelrys.com获得)的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的相同性百分比,其中使用NWSgapdna.CMP矩阵,缺口权重为40、50、60、70或80,长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中,使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比,所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可从http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得)中,其中使用PAM120权重残基表,缺口长度惩罚(penalty)为12,缺口惩罚为4。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列”来进行针对公众数据库的搜索,例如,去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用BLASTN程序,以分数=100,字长(word length)=12来进行BLAST核苷酸搜索,以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序,以分数=50,字长=3来进行BLAST蛋白质搜索,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的,为获得有缺口的比对,可以利用Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时,可以使用各个程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
在另一种优选的实施方式中,本发明的经分离的核酸分子包含是本发明的核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:1所示的序列)的互补序列的核酸分子。与本文公开的核苷酸序列互补的核酸分子是这样的序列:其与SEQID NO:1所示的核苷酸序列足够互补,从而其可与所述核苷酸序列杂交,由此形成稳定的双链体(duplex)。
在另一种优选的实施方式中,SEQ ID NO:1所示的本发明的核酸或其互补序列含有至少一处突变,所述突变导致基因产物具有经修饰的功能/活性。所述至少一处突变可通过本文所述的方法引入。在一个方面,所述至少一处突变导致产生这样的SMS02蛋白:其功能和/或活性较之野生型副本而言被部分或全部破坏。用于引入此类突变的方法是本领域公知的。
本文中使用的术语——活性的“降低”包括:减少生产生物中一种或多种多肽的活性,所述多肽是本文所述的相应的多核苷酸编码的。本领域中可获得用于降低给定蛋白(在本文的情况下是SMS02蛋白)活性的多种方法。通常,可减少蛋白质的比活性或者可以减少蛋白质的拷贝数。
为协助这种减少,对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被减少,例如,通过基因的欠表达(underexpressed)或者对基因的打断来实现。如果基因的转录水平较之野生型基因降低,所述基因就被说成是“欠表达”。这可以通过例如Northern印迹杂交分析来测量,Northern印迹杂交分析对作为基因表达指示的mRNA的量进行定量。在本文中,如果产生的mRNA的量较之野生型基因产生的mRNA的量减少了至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%,那么该基因就是欠表达的。或者,可使用弱启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中,基因的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变,以获得对表达的负调。还可以通过减少信使RNA的相对半寿期来降低表达。在另一种实施方式中,还可以通过在多肽氨基酸序列中利用能减少活性的一处或多处突变来减少多肽自身的活性。例如,改变多肽与其相应底物的亲和性可导致活性降低。类似地,可减少肽的相对半寿期。在基因表达降低或者比活性降低的情况下,可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种降低。本文中使用的“降低的表达”或“降低的活性”表示较之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被降低之前存在的蛋白的活性和/或浓度而言,至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%的减少。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂相接触来降低SMS02蛋白的活性。术语“降低的活性”、“减少的或消失的活性”在本文中可互换使用。
本发明的另一方面涉及载体,所述载体含有编码本发明蛋白质的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”,“质粒”指环状的双链DNA环,另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体,其中,另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如,具有细菌的复制起点的细菌载体)。其它载体在被引入宿主细胞之后就被整合进宿主细胞的基因组中,因此它们与宿主基因组一同复制。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸,所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达,这意味着该重组表达载体包括一段或多段调控序列,所述调控序列是基于将用于表达的宿主细胞来选择的,其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中,“可操作地连接”被用来表示:人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上,所述的连接以允许该核苷酸序列表达(例如,在体外转录/翻译***中表达,或者当载体被引入宿主细胞中时,在该宿主细胞中的表达)的方式进行。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如,弱化子)。例如,在Goeddel;Gene Expression Technology:Methods inEnzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型或诱导型表达的调控序列,也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如,组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到,对表达载体的设计可能取决于以下因素:例如:对将被转化的宿主细胞的选择,期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞,由此生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽,其包括但不限于:本文所述的核酸编码的突变体蛋白、其片段、其变体或功能等同物以及融合蛋白,例如,SMS02蛋白、SMS02蛋白的突变体形式、融合蛋白等。
为了在合适的微生物中表达SMS02蛋白,可对本发明的重组表达载体加以设计。例如,根据本发明的蛋白可在细菌细胞中表达,例如,在属于Gluconobacter、Gluconacetobacter或Acetobacter属的菌株中表达。在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体,例如源自细菌质粒、噬菌体的载体和源自上述物质的组合的载体,例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体,例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
DNA***应当被可操作地连接到合适的启动子上,启动子可以是组成型启动子或可诱导的启动子。技术人员知道如何选择合适的启动子。表达构建体可以含有用于转录起始、终止的位点,还可在转录区域含有核糖体结合位点,以用于翻译。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可优选包括处于起点的起始密码子,以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。
可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入合适的宿主细胞。本文中使用的术语“转化”、“转桥联(transconiugation)”和“转染”意指本领域内已知的、用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的多种技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook,et al.(上文所述的),Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。
为对已将外源DNA整合进它们基因组的细胞进行鉴定和选择,通常,将编码选择标记(例如,对抗生素的抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物(例如卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素和链霉素)抗性的那些。编码选择标记的核酸优选在与编码根据本发明的蛋白的载体相同的载体上引入宿主细胞,或者其可在单独的载体上引入,该载体例如是***性载体,其不能在宿主细胞中复制。可通过药物选择鉴定出经过引入的核酸稳定转染的细胞(例如,已合并有选择标记基因的细胞将存活,而其它细胞会死亡)。
本发明还提供了经分离的多肽,其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或可通过在合适的宿主中表达本发明的多核苷酸(例如,SEQ IDNO:1所示的多核苷酸序列)获得的氨基酸序列。
根据本发明的多肽可仅含对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的保守取代,或对非关键氨基酸的取代、***或缺失。因此,非关键氨基酸是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中可被改变、且不会对生物功能造成实质性影响的残基。例如,在本发明的蛋白质之间保守的氨基酸残基被预计为对改变特别不敏感。此外,在根据本发明的蛋白质和其它SMS02蛋白之间保守的氨基酸也对改变不太敏感。
术语“保守取代”用于表示下述取代,其中,氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。这些家族是本领域已知的,其包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带beta支链侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
如上所述,本发明的多核苷酸可用于对合适的宿主细胞进行遗传工程改造,使其在发酵中更好且更有效,例如,在对维生素C的直接发酵工艺中更好且更有效。
根据本发明,提供了经遗传工程改造/重组产生的宿主细胞(也被称为重组细胞或经转化细胞),其携带有此类经修饰的多核苷酸,其中,相连的蛋白的功能较之野生型细胞而言被显著修饰,使得对一种或多种发酵产物(例如维生素C)的生产的产率、产量和/或效率被提高。宿主细胞可选自能从给定的碳源直接生产一种或多种发酵产物(例如维生素C)的微生物,特别是Gluconobacter oxydans,优选地,G.oxydans DSM 17078。
“经转化细胞”或“重组细胞”是已通过重组DNA技术向其(或其祖先细胞)中引入了根据本发明的核酸的细胞,或者是其中SMS02蛋白的活性已被降低和/或消失的细胞。合适的宿主细胞包括能生产给定发酵产物(例如,能将给定碳源直接转化为维生素C)的微生物的细胞。特别地,其包括来自Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Corynebacterium、Ketogulonicigenium属的菌株,以及乙酸细菌,例如Gluconobacter、Acetobacter或Gluconacetobacter,优选地,Acetobacter sp.、Acetobacteraceti、Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacterthailandicus、Gluconobacter oxydans,更优选地,G.oxydans,最优选地,G.oxydans DSM 17078。
为提高某重组宿主细胞对维生素C的产生,可在该生物中抑制SMS02基因的表达,这例如通过靶向与SMS02核苷酸序列的调控区域(例如,SMS02启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列,以形成三螺旋结构,阻止靶细胞中SMS02基因的转录来实现。一般而言,见Helene,C.(1991)Anticancer DrugDes.6(6):569-84;Helene,C.et al.(1992)Ann.N.YAcad Sci.660:27-36和Maher,L J.(1992)Bioassays14(12):807-15。
还可通过对SMS02基因加以修饰来抑制或阻止基因表达,例如,通过向SMS02基因中引入一处或多处突变来实现,其中所述突变导致产生较之野生型蛋白而言功能显著降低的SMS02蛋白。
因此,在另一种实施方式中,从SEQ ID NO:1所示的多核苷酸或其等同物获得携带至少一处突变的多核苷酸。
本文中使用的突变可以是导致功能更弱或更不稳定的多肽(例如,功能更弱或更不稳定的SMS02基因产物)的任何突变。这可包括,例如,在微生物基因组中的下述改变:其干扰了SMS02的合成,或者导致SMS02蛋白以改变的氨基酸序列表达,该改变使得该蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被完全或部分破坏。干扰可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。
微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或多交叉重组用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子,该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列,或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于:缺失-***突变。此类改变的例子包括基因打断,即对基因加以扰乱,使得通常由该基因生产的产物不以功能性形式产生。这可通过完全缺失、选择性标记的缺失和***、选择性标记的***、读码框位移突变、同框(in-frame)缺失或者导致成熟前终止的点突变导致。在这些情况中的一些中,基因的整条mRNA不存在,在另一些中,产生的mRNA的量有所变化。在所有情况下,所述基因编码的多肽都不以功能性形式产生,其或者不存在或者以经突变形式存在,例如,具有本文定义的降低的活性的蛋白。
还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更弱或没有功能的多肽的改变:使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变,以及选择或筛选出是一种或多种发酵产物的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。
在一种特定实施方式中,需要敲除本发明的SMS02基因,即,其中,当引入合适的宿主细胞时,其基因表达被人工遏制,以提高对发酵产物生产的产率、生产能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供携带此类被遏制基因的微生物的方法是本领域公知的。可通过缺失掉基因或其调控区域的至少一部分,来诱导对内源SMS02基因的遏制。本文中使用的“对基因表达的遏制”包括完全遏制和部分遏制,以及在特定条件下的遏制,还包括对两个等位基因中任何一个的表达的遏制。
为制造其中SMS02基因的表达被人工遏制的敲除微生物,首先可克隆SMS02基因,然后可使用该基因来构建用于同源重组的载体,以在靶标微生物中失活内源SMS02基因。用于同源重组的载体含有设计来使靶标微生物中内源SMS02基因失活的核酸序列。此核酸序列可以是:例如,含有至少部分缺失突变的SMS02基因或其调控区域(例如,将被失活的基因侧翼存在的区域(顺式情况下)或单独存在的(反式情况下))的核酸序列,或者其可以是含有其它基因的SMS02基因或其调控区域。优选地,选择还可用作为标记发挥作用的基因作为将被***进SMS02基因或其调控区域的基因。将使用的***基因包括,例如,前文定义的药物抗性基因。对于基因可***到SMS02基因中的位置没有特别限制,只要在该位置的***能导致对靶标中内源SMS02基因表达的遏制即可。为避免***的极性作用,可通过使用例如sacB***,或通过长侧翼同源性PCR来引入同框沉默缺失。这些技术是本领域技术人员公知的。
用于SMS02蛋白的上述诱变策略可导致想要的化合物(特别是维生素C)的产率增加。这些策略的列出并不意味着限制;对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制,用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物,例如表达经突变SMS02核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或细菌的相关菌株,使得对想要的化合物(例如维生素C)的生产的产率、生产能力和/或产量被提高。
在关于使用微生物进行上述工艺的一个方面,本发明的工艺导致维生素C的产率通常为至少约高于5.7g/l,例如,10g/l、20g/l、50g/l、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l或者超过600g/l。在一种实施方式中,通过本发明的工艺生产的维生素C的产率在大约高于5.7g/l至大约600g/l的范围内。维生素C的产率指直接来自生产容器的收获流(即包含维生素C的不含细胞上清液)中维生素C的浓度。
在本发明的一个方面,提供了能从合适的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山梨糖)直接生产维生素C的微生物(特别是Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter属的)。当例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量时,发现这些生物能以分别高至280mg/l和670mg/l的水平从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产维生素C。在本发明的另一个方面,提供了下述微生物,当从D-山梨糖醇起始时,其能以300mg/l或更多的量直接生产维生素C,或者当从L-山梨糖起始时,其能以800mg/l或更多的量直接生产维生素C,所述的量是例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量的。这可以通过使SMS多肽(优选地,SMS02多肽)的活性降低或消失来获得。从D-山梨糖醇产生的维生素C的产率甚至可以高达400、600、1000mg/l,或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50g/l。从L-山梨糖产生的维生素C的产率甚至可以高达1000mg/l,或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50g/l。优选地,维生素C的这些量可以是例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量获得的。
本文中使用的以“静止细胞方法”进行的测量包括(i)通过本领域技术人员公知的任何方法培养细胞,(ii)从生长培养基收获细胞,以及(iii)在含有将被转化为想要的产物(例如维生素C)的培养基中,于其中细胞不再生长的条件下,温育收获的细胞(即,在该所谓的转化步骤期间,生物质没有量上的增加)。
携带有例如经修饰的SMS02基因并且能以显著更高的产率、生产能力和/或效率生产发酵产物的重组微生物可在上文所述的需氧条件下被培养于补充有合适营养物的水性培养基中。
本文所述的核酸分子、多肽、载体、引物和重组微生物可用于下述方法中的一种或多种:鉴定Gluconobacter oxydans以及相关的生物;绘制与Gluconobacter oxydans相关的生物的基因组图谱;对感兴趣的Gluconobacter oxydans序列进行鉴定和定位;进化研究;测定功能所需的SMS02蛋白区域;调节SMS02蛋白活性或功能;调节SMS途径的活性;以及调节对想要的化合物(例如,维生素C)的细胞内生产。
本发明提供了筛选能调节SMS02蛋白活性的分子的方法,这种调节或者通过与蛋白本身或底物或SMS02蛋白的结合伴侣的相互作用或者通过调节本发明的SMS02核酸分子的转录或翻译来实现。在此类方法中,将表达一种或多种本发明的SMS02蛋白的微生物与一种或多种测试化合物接触,并评估每种测试化合物对于SMS02蛋白表达水平或活性的影响。
可通过技术人员公知的方法来测定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性,所述方法例如:在存在其底物、电子受体或供体(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯酚-吲哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP、NADPH,可通过光度、色度或荧光方法对其消耗进行直接或间接测量)以及其它可能与活性的发展相关的无机组分的情况下,温育含有SMS蛋白的膜级分(membrane fraction)。因此,例如,可在下述试验中测量与膜结合的D-山梨糖醇脱氢酶的活性,所述试验中,在存在pH6的磷酸盐缓冲液、D-山梨糖醇和人工电子受体DCIP和PMS的情况下,温育含有该酶的膜级分。可在600nm处测量DCIP的消耗速率,其与膜级分中存在的D-山梨糖醇脱氢酶活性直接成正比。
从上述描述中可显而易见:根据本发明的方法的发酵产物可不仅限于维生素C。本文中使用的“想要的化合物”或“发酵产物”可以是Gluconobacter oxydans的任何天然产物,其包括生物合成途径的终产物和中间产物,例如,L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯、5-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯、2,5-二酮基-葡萄糖酸盐/酯和2-酮基-L-古洛糖酸盐/酯(2-KGA),特别是对维生素C的生物合成生产。
因此,本发明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、载体、引物和重组微生物在生产维生素C(即将碳源直接转化为维生素C)中的用途。在一种优选的实施方式中,本文所述的经修饰的多核苷酸、多肽、载体和重组微生物用于提高对维生素C生产的产率、生产能力和/或效率。
术语“产量”或“生产能力”是本领域已知的,其包括给定的时间和给定的发酵体积中形成的发酵产物(例如维生素C)的浓度(例如,每升每小时的kg产物)。术语“生产效率”包括:获得的特定水平的生产所需要的时间(例如,细胞达到发酵产物的特定速率输出所需时间有多长)。术语“产率”是本领域已知的,其包括碳源向产物(例如,维生素C)转化的效率。这通常写作,例如,kg产物/kg碳源。“增加”化合物的“产率和/或产量和/或生产能力”表示,给定的时间中给定量的培养物中回收的该化合物分子或回收的该化合物有用分子的量增加。术语“生物合成”或“生物合成途径”是本领域已知的,其包括:通过细胞,以可能是多步骤且被高度调控的过程,从中间产物化合物对化合物(优选地,有机化合物)的合成。措辞“代谢”是本领域已知的,其包括对生物中发生的生化反应的总称。然后,特定化合物的代谢(例如,氨基酸(例如甘氨酸)的代谢)包含细胞中与该化合物相关的总的生物合成、修饰和降解途径。措辞“转运”或“运入”是本领域已知的,其包括一种或多种分子在协助下移动经过该分子本来不能经过或不能高效经过的细胞膜。
本文中使用的维生素C可以是水溶液中发现的L-抗坏血酸的任何化学形式,例如未离解的、以其游离酸形式存在的或离解为阴离子的。L-抗坏血酸的溶解的盐形式的特征为:在通常发现于发酵上清液中的任何种类的阳离子(例如,钾、钠、铵或钙)存在时的阴离子。还包括在内的可以有L-抗坏血酸的游离酸形式的经过分离的晶体。另一方面,用其相应的盐的名称来命名L-抗坏血酸的盐形式的经过分离的晶体,即抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸钙等。
在一种优选的实施方式中,本发明涉及生产维生素C的方法,其中,将根据本发明的核苷酸或上文所述的经修饰多核苷酸序列引入合适的微生物,在允许以高生产能力、产率和/或效率生产维生素C的条件下培养重组微生物,从培养基中分离产生的发酵产物,以及可选地,进一步纯化。
将通过下述实施例进一步阐述本发明,所述实施例不应被理解为起限制作用。本文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容都通过引用并入本文。
实施例
实施例1制备染色体DNA以及通过PCR扩增DNA片段
在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l细菌蛋白胨(Difco)构成的液体甘露糖醇培养基(MB)中,于30℃对Gluconobacter oxydans DSM 17078的细胞进行一天的培养,通过Sambrooket al(1989)″Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Second Edition″,ColdSpring Harbor Laboratory Press所述的方法,从培养的细胞制备Gluconobacter oxydans DSM 17078的染色体DNA。
使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf(SEQ IDNO:3)和Pr(SEQ ID NO:4),通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书,用Expand High Fidelity PCR试剂盒(Roche Diagnostics)和10ng染色体DNA以10μl的总体积来进行反应,获得了含有SMS02DNA序列(SEQ ID NO:1)的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物,并验证了其正确序列。
实施例2在G.oxydans DSM 17078中打断SMS02基因
为构建SMS02基因的敲除构建体,用长侧翼同源性(LFH)-PCR来构建干净(clean)的缺失-***突变。首先,使用各引物对SMS 02LFH+1(SEQ ID NO:5)/SMS02KmLFH-1(SEQ ID NO:6)(在5’末端含有互补性的卡纳霉素抗性盒重叠序列)和SMS 02KmLFH+1(SEQ ID NO:7)(在5’末端含有互补性的卡纳霉素抗性盒重叠序列)/SMS02LFH-l(SEQ ID NO:8),通过PCR扩增出SMS02基因侧翼的上游和下游区域,获得大约550bp的产物。G.oxydans DSM 17078基因组DNA用作为模板,反应条件由35个循环的94℃变性30秒、50℃退火30秒和72℃延伸1分钟组成。在两种情况下,都用GC-rich的PCR试剂盒(RocheMolecular Biochemicals)来使得PCR产生的错误最小化。使用质粒pUC4K(Amersham Bioscience,accession No.X06404)作为模板,用引物对Km+1(SEQ ID NO:9)/Km-1(SEQ ID NO:10),产生1.3kb的片段。反应条件如上文所述。对三种产物进行凝胶纯化、混合,用于以侧翼引物对SMS 02LFH+1/SMS02 LFH-1进行的第二轮PCR反应,以产生2.4kb的产物。用于第二轮反应的PCR反应条件是这样的:94℃2分钟,然后10个循环的[94℃30秒,63℃30秒,68℃6分钟],接着是20个循环的[94℃30秒,63℃30秒,68℃6分钟以及每个循环额外的20秒]以及在68℃最后延伸10分钟。
将PCR产物克隆进pGEM-TEasy载体(Promega Corp.),产生质粒pGEM-SMS02。将该质粒转化进感受态G.oxydans DSM 17078细胞,在含有终浓度为50μg ml-1的卡纳霉素的MB琼脂培养基上对转化子加以选择。观察到若干个可能的转化子,使用侧翼引物对SMS02LFH+1/SMS02LFH-1通过PCR对其中两个进行分析,以验证SMS02::Km突变已通过双交叉整合。携带有该突变的两种菌株被命名为G.oxydans DSM 17078-SMS02::Kml以及G.oxydans DSM 17078-SMS02::Km2。
实施例3使用静止细胞从D-甘露糖醇生产维生素C
在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/l MgSO4·7H2O、10g/L的CaCO3和18g/l琼脂(Difco)的No.3BD琼脂培养基上,于27℃对G.oxydans DSM 17078、G.oxydans DSM 17078-SMS02::Kml以及G.oxydans DSM 17078-SMS02::Km2的细胞进行3天的培养。
从琼脂平板上刮下细胞,将其悬浮于蒸馏水中,用于在30℃,220rpm振荡下进行的静止细胞反应。用处于反应混合物(还含有0.3%NaCl和1%CaCO3)中的2%D-山梨糖醇来进行一系列反应(0.5ml反应混合物,处于5ml反应试管中),用终浓度为OD600=10的细胞进行温育。20小时的温育后,用具有与Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad,Reinach,Switzerland)相连的LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck,Darmstadt,Germany)的Agilent 1100 HPLC***(AgilentTechnologies,Wilmington,USA),通过高效液相色谱(HPLC)来对反应混合物样品进行分析。移动相为0.004M硫酸,流速为0.6ml/分钟。用UV探测器(波长254nm)组合折射系数探测器,记录下两个信号。此外,用具有UV探测的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II,YMC,Inc.,Kyoto,Japan)在254nm处来进行对L-抗坏血酸的鉴定。移动相为50mMNH4H2PO4和乙腈(40:60)。
用Agilent Series1100HPLC-质谱(MS)***来鉴定L-抗坏血酸。用电喷雾界面在正离子模式下来操作MS。用LUNA0C8(2)柱(100x4.6mm)(Phenomenex,Torrance,USA)来进行分离。移动相为0.1%蚁酸和甲醇(96:4)的混合物。L-抗坏血酸以3.1分钟的驻留时间被洗脱出来。通过驻留时间和该化合物的分子量来确认L-抗坏血酸的身份。
G.oxydans DSM 17078-SMS02::Kml以及G.oxydans DSM17078-SMS02::Km2突变体菌株能产生1100m/l的维生素C,相比之下,菌株G.oxydans DSM 17078仅为730mg/l,表明维生素C产量大约增加50%。
实施例4 SMS02基因和等同物在其它生物中的存在
可通过简单的DNA杂交实验来测定其它生物(而非本文前面公开的那些,例如表1中提到的生物)中SEQ ID NO:1和/或展示出与SEQ IDNO:1的相似性/相同性的等同物的存在。
在含有5g/l细菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l葡萄糖、5g/l甘露糖醇、1g/l MgSO4·7H2O、5ml/l乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上,于27℃,对菌株Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和IFO13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)、3g/l细菌蛋白胨(Difco)和18g/l琼脂(Difco)的甘露糖醇培养基(MB)型琼脂培养基上,于27℃,对所有其它Acetobacter、Gluconacetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。在Luria Broth琼脂培养基上培养E.coli K-12。在厂商推荐的培养基上或者按照本领域已知的方法培养其它菌株/细胞。按照例如Sambrook et al,1989,″Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Second Edition″,Cold SpringHarbor Laboratory Press所述,从合适的生物(例如表1提到的)提取基因组DNA。
用限制性酶(例如EcoRI或HindIII)消化基因组DNA制备物,通过琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖)分离出1μg的DNA片段。用0.25N HCl对凝胶进行15分钟的处理,接着再用0.5N NaOH处理30分钟,然后按照厂商说明书,用Vacuum Blotter Model 785(BIO-RAD Laboratories AG,Switzerland)将凝胶印到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用得到的印迹与含有探针(例如具有SEQ ID NO:1序列的DNA片段,或含有SEQ IDNO:1序列的部分或全部的DNA片段)的溶液接触或杂交,以从测试生物中探测阳性DNA片段。可按照实施例1,用PCR-DIG标记试剂盒(Roche Diagnostics)和引物组SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4来制备DIG标记的探针,例如SEQ ID NO:1。此印迹杂交结果示于表1中。
杂交可在严谨条件或高度严谨条件下进行。此类条件的一个优选的非限制性的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中,大约45℃下杂交,随后在1x SSC、0.1%SDS中,50℃下进行一次或多次洗涤,洗涤优选在55℃下,更优选在60℃下,进一步优选在65℃下进行。高度严谨条件包括,例如,在溶液中,例如在含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中,或包含50%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02%十二烷基磺酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中,于42℃温育2小时至4天,接着在2x SSC和0.1%SDS中,于室温下,洗两次膜,每次5至15分钟,然后在65-68℃,于0.5x SSC和0.1%SDS或0.1x SSC和0.1%SDS中洗两次,每次15-30分钟。为检测出与探针DNA具有较低相同性的DNA片段,最后的洗涤步骤可在较低温度(例如50-65℃)进行较短的洗涤时间(例如1-15分钟)。
可通过本领域公知的PCR方法,对表1所示各生物中阳性信号对应的基因加以克隆,这使用此生物的基因组DNA与合适的引物组(例如,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)在实施例1所述条件下进行,或者按照这样进行:每个反应使用5至100ng基因组DNA(总体积50μl)。可用Expand High Fidelity PCR***(Roche Diagnostics),采用下述反应条件:94℃2分钟;30个循环的(i)94℃15秒的变性步骤,(ii)60℃30秒的退火步骤,(iii)72℃0.5至5分钟(取决于目标DNA长度,1分钟/1kb)的合成步骤;72℃延伸7分钟。或者,可以用简并引物来进行PCR,对简并引物的设计可基于SEQ ID NO:2或基于作为共有序列的氨基酸序列(通过对由序列搜索程序(例如BLASTP,或当核苷酸序列被用作“查询序列”时,BLASTX)获得的若干氨基酸序列进行比对选出的),以找到与SEQ ID NO:2的蛋白相似的蛋白。对使用简并引物进行的PCR而言,第二个退火步骤的温度(见上文)可被降低至55℃,或者甚至50-45℃。此实验的结果如表1所示。
通过琼脂糖凝胶电泳来分离PCR反应的样品,在用例如溴化乙啶染色后,用透照器(transilluminator)来观察条带,从凝胶对条带进行分离,验证正确的序列。
上文提到的共有序列可以是属于若干蛋白质结构域/家族数据库的某些类的氨基酸序列,所述数据库例如PROSITE(蛋白质家族和结构域的数据库)、COGs(直向同源体组的簇)、CDD(保守结构域数据库)、pfam(多重序列比对和隐Markov模型的大集合,覆盖很多常见的蛋白质结构域和家族)。一旦可从含有此类数据库的结构域或家族的蛋白中选出与本发明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白,即可使用蛋白序列或其核苷酸序列(当可从公众数据库获得时)通过PCR来扩增编码该蛋白的对应DNA。
实施例5在其它生物中打断SMS02基因和等同物,用于生产维生素C
为在合适的 微生物(能从给定碳源直接生产维生素C)中提高维生素C的生产,可按照关于G.oxydans DSM 17078中的SMS基因所述方法(见实施例2),破坏SMS02基因和等同物(例如,实施例4中获得的PCR产物,其在本文中被称为基因X),以产生携带SMS02等同物基因::Km的敲除突变体。用于产生此类敲除突变体的合适的宿主细胞可选自,例如,表1列出的Gluconobacter菌株,特别是G.oxydans IFO3293、G.oxydans IFO3292、G.oxydans IFO ATCC 621H、G.oxydans IFO12528、G.oxydans IFO3291、G.oxydans IFO3255、G.oxydans IFO3244、G.cerinus IFO3266、G.frateurii IFO3260、G.oxydans IFO3287、Acetobacteraceti subsp.orleanus IFO3259、Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693、Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773和Acetobacter sp.ATCC15164。
敲除突变体,例如,敲除突变体G.-oxydans IFO3293-SMS02等同物基因::Km可以按照下文所述来产生:将实施例4获得的PCR产物克隆进E.coli载体pCR2.1-TOPO,并用于转化E.coli TG1,以获得携带pCR2.1-基因X的Apr转化子。然后,用连接酶将从pUC-4K(AmershamBioscience,编号X06404)分离的Kmr盒***目标基因的限制性位点之一,用得到的连接产物转化E.coli TG1,以获得携带pCR2.1-基因X::Km的Apr Kmr转化子。用选自载体部分的多克隆位点的两种限制性酶消化从转化子制备的pCR2.1-基因X::Km质粒,以分离出含有基因X::Km的DNA片段。通过电穿孔用得到的DNA片段转化携带有SMS02等同物基因的宿主菌株,以获得携带有SMS02等同物基因::Km的基因打断子(disruptant)。
可产生进一步的修饰,包括对所述菌株中涉及将D-山梨糖醇、L-山梨糖和/或L-山梨糖酮转化为维生素C的基因进行的修饰,以提高此类菌株的维生素C产量。
按照实施例3,使用敲除突变体的细胞(例如G.oxydans IFO3293-SMS02等同物基因::Km的细胞)和对应的野生型菌株(例如G.oxydansIFO3293)进行对维生素C的生产。
在用1%L-山梨糖酮作为底物的静止细胞反应中,突变体菌株生产的维生素C可比野生型菌株多至少20%。
表1:其它生物中SMS02基因的等同物
菌株 | 信号1 | 信号2 | 信号3 |
G.oxydans DSM17078 | + | + | + |
G.oxydans IFO3293 | + | + | + |
G.oxydans IFO3292 | + | + | + |
G.oxydans ATCC621H | + | + | + |
G.oxydans IFO12528 | + | + | + |
G.oxydans G624 | + | + | + |
G.oxydans T-100 | + | + | + |
G.oxydans IFO3291 | + | + | + |
G.oxydans IFO3255 | + | + | + |
G.oxydans ATCC9937 | + | + | + |
G.oxydans IFO3244 | + | + | + |
G.cerinus IFO3266 | + | + | + |
G.frateuriiIFO3260 | + | + | + |
G.oxydans IFO3287 | + | + | + |
Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO3259 | + | + | + |
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693 | + | + | + |
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13773 | + | + | + |
Acetobacter sp.ATCC15164 | + | + | + |
G.thailandicus NBRC100600 | + | + | + |
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC14835 | + | + | + |
Gluconacetobact erpolyoxogenesNBI1028 | + | + | + |
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037 | + | + | + |
Gluconacetobact ereuropaeus DSM6160 | + | + | + |
Acetobacter aceti 1023 | + | - | + |
Acetobacter pasteurianus NCI1193 | + | - | + |
Bacillus cereus ATCC14579 | - | - | + |
Bacillus subtilis168 | - | - | + |
Bacillus thuringiensis serovar konkukian97-27 | - | - | + |
Brucella suis 1330 | + | - | + |
Brucella melitensis 16M | + | - | + |
Azotobacter vinelandii AvOP | - | - | + |
Azotobacter chroococcum MCD1 | - | - | + |
E.coli | - | - | - |
Saccharomyces cerevisiae | - | - | - |
Aspergillus niger | - | - | - |
小鼠 | - | - | - |
信号1:在使用不同菌株的基因组DNA,用SEQ ID NO:1作为经标记探针进行的印迹杂交试验上对DNA的探测。信号2:使用引物对SEQID NO:3和SEQ ID NO:4在PCR反应中对不同菌株DNA的探测。信号3:使用简并引物进行的PCR反应中对不同菌株DNA的探测。更多解释参见文本。
Claims (11)
1.被打断的编码根据SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸用于在下述工艺中生产维生素C和/或2-KGA的用途,所述工艺中,在水性营养培养基中,在使得能从D-山梨糖醇或L-山梨糖通过直接发酵生产维生素C和/或2-KGA的条件下,培养携带被打断的所述多核苷酸的选自Gluconobacteroxydans DSM 17078、Gluconobacter oxydans IFO 3293、Gluconobacteroxydans IFO 3292、Gluconobacter oxydans IFO 3244、Gluconobacter cerinusIFO 3266、Gluconobacter frateurii IFO 3260、Gluconobacter oxydans IFO3287或Acetobacter sp.ATCC15164的微生物。
2.如权利要求1所述的用途,其中根据SEQ ID NO:1的多核苷酸被打断。
3.携带权利要求1或2中使用的被打断的多核苷酸的微生物,所述微生物选自Gluconobacter oxydans DSM 17078、Gluconobacter oxydans IFO3293、Gluconobacter oxydans IFO 3292、Gluconobacter oxydans IFO 3244、Gluconobacter cerinus IFO 3266、Gluconobacter frateurii IFO 3260、Gluconobacter oxydans IFO 3287或Acetobacter sp.ATCC 15164。
4.如权利要求3所述的微生物,其能以300mg/l或更多的量从D-山梨糖醇直接生产维生素C,所述的量是在20小时以低于0.02h-1的生长速率温育之后测量的。
5.如权利要求3所述的微生物,其能以1000mg/l或更多的量从L-山梨糖直接生产维生素C,所述的量是在20小时以低于0.02h-1的生长速率温育之后测量的。
6.根据权利要求3至5中任意一项所述的微生物,其生产具有减少的或消失的D-山梨糖醇脱氢酶活性的多肽,其中所述多肽由权利要求1使用的多核苷酸编码。
7.如权利要求3至6中任意一项所述的微生物,其选自Gluconobacteroxydans DSM 17078。
8.如权利要求3至7中任意一项所述的微生物用于生产维生素C的用途。
9.用于生产能以较之野生型微生物而言增加至少5%的产率产生维生素C和/或2-KGA的选自Gluconobacter oxydans DSM 17078、Gluconobacter oxydans IFO 3293、Gluconobacter oxydans IFO 3292、Gluconobacter oxydans IFO 3244、Gluconobacter cerinus IFO 3266、Gluconobacter frateurii IFO 3260、Gluconobacter oxydans IFO 3287或Acetobacter sp.ATCC15164的微生物的方法,所述工艺包括如下步骤:通过使所述微生物内的D-山梨糖醇脱氢酶活性减少或消失,改变所述微生物,其中,编码展示出所述降低或消失的D-山梨糖醇脱氢酶活性的多肽的内源基因选自编码根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
10.根据权利要求9的方法,其中所述内源基因被打断。
11.用根据权利要求3至7中任意一项所述的微生物生产维生素C和/或2-KGA的方法,其中,在水性营养培养基中,在允许从D-山梨糖醇或L-山梨糖对维生素C和/或2-KGA进行直接生产的条件下培养所述微生物。
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CN1247230A (zh) * | 1998-07-30 | 2000-03-15 | 味之素株式会社 | 醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因 |
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