CN101151276B - 使用仓鼠igf-1的蛋白质制备方法 - Google Patents
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Abstract
通过本发明提供一种多肽，其选自以下多肽：(1)具有序列编号1中记载的氨基酸序列的多肽，以及(2)具有在序列编号1中记载的氨基酸序列中，第3位的氨基酸被其它氨基酸置换的氨基酸序列，且具有***1(IGF-1)活性的多肽；编码所述多肽的DNA；含有所述DNA的载体；含有所述载体的宿主细胞、以及使用所述多肽制备重组蛋白质的方法。
Description
技术领域
本发明涉及新型的仓鼠IGF-1多肽。本发明进一步涉及利用上述新型IGF-1多肽有效且廉价地制备期望的重组蛋白质的方法。
背景技术
使用基因重组技术生产用作药品的蛋白质的时候，由于使用动物细胞可以实现在细菌细胞中无法完成的复杂的翻译后修饰或折叠，因此动物细胞多作为生产重组蛋白质的宿主细胞进行使用。
目前，在培养动物细胞以获得该动物细胞生产的天然蛋白质时，或者培养导入了编码期望的蛋白质的基因的动物细胞以制备期望的蛋白质等时，除了盐类、糖类、氨基酸类及维生素类等基础营养物质以外，为了该动物细胞的增殖，还必须在培养基中添加5～20％的范围的常规动物来源的提取物，具体而言如胎牛血清等血清。但是，上述操作具有以下的缺点：1)相关的哺乳动物来源的血清昂贵；2)由于每批次间存在品质差异无法获得稳定的增殖；3)存在受到病毒或者支原体污染的可能性；及4)由培养基中分离、纯化作为细胞产物的期望蛋白质的复杂化。因此，期待有一种在不含有血清的培养基中培养动物细胞、能够廉价地生产重组蛋白质的技术。
为了在无血清的培养基中制备蛋白质，必须添加在血清中含有的增殖因子，例如培养CHO细胞时，通过添加人IGF-1(***1：insulin-like growth factor 1)，可改善细胞增殖及存活率，使长期培养或大量培养成为可能。
IGF-1是作为具有与胰岛素相类似的活性的多肽而表达的70个氨基酸的单链多肽，具有类似于胰岛素前体的结构。IGF-1在具有细胞增殖的作用同时还具有胰岛素样的代谢活性，是个体成长中最重要的生长因子之一。认为IGF-1受到由脑下垂体分泌的生长激素(Growth Hormone；GH)的作用由肝脏产生，在促进比较远的目标的骨骼组织的生长同时，还在肌肉或脂肪细胞中显示出代谢活性。
近年来，除了上述内分泌的作用之外，还报道了在各种细胞培养***中生产IGF-1，且IGF-1除了具有对这些细胞的增殖作用以外还有着各种生理活性。另外，着眼于IGF-1具有的细胞增殖作用，还提出了在生产重组蛋白质的动物细胞培养***中导入编码IGF-1等具有增殖促进作用的多肽的DNA的重组蛋白质的制备方法(US 2002/0102650 A1)。
由于IGF-1等各种增殖因子使用人源性的重组体，价格非参昂贵，从制备成本的观点出发，期望减少IGF-1的添加量。
发明内容
发明欲解决的课题
本发明的目的为得到制备成本低廉的、且具有强力的细胞增殖促进作用的新型IGF-1多肽。本发明的进一步的目的为利用编码上述新型IGF-1多肽的DNA，有效且廉价地制备能够生产重组蛋白质的宿主动物细胞。本发明另一目的为提供一种使用相关宿主动物细胞以制备重组蛋白质的方法。
解决课题的方法
本发明者们为实现上述目的进行了深入的研究，结果开发了仓鼠来源的新型***1(IGF-1)多肽，并发现该新型IGF-1多肽在动物细胞的培养中具有显著的细胞增殖促进作用，从而完成了本发明。
也即，本发明提供以下内容。
1.多肽，其选自以下多肽
(1)具有序列编号1中记载的氨基酸序列的多肽，以及
(2)具有在序列编号1中记载的氨基酸序列中，第3位的氨基酸被其它氨基酸置换的氨基酸序列，且具有***1(IGF-1)活性的多肽。
2.上述1所述的多肽，其第3位的氨基酸被丝氨酸所置换。
3.上述1所述的多肽，其第3位的氨基酸被赖氨酸所置换。
4.编码上述1所述的多肽的DNA。
5.含有上述4所述的DNA的载体。
6.含有上述5所述的载体的宿主细胞。
7.上述6所述的宿主细胞，其为CHO细胞。
8.制备上述1所述的多肽的方法，其使用上述6或7中记载的宿主细胞。
9.与上述1所述的多肽相结合的抗体。
10.细胞，其中导入了编码上述1所述的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA，以用于生产所期望的蛋白质。
11.上述10所述的细胞，其中编码上述1所述的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA通过单个载体同时进行导入。
12.上述10所述的细胞，其中编码上述1所述的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA通过多个载体分别进行导入。
13.上述10～12任一项所述的细胞，其为CHO细胞。
14.制备期望的蛋白质的方法，该方法包含培养上述10～13任一项所述的细胞。
15.含有上述1所述的多肽的培养基。
16.上述15所述的培养基，上述1所述的多肽通过在培养基中进行添加而含有在培养基中。
17.上述15所述的培养基，上述1所述的多肽通过从宿主细胞分泌而含有在培养基中。
18.上述15～17中任一项所述的培养基，是无血清培养基、或者不合有除了上述1所述的多肽以外的哺乳动物来源的成分的培养基。
19.期望的蛋白质的制备方法，包括使用上述15～18中任一项所述的培养基进行CHO细胞的培养。
20.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤。
21.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(b)从(a)制备的细胞中选择表达期望蛋白质的细胞的步骤；
(c)在(b)选择的细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤。
22.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中同时导入编码期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA的步骤；
(b)从(a)制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤。
23.上述22所述的方法，使用含有编码期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA的单个载体，在CHO细胞中同时导入编码期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA。
24.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤。
25.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中导入编码期望蛋白质的DNA的步骤；
(c)从(b)中制备的细胞中选择表达期望蛋白质的细胞的步骤。
26.上述20～25中任一项所述的制备方法，IGF-1为上述1所述的多肽。
27.用于制备期望的蛋白质的细胞的筛选方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤；
(c)在(b)选择的细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤；
(d)从(c)中制备的细胞中选择表达期望蛋白质及IGF-1的细胞的步骤。
28.上述27中所述的筛选方法，IGF-1为上述1所述的多肽。
附图说明
图1：表示本发明中CHO细胞来源的仓鼠IGF-1基因的碱基序列及氨基酸序列的图。
图2：表示本发明中CHO细胞来源的仓鼠IGF-1和人IGF-1之间的氨基酸序列的比较的图。
图3：将仓鼠IGF-1的70氨基酸的N末端开始的第3位的具有负电荷的E变换为K及S，使电荷向正性一侧移动的活性型仓鼠IGF-1的示意图。(+)为带有正电荷的氨基酸，(-)为带有负电荷的氨基酸，(±)为不带电荷的氨基酸。
图4：表示用于表达导入变异的仓鼠IGF-1的质粒的图。
图5：表示天然型及变异型仓鼠IGF-1对增殖能力的效果的图。
图6：表示天然型及变异型仓鼠IGF-1对存活率的效果的图。
图7：表示导入仓鼠及人IGF-1(E3S)的抗IL6R抗体产生细胞的Fed-Batch培养基中抗体产生量的比较的图。
图8：表示导入仓鼠、小鼠及人IGF-1(E3S)的抗IL6R抗体产生细胞的Fed-Batch培养基中抗体产生量的图。
图9：表示导入仓鼠、小鼠及人IGF-1(E3S)的抗IL6R抗体产生细胞的3种细胞株中产生量最高的最高产细胞株的抗体产生量的比较的示意图。
图10：导入仓鼠、小鼠及人IGF-1(E3S)的抗IL6R抗体产生细胞的Fed-Batch培养基中抗体产生量的图。
具体实施方式
本发明的多肽优选具有图1及序列编号1所示的氨基酸序列的成熟的分泌型仓鼠IGF-1，但也可以为前体型仓鼠IGF-1。
另外，本发明的多肽包含具有在序列编号1所示的仓鼠IGF-1的氨基酸序列中，在第3位的氨基酸被其他的氨基酸置换的氨基酸序列，且具有***1(IGF-1)活性的多肽。置换的氨基酸并无特别限定，可被任意种氨基酸置换，但是优选被丝氨酸、赖氨酸、或天冬氨酸置换，特别优选被丝氨酸或赖氨酸置换。
在本发明中，“具有***1(IGF-1)活性”这一用语是指，对动物细胞具有增殖促进活性和/或提高存活率的活性。
在本发明中，“多肽”与“蛋白质”以同样含义使用。
本发明中的多肽，可通过本领域人员公知的方法，可以作为重组多肽或天然多肽的形式进行制备。如果为重组多肽可如下制备，将编码本发明的多肽的DNA重组至适当的表达载体中，对将其导入至适当的宿主细胞中而得到的转化体进行回收，获得提取物后，可以通过离子交换、反相、凝胶过滤等色谱层析法、或将抗本发明的多肽的抗体固定化的亲合色谱层析法、或者将这些层析柱进行多种组合来进行纯化、制备。
另外，本发明的多肽作为与谷胱甘肽S转移酶蛋白质的融合蛋白、或添加多个组氨酸的重组蛋白质在宿主细胞(例如，动物细胞或大肠杆菌等)内进行表达时，表达的重组蛋白质可使用谷胱甘肽柱或者镍柱进行纯化。
融合的蛋白质在纯化后，还可根据需要在融合蛋白之内通过凝血酶或者因子Xa等切断、除去目的多肽以外的区域。
如果是天然多肽，可通过本领域人员公知的方法，例如可对表达本发明的多肽的组织或细胞的提取物，使用后述的与仓鼠IGF-1多肽结合的抗体相结合的亲合柱层析进行纯化而进行分离。抗体可以为多克隆抗体也可为单克隆抗体。
另外，本发明提供编码本发明的仓鼠IGF-1的DNA。本发明的DNA可用于如上所述的本发明的多肽的体内(in vivo)或体外(in vitro)的生产中。本发明的DNA，只要编码本发明的多肽即可，可为任一种形态。即，可为从mRNA合成的cDNA或基因组DNA、或化学合成DNA等。另外，只要能编码本发明的多肽，包含具有基于遗传密码的简并的任一的碱基序列的DNA。
本发明的DNA可通过本领域人员公知的方法进行制备。例如，可以通过表达本发明的多肽的细胞制备cDNA文库，将本发明的DNA的序列(例如序列编号2)的一部分作为探针进行杂交而制备。cDNA文库可通过例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中记载的方法进行制备，也可使用市售的DNA文库。另外，可通过表达本发明的多肽的细胞制备RNA，基于本发明的DNA序列合成寡聚DNA，将其作为引物使用进行PCR反应，扩增编码本发明的多肽的cDNA进行制备。
具体而言，可以如下进行操作。首先，从表达本发明的多肽的细胞、组织、器官等分离mRNA。mRNA的分离可使用公知的方法、例如胍超速离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.and Sacchi，N.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等从总RNA中纯化mRNA。另外，还可使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备mRNA。
使用逆转录酶从得到的mRNA合成cDNA。cDNA的合成可使用AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生化学工业)等进行。另外，可使用本说明书中记载的引物等，按照使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech制)及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)，进行cDNA的合成及扩增。
在后述的本发明的实施例中，编码仓鼠IGF-1多肽的cDNA通过PCR克隆获得。PCR引物的设计，可使用已知的大鼠/小鼠/人IGF-1之间基因序列保守的区域来进行。
从获得的PCR产物制备目的DNA片段，与载体DNA相连接。进一步，通过此方法制备重组载体，导入至大肠杆菌中选择菌落制备期望的重组载体。目的的DNA的碱基序列可通过公知的方法、例如双脱氧核苷链终止法进行确认。
另外，通过将获得的cDNA作为探针对DNA文库进行筛选，可以分离基因组DNA。
另外，在本发明的DNA中，考虑用于表达的宿主的密码子的使用频率，可以设计表达效率更高的碱基序列(Grantham，R.et al.，Nucleic Acids Research(1981)9，r43-74)。另外，本发明的DNA可通过市售的试剂盒或公知的方法进行改变。改变可举出例如通过限制性酶消化、合成寡聚核苷酸或适当的DNA片段的***、连接子的添加、起始密码子(ATG)及/或终止密码子(TAA、TGA或TAG)的***等。
另外，本发明提供一种***了本发明的DNA的载体。本发明的载体可以用于在宿主细胞内保持本发明的DNA，或者进一步用于表达本发明的多肽。
作为载体例如以大肠杆菌为宿主时，为了使载体在大肠杆菌(例如JM109、DH5α、DH10α、HB101、XL1-blue)等中大量扩增大量制备，只要具有用于在大肠杆菌中扩增的“ori”，进一步具有转化的大肠杆菌的选择性基因(例如能够通过任一种药物(氨苄西林或四环素、卡那霉素、氯霉素)进行选择的药物抗性基因)就并无特别限定。作为载体可举出例如M13类载体、pUC类载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，在以切取cDNA亚克隆为目的时，除了可举出上述载体以外，可举出pGEM-T、pDIRECT、pT7等。在以生产本发明的多肽为目的使用载体时，特别优选表达载体。作为表达载体，除了例如以在大肠杆菌中的表达为目的时，载体具有能在大肠杆菌中扩增的上述特征以外，在以JM109、DH5α、DH10α、HB101、XL1-blue等大肠杆菌为宿主时，必须具有在大肠杆菌内能有效表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等，Science(1998)240，1041-1043)或T7启动子等。此类启动子除了上述启动子以外，还可举出pGEX-5X-1(Pharmacia公司制备)、“QIAexpress system”(Qiagen公司制备)、pEGFP或pET(此时宿主优选是表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
另外，载体中还可以含有用于多肽分泌的信号肽序列。用于多肽分泌用的信号肽序列，在大肠杆菌的外周胞质中生产时，可以使用pelB信号肽序列(Lei，S.P.et al.，J Bacteriol.(1987)169，4379)。向宿主细胞中导入载体可使用例如氯化钙法、电穿孔法等进行。
除了大肠杆菌以外，用于本发明的多肽的制备的载体，可举出例如来源于哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen公司)、或pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18，p5322)、pEF、pCDM8)、昆虫细胞来源的表达载体(例如“BAC-to-BACTM baculovairusexpression system”(Invitrogen公司制备、pBacPAK8)、植物来源的表达载体(例如pMH1、pMH2)、动物病毒来源的载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、逆转录病毒来源的表达载体(例如pZI pneo)、酵母来源的表达载体(例如，“Pichia Expression Kit”(Invitrogen公司制备)、pNV11、SP-Q01)、枯草杆菌来源的表达载体(例如pPL608、pKTH50)等。
在以CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达为目的时，必须具有在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、RSV启动子、CMV启动子等，优选具有用于选择转化细胞的基因(例如可以通过药物(新霉素、G418、潮霉素、嘌呤霉素等)进行选择的药物抗性基因)。具有上述特性的载体可举出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
进一步，以稳定的表达基因、且在细胞内的基因的拷贝数的扩增为目的时，可举出在缺失核酸合成途径的CHO细胞内导入具有与其互补的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，通过氨甲喋呤(MTX)进行扩增的方法，另外，在以基因的瞬时性表达为目的时，可举出使用在染色体上具有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，以具有SV40的复制起点的载体(pCD等)进行转化的方法。复制起始点可使用polyomaviruse、腺病毒、牛乳突淋瘤病毒(BPV)等来源的序列。进一步，为了在宿主细胞系中扩增基因的拷贝数，表达载体的选择标记可含有氨基糖甙转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
另一方面，在动物生物体内表达本发明的DNA的方法，可举出将本发明的DNA重组至适当的载体中，通过逆转录病毒、脂质体法、阳离子脂质体法或腺病毒法等导入至生物体内的方法等。使用的载体可举出例如腺病毒载体(pAdexlw)或逆转录病毒载体(例如pZIPneo)等，但并不限定于此。在载体中***本发明的DNA等的常规的基因操作，可按照常规方法进行(Molecular Cloning，5.61-5.63)。在生物体内的给药可为离体(ex vivo)法，也可为在体(in vivo)法。
另外，本发明提供导入了本发明的载体的宿主细胞。导入了本发明的载体的宿主细胞并无特别限定，可以使用例如大肠杆菌或CHO细胞等各种动物细胞等。本发明的宿主细胞可作为例如用于制备或表达本发明的多肽的生产体系进行使用。用于多肽的制备的生产体系有体外及体内的生产体系。体外生产体系可举出使用真核细胞的生产体系或使用原核细胞的生产体系。
使用真核细胞时，可使用例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞作为宿主。动物细胞已知有哺乳类细胞、例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、两栖类细胞、例如爪蟾***(Valle，et al.，Nature(1981)291，358-340)或昆虫细胞，例如已知有Sf9、Sf21、Tn5。CHO细胞可特别优选使用缺失DHFR基因的CHO细胞的CHO dhfr-(Pro.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)或CHO K-1(Pro.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60，1275)。在动物细胞中，在以大量表达为目的时特别优选CHO细胞。向宿主细胞中导入载体例如可按照磷酸钙法、DEAE糊精法、使用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim公司制备)的方法、电穿孔法、脂质转染法等进行。
植物细胞已知有例如烟草(Nicotiana tabacum)来源的细胞作为多肽生产体系，也可将其作为愈伤组织培养。另外，也可使用利用水草的培养(Biolex公司)。真菌细胞已知有酵母、例如酿酒酵母(Saccharomyces)属、例如絮凝酵母(saccharomyces cerevisiae)、丝状菌、例如曲霉菌(Aspergillus)属、例如黑曲霉菌(Aspergillusniger)。
使用原核细胞时，有使用细菌的生产体系。细菌细胞可举出大肠杆菌(E.coli)，例如JM109、DH5α、DH10α、HB101等，其他的已知有枯草杆菌。
以这些细胞为目标，进行DNA转化，通过将转化后的细胞进行体外培养获得多肽。培养可按照公知的方法进行。例如，动物细胞的培养液可使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时可合并使用胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可进行无血清培养。培养时的pH优选约为6～8。培养通常在约30～40℃下进行15～240小时，根据必要加入培养基的交换、通气、搅拌等。
另一方面，在体内生产多肽的体系可举出例如使用动物的生产体系或使用植物的生产体系。以上述动物或植物为目标导入DNA，在动物或植物体内生产、回收多肽。本发明中的“宿主”包含这些动物、植物。
使用动物的时候有使用哺乳类动物、昆虫的生产体系。哺乳类动物可使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛(Vicki Glaser，SPECTRUMBiotechnology Application，1993)。另外，使用哺乳类动物时，可使用转基因动物。
例如将目的DNA与编码山羊β酪蛋白等此类乳汁中固定产生的多肽的基因制成融合基因。然后将含有该融合基因的DNA片段注入至山羊胚胎中，将该胚胎移植至雌性山羊中。从接受胚胎的山羊生育的转基因山羊或其后代产生的乳汁中，获得目的多肽。为了增加从转基因山羊生产的含有多肽的乳汁量，也可对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外，昆虫可使用例如蚕。使用蚕的时候，可以通过使用***了编码目的多肽的DNA的杆状病毒(baculovirus)感染蚕，从该蚕的体液中获得目的多肽(Susumu，M.et al.，Nature(1985)315，592-594)。
进一步，使用植物时，可以使用例如烟草。使用烟草时，将目的基因的编码多肽的DNA***至植物表达用载体、例如pMON 530中，将该载体导入至根癌土壤杆菌(Agrobacterium tume faciens)等此类细菌中。可使用该细菌感染烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)，通过本烟草的叶子获得期望的多肽(Julian K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上述得到的本发明的多肽，可从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，可纯化得到基本上纯粹而均一的多肽。多肽的分离和纯化使用多肽的纯化中常用的分离、纯化的方法即可，并无任何限定。例如，可适当选择、组合使用层析色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析、重结晶等，对多肽进行分离、纯化。
层析色谱可举出例如亲合层析色谱、离子交换层析色谱、疏水性层析色谱、凝胶过滤、反相层析色谱、吸附层析色谱等(Strategies forProtein Purification and Characterization：A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1996)。上述层析色谱可使用液相层析色谱、例如HPLC、FPLC等液相层析色谱进行。本发明包含使用上述纯化方法，以高度纯化多肽。
并且，在纯化多肽之前或纯化之后，通过适当的多肽修饰酶的作用，可加入任意的修饰或部分除去多肽。多肽修饰酶可使用例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肽链内切酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
另外，本发明提供与本发明的多肽相结合的抗体。本发明的抗体的形态并无特别限定，除了多克隆抗体还可包含单克隆抗体。另外，还包含使用本发明的多肽对兔子等免疫动物进行免疫得到的抗血清、所有等级的多克隆抗体以及单克隆抗体、以及人抗体或通过基因重组获得的人源化抗体。
作为获得抗体的致敏抗原使用的本发明的多肽，可使用本说明书中公开的基因序列或氨基酸序列而获得。
在本发明中，作为致敏抗原而使用的多肽，可以是完整的多肽也可以是多肽的部分肽。
将编码本发明中的多肽或其片段的基因***至公知的表达载体体系中，通过该载体对本说明书所述的宿主细胞进行转化，可以用公知的方法从该宿主细胞内或外获得目的多肽或其片段，将它们作为致敏抗原使用。另外，还可以将表达多肽的细胞或其溶解物或化学合成的本发明的多肽作为致敏抗原使用。
作为经致敏抗原免疫的哺乳动物，并无特别限定，但优选考虑与在细胞融合中使用的母细胞之间的适应性而进行选择，一般而言可使用啮齿类动物、兔类动物、灵长类动物。
啮齿类动物可使用例如小鼠、大鼠、仓鼠等等。兔类动物可使用例如兔子。灵长类动物可使用例如猴子。猴子可使用狭鼻下目Catarrhini(旧世界猴)，例如猕猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩。
使用致敏抗原对动物进行免疫可采用公知的方法进行。一般的方法有将致敏抗原注射至哺乳动物的腹腔内或皮下。具体而言，以PBS(磷酸缓冲液)或生理盐水等将致敏抗原稀释至适当的量，对于混选体系，根据需要与常用的佐剂、例如弗氏完全佐剂适量混合、乳化后，对哺乳动物进行给药。进一步优选将与弗氏完全佐剂适量混合后的致敏抗原在4～2 1日内每天进行数次的给药。另外，进行致敏抗原进行免疫时使用适当的载体。如上所述进行免疫，通过常用方法确认血清中期望抗体水平的上升。
此处，为了获得针对本发明的多肽的多克隆抗体，在确认血清中期望的抗体水平上升以后，取出经抗原致敏后的哺乳动物的血液。通过公知的方法从该血液中分离血清。多克隆抗体可使用含有多克隆抗体的血清，也可根据需要从该血清中分离含有多克隆抗体的组份，并进行使用。例如，使用本发明的多肽进行偶联的亲合层析色谱，获得仅识别本发明的多肽的组分，进一步利用A蛋白或G蛋白柱对该组分进行纯化，可制备免疫球G蛋白或M。
为了获得单克隆抗体，在确认经上述抗原致敏后的哺乳动物的血清中期望的抗体水平上升以后，从哺乳动物中取出免疫细胞并用于细胞融合即可。此时，优选用于细胞融合的免疫细胞特别可举出脾脏细胞。作为与上述免疫细胞融合的其他的母细胞优选哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选获得通过药物选择融合细胞的特性的骨髓瘤细胞。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合为基本上公知的方法，例如可按照Milstein等的方法(Galfre，G.and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)进行。
通过细胞融合得到的杂交瘤可通过通常的选择培养液，例如HAT液(含有次黄嘌呤、氨喋呤、胸腺嘧啶的培养液)进行选择。使用该HAT培养液的培养，可持续进行至能够使作为目的的杂交瘤细胞以外的细胞(非融合细胞)死亡所需的足够的时间，通常为数天或数周的时间。然后实施常用的限制性稀释法，并进行生产目的抗体的杂交瘤的筛选。
另外，除了在人以外的动物中进行抗原免疫获得上述杂交瘤以外，还可以人淋巴细胞、例如经EB病毒感染的人淋巴细胞在体外条件下，以多肽、多肽表达细胞或其溶解物进行致敏，使致敏淋巴球蛋白与人来源的具有永久***能力的骨髓瘤细胞、例如U266相融合，可生产具有与多肽结合活性的期望的人抗体的杂交瘤(特开昭63-17688号公报)。
然后，将得到的杂交瘤移植至小鼠的腹腔内，对相同小鼠进行腹水回收，可通过例如硫酸铵沉淀A蛋白柱、G蛋白柱、DEAE离子交换层析色谱、偶联了本发明的多肽的亲合层析色谱对得到的单克隆抗体进行纯化而制备。本发明的抗体，除了用于本发明的多肽的纯化、检测之外，还可用于本发明的多肽的激动剂或阻断剂的侯选。另外，该抗体还可应用于本发明的多肽相关的疾病的抗体疗法中。以得到的抗体对人体进行给药为目的进行使用时(抗体疗法)，为了降低免疫原性，优选人抗体或人源性抗体。
例如，可对具有人抗体基因谱(repertoires)的转基因动物以作为抗原的多肽或多肽表达细胞或其溶解物进行免疫，取得抗体产生细胞，使用其与骨髓瘤细胞相融合的杂交瘤，可获得抗多肽的人抗体(参照国际公开编号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735及WO96-34096)。
除了使用杂交瘤生产抗体以外，还可以使用通过癌基因(oncogene)对生产抗体的免疫淋巴细胞等的免疫细胞永生化后得到的细胞。
如上述得到的单克隆抗体，还可以作为使用基因重组技术生产的重组型抗体而获得(例如参照Borrebaeck，C.A.K.and Larrick，J.W.，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the UnitedKingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。重组型抗体可如下进行生产，将编码其的DNA从杂交瘤或产生抗体的免疫淋巴细胞等免疫细胞中克隆，重组至适当的载体中，并将其导入至宿主中进行生产。本发明包含该重组型的抗体。
此外，本发明的抗体只要能与本发明的多肽进行特异性结合，也可为该抗体的片断或抗体修饰物。例如，抗体片段可举出Fab、F(ab’)2、Fv或H链和L链的Fv通过适当的连接子连接的单链Fv(scFv)(Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。具体而言，抗体在经酶、例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶处理之后生成片段，或者构建编码该片段的基因，将其导入至表达载体后，在适当的宿主细胞中进行表达(例如参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.and Horwitz，A.H.，Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.and Skerra，A.，Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，MethodsEnzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，MethodsEnzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.and Walker，B.W.，TrendsBiotechnol.(1991)9，132-137)。
作为抗体修饰物，可使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明的“抗体”中也包含上述抗体的修饰产物。为了获得上述抗体的修饰产物。可通过对得到的抗体进行化学修饰而获得。这些方法在本领域中早已被建立。
另外，本发明的抗体可如下获得，使用公知技术得到的由非人抗体来源的可变区域和人抗体来源的恒定区域构成的嵌合抗体、或者非人抗体来源的CDR(互补性决定区域)与人抗体来源的FR(框架区域)以及恒定区域共同构成的人源化抗体。
如上所述得到的抗体可以纯化至均一。本发明中使用的抗体的分离、纯化采用通常的蛋白质中使用的分离、纯化方法即可。例如可适当的选择、组合使用亲合层析色谱等层析色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酸凝胶电泳、等电点电泳等，进行抗体的分离、纯化(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Sprig Harbor Laboratory，1988)，但不限定于此。如上述获得的抗体的浓度测定可通过吸光度测定或酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)等进行。
使用亲和柱层析色谱法的柱可举出A蛋白柱、G蛋白柱。例如，使用A蛋白质柱的柱子可举出Hyper D，POROS，Sepharose F.F.(Pharmacia)等。
作为亲合层析色谱以外的层析色谱法，可举出例如离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤、反相色谱、吸附色谱等(Strategies forProtein Purification and Characterization：A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1996)。上述层析色谱法可采用HPLC、FPLC等液相色谱法进行。
另外，作为测定本发明的抗体的抗原结合活性的方法，可使用吸光度测定、酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbentassay；ELISA)、RIA(放射免疫测定法)或荧光抗体法。使用ELISA的时候，将本发明的多肽添加至已固定化本发明的抗体的多孔板上，然后添加含有目的抗体的样品、例如抗体产生细胞的培养上清或纯化抗体。添加识别以酶、例如碱性磷酸酶标记的抗体的第二抗体，与多孔板温育，然后洗净后，加入p-硝苯基磷酸等酶底物，并通过测定吸光度可以评价抗原结合活性。多肽可使用多肽的片段、例如可使用其C末端构成的片断或N末端构成的片段。本发明的抗体的活性评价中可使用BIAcore(Pharmacia制备)。
本发明提供导入了编码本发明的多肽的DNA和编码所期望的蛋白质的DNA的生产所期望的蛋白质的细胞。该细胞可用于所期望的蛋白质的制备。
本发明中所期望的蛋白质并无特别限定，可以为抗体(天然抗体、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体等)或生理活性蛋白质(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-SCF)、促红素、干扰素、IL-1或IL-6等白介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、凝血因子等)等中的任一种蛋白质，但优选为抗体。
编码本发明的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA的导入可通过单个载体同时导入，也可使用多个载体分别导入。
导入了编码本发明的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA的细胞并无特别限定，可为任意种细胞，优选CHO细胞、特别优选CHO dhfr-细胞。
本发明进一步提供含有本发明的多肽的培养基。培养基中的本发明的多肽的含量可根据使用的培养基、培养的细胞及欲制备的期望的蛋白质的种类等等进行适当的选择决定，通常为0.1mg/L～5mg/L、优选为0.2mg/L～1mg/L、进一步优选为0.5mg/L。
含有本发明的多肽的培养基可用于使用动物细胞、特别是CHO细胞以制备蛋白质的情况。
本发明的培养基只要含有本发明的多肽即可，可添加本发明的多肽，也可从宿主细胞中分泌。
本发明中使用的培养基的成分可适当使用通常在细胞(优选为动物细胞)培养基中使用的各成分，它们通常含有氨基酸、维生素类、脂质因子、能量源、渗透压调节剂、铁源、pH缓冲剂。上述成分的含量通常在下述适当的范围内：氨基酸0.05～1500mg/L，维生素0.001～10mg/L，脂质因子0～200mg/L，能量源1～20g/L，渗透压调节剂0.1～10000mg/L，铁源0.1～500mg/L，pH缓冲剂1～10000mg/L，微量金属元素0.00001～200mg/L，表面活性剂0～5000mg/L，增殖辅助因子0.05～10000μg/L及核苷0.001～50mg/L，但并不限定于此，可根据培养的细胞的种类，期望的蛋白质的种类等进行适当的决定。
上述成分之外，还可添加例如微量金属元素、表面活性剂、增殖辅助因子、核苷等。
具体而言可举出例如含有下述物资的培养基：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等氨基酸类，优选为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等氨基酸类；异肌醇、生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆辛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等，优选为生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等维生素类；氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸、胆固醇等，优选为氯化胆碱等脂类因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，优选为葡萄糖等能量源；氯化钠、氯化钾、硝酸钾等，优选为氯化钠等渗透压调节剂；EDTA铁、柠檬酸铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硝酸亚铁等，优选为氯化亚铁、EDTA铁、柠檬酸铁等铁源类；碳酸氢钠、氯化钙、磷酸氢钠、HEPES、MOPS等，优选为碳酸氢钠等pH缓冲剂。
除了上述成分以外，还可以添加下述物质：例如硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁、亚硅酸钠等，优选为硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁等微量金属元素；Tween80、Pluronic F68等表面活性剂；以及重组型胰岛素、重组型IGF-1、重组型EGF、重组型FGF、重组型PDGF、重组型TGF-α、盐酸乙醇胺、***钠、视黄酸、盐酸腐胺，优选为***钠、盐酸乙醇胺、重组型IGF-1、盐酸腐胺等增殖辅助因子；脱氧腺苷、脱氧胞嘧啶、脱氧鸟苷、腺苷、胞嘧啶、鸟苷、尿嘧啶等核苷等。并且在上述本发明的优选的例子中，还可以含有链霉素、青霉素G钾及庆大霉素等抗生素、或酚红等pH指示剂。
另外，还可在培养基中添加鱼肉提取物或鱼肉的酶分解物。
培养基的pH根据培养的细胞而不同，一般而言为pH6.8～7.6，大多数情况为pH7.0～7.4为宜。
培养基可采用市售的动物细胞培养用培养基、例如以D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1∶1Mixture(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Introvigen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL 301(JRH bioscience公司)、CD-CHO(Introvigen公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)PF-ACE-CHO(Sigma-Aldrich公司)等培养基进行制备。
另外，本发明的培养基优选为无血清培养基、或者不含有除本发明的多肽之外的哺乳动物来源的成分的培养基。
本发明提供包含使用含有本发明的多肽的培养基进行CHO细胞培养，制备期望的蛋白质的方法。
本发明进一步通过培养导入了编码本发明的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA的CHO细胞，以制备所期望的蛋白质的方法。
CHO细胞的培养可使用本领域人员公知的方法进行。例如，通常可在气相的CO2浓度为0～40％，优选在2～10％的气体环境下，30～39℃，优选在37℃左右，培养1～28天。
另外，动物细胞培养用的各种培养装置可使用例如发酵型罐装培养装置、气升型培养装置、培养基培养瓶培养装置、旋转培养瓶培养装置、微载体型培养装置、流动层型培养装置、中空纤维培养装置、转瓶培养装置、填充槽型培养装置等。
本发明进一步提供包含下述步骤的用于制备期望的蛋白质的细胞的方法：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤，
(b)在(a)中制备的细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤。
本发明进一步提供包含下述步骤的用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤，
(b)从(a)中制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤
(c)在(b)选择的细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤。
本发明进一步提供包含下述步骤的用于制备期望的蛋白质的细胞的方法：
(a)在CHO细胞中同时导入编码期望的蛋白质和IGF-1的DNA的步骤，
(b)在(a)中制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤。
在上述方法中，在CHO细胞中同时导入编码所期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA时，也可通过不同的载体同时导入编码期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA，或者使用含有编码期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA的单一载体进行同时导入。优选使用单个载体同时进行导入的方法。
本发明进一步提供包含下述步骤的用于制备期望的蛋白质的细胞的方法：
(a)在CHO细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤，
(b)在(a)中制备的细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤。
本发明进一步提供包含下述步骤的用于制备期望的蛋白质的细胞的方法：
(a)在CHO细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤，
(b)在(a)制备的细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤，
(c)从(b)中制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤。
即，在CHO细胞中导入编码所期望的蛋白质的DNA和编码IGF-1的DNA时，可将它们按照任意顺序进行导入，从易于控制期望蛋白质的表达量的角度出发，优选编码IGF-1的DNA与编码期望蛋白质的DNA同时导入，或者在导入编码期望的蛋白质的DNA以后，导入编码IGF-1的DNA。
在用于上述各种期望的蛋白质的制备中的细胞的制备方法中，优选IGF-1为本发明的多肽。
本发明进一步提供包含下述步骤的用于筛选期望的蛋白质的细胞的方法：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤，
(b)在(a)制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤，
(c)在(b)中选择的细胞中导入编码IGF-1的DNA的步骤，
(d)在(c)中制备的细胞中选择表达期望的蛋白质和IGF-1的细胞的步骤。
上述筛选方法中优选IGF-1为本发明的多肽。
本发明中的用于制备期望的蛋白质的细胞的制备法或用于制备期望的蛋白质的细胞的筛选方法中采用的编码IGF-1的基因并无特别限定，可为人、小鼠、大鼠、仓鼠等任一种动物来源的IGF-1，优选为仓鼠IGF-1。并且，仓鼠IGF-1以外的IGF-1序列记载于NucleicAcids Res.14(20)，7873-7882(1986)及J.Biol.Chem 262(16)，7894-7900(1978)。
本发明者们如后述的实施例所示，确认了通过在为了产生抗体而构建的细胞中导入编码本发明的多肽的DNA，使之表达活性型的IGF-1，可以在IGF-1无添加培养中构建了具有理想的培养行为的抗体生产用细胞。本发明的导入了多肽的抗体生产细胞的增殖能力和存活率优良，且在抗体产生量方面显示出非常优异的效果。本发明可用于任一种期望的蛋白质的产生细胞、特别是抗体产生细胞的用途中，在工业上具有极其巨大的利用价值。
通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不局限于此。本领域人员可进行各种变更和修饰，但这些变更与修饰也包含于本发明中。
实施例
实施例1：编码仓鼠IGF-1的cDNA的克隆
(1)cDNA的合成
从在CHO-DXB11细胞中导入抗白介素6受体(IL-6R)抗体基因的抗IL-6R抗体产生细胞(特开平8-99902号公报，参考例2)进行总RNA的提取。从得到的mRNA合成cDNA。
具体按照以下方法进行。通过将传代后经过72小时的处于细胞增殖期的约5×106个CHO细胞在4℃、1000rpm条件下离心5分钟，在不含培养液的离心管底部获得沉淀状态的细胞，加入在65℃预热的Sepasol-RNAI 4ml，然后使用移液管操作使其快速溶解，在室温下放置5分钟。进一步加入0.8ml氯仿，以Voltex充分搅拌后，在室温下放置3分钟。通过冷却离心机AvantiTM J25(BECKMAN制备)在4℃、7000rpm下离心5分钟后，小心采取上层，移至新的15ml管中。加入4ml的2-丙醇，以Voltex充分搅拌，在室温下放置10分钟。在4℃、7000rpm下离心10分钟后，完全除去上清液，得到RNA块状物。贴着离心管壁注射入4ml 75％的乙醇，在4℃、7000rpm下离心5分钟。完全除去上清后，再次注射入4ml 100％的乙醇。在4℃、7000rpm下离心5分钟后得到RNA块状物，于室温放置30分钟。空气干燥的RNA块状物通过加入100μl DEPC水，移液管操作使其完全溶解。进一步按照RNeasy MiNi Kit的操作方法对总RNA进行纯化。得到的30μl总RNA浓度的测定使用分光光度计DU640进行，按照波长260nm的吸光度10D＝40μg/ml计算出RNA浓度。将5μg高纯度总RNA用于cDNA合成。5μg高纯度总RNA以DEPC水配制成10μl后，通过移液管加入1μl HPLC级别的100pmol/μl T7-(T)24引物，完全混合后旋转汇集(spun down)。在70℃下加热10分钟使引物退火，快速旋转汇集后放置于冰上。在冰上放置2分钟后，通过移液管加入4μl 5×第一条链缓冲液、2μl的0.1M DTT、1μl的10mM dNTP Mix，在4℃下旋转汇集，放置于冰上。在42℃的加热器上开始进行温育，经过2分钟时通过移液管加入2μl的SuperScriptII逆转录酶混合物，开始进行第一链合成反应。经过60分钟后，快速进行旋转汇集，放置于冰上。继续进行第二条链的合成反应，通过移液管按顺序加入91μl的DEPC水、30μl的5×第二条链缓冲液、3μl的10mM dNTP混合物、1μl的E.coli DNA连接酶、4μl的E.Coli DNA聚合酶、1μl的E.coliRNaseH，在4℃下旋转汇集，放置于冰上。在16℃下温育120分钟，进行第二条链的合成。2小时后，加入2μl的T4 DNA聚合酶，进一步温育5分钟，快速旋转汇集，放置于冰上。加入152μl的25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇，进行30秒钟旋转振荡后旋转汇集，使用移液管进一步混合，移入预先离心1分钟的Phase Lock Gel管中并与胶共沉淀。在4℃下离心15000rpm 2分钟后，将水层通过移液管移至新的1.5ml Eppendorf管中，按顺序加入0.5μl的Pellet Paint、76μl乙酸铵7.5M溶液，充分旋转振荡。加入600μl 99.5％的乙醇，振荡30秒后，于室温下放置5分钟。在4℃、15000rpm下离心10分钟，获得除去未反应dNTP的cDNA沉淀。cDNA中加入500μl 75％乙醇，在4℃、15000rpm下离心3分钟。重复洗净2次进行脱盐，进一步加入100μl的99.5％乙醇在4℃、15000rpm下离心分离5分钟后，完全除去乙醇。进行约5分钟的空气干燥，溶解于1.5μl的无RNase的水中，将cDNA保存于-20℃。将50分之一的量用作PCR模板。
(2)编码仓鼠IGF-1的cDNA的克隆
仓鼠IGF-1基因通过PCR克隆获得。PCR引物的设计使用已知的大鼠/小鼠/人IGF-1之间的基因序列保守的区域进行。
具体而言可按照如下方法进行。将编码从成熟型大鼠IGF-1的N末端第13位的Ala至19位的Gly的基因序列：5’-gctcttcagttcgtgtgtgg(序列编号3)作为正向引物，将编码从N末端第50位的Arg至56位的Arg的基因的互补序列：5’-ctcctcagatcacagctccg(序列编号4)作为反向引物进行使用，以上述cDNA为模板进行PCR反应。在95℃、5分钟的前处理后，重复进行35次98℃、5秒钟的变性，53℃、30秒钟的退火，72℃、30秒钟的延伸反应，扩增目的基因后，再次进行72℃、10分钟的延伸反应，得到131bp的仓鼠IGF-1PCR片段。
通过测定得到的PCR片段的碱基序列确认了为扩增IGF-1的DNA，使用该序列信息继续进行PCR反应。将编码从N末端第29位的Thr至35位的Ile的基因序列：5’-acaggctatggctccagcatt(序列编号5)作为正向引物，将编码从N末端第85位的Gln至77位的Arg的基因的互补序列：5’-tgagtcttgggcatgtcagtg(序列编号6)作为反向引物进行使用，以上述cDNA作为模板进行PCR反应。在进行95℃、5分钟的前处理后，重复进行35次98℃、5秒钟的变性，53℃、40秒钟的退火，72℃、90秒钟的延伸反应，扩增目的基因后，再次进行72℃、10分钟的延伸反应，得到170bp的仓鼠IGF-1PCR片段。以上结果获得了成熟型仓鼠IGF-1从N末端13位的Ala至C末端70位的Ala的碱基序列。
进一步为了获得N末端一侧的序列，将编码包含有从成熟型大鼠IGF-1的N末端的5’对应的碱基的g至5’侧-33位的t开始至第14位的g的序列：5’-tgcttgctcacctttaccag(序列编号7)作为正向引物，将编码从N末端第50位的Arg至56位的Arg的基因的互补序列：5’-ctcctcagatcacagctccg(序列编号8)作为反向引物进行使用，以上述cDNA作为模板进行PCR反应。在进行95℃、5分钟的前处理后，重复进行35次95℃、30秒钟的变性，44℃、60秒钟的退火，72℃、90秒钟的延长反应，扩增目的基因后，再次进行72℃、10分钟的延伸反应，得到185bp的含有仓鼠IGF-1的N末端区域的片段。
实施例2：编码仓鼠IGF-1的cDNA的碱基序列及氨基酸序列的确定
克隆的基因通过DNA测序仪确定了基因序列，进一步确定了氨基酸序列，确认其编码了仓鼠IGF-1。得到的氨基酸序列在图1及序列编号1中表示，DNA序列在序列编号2中表示。
各个种的成熟的分泌型IGF-1均由70个氨基酸构成，但仓鼠IGF-1基因具有特异的序列，与人IGF-1比较，第20位的P(人：D)，第35位的I(人：S)，第67位的T(人：A)的三个氨基与人不同酸(图2)
实施例3：变异型仓鼠IGF-1基因的制备及其IGF-1的活性
(1)变异型仓鼠IGF-1基因的制备
分泌型仓鼠IGF-1基因具有在基因N末端第3位具有负电荷的E(谷氨酸)。制备了将该部位的氨基酸变更为使电荷朝正电荷方向移动的氨基酸的变异型IGF-1基因。IGF-1基因的变异的导入通过定点突变法进行。
天然型仓鼠IGF-1基因及获得的变异型仓鼠IGF-1基因分别称为E3E(天然型)、E3K(第3位的谷氨酸置换为赖氨酸)、E3S(第3位的谷氨酸置换为丝氨酸)(参照图3)。
(2)天然型及变异型仓鼠IGF-1的增殖能力及存活率的效果
构建表达变异型仓鼠IGF-1的质粒(图4)，并导入至亲代细胞株的抗IL-6R抗体产生CHO细胞中，选择耐受潮霉素的抗药性细胞株，获得稳定表达的细胞株。得到的细胞株进一步通过限制性稀释进行单细胞克隆，在IGF-1无添加的无血清培养基中得到增殖能力高的克隆细胞。
从分别带有不同电荷的E3E、E3K、E3S得到的克隆细胞中选择ME45(E3E)、MK44(E3K)、MS19(E3S)，放置于IGF-1无添加的无血清培养基中，在100ml的旋转培养瓶中比较细胞的增殖能力及生存能力。对于亲代细胞株的抗IL-6R抗体产生细胞，通过在JRH公司购进的人IGF-1(LongTM R3IGF-1)添加培养基和无添加培养基中培养进行比较。在S100旋转培养瓶中加入100mlMRA传代用无血清培养基，在37℃的CO2温育器内保持温度，然后3×106个细胞被离心后加入。分别取1mL培养液测定开始的细胞数及存活率。定时以1mL分别取样测定第3天以后至第7天的细胞数及存活率。
得到的结果在图5(增殖能力)和图6(生存能力)中显示。确定MS19(E3S)的增殖能力、生存能力均为最优。然后是MK44(E3K)显示良好结果。而作为亲代细胞株的抗IL-6R抗体产生细胞在IGF-1无添加培养基中不能增殖。MS19的增殖能力从培养第3日至第6日呈现显著，特别是从第4日至第5日的倍增时间(Ms19；26.5小时，MK4433.0小时，Me45；47.0小时，抗IL-6R亲代细胞株；86.7小时)、及最高到达细胞数(MS19；25.8×105个细胞/ml，MK44；20.3×105个细胞/ml，ME45；7.98×105个细胞/ml，抗IL-6R亲代细胞株；21.7×105个细胞/ml)考虑MS19的优越性明显。细胞的增殖上升平缓，一直延伸至其后的培养末期的MS19的培养特性，可作为理想的抗体生产细胞使用。另外，在存活率的比较中如在培养第7日非常显著(MS19；86.2％，MK44 66.4％，ME45；58.1％，抗IL-6R亲代细胞株；76.0hr％)显示，MS19一直至培养后期仍为稳定的细胞。
实施例4：仓鼠IGF-1(E3S)导入细胞的抗体产生量
为了证明仓鼠IGF-1具有等同或高于人IGF-1的抗体产生量的潜力，将导入了仓鼠IGF-1(E3S)与人IGF-1(E3S)至亲代细胞株中的细胞中培养特性最佳的单克隆的抗IL-6R抗体产生量进行了比较。人IGF-1(E3S)表达质粒通过以仓鼠IGF-1(E3S)为模板按顺序导入用于P20D、I35S、T67A置换的变异而构建。按照与实施例1同样的方法在亲代细胞株IL-6R抗体产生CHO细胞株中进行导入，选择潮霉素抗性细胞，通过使IGF-1(E3S)稳定的表达选择在IGF-1无添加培养基中获得增殖能力的细胞株。通过对细胞进行限制性稀释获得单克隆，进一步进行使用增殖方面优良的导入了IGF-1(E3S)的细胞的Fed-Batch培养，比较抗体的产生量。
得到的结果如图7所示。导入了仓鼠IGF-1(E3S)的细胞的抗体产生量在培养第8天为973mg/L，亲代细胞株为(843mg/L)，比人IGF-1(E3S)导入细胞(821mg/L)更为优越。确认了无论采用何种培养方法，相对于亲代细胞株仓鼠基因导入细胞的抗体生产量均为最高。
实施例5：仓鼠IGF-1(E3S)导入细胞的抗体产生量
在实施例4中显示了仓鼠IGF-1具有与IGF-1等同或更高的抗体产生量的能力，进一步比较了包含小鼠IGF-1的3种IGF-1的抗体产生量能力。小鼠IGF-1(E3S)表达质粒通过以仓鼠IGF-1(E3S)为模板导入了用于S69A的置换的变异而构建。为了比较3种天然型IG-1(E3E)以及变异体IGF-1(E3S)的抗体产生量，以仓鼠、人、小鼠IGF-1(E3S)为模板在E3E中导入变异，分别构建天然型IGF-1(E3E)表达质粒。
得到的6种IGF-1表达质粒以电穿孔法导入至同时制备的亲代细胞株中，选择潮霉素的抗性细胞后，通过使IGF-1稳定的表达选择在IGF-1无添加培养基中获得增殖能力的细胞株增殖能力最好的3株细胞(n＝3)。在扩增过程中人IGF-1(E3E)1株为增殖不良株，仅对IGF-1(E3E)n＝2继续进行试验，将合计17个细胞株在100ml旋转培养中进行扩大后，通过Fed-Batch培养比较抗体产生量。
图8表示仓鼠、小鼠及人IGF-1(E3S)导入细胞的Fed-Batch培养中的抗体产生量。增殖良好的各种3株(n＝3)的平均生产量优良，顺序为仓鼠＞小鼠＞人。图9表示仓鼠、小鼠及人IGF-1(E3S)导入细胞的3株中具有最大的抗体生产量的细胞株的比较。不仅平均生产量，在最大生产量中仓鼠IGF-1(E3S)导入株更优越。图10表示仓鼠、小鼠及人IGF-1(E3E)导入细胞的Fed-Batch培养中的抗体产生量。增殖良好的各种平均生产量在天然型IGF-1(E3E)导入株中顺序仍然为仓鼠＞小鼠＞人。
序列表
<110>中外制药株式会社
<120>使用仓鼠IGF-1的蛋白质的制备方法
<130>050252
<160>8
<210>1
<211>70
<212>PRT
<213>仓鼠(Hamster)
<400>1
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
1 5 10 15
Val Cys Gly Pro Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
20 25 30
Ser Ser Ile Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
35 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
50 55 60
Lys Pro Thr Lys Ser Ala
65 70
<210>2
<211>242
<212>DNA
<213>仓鼠
<400>2
tttgccacag ctggaccaga gaccctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcaattc 60
gtgtgtggac caaggggctt ttacttcaac aagcccacag gctatggctc cagcattcgg 120
agggcacctc agacaggcat tgtagatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctgagaaga 180
ctggagatgt actgtgcccc cctcaagcct acaaaatcgg cccgctctat ccgtgcccag 240
cg 242
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>3
gctcttcagt tcgtgtgtgg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>4
ctcctcagat cacagctccg
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>5
acaggctatg gctccagcat t 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>6
tgagtcttgg gcatgtcagt g 21
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>7
tgcttgctcacctttaccag
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>8
ctcctcagat cacagctccg 20
Claims (26)
1.由在序列编号1中记载的氨基酸序列中，第3位的氨基酸被丝氨酸或赖氨酸置换的氨基酸序列组成，且具有***1活性的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，第3位的氨基酸被丝氨酸所置换。
3.如权利要求1所述的多肽，第3位的氨基酸被赖氨酸所置换。
4.编码如权利要求1所述的多肽的DNA。
5.含有如权利要求4所述的DNA的载体。
6.含有如权利要求5所述的载体的宿主细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其是CHO细胞。
8.制备如权利要求1所述的多肽的方法，其使用如权利要求6或7中记载的宿主细胞。
9.与权利要求1所述的多肽相结合的抗体。
10.细胞，其中导入了编码如权利要求1所述的多肽的DNA以及编码期望的蛋白质的DNA，以用于生产所期望的蛋白质。
11.如权利要求10所述的细胞，其中编码如权利要求1所述的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA通过单个载体同时进行导入。
12.如权利要求10所述的细胞，其中编码权利要求1所述的多肽的DNA和编码期望的蛋白质的DNA通过多个载体分别进行导入。
13.如权利要求10～12中任一项所述的细胞，其是CHO细胞。
14.制备期望的蛋白质的方法，包含培养权利要求10～13中任一项所述的细胞。
15.含有如权利要求1所述的多肽的培养基。
16.如权利要求15所述的培养基，其中权利要求1所述的多肽通过在培养基中进行添加而含有在培养基中。
17.如权利要求15所述的培养基，其中权利要求1所述的多肽通过从宿主细胞分泌而含有在培养基中。
18.如权利要求15～17中任一项所述的培养基，其是无血清培养基或者不含有除了权利要求1所述的多肽以外的哺乳动物来源的成分的培养基。
19.期望的蛋白质的制备方法，包含使用如权利要求15～18中任一项所述的培养基进行CHO细胞的培养。
20.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中导入编码权利要求1的多肽的DNA的步骤。
21.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(b)从(a)制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤；
(c)在(b)选择的细胞中导入编码权利要求1的多肽的DNA的步骤。
22.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中同时导入编码期望的蛋白质的DNA和编码权利要求1的多肽的DNA的步骤；
(b)从(a)制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，使用含有编码期望的蛋白质的DNA和编码权利要求1的多肽的DNA的单个载体，在CHO细胞中同时导入编码期望的蛋白质的DNA和编码权利要求1的多肽的DNA。
24.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码权利要求1的多肽的DNA的步骤；
(b)在(a)步骤制备的细胞中导入编码期望蛋白质的DNA的步骤。
25.用于制备期望的蛋白质的细胞的制备方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码权利要求1的多肽的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(c)从(b)中制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤。
26.用于制备期望的蛋白质的细胞的筛选方法，包含以下步骤：
(a)在CHO细胞中导入编码期望的蛋白质的DNA的步骤；
(b)在(a)制备的细胞中选择表达期望的蛋白质的细胞的步骤；
(c)在(b)选择的细胞中导入编码权利要求1的多肽的DNA的步骤；
(d)从(c)中制备的细胞中选择表达期望的蛋白质及IGF-1的细胞的步骤。
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