CN101149372A - 免疫荧光标记试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫荧光标记试剂盒。是以绿色荧光蛋白(GFP)为指示剂、以葡萄球菌蛋白A(SPA)为抗抗体、应用于免疫标记方面的试剂盒。同时还公开了该试剂盒的制备方法。本发明可广泛应用于免疫荧光标记、免疫组织化学、生化分析、抗体检测、蛋白质芯片等领域，可有效取代现有产品，且操作更加简便，稳定性、灵敏性和可靠性更好，尤其适用于采用荧光分析仪器进行的高通量分析。
Description
技术领域
本发明是以绿色荧光蛋白为指示剂、以葡萄球菌蛋白A为抗抗体、应用于免疫标记方面的试剂盒，其涉及免疫荧光标记、免疫组织化学、生化分析、抗体检测、蛋白质融合、绿色荧光蛋白、蛋白A、基因工程等，属于免疫分析和生物技术应用等相关领域。
背景技术
自标记免疫测定技术出现以来，其在医学和生物学研究中已被广泛应用。其原理就是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，以显色或荧光物质标记抗体，对组织或细胞内的抗原物质进行定位检测。
在免疫测定中，用酶或荧光物质标记抗体/抗原是必需的。传统的标记方法是将指示物通过化学交联法耦联到抗体/抗原分子上(如将酶通过具有双功能或多功能化学基团的交联剂结合到蛋白分子上。但这种方法有其缺点：大量的抗体或抗原分子、酶作为反应物参加耦合；需纯化步骤才可获得抗体-酶耦合物；交联后酶活性时常降低；而且在测定过程中因随机结合引发的空间位阻的干扰而影响免疫测定的灵敏度。另外，传统荧光染料在荧光显微镜激发光照射下易发生光漂白现象，而且传统抗体制备及标记方法易降低抗体效价并产生非特异性染色。因此开发新的标记物及标记方法是很有意义的。
绿色荧光蛋白(GFP)是来自发光水母等海洋无脊椎动物的一种功能独特的蛋白质，其受到紫外或蓝光激发时，可以发射出绿色荧光。自1994年GFP基因被克隆成功以来，其作为生物标记分子有着巨大的应用潜力，主要因为它具有以下特性：(1)种属不依赖性，原核、真核细胞中都可表达为有活性的GFP；(2)荧光的产生不需要反应底物与辅助因子；(3)相对较小的分子和单体蛋白使之易于融合；(4)GFP肽链中一些特定氨基酸的替代可使之产生不同颜色的荧光，可适应于不同研究的需要；(5)GFP可作为一种非侵入方法(无需细胞通透作用，无毒作用)检测体内基因表达或蛋白标记；(6)它构象稳定，无光漂白作用，荧光强度高；(7)对一系列与GFP的N端或C端融合蛋白的性质研究中，已证明融合蛋白具有GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物功能。
葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁分离出的一种分子量为42000的单一多肽链。SPA具有许多生物学活性如激活补体、促有丝***、抑制吞噬等。其中SPA可与人和多种哺乳动物血清中IgG的Fc片段非特异性结合，且这种结合不影响Fab片段与抗原特异性结合的免疫活性，利用这一特性，结合放射、荧光、酶联及免疫电镜等技术建立了许多敏感、特异、快速、简便的实验方法，用于疾病诊断和其它方面的研究。目前SPA除用于免疫球蛋白和单克隆抗体的纯化外，以生物素(biotin)、过氧化物酶(peroxidase)、异硫氰酸荧光素(FITC)、胶体金(colloidal gold)等标记蛋白SPA，在免疫组化、免疫电镜、Western Blotting和ELISA中得到大量应用，被称为“广泛二抗”。
CN1731181公开了一种免疫荧光检测试剂，由增强型绿色荧光蛋白与葡萄球菌蛋白A的融合蛋白(ProA-EGFP)组成。同时还公开了该试剂的制备方法，即构建绿色荧光蛋白(GFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)融合基因表达载体，以大肠杆菌E.coli DH5α菌株表达ProA-EGFP融合蛋白；分离纯化ProA-EGFP融合蛋白。本发明的免疫荧光检测试剂在制备免疫学诊断或检测试剂中具有广泛的应用。该专利申请针对的是免疫荧光试剂的制备。本申请针对的是该试剂的具体应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种免疫荧光标记试剂盒及其制备方法。
本发明的免疫荧光标记试剂盒，是一种使用绿色荧光蛋白作为荧光指示剂的免疫荧光标记试剂盒。
本发明的免疫荧光标记试剂盒，组成如下：
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的融合蛋白SPA-EGFP，封闭剂，洗脱缓冲液。
所述的封闭剂为0.5％的牛血清白蛋白。
所述的洗脱缓冲液为含0.5％吐温20的10mM PBS，pH7.4。
本发明的免疫荧光标记试剂盒的制备方法，构建增强型绿色荧光蛋白和葡萄球菌蛋白A的融合蛋白基因spa-egfp，以毕赤酵母表达SPA-EGFP融合蛋白，分离纯化SPA-EGFP融合蛋白；分离纯化的SPA-EGFP融合蛋白作为荧光指示剂与封闭剂、洗脱缓冲液共同构成试剂盒。
所述的SPA-EGFP融合蛋白为酵母分泌表达，作用表达载体为质粒pPIC9K，引物按按常规设计，SPA-EGFP融合蛋白基因spa-egfp***质粒pPIC9K的α-factor信号肽下游，表达用宿主细胞为毕赤酵母GS115，电转化毕赤酵母并筛选高拷贝重组子，构建重组spa-egfp融合基因毕赤酵母工程菌。
对上述毕赤酵母工程菌进行发酵，方法如下：
使用BMMY培养基，发酵条件为：30℃，甲醇浓度2％，缓冲液pH值7.0，同时添加1％酸水解酪素(Casamino acids)。300rpm摇床培养80～84h，每20～24小时添加甲醇至终浓度2％。
上述BMMY培养基配方：1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨，100mM磷酸缓冲液，1.34％无氨基酵母氮源，4×10-5％生物素，2％甲醇，1％酸水解酪素(Casaminoacids)。
将上述毕赤酵母工程菌发酵液离心，取上清液过0.45微米滤膜，上HisTrap HP柱纯化，再过HiTrap Desalting柱脱盐，得到纯度大于99％的SPA-EGFP。
将纯化的SPA-EGFP融合蛋白冻干浓缩，所获得的SPA-EGFP融合蛋白用稀释缓冲液定容至一定浓度，作为荧光指示剂与封闭剂、洗脱缓冲液共同构成试剂盒。
所述的SPA-EGFP融合蛋白在酵母中表达后可以有效地分泌至培养基中，并且表达产物同时具备SPA的IgG结合活性以及EGFP的荧光活性。
本发明所述的免疫荧光标记试剂盒可用于制备临床诊断试剂盒。
本发明所述的免疫荧光标记试剂盒可用于制备检测试剂盒。
本发明所述的免疫荧光标记试剂盒可用于免疫学标记、细胞免疫组化检测及蛋白芯片等方面的研究。
本发明通过DNA重组技术，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因与葡萄球菌蛋白A(SPA)基因融合，将融合基因转染到毕赤酵母GS115中，并使其高效表达SPA-EGFP，将表达产物分泌至培养基中，纯化后获得高纯度的SPA-EGFP融合蛋白。利用此融合蛋白取代传统免疫标记试剂盒中的指示剂***(酶联显色/荧光试剂)和抗抗体(也可称为二抗)，配合以专用的封闭剂、洗脱缓冲溶液，构成新型免疫标记试剂盒。
本发明的绿色荧光蛋白免疫荧光标记试剂盒，以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为指示剂、以葡萄球菌蛋白A(SPA)为抗抗体，可广泛应用于免疫荧光标记、免疫组织化学、生化分析、抗体检测、蛋白质芯片等领域，可有效取代现有产品，且操作更加简便，稳定性、灵敏性和可靠性更好，尤其适用于采用荧光分析仪器进行的高通量分析。
具体实施方式
实施例1：免疫荧光标记试剂盒
组成如下：增强型绿色荧光蛋白和葡萄球菌蛋白A构成的融合蛋白SPA-EGFP，封闭剂0.5％的牛血清白蛋白，洗脱缓冲液含0.5％Tween 20的10mMPBS，pH7.4。
实施例2：免疫荧光标记试剂盒的制备
1、融合蛋白SPA-EGFP构建表达方法参见CN1731181。
SPA-EGFP融合蛋白基因spa-egfp(质粒是DNA序列，只有基因才可***质粒中)***质粒pPIC9K的α-factor信号肽下游，表达用宿主细胞为毕赤酵母GS115，电转化毕赤酵母并筛选高拷贝重组子，构建重组SPA-EGFP融合基因毕赤酵母工程菌。对上述毕赤酵母工程菌进行发酵，使用BMMY培养基，发酵条件为：30℃，甲醇浓度2％，缓冲液pH值7.0，同时添加1％Casaminoacids。300rpm摇床培养80～84h，每20～24小时添加甲醇至终浓度2％。将毕赤酵母工程菌发酵液离心，取上清液过0.45微米滤膜，上HisTrap HP柱纯化，再过HiTrap Desalting柱脱盐，得到纯度大于99％的SPA-EGFP。将纯化的SPA-EGFP融合蛋白冻干浓缩，备用。
2、采用0.5％的牛血清白蛋白作为封闭剂。
3、采用含0.5％Tween 20的50mM PBS作为洗脱缓冲液，其pH7.4。
4、将所获得的纯化SPA-EGFP融合蛋白用稀释缓冲液定容至1∶100(质量体积百分比)，作为荧光指示剂与封闭剂、洗脱缓冲液共同构成试剂盒。
上述的稀释缓冲液具体是20mM PBS，其为pH8.0。下面的实施例3-4的稀释缓冲液与本实施例相同。
实施例3：免疫荧光标记试剂盒的使用方法(直接法)
稀释：根据需要，用稀释缓冲液将抗原稀释至一定浓度。
固定：将稀释好的抗原滴加至固相载体上，以封闭剂覆盖无抗原区域，避免荧光指示剂的非特异性吸附。
标记：将荧光指示剂稀释至实验所需浓度，与样品混合，温育，以使之与抗体结合。
加样：滴加标记好的样品至固定有抗原的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合。
清洗：以洗脱缓冲液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂。
结果观察：荧光显微镜下进行定性/定量观察。
实施例4：免疫荧光标记试剂盒的使用方法(间接法)
稀释：根据需要，用稀释缓冲液将抗原稀释至一定浓度。
固定：将稀释好的抗原滴加至固相载体上，以封闭剂覆盖无抗原区域，避免荧光指示剂的非特异性吸附。
样品处理：使用稀释缓冲液将样品稀释至一定浓度。
加样：将处理好的样品滴加至固定有抗原的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合。
标记：将荧光指示剂滴加至抗原抗体结合后的固相载体上，以使之与抗体结合。
清洗：以洗脱缓冲液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂。
结果观察：荧光显微镜下进行定性/定量观察。
Claims (7)
1.一种使用绿色荧光蛋白作为荧光指示剂的免疫荧光标记试剂盒。
2.如权利要求1所述的免疫荧光标记试剂盒，其特征在于由下列试剂组成：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)构成的SPA-EGFP融合蛋白，封闭剂，洗脱缓冲液；所述的封闭剂为0.5％的牛血清白蛋白，所述的洗脱缓冲液为含0.5％吐温20的10mM PBS，pH7.4。
3.如权利要求2所述的免疫荧光标记试剂盒，其特征在于SPA-EGFP融合蛋白为酵母分泌表达，表达用宿主细胞为毕赤酵母GS115。
4.如权利要求2所述的免疫荧光标记试剂盒，其特征在于将spa-egfp融合基因***酵母表达载体pPIC9K中，将此表达载体转化毕赤酵母GS115，构建成SPA-EGFP融合蛋白毕赤酵母工程菌。
5.如权利要求3所述的免疫荧光标记试剂盒，其特征在于SPA-EGFP融合蛋白在酵母中表达后有效地分泌至培养基中，表达产物同时具备SPA的IgG结合活性以及EGFP的荧光活性。
6.权利要求1所述的免疫荧光标记试剂盒在制备检测试剂中的应用。
7.权利要求1所述的免疫荧光标记试剂盒在制备免疫学标记、细胞免疫组化检测及蛋白芯片等方面上的应用。
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