CN101148480A - 苯基聚蔗糖微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术方案利用化学反应将疏水基团苯基接枝到聚蔗糖微球上面,提供一种新型的疏水聚蔗糖微球及其制备方法。本发明的一种疏水聚蔗糖微球,由作为基质的聚蔗糖微球和作为配基的疏水基团组成,所述的疏水基团为苯基。本发明的制备方法,按照下述步骤进行:(1)制备聚蔗糖微球;(2)将聚蔗糖微球和反应物放入混合溶剂中,搅拌;(3)向反应体系中滴加催化剂;(4)整个体系在50-80℃下反应3-24h,过滤可得疏水微球。本发明的微球具有疏水基团含量高,蛋白吸附量高等优点,同时制备方法简便,污染小。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚合物微球及其制备方法,更确切的说,涉及一种含有疏水基团苯基的聚蔗糖微球及其制备方法。
背景技术
疏水作用色谱(HIC)采用含有疏水性配基的分离介质来分离纯化蛋白质,利用表面含有弱疏水性配基的疏水性介质为固定相,在水相无机盐浓度高的条件下,蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏而裸露出来,疏水作用增大,蛋白质分子上疏水区与固定相弱疏水配基间的作用使蛋白质分子被保留,随着水相中离子强度的降低,固定相和蛋白质之间的疏水作用降低,蛋白质分子上极性区与流动相的相互作用增强,蛋白质根据其与介质表面间疏水作用的强弱被依次洗脱下来。
目前研究人员致力于开发适于蛋白质分离的疏水吸附剂,制备出一系列较理想的吸附剂。用作分离介质的多孔硅胶是人工合成的多孔二氧化硅,其特点是表面含有硅醇基(或硅羟基)-Si-OH,因此可以通过整体修饰、表面硅羟基的化学修饰来改进硅胶的表面性质。大部分高分子材料具有一定的疏水性,因此在分离中会产生非特异性吸附,但是由于高分子材料的机械及化学稳定性好,因此其经过表面改性后能够得到广泛的应用。用于制备疏水作用色谱介质的基质的多糖类材料,集中在琼脂糖、纤维素和壳聚糖。其中,半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质,由于壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性,近年来在疏水层析中也得到了应用。但是目前还没有利用蔗糖合成疏水作用色谱介质的相关报道。
发明内容
本发明的技术方案旨在已有技术的基础上,利用化学反应将疏水基团苯基接枝到聚蔗糖微球上面,克服已有技术中接枝效率低,蛋白吸附能力不强的缺点,提供一种新型的苯基聚蔗糖微球及其制备方法。
所述的聚蔗糖微球粒径在80~500μm。所述的聚蔗糖微球可以采用“聚蔗糖凝胶微球的制备方法”(专利申请号为200410093916.2,申请日为2004年12月13日)专利中公开的方法制备,也可以采用“一种制备多孔聚蔗糖微球的方法”(专利申请号为200610016148.X,申请日为2006年10月17日)专利中公开的方法制备。
本发明的一种制备苯基聚蔗糖微球的方法,按照下述步骤进行:
(1)以蔗糖或者聚蔗糖为原料,环氧氯丙烷为交联剂,利用反相悬浮聚合,制备聚蔗糖微球。
(2)将过滤后得到的聚蔗糖微球和环氧丙基苯基醚放入混合溶剂中,搅拌。
(3)向反应体系中加入催化剂。
(4)整个体系在50-80℃下反应3-24h,过滤可得苯基聚蔗糖微球。
所述混合溶剂由丙酮或者***之一和水按照(1∶3)~(1∶5)的体积比混合而成。
所述的催化剂为氢氧化钠的水溶液或者三氟化硼的***溶液,体积为3-15ml,可以采用直接方式加入或者滴加方式加入,滴加速度为0.1-0.5ml/s。
图1反应的是聚蔗糖微球和环氧丙基苯基醚反应的示意图,图2为聚蔗糖微球和苯基聚蔗糖微球的红外光谱图(A是聚蔗糖微球,B是苯基聚蔗糖微球)。从图2中可以看出苯基聚蔗糖微球与聚蔗糖微球相比,在3448cm-1处的羟基吸收峰强度减弱,在2874cm-1处的亚甲基吸收峰强度减弱,在3039cm-1处出现苯基中v(CH)的吸收峰,在1597cm-1处出现苯基中v(CC)的弱而尖锐的吸收峰,在1496cm-1处出现苯基中β(CH)的吸收峰,在690cm-1处出现苯基中γ(CH)的吸收峰,这说明作为疏水基团的苯基成功地接到聚蔗糖微球上面,符合图1所示的反应示意图。
利用紫外光谱法(Johansson B,Nystrom I.Three methods for quantitative determination of the ligand inphenyl-Sepharose CL-4B,Journal of Chromatography,1986,355:442-447.)对制备出的微球的苯基含量进行测定,测试结果显示,制备的苯基聚蔗糖中苯基含量为0.50mmol/g~3.20mmol/g。
通过静态蛋白吸附实验(Bo Xue,Yan Sun.Fabrication and characterization of a rigidmagnetic matrix for protein adsorption,Journal of Chromatography A,2002,947:185-193.),由图5的蛋白吸附数据显示:(1)pH4.5,NaCl 0.0mol/L情况下(■),饱和吸附量(mg/g)为66.14;(2)pH4.5,NaCl 0.1mol/L情况下(●),饱和吸附量(mg/g)为72.99;(3)pH4.5,NaCl 0.2mol/L情况下(▲),饱和吸附量(mg/g)为83.33,这说明本发明的苯基聚蔗糖微球与聚蔗糖微球相比(pH4.5,NaCl 0.2mol/L,饱和吸附量为42.64)可以在高盐浓度下实现较高的蛋白吸附量。
附图说明
图1聚蔗糖微球的苯基化反应示意图;
图2聚蔗糖微球和苯基聚蔗糖微球的红外光谱图,
图3苯基聚蔗糖微球的扫描电镜照片;
图4苯基聚蔗糖微球的光学显微镜照片;
图5苯基聚蔗糖微球的蛋白吸附等温线。
具体实施方式
本发明利用的聚蔗糖微球可以采用“聚蔗糖凝胶微球的制备方法”(中国专利,专利申请号为200410093916.2,申请日为2004年12月13日)专利中公开的方法制备,也可以采用“一种制备多孔聚蔗糖微球的方法”(中国专利,专利申请号为200610016148.X,申请日为2006年10月17日)专利中公开的方法制备,因此本领域技术人员可以通过上述的已有技术制备聚蔗糖微球。下面结合具体实施方式进一步说明本发明的制备苯基聚蔗糖微球方法中聚蔗糖微球和环氧丙基苯基醚反应的技术方案。
实施例1
将粒径为80μm的聚蔗糖微球5g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml丙酮和30ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂氢氧化钠的水溶液5ml,在50℃下反应24h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为1.85mmol/g。
实施例2
将粒径为100μm的聚蔗糖微球5g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml***和30ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂氢氧化钠的水溶液3ml,在50℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为1.20mmol/g。
实施例3
将粒径为180μm的聚蔗糖微球7g和环氧丙基苯基醚8ml放入10ml***和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂氢氧化钠的水溶液10ml,在80℃下反应3h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为0.5mmol/g。
实施例4
将粒径为250μm的聚蔗糖微球8g和环氧丙基苯基醚8ml放入10ml***和50ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂氢氧化钠的水溶液15ml,在70℃下反应10h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为0.85mmol/g。
实施例5
将粒径为280μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml丙酮和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂氢氧化钠的水溶液10ml,在60℃下反应15h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为0.98mmol/g。
实施例6
将粒径为350μm的聚蔗糖微球5g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml丙酮和50ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂氢氧化钠的水溶液3ml,在50℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.26mmol/g。
实施例7
将粒径为420μm的聚蔗糖微球5g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml***和30ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂三氟化硼的***溶液3ml,在50℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.29mmol/g。
实施例8
将粒径为450μm的聚蔗糖微球15g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml***和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂三氟化硼的***溶液10ml,在70℃下反应15h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为1.45mmol/g。
实施例9
将粒径为500μm的聚蔗糖微球15g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml丙酮和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂三氟化硼的***溶液15ml,在80℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.38mmol/g。
实施例10
将粒径为350μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml***和50ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中直接加入催化剂三氟化硼的***溶液8ml,在50℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.25mmol/g。
实施例11
将粒径为280μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml丙酮和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂氢氧化钠的水溶液3ml,滴加速度为0.1ml/s,在60℃下反应24h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.66mmol/g。
实施例12
将粒径为180μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚8ml放入10ml***和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂氢氧化钠的水溶液10ml,滴加速度为0.3ml/s,在80℃下反应3h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.20mmol/g。
实施例13
将粒径为80μm的聚蔗糖微球5g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml丙酮和30ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂氢氧化钠的水溶液15ml,滴加速度为0.5ml/s,在50℃下反应24h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为1.25mmol/g。
实施例14
将粒径为420μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml***和50ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂三氟化硼的***溶液3ml,滴加速度为0.1ml/s,在50℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为1.56mmol/g。
实施例15
将粒径为280μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml丙酮和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂三氟化硼的***溶液10ml,滴加速度为0.5ml/s,在60℃下反应15h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.80mmol/g。
实施例16
将粒径为450μm的聚蔗糖微球15g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml***和30ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂三氟化硼的***溶液15ml,滴加速度为0.3ml/s,在70℃下反应15h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为3.20mmol/g。
实施例17
将粒径为350μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml丙酮和50ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂三氟化硼的***溶液8ml,滴加速度为0.3ml/s,在60℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为3.05mmol/g。
实施例18
将粒径为420μm的聚蔗糖微球5g和环氧丙基苯基醚5ml放入10ml丙酮和40ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂氢氧化钠的水溶液3ml,滴加速度为0.3ml/s,在50℃下反应20h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为1.85mmol/g。
实施例19
将粒径为350μm的聚蔗糖微球15g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml丙酮和30ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂三氟化硼的***溶液15ml,滴加速度为0.5ml/s,在70℃下反应15h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.20mmol/g。
实施例20
将粒径为280μm的聚蔗糖微球10g和环氧丙基苯基醚10ml放入10ml***和50ml水的混合溶剂中,搅拌,向体系中滴加催化剂氢氧化钠的水溶液15ml,滴加速度为0.1ml/s,在65℃下反应15h,即可得苯基聚蔗糖微球,苯基含量为2.45mmol/g。
将上述制备的苯基聚蔗糖微球,利用紫外光谱法(Johansson B,Nystrom I.Three methodsfor quantitative determination of the ligand in phenyl-Sepharose CL-4B,Journal ofChromatography,1986,355:442-447.)对制备出的微球的苯基含量进行测定,测试结果显示,制备的苯基聚蔗糖中苯基含量为0.50mmol/g~3.20mmol/g,其中实施例4制备的苯基聚蔗糖微球的苯基含量高达2.8mmol/g,实施例16制备的苯基聚蔗糖微球的苯基含量高达3.2mmol/g。通过静态蛋白吸附实验(Bo Xue,Yan Sun.Fabrication and characterization of a rigid magneticmatrix for protein adsorption,Journal of Chromatography A,2002,947:185-193.),将实验结果通过最小二乘法拟核做出蛋白吸附的等温线(图5),蛋白吸附数据显示:(1)pH4.5,NaCl 0.0mol/L情况下(■),饱和吸附量(mg/g)为66.14;(2)pH4.5,NaCl 0.1mol/L情况下(●),饱和吸附量(mg/g)为72.99;(3)pH4.5,NaCl 0.2mol/L情况下(▲),饱和吸附量(mg/g)为83.33,这说明本发明的苯基聚蔗糖微球与聚蔗糖微球相比(pH4.5,NaCl 0.2mol/L,饱和吸附量为42.64)可以在高盐浓度下实现较高的蛋白吸附量。
Claims (5)
2.根据权利要求1所述的一种苯基聚蔗糖,其特征在于,所述的聚蔗糖微球粒径在80~500μm。
3.一种制备如权利要求1所述的一种苯基聚蔗糖微球的方法,其特征在于,按照下述步骤进行:
(1)以蔗糖或者聚蔗糖为原料,环氧氯丙烷为交联剂,利用反相悬浮聚合,制备聚蔗糖微球;
(2)将过滤后得到的聚蔗糖微球和环氧丙基苯基醚放入混合溶剂中,搅拌;
(3)向反应体系中加入催化剂;
(4)整个体系在50-80℃下反应3-24h,过滤可得苯基聚蔗糖微球。
4.根据权利要求3所述的一种制备如权利要求1所述的一种苯基聚蔗糖微球的方法,其特征在于,步骤(2)中所述混合溶剂由丙酮或者***之一和水按照(1∶3)~(1∶5)的体积比混合而成。
5.根据权利要求3所述的一种制备如权利要求1所述的一种苯基聚蔗糖微球的方法,其特征在于,步骤(3)中所述的催化剂为氢氧化钠的水溶液或者三氟化硼的***溶液,催化剂体积为3-15ml,加入方式为直接加入或者滴加,滴加速度为0.1-0.5ml/s。
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