CN101144097A - 一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，包括如下步骤：将虾蟹壳、昆虫皮壳或真菌菌丝体等常用原料，用干法或湿法进行微粉化处理；所得微粉体原料，甲壳类先用化学法脱钙后，再用微生物复合酶粗酶液共酶解的方法脱脂、脱蛋白，昆虫类和真菌类微粉体则直接脱脂、脱蛋白；制备甲壳素脱乙酰酶高产菌株的全细胞固定化生物反应器，对甲壳素进行循环脱乙酰反应，得到相应脱乙酰度的壳聚糖；用专性厌氧的产酸细菌和高产壳聚糖酶细菌，液体深层发酵壳聚糖，获得高度水溶性的壳寡糖。本发明有益效果：有助于充分利用资源，变废为宝，同时规避化学法生产工艺的缺陷，改进生产效率，节能降耗，保护环境，还可产生相应高附加值的副产品，明显提高相关加工产业的综合经济效益，推动产业发展，达到多赢的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及化工产品和新材料生产的新工艺，特别涉及一种从多种原料制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法。
背景技术
众所周知，甲壳素(几丁质，chitin)是地球上存在最广泛的天然有机化合物之一，数量上仅次于纤维素位居第二，每年的生物合成量将近100亿吨；甲壳素亦是地球上除蛋白质之外数量最大的含氮天然有机化合物；仅此两点，就足以说明甲壳素在自然界和人类生活中的重要地位。近数十年来的研究表明，甲壳素及其脱乙酰产物壳聚糖，以及两者的各种衍生物，作为新型的化工材料和有机产品，在人们的生产和生活中具有极其广泛的应用价值，涉及医药卫生、食品工业、轻纺工业、造纸、日用化学、功能材料、环境保护、能源工业、农业等诸多领域的各个方面，展现出非常美好的市场前景；由甲壳素和壳聚糖水解而得的寡糖(甲壳寡糖和壳寡糖)，更是显示出优良的生理活性、药理活性和作为新型化工材料的诸多特殊优点，成为目前深入开发甲壳素产品的热点；而且，甲壳素产品以其对人体和环境有益无害的“绿色健康”和“环境友好”特点，非常符合时代潮流，因而倍受人们青睐，对甲壳素及其延伸产品的不断开发以及相关生产技术的深入探讨，正方兴未艾。
尽管甲壳素被公认为一种价值非凡的优良天然有机物原料，但作为各种动物、微生物和某些植物的组织结构成分，从其原始材料中提取出来并不容易。近数十年来，在实际生产水平上提取甲壳素/壳聚糖以及制备其衍生物的主流工艺是化学法，目前发现其存在如下一系列弊端：1)制取过程中过多使用强酸、强碱和有害化学试剂，产生大量废水和废料，严重污染环境特别是水体环境；2)高频度、长时间的高温处理过程产生巨大的能源消耗；3)制取过程需要耐腐蚀、耐高温设备，增加生产成本；4)化学催化剂的非特异性催化作用，使不同化学结构成分不能清晰有效地解离和/或合成，影响了目标产品的得率和纯度；5)强酸、强碱和其它萃取溶剂的剧烈化学反应条件，明显制约了目标化学成分的稳定性和质量控制；6)工艺过程中频繁的洗涤净化程序和稀酸、稀碱的回收处理难度，导致大量宝贵的清洁淡水被消耗浪费；7)强酸、强碱及其它萃取溶剂的腐蚀性和易爆性等化学特点，对工作环境和人体健康构成了安全威胁。鉴于上述情况，为保证甲壳素产业能够做大做强，真正做到可持续发展，就必须对现有生产技术进行重大改进，有效克服上述弊端，开发出可以明显提高目标成分得率、高效综合利用原料资源、反应条件温和、节约能源和设备成本、大幅度减少化学品使用从而减少废水废渣、有利于环境保护、安全生产以及降低对人体健康威胁的甲壳素/壳聚糖及壳寡糖的新型提取和制备工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以生物法为主的生产工艺路线，用于从当前常用的原料中提取甲壳素并进一步制取壳聚糖和壳寡糖的方法，旨在克服传统的化学法工艺的上述缺点，能够在明显提高目标成分的提取效率和产品质量的前提下，大幅减少酸、碱、氧化剂和其它有害化学品的使用量以及废液、废渣的排放，消除其对环境的污染和人体健康的威胁，降低能耗和设备成本，并能够同时生产出附加值高的副产品，综合利用资源，提高生产效益，从而提供一种增效节耗、环境友好、资源节约的绿色提取和制备工艺，达到有效、可持续地促进甲壳素产业发展的目的。
本发明还涉及将提取的甲壳素/壳聚糖用生物学和/或化学的方法进一步制备成壳寡糖和/或甲壳寡糖。
实现本发明目的的具体技术方案如下：
一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，制备过程包括如下步骤：将虾蟹壳、昆虫皮壳或真菌菌丝体等常用原料用物理方法(干法或湿法)进行微粉化处理；所得甲壳类微粉体原料先用化学法脱钙后，再用来自微生物的蛋白酶、脂肪酶粗酶液复配后共酶解的方法脱脂、脱蛋白，昆虫类和真菌类微粉体则直接用上述粗酶液复配后脱脂、脱蛋白；必要时，脱脂、脱蛋白后的物料用氧化剂结合微生物酶酶解的方法进行脱色；制备甲壳素脱乙酰酶高产菌株的全细胞固定化生物反应器，对所获甲壳素进行循环脱乙酰反应，得到相应脱乙酰度的壳聚糖；用专性厌氧的产酸细菌和高产壳聚糖酶细菌，液体深层发酵壳聚糖，获得高度水溶性的壳寡糖；必要时，用化学法或酶法将壳寡糖乙酰化，得甲壳寡糖。
所述原料的微粉化处理，包括干法处理和湿法处理：干法处理是指将虾蟹壳、昆虫皮壳或真菌菌丝体等原料充分干燥(含水量<10％)后，机械研磨至平均粒度为50-100μm的微粉体；湿法处理是指为获得更细粒度的微粉体，将上述原料先行粉碎成平均粒度150-200μm的颗粒，配成混悬液，再机械研磨或气流粉碎成为平均粒度为10-25μm的微粉体。
所述从原料中脱除钙盐、脂肪和蛋白质是指对于甲壳类原料的微粉体先用4-6％的稀盐酸脱去钙质，将沉淀洗至中性后，再用富含脂肪酶和蛋白酶的复合粗酶液进行共酶解反应，脱除脂肪和蛋白质；对于昆虫类和真菌类微粉体，则直接用微生物复合酶粗酶液共酶解，进行脱脂、脱蛋白。
所述微生物复合酶粗酶液，是指用自行分离的出发菌株，诱导驯化而得的高产脂肪酶活的产朊假丝酵母菌株(保藏号CCTCC N0.M207053)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名为产朊假丝酵母ODK-CC1(Candida utilis ODK-CC1)；以及高产蛋白酶活的枯草芽孢杆菌菌株(保藏号CCTCC NO.M207028)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名枯草芽孢杆菌ODK-BK1(Bacillus subtilisODK-BK1)；分别经好氧液体深层发酵后，去除菌体所得的胞外酶粗酶液混配而成。
所述共酶解脱脂、脱蛋白反应，是指先将原料的微粉体用65℃温水浸泡30min，抑制原料中的杂菌及无关酶活；然后，将上述脂肪酶和蛋白酶粗酶液以1∶1容积混配，在反应釜内与处理过的原料微粉体按液：固＝5∶1的配比量混合，在40℃恒温下于反应釜内充分搅拌混合，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18小时，反应终止后以2500r/min离心进行固、液分离，收集沉淀。
所述脱色处理工艺，是指对含有色泽的原料，采用两步法进行脱色，即先将共酶解反应完成后沉淀的固体物料，加入稀碱中浸泡、煎煮2h，更换碱液后重复3次，过滤收集滤渣，洗涤3遍后，先用5％H2O2煮沸1小时，快速脱色，再用富含H2O2氧化-还原酶系的另一组微生物粗酶液进行酶解反应，脱除原料中难解离色素并陆续将H2O2转化为无毒无害的CO2和H2O。反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心固、液分离，将沉淀洗涤、干燥后得白色粉末状甲壳素。
所述富含H2O2氧化-还原酶系粗酶液，是指将自行分离驯化的高产H2O2及其氧化-还原酶系的采绒革盖菌(又名云芝)(保藏号CCTCC N0.M207024)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名云芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)，经好氧液体深层发酵后，去除菌体得到的胞外酶粗酶液。
所述脱乙酰反应，是指先将自行分离驯化的高产脱乙酰酶的米根霉菌株(保藏号CCTCC NO.M207054)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名米根霉ODK-RM1(Rhizopus oryzae ODK-RM1)，制备成为全细胞固定化生物反应器，再将前述所得甲壳素用40℃温水悬浮、充分混匀后，循环流加于该生物反应器中，通过脱乙酰酶的水解作用进行脱乙酰基反应；根据产品和用途对脱乙酰度的要求，动态监测反应产物的DD值，直至达到所要求的DD值标准，终止反应， 收集反应产物，按1/3容积浓缩后，真空或冷冻干燥，得壳聚糖。
所述全细胞固定化生物反应器的制备，包括两个程序：1)细胞固定化：将定量的2％海藻酸钠溶液与米根霉冻干粉按液：固＝4∶1的比例充分混合，所得混悬液在室温下以10ml/min的速度，通过针泵滴入0.2mol/L的CaCl2中，使形成直径5.0-5.5mm的小珠；全部混悬液滴注完毕后，将形成的小珠装入生物反应器装置中；2)上流式生物反应器制作：制作圆柱状不锈钢反应器主体罐，内径50.8cm，高度584cm，工作容积10L，主体罐按上流式反应原理设计，辅以底物流入、产物流出、微生物培养成分流加和惰性气体加压等功能通道，与相应供应渠道连接配套。
所述壳寡糖的制备工艺，是指应用自行分离驯化的高产乙酸的双歧杆菌菌株(保藏号CCTCC NO.M207027)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为长双歧杆菌ODK-BS1(Bifidobacterium longum ODK-BS1)；和高产壳聚糖酶的乳杆菌菌株(保藏号CCTCC NO.M207026)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为植物乳杆菌ODK-LR1(Lactobacillus plantarum ODK-LR1)，在厌氧条件下，混合液体深层共发酵前述所得的壳聚糖，监测控制双歧杆菌菌体生物量在1.0×108cfu/ml及发酵液乙酸浓度在15-20mol/L的范围；发酵后期流加有利于乳杆菌生长的微量氮源和无机盐并调整pH，直至乳杆菌菌体生物量达到>1.0×1010cfu/ml后，终止发酵，发酵液去除菌体、杂质后直接浓缩，真空或冷冻干燥，得80％以上相对分子量<8000的壳寡糖。
所述通过乙酰化壳寡糖获得甲壳寡糖的方法，是指将上述所得壳寡糖，在0℃下浸泡于由乙酸酐和高氯酸组成的混合溶液中并适当搅拌，乙酰化反应24h以上，待乙酰度达1.0以上时终止反应，用冰水洗涤至中性，再用乙醇进行脱水，真空干燥得甲壳寡糖。
本发明的方法适用于从目前有代表性的常用原料中提取甲壳素和制备壳聚糖、壳寡糖，如节肢动物门中甲壳纲动物虾和蟹的甲壳，昆虫纲动物蚕蛹、蝇蛆、蜚蠊的皮壳；软体动物门中腹足纲动物鲍鱼和蜗牛的甲壳，瓣鳃纲动物蚶和牡蛎的甲壳；微生物中真菌(子囊菌、担子菌、藻菌等)的细胞壁；某些植物(如蘑菇)的细胞壁；等等。经初步验证，增加适当的前处理步骤，本发明的方法也适用于从当前未普遍使用的原料中提取甲壳素和制备壳聚糖、壳寡糖，如昆虫纲的蝗虫、多足纲的蜈蚣、头足纲的乌贼、毛足纲的沙蚕、蛭纲的蚂蟥、珊瑚纲的珊瑚虫、微藻中的硅藻以及哺乳动物的关节、蹄、足部分，等等。
本发明的有益效果：
1.目前用于提取甲壳素的常用原料，基本上是某些产品加工过程中的固体废弃物，如虾、蟹加工后的甲壳，蚕蛹、蝇蛆提取蛋白、油脂时留下的皮壳，真菌发酵目标产物后遗留的菌丝体残渣，动物屠宰剩下的蹄、足、关节等。这些废弃物的丢弃，不仅造成了宝贵资源的浪费，而且占据宝贵空间，带来严重的环境污染，影响生产和人体健康。本发明技术方法对甲壳素提取原料的普遍适用性，有助于充分利用资源，变废为宝，同时改善生产条件、治理环境，还可以明显提高相关加工产业的综合经济效益，推动产业发展，达到多赢的效果。
2.本发明的目的在于针对目前提取甲壳素及其产品制备的主流工艺路线—化学法工艺所存在的各种弊端，进行一系列的技术改进，充分综合应用环境友好的生物技术手段，特别是微生物相关的发酵工程和酶工程技术手段，结合部分物理和化学方法，设计并实施一套以生物法为主的生产工艺路线，用于从目前常用的原料中提取甲壳素，并进一步制备壳聚糖和壳寡糖。本发明新工艺的实施，能够克服传统的化学法工艺中存在的多种缺点，主要表现在：能够在明显提高目标成分的提取效率和产品质量的前提下，大幅减少酸、碱、氧化剂和其它有害化学品的使用量，从而减少废液、废渣排放，消除其对环境的污染和人体健康的威胁；工艺流程反应平缓，条件温和，大部分工作单元在常温、中温下进行，反应过程没有腐蚀性和成垢性，中间产物不需要大量淡水洗涤处理，得以节省大量能耗成本和设备成本以及宝贵的水资源，降低了生产成本；核心工艺是以微生物酶为主导的的生物催化反应，特异性强，选择性高，能够有效解离原料中的蛋白、脂肪、色素等无关成分，明显提高甲壳素的得率、纯度和质量稳定性；采用的全细胞固定化生物反应器循环酶解反应脱乙酰新工艺，不仅过程简单、没有污染，而且可以准确把握脱乙酰度，按产品和用途的需要生产出不同DD值的壳聚糖，有益于产品的质量控制以及种类和用途的多元化；采用的高产乙酸双歧杆菌和高产壳聚糖酶乳杆菌混合发酵壳聚糖新工艺，综合酸水解和酶水解的优点，大大提高了壳聚糖水解为壳寡糖的效率和可控性，是用生物技术获得具有高生理活性的壳寡糖的全新方法，为壳寡糖的开发技术增添了新的亮点。总之，本发明提供了一种增效节耗、环境友好、资源节约的甲壳素/壳聚糖和壳寡糖绿色提取和制备工艺，为进一步、可持续地促进甲壳素产业发展提供了新的动力。
3.本发明另一个突出的有益效果，是能够充分进行资源综合开发利用，得到一系列附加值高的副产品，提高综合经济效益。体现在：1)甲壳类原料的微粉化前处理，有助于后续用化学法获得产量更大、纯度更高的食品级碳酸钙；2)微生物复合酶共酶解工艺，通过脂肪酶和蛋白酶的充分解离，可得到纯度高、易提取得脂类成分和蛋白质成分，用以制得一系列脂类、蛋白类和氨基酸类产品；3)发酵法制备粗酶液时，可获得各种高生物量的有益微生物菌体，如云芝、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、双歧杆菌和乳杆菌，均为极度安全的可食用微生物，可直接用作食用或饲用微生物菌剂或微生态制剂，也可制成相关产品。
附图说明
图1表示全细胞固定化生物反应器的脱乙酰反应循环次数对产物脱乙酰度的影响；
图2表示全细胞固定化生物反应器的脱乙酰反应循环次数对产物黏度的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚明白，结合以下实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
确定甲壳类原料的脱钙工艺：
制备过程：虾、蟹壳洗净、除杂、干燥、称重后，机械粉碎至平均粒度为150-200μm的微粉体；将粉碎后物料装入透液耐酸容器中，浸入4-6％的HCI反复浸泡，即每隔2h提出物料，沥酸液15分钟，重新浸泡；待反应过程产生的气泡(二氧化碳)停止冒出，继续浸泡2h后终止脱钙，过滤截留未溶物料用于提取甲壳素；将富含氯化钙的滤液，在反应釜中加温至45℃，通入CO2不断搅拌，反应至滤液基本透明(约4h)；过滤收集沉淀出的碳酸钙，水洗、干燥，得洁白、细腻、颗粒均匀的碳酸钙粉末，得率约30-32％。
确定发酵产朊假丝酵母制取脂肪酶粗酶液工艺：
产朊假丝酵母出发菌株分离自酿酒酒糟，由本发明人反复诱导驯化，成高产脂肪酶活菌株，保藏编号CCTCC NO.M207053，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名为产朊假丝酵母ODK-CC1(Candida utilis ODK-CC1)。
粗酶液制备过程：产朊假丝酵母接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)5天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，25℃，100r/min恒温振荡培养3天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L的PDA液体培养基的10L不锈钢气升式发酵罐中，25℃，100r/min好氧深层液体培养约5天，测得脂肪酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏，待用于本工艺的共酶解步骤。
确定发酵枯草杆菌制取蛋白酶粗酶液工艺：
枯草杆菌出发菌株分离自日本产有机小粒纳豆，由本发明人反复诱导驯化，成为高产蛋白酶活菌株，保藏编号CCTCC N0.M207028，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名枯草芽孢杆菌ODK-BK1(Bacillus subtilis ODK-BK1)。
粗酶液制备过程：枯草杆菌菌株接种于普通固体培养基恢复培养(复壮)2天，转种于装有300ml的去琼脂液体培养基的500ml三角烧瓶中，25℃，100r/min恒温振荡培养3天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体培养基的10L不锈钢气升式发酵罐中，25℃，100r/min好氧深层液体培养约3天，测得脂肪酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏，待用于本工艺的共酶解步骤。
确定发酵采绒革盖菌制取过氧化氢合成酶-还原酶粗酶液工艺：
采绒革盖菌(云芝)出发菌株购自广东省微生物研究所菌种保藏中心(菌株编号：GIM5.178)，由本发明人反复诱导驯化，成为H2O2氧化-还原酶系高产菌株，保藏编号CCTCC NO.M207024，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名云芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)。
粗酶液制备过程：云芝菌株接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)7天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，28℃，150r/min恒温振荡培养5天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的不锈钢气升式发酵罐中，30℃，100r/min好氧深层液体培养约7天，测多酚过氧化物酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏，待用于本工艺路线中的脱色步骤。
确定高产乙酸双歧杆菌株制取工艺：
长双歧杆菌分离自健康人新鲜粪便，由本发明人反复诱导驯化，成为乙酸高产菌株，保藏编号CCTCC NO.M207027，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为长双歧杆菌ODK-BS1(Bifidobacterium longum ODK-BS1)。
生产菌株制备过程：纯培养主种子菌株在厌氧手套箱内，经倍比稀释后接种于选择性TPY培养基，混合气体厌氧培养48h，平板满布典型菌落后终止培养；计数后于净化台上将菌落刮入20％脱脂奶粉+2％海藻酸钠混悬液中，混匀后装入菌种管，每支3ml，冷冻干燥，抽真空后封口保存，作为生产菌株备用。留样进行生产特性和API20A表型鉴定。
确定高产壳聚糖酶乳杆菌株制取工艺：
嗜酸乳杆菌分离自健康人新鲜粪便，由本发明人反复诱导驯化，成为壳聚糖酶高产菌株，保藏编号CCTCC N0.M207026，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为植物乳杆菌ODK-LR1(Lactobacillus plantarum ODK-LR1)。
生产菌株制备过程：纯培养主种子菌株在厌氧手套箱内，经倍比稀释后接种于选择性MRS培养基平板，混合气体厌氧培养48h，平板满布典型菌落后终止培养；计数后于净化台上将菌落刮入20％脱脂奶粉+2％海藻酸钠混悬液中，混匀装入菌种管，每支3ml，冷冻干燥，抽真空后封口保存，作为生产菌株备用。留样进行生产特性和API20A表型鉴定。
确定米根霉发酵、固定化反应器制备及甲壳素脱乙酰反应工艺：
确定米根霉发酵产酶工艺条件：白色米根霉出发菌株购自广东省微生物研究所菌种保藏中心(菌株编号：3038)，由本发明人反复诱导驯化，成为甲壳素脱乙酰酶高产菌株，保藏编号CCTCC NO.M207054，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名为米根霉ODK-RM1(Rhizopus oryzae ODK-RM1)，。
米根霉细胞增殖过程：白色米根霉接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)7天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，25℃，120r/min恒温振荡培养5天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的不锈钢气升式发酵罐中，28℃，100r/min好氧深层液体培养约5天，测甲壳素脱乙酰酶酶活达定值时，终止发酵，用管式菌体离心机收集菌体，加保护剂后冻干制成菌粉。
制备米根霉全细胞固定化生物反应器：
全细胞固定化：将2％海藻酸钠溶液与上述干菌粉按液：固＝5∶1的比例充分混合，得混悬液约3L，室温下以10ml/min的速度，通过针泵滴入0.2mol/L的CaCL2中，形成直径约5.0-5.5mm的小珠，全部混悬液滴注完毕后，将形成的小珠装入反应器装置。
上流式生物反应器制作：制作圆柱状不锈钢上流式反应器主体，内径50.8cm，高度584cm，工作容积10L；辅以底物流入、产物流出、菌培养基流加及惰性气体加压等功能通道。
脱乙酰反应及效果评定： 本发明工艺路线所得甲壳素，用40℃温水悬浮、充分混匀后，从底物入口缓慢流加于米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，产物出口收集反应液后，由闭路通道循环回流到反应器，每一循环周期约60min。转化反应期间如反应液黏度偏大，用惰性气体加压洗脱产物。反应终止的时间点依对产物脱乙酰度的要求以及反应器酶活强度而定。反应循环次数对脱乙酰度的影响见下表：
固定化细胞脱乙酰反应循环次数对产物脱乙酰度的影响
| 循环次数 | 脱乙酰度(％) | 黏度(mPa.s) | 溶解性 |
| 123456 | 42.2156.7468.4576.3285.7592.38 | 220380320230 | 少量溶少量溶少量不溶少量不溶全溶全溶 |
实施例1：蟹壳甲壳素的制备
a.取河蟹壳10kg，洗净、除杂、干燥后，浸入4-6％的HCI反复浸泡脱钙，即每隔2h提出物料，沥酸液15分钟后，重新浸泡；待反应过程中停止冒出气泡(二氧化碳)，再继续浸泡2h后终止脱钙。
b.过滤分离脱钙蟹壳和含钙酸液(滤液另行处理)，脱钙壳料清水洗涤至中性，充分烘干，用销棒式粉碎机粉碎至平均粒度为60-100μm的微粉体。
c.将微粉体沸水煮15min后，沥干，再以固：液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水，混悬后于反应釜内，按1∶1的配比量与脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液缓慢混合，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18h，将大部分脂肪、蛋白质溶解于反应液中，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离，溶于反应液中的蛋白和脂肪产物另法提取。
d.收集酶解反应后的固体物料，水洗3遍后，先用5％H2O2煮沸1h，快速脱色，再用富含H2O2氧化-还原酶系的采绒革盖菌去菌体粗酶液进行酶反应，脱除原料中难解离的色素，并陆续将H2O2转化为无毒无害的CO2和H2O，反应温度38℃，反应时间18h，反应毕离心(2500r/min)，将沉淀洗涤、干燥，得白色粉末状蟹壳甲壳素。
实施例2：蝇蛆壳壳聚糖的制备
a.预处理：收集新鲜蝇蛆30kg，清洗除杂、充分沥水后机械破皮处理，用压榨机挤出内容物(另行处理)，收集所余皮壳，烘干至水分<10％，0℃以下预冻6h，板结后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的微粉体。
b.所获微粉体沸水煮15min后，沥干，再以固：液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水，混悬后于反应釜内，按1∶1的配比量与脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液缓慢混合，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18h，将大部分脂肪、蛋白质溶解于反应液中，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离，溶于反应液中的蛋白和脂肪产物另法提取。
c.收集酶解反应后的固体物料，40℃温水洗3遍，沥干，先用5％H2O2煮沸1h，快速脱色，再用富含H2O2氧化-还原酶系的采绒革盖菌去菌体粗酶液进行酶法脱色，反应温度38℃，反应时间18h，反应毕进行离心(2500r/min)，将沉淀洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。
d.将洗涤后的沉淀物按固：液＝1∶4的配比量、或已干燥的甲壳素按固：液＝1∶8的配比量，与40℃温水混合为悬浮液，充分混匀后，按规定量循环流加于上流式米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，用电位滴定法动态检测反应产物的DD值(脱乙酰度)，直至反应液样本的DD值>85％、黏度低于100×10-3Pa·s时，终止反应。
f.洗脱、收集反应产物，按1/3容积减压浓缩后真空或冷冻干燥，得高脱乙酰度、低黏度壳聚糖。
实施例3：黑曲霉菌丝体壳寡糖的制备
a.预处理：食品添加剂厂收集的柠檬酸废渣(主要含黑曲霉菌丝体)50kg，清水沥湿至湿度达70％，用胶体磨进行研碎至物料平均粒度为20-60μm的菌丝微粉体。
b.菌丝微粉体先用65℃热水浸泡30min，倾掉，再以固：液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水，于反应釜内与同菌丝悬液等量容积的脂肪酶和蛋白酶粗酶液(脂肪酶：蛋白酶＝1∶6)混合，间歇搅拌混匀，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18h，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离。
c.收集固形物，40℃温水洗3遍，沥干，先用5％H2O2煮沸1h，快速脱色，再用富含H2O2氧化-还原酶系的采绒革盖菌去菌体粗酶液进行酶法脱色，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心(2500r/min)，沉淀物洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。
d.将所获甲壳素按固：液＝1∶8的配比量，用40℃温水重新悬浮，混匀后定量循环流加于上流式米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，电位滴定法动态检测反应产物的DD值(脱乙酰度)，直至反应液样本的DD值>70％，终止反应。
f.收集反应液，定容定浓度后作为碳源及发酵底物，添加1％多价蛋白胨为氮源和少量无机盐，按2％接种量接种本发明人诱导驯化、能够以壳聚糖为营养物质的双歧杆菌和乳杆菌，厌氧深层液体混合发酵，直至菌体生物量至少达到>1.0×109cfu/ml后，终止发酵，用特制菌体分离机去除菌体，发酵液直接浓缩，真空或冷冻干燥，得固体半透明粉末状、其中80％相对分子量<8000的壳寡糖。
实施例4：蟹壳食品级碳酸钙的制备
a.河蟹壳10kg，洗净、除杂、干燥后，机械粉碎至平均粒度为150-200μm的微粉体。
b.将上述微粉体装入耐酸的透液容器中，浸入4-6％的HCI反复浸泡，即每隔2h提起浸酸物料，沥酸液15分钟，重新浸泡；待反应过程产生的气泡(二氧化碳)停止冒出后，再继续浸泡2h后终止脱钙，过滤截留未溶解的固体物料用于提取甲壳素。
c.收集富含氯化钙的滤液，在反应釜中加温至45℃，通入CO2不断搅拌，反应至滤液基本透明(约4h)后，终止通气和搅拌。
d.过滤收集沉淀出的碳酸钙，水洗、干燥，得洁白、细腻、颗粒均匀的碳酸钙粉末，得率约为蟹壳干重的30-32％。
实施例5：蚕蛹蛋白的提取
a.预处理：新鲜蚕蛹20kg清洗除杂，压榨法挤出内容物待用，皮壳烘干至水分<10％，0℃以下预冻后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的微粉体。
b.微粉体先用65℃热水浸泡30min，倾掉，再以固：液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水，40℃恒温下于反应釜内与等量容积的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液进行共酶解脱脂脱蛋白反应，时间18h，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离。
c.固体用于甲壳素提取。收集富含脂质蛋白质的分离液体，减压浓缩至1/4原容积，与先前挤压出的内容物混合，继续浓缩至膏状。
d.将蛹膏用3倍量的石油醚浸没，60℃浸取4次，每次1h，浸毕离心(3500r/min，20min)固、液分离。
e.分离后的液态混合油用于蛹油提取。将沉淀的灰色固体脱脂蛹粕，加蒸馏水搅拌成匀浆，用0.25％NaOH溶解蛋白质，过滤去除固形物，滤液用HCL调pH至4.5，静置3h，加入饱和硫酸铵溶液，静置、离心，沉淀物即为蛋白质，将此浆状蛋白沉淀装入透析袋，透析除盐后用活性炭脱色，95％乙醇抽提，真空干燥，得精制蚕蛹蛋白粉。
实施例6：蘑菇柄纤维素、木质素的提取
a.收集加工蘑菇后所余蘑菇柄30kg，洗净、除杂、烘干、切片，机械粉碎至平均粒度100-150μm，再气流粉碎至平均粒度为10-25μm的微粉体。
b.上述微粉体用40℃净水按固：液＝1∶4混悬后，于反应釜内与等容积预制的木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应，反应温度40℃，反应时间24h。
c.反应完毕，立即冷冻干燥，干燥后微粉体加入足量2.0％NaOH脱除蛋白，加热95℃，2h，冷至室温后4000r/min离心15min，倾去含蛋白上清，沉淀水洗至中性。
d.沉淀按固：液＝1∶8的配比量，用40℃温水重新悬浮，循环流加于上流式米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，电位滴定法动态检测反应产物的DD值(脱乙酰度)>70％，终止反应，收集反应液固、液分离，4000r/min离心15min，上清为壳聚糖溶液，沉淀为木质素和纤维素。
e.将沉淀用80％乙醇按固：液＝1∶10的比例充分浸提后，2500r/min低速离心，收集上清，乙醇回流浸提，共3次，每次30min，合并浸提液，抽滤、蒸馏回收乙醇；将浓缩液pH调至4.0，充分沉淀后彻底干燥，得木质素产品，其中木质素含量不低于90％。
f.收集2500r/min离心后的沉淀，乙醇回流浸提，共3次，每次30min，收集不溶性沉淀物，用18％氢氧化钠溶液按固：液＝1∶20比例混合，加热至120℃，搅拌45min，水洗3次后充分干燥，得纤维素产品，其中纤维素含量不低于90％。
Claims (8)
1.一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将虾蟹壳、昆虫皮壳或真菌菌丝体用干法或湿法进行微粉化处理制得微粉体原料，其中所述干法处理是指将虾蟹壳、昆虫皮壳或真菌菌丝体充分干燥至含水量＜10％后，机械研磨至平均粒度为50-100μm的微粉体；所述湿法处理是指将所述原料先行粉碎成150-200μm的颗粒，配成混悬液，再机械研磨或气流粉碎成为平均粒度为10-25μm的微粉体；
对于甲壳类微粉体，先用4-6％的稀盐酸脱去钙质，将沉淀洗至中性后，再用富含脂肪酶和蛋白酶的粗酶液进行共酶解反应，脱除脂肪和蛋白质，制得甲壳素；对于昆虫类和真菌类微粉体，则直接用微生物复合酶粗酶液共酶解，进行脱脂、脱蛋白，制得甲壳素。
2.根据权利要求1所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：所述微生物复合酶粗酶液是指用自行分离的出发菌株，诱导驯化而得的高产脂肪酶活的产朊假丝酵母菌株，其保藏号CCTCC NO.M207053，和高产蛋白酶活的枯草芽孢杆菌株，其保藏号CCTCC NO.M207028，分别经好氧液体深层发酵后，去除菌体所得的胞外酶粗酶液混配而成；所述共酶解脱脂、脱蛋白反应是先将原料微粉体用65℃温水浸泡30min，抑制原料中的杂菌及无关酶活；将上述脂肪酶和蛋白酶粗酶液以1∶1容积混配后，在反应釜内与原料微粉体按液∶固＝5∶1的配比量混合，在40℃恒温下于反应釜内充分搅拌混合，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18小时，反应终止后以2500r/min离心进行固、液分离，收集沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：所述脱脂、脱蛋白后制得的甲壳素用氧化剂结合微生物酶酶解的方法进一步脱色，所述脱色处理采用两步法脱色，即先将酶解反应后沉淀的固体物料，加入稀碱中浸泡、煎煮2h，更换碱液后重复3次，过滤收集滤渣，洗涤3遍后，用5％H2O2煮沸1小时，快速脱色，再用富含H2O2氧化-还原酶系粗酶液进行酶解反应，脱除原料中难解离色素并陆续将H2O2转化为无毒无害的CO2和H2O，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心固、液分离，将沉淀洗涤、干燥后得白色粉末状甲壳素。
4.根据权利要求3所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：所述H2O2氧化-还原酶系粗酶液是将自行分离驯化的高产H2O2及其氧化-还原酶系的采绒革盖菌，其保藏号CCTCC NO.M207024，经好氧液体深层发酵后，去除菌体得到的胞外酶粗酶液。
5.根据权利要求1或2所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：制备甲壳素脱乙酰酶高产菌株的全细胞固定化生物反应器，对甲壳素进行循环脱乙酰反应，所述脱乙酰反应是先将自行分离驯化的高产脱乙酰酶的米根霉菌株，其保藏号CCTCC NO.M207054，制备成为全细胞固定化生物反应器，再将前述所得甲壳素用40℃温水悬浮、充分混匀后，循环流加于该反应器中，通过脱乙酰酶的水解作用进行脱乙酰基反应；根据产品和用途对脱乙酰度的要求，动态监测反应产物的DD值，直至达到所要求的DD值标准，终止反应，收集反应产物，按1/3容积浓缩后，真空或冷冻干燥，得壳聚糖。
6.根据权利要求5所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：所述全细胞固定化生物反应器的制备包括：1)细胞固定化：将定量的2％海藻酸钠溶液与米根霉冻干粉按液∶固＝4∶1的比例充分混合，所得混悬液在室温下以10ml/min的速度，通过针泵滴入0.2mol/L的CaCl2中，使形成直径5.0-5.5mm的小珠，全部混悬液滴注完毕后，将形成的小珠装入生物反应器装置中；2)制作圆柱状不锈钢反应器主体罐，内径50.8cm，高度584cm，工作容积10L，主体罐按上流式反应原理设计，辅以底物流入、产物流出、微生物培养成分流加和惰性气体加压功能通道。
7.根据权利要求5所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：应用自行分离驯化的高产乙酸的双歧杆菌株，其保藏号CCTCCNO.M207027，和高产壳聚糖酶的乳杆菌株，其保藏号CCTCC NO.M207026，在厌氧条件下混合液体深层发酵壳聚糖，控制双歧杆菌菌体生物量在1.0×108cfu/ml及发酵液乙酸浓度在15-20mol/L的范围；发酵后期流加有利于乳杆菌生长的微量氮源和无机盐并调整pH，直至乳杆菌菌体生物量达到＞1.0×1010cfu/ml后，终止发酵，发酵液去除菌体后直接浓缩，真空或冷冻干燥，得80％以上相对分子量＜8000的壳寡糖。
8.根据权利要求7所述的制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法，其特征在于：将上述所得壳寡糖在0℃下浸泡于由乙酸酐和高氯酸组成的混合溶液中并适当搅拌，乙酰化反应24h以上，待乙酰度达1.0以上时终止反应，用冰水洗涤至中性，再用乙醇进行脱水，真空干燥得甲壳寡糖。
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