CN101142231A

CN101142231A - 在丝状真菌中重组表达防卫素

Info

Publication number: CN101142231A
Application number: CNA2006800085200A
Authority: CN
Inventors: 汉斯-亨里克·K·霍根豪格; 柯克·M·施努尔; 莫根斯·T·汉森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2005-03-16
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2008-03-12
Also published as: MX2007011158A; EP1861421B1; IL185443A0; BRPI0608518A2; KR20070121676A; NZ561009A; TW200700431A; ATE529439T1; RU2404990C2; NO20075277L; AU2006224628B2; JP2012110347A; ZA200708406B; AP2007004141A0; CA2600026A1; ES2375150T3; AR052703A1; RU2007138215A; JP2008532533A; WO2006097464A1

Abstract

本发明涉及在丝状真菌的发酵中防卫素抗微生物肽的重组表达。

Description

在丝状真菌中重组表达防卫素

技术领域

本发明涉及在丝状真菌中防卫素抗微生物肽的重组表达。

背景技术

防卫素属于一类小的抗微生物肽。它们能够杀死广谱的微生物，其中某些微生物正变得对于传统抗生素具有不断增加的抗性。由于这种原因，对于能够以低成本大量产生防卫素变得越来越有兴趣。

因为防卫素通常仅包含30-50个氨基酸残基，所以它们通常难以通过使用重组发酵的方法而有效产生。化学肽合成是可替换的方法，但当肽超过25-30个氨基酸残基时，这种方法太过昂贵。另一个复杂之处在于防卫素包含特殊的半胱胺酸模式(cysteine pattern)，其难以通过化学合成而产生。

因此，本发明的目的是提供在丝状真菌的重组发酵中，用于获得防卫素抗微生物肽改进的表达水平的方法。

发明概述

本发明的发明人已发现，通过将一个或多个内含子序列***到指导防卫素表达的核酸构建体中，与使用无内含子序列的核酸构建体的情况相比，重组表达水平可改进超过50％。可将内含子序列***至核酸构建体中的任何位置，例如在成熟的防卫素编码序列中，或甚至在信号肽编码序列中。

因此，本发明涉及重组的丝状真菌宿主细胞，其包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码防卫素的外源核酸序列和一个或多个内含子序列。

在第二方面，本发明涉及在丝状真菌宿主细胞中重组产生防卫素的方法，其包括培养包含核酸构建体的丝状真菌宿主细胞，所述核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列和一个或多个内含子序列；和回收防卫素肽。

在第三方面，本发明涉及核酸构建体用于在丝状真菌宿主细胞中改进防卫素重组表达水平的用途，所述核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列和一个或多个内含子序列。

定义

抗微生物活性：术语“抗微生物活性”在此定义为能够杀死或抑制微生物细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗微生物”的意思指存在杀细菌的(bactericidal)和/或抑细菌的(bacteriostatic)和/或杀真菌的(fungicidal)和/或抑真菌的(fungistatic)作用和/或杀病毒的作用，其中应将术语“杀细菌的”理解为能够杀死细菌细胞。应将术语“抑细菌的”理解为能够抑制细菌生长，即，抑制生长的细菌细胞。应将术语“杀真菌的”理解为能够杀死真菌细胞。应将术语“抑真菌的”理解为能够抑制真菌生长，即，抑制生长的真菌细胞。应将术语“杀病毒的”理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”代表细菌或真菌细胞(包括酵母)。

在本发明的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”的意思指细胞处于非生长的状态，即，它们不能增殖。

就本发明而言，可根据Lehrer等，J.Immunol.Methods，137(2)：167-174(1991)所描述的方法测定抗微生物活性。可选择地，抗微生物活性可根据CLSI(临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)；先前称为国家临床和实验室标准委员会(National committee for Clinical and LaboratoryStandards))的NCCLS准则测定。

在具有抗微生物活性的防卫素的25％(重量/重量)水溶液中，优选在10％(重量/重量)的水溶液中，更优选在5％(重量/重量)的水溶液中，甚至更优选在1％(重量/重量)的水溶液中，最优选在0.5％(重量/重量)的水溶液中，并且特别是在0.1％(重量/重量)的水溶液中，于20℃温育8小时之后(优选4小时之后，更优选2小时之后，最优选1小时之后，并且特别是30分钟之后)，具有抗微生物活性的防卫素可能能够将大肠杆菌(DSM1576)的活细胞数减少至1/100。

当以1000ppm的浓度添加时，优选当以500ppm的浓度添加时，更优选当以250ppm的浓度添加时，甚至更优选当以100ppm的浓度添加时，最优选当以50ppm的浓度添加时，并且特别是当以25ppm的浓度添加时，具有抗微生物活性的防卫素可能还能够于25℃在微生物的生长底物(growthsubstrate)中将大肠杆菌(DSM1576)的生长晕(outgrowth)抑制24小时。在具有抗微生物活性的防卫素的25％(重量/重量)水溶液中，优选在10％(重量/重量)的水溶液中，更优选在5％(重量/重量)的水溶液中，甚至更优选在1％(重量/重量)的水溶液中，最优选在0.5％(重量/重量)的水溶液中，并且特别是在0.1％(重量/重量)的水溶液中，于20℃温育8小时之后(优选4小时之后，更优选2小时之后，最优选1小时之后，并且特别是30分钟之后)，具有抗微生物活性的防卫素可能能够将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC6633)的活细胞数减少至1/100。

当以1000ppm的浓度添加时，优选当以500ppm的浓度添加时，更优选当以250ppm的浓度添加时，甚至更优选当以100ppm的浓度添加时，最优选当以50ppm的浓度添加时，并且特别是当以25ppm的浓度添加时，具有抗微生物活性的防卫素可能还能够于25℃在微生物的生长底物中将枯草芽孢杆菌(ATCC6633)的生长晕抑制24小时。

本发明的防卫素具有由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42所示氨基酸序列组成的防卫素的抗微生物活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

cDNA：术语“cDNA”在此定义为能够从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子通过反转录制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。起始、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其经过一系列步骤加工，然后显现为成熟的已剪接的mRNA。这些步骤包括通过被称为剪接的方法来去除内含子序列。因此，源自mRNA的cDNA缺少任何内含子序列。

核酸构建体：本文所使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或者被修饰以自然界原本不存在的方式包含核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒(expression cassette)”同义。

控制序列：术语“控制序列”在本文中定义为包括对于编码防卫素的多核苷酸的表达是必要或有利的所有成份。对于编码防卫素的核苷酸序列而言，每个控制序列可以是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于，前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。最少的情况，控制序列包括启动子以及转录和翻译的终止信号。可以将控制序列与接头(linker)一起提供，所述接头的目的是引入特定的限制位点，以促进控制序列与编码防卫素的核苷酸序列的编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文中代表一种结构(congifuration)，其中将控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得控制序列指导防卫素的编码序列的表达。

编码序列：当用于本文时，术语“编码序列”的意思是直接具体指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开读框决定，其通常开始于ATG起始密码子或可选的起始密码子例如GTG和TTG。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括涉及防卫素产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文中定义为线状或环状DNA分子，所述DNA分子包含编码防卫素肽的多核苷酸，并且将其可操作地连接至提供其表达的附加的核苷酸。

宿主细胞：如本文使用的术语“宿主细胞”包括任何的细胞类型，其容易用本发明的核酸构建体的转化、转染、转导等。

修饰：术语“修饰”在本文中是指防卫素的任何化学修饰。修饰可以是氨基酸的取代(substitution)、缺失和/或***，以及氨基酸侧链的置换(replacement)；或在氨基酸序列内使用具有相似性质的非天然氨基酸。具体而言修饰可以是酰胺化(amidation)，例如C端的酰胺化。

同一性：两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。

就本发明而言，将两种氨基酸序列之间的同一性程度通过使用程序FASTA测定，其包括在FASTA程序包的版本2.0x内(参见W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”，PNAS85：2444-2448；and W.R.Pearson(1990)，“Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA”，Methods in Enzymol.183：63-98)。所使用的计分矩阵是BLOSUM50，缺口(gap)罚分是-12，并且缺口延伸罚分是-2。

两种核苷酸序列之间的同一性程度使用与上述相同的算法和软件包测定。所使用的计分矩阵是同一性矩阵，缺口罚分是-16，并且缺口延伸罚分是-4。

可选择地，两种氨基酸序列的比对通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序来测定。Needle程序执行总体比对算法，所述算法描述于Needleman S.B.and Wunsch C.D.(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453中。所使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开启罚分是10，并且缺口延伸罚分是0.5。

本发明的氨基酸序列(“本发明序列”，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸1至40)和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度，是以两种序列比对的重叠区中精确匹配的数目除以“本发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个而计算的。结果以百分比同一性表示。

当“本发明序列”和“外源序列”在重叠区的相同位置中具有相同的氨基酸残基时，出现精确匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如，SEQ ID NO：2的氨基酸1至40的长度是40)。

发明详述

防卫素

本发明的防卫素是本领域技术人员公认的属于抗微生物肽的防卫素类的任何抗微生物肽。为了确定抗微生物肽是否为本发明的防卫素，优选将氨基酸序列与熟知的PFAM数据库的隐蔽马尔科夫模型序型(hidden markov modelprofile)(HMM序型)进行比较(参见实施例6)。

防卫素可属于α-防卫素类、β-防卫素类、θ-防卫素类、节肢动物防卫素类、昆虫防卫素类、植物防卫素类。

防卫素也可以是合成的防卫素，其共享任何防卫素类的独特特征。

在实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包含4、5、6、7、8、9或10个半胱胺酸残基，优选6、7、8、9或10个半胱胺酸残基，更优选6、8或10个半胱胺酸残基，并且最优选6或8个半胱胺酸残基。

防卫素的实例包括但不限于，α-防卫素HNP-1(人嗜中性粒细胞肽)、HNP-2和HNP-3；β-防卫素-12、果蝇防卫素(Drosomycin)、海利防卫素(Heliomicin)、γ1-嘌呤硫素(purothionin)、昆虫防卫素A和PCT申请WO9953053(RHONE POULENC AGROCHIMIE)(1999年10月21日)和WO02085934(ENTOMED)(2002年10月31日)中公开的防卫素，其以引用方式纳入本文中；或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的成熟氨基酸序列或与这些序列具有至少60％、优选70％、更优选80％、甚至更优选90％并且最优选95％同一性的氨基酸序列中所列举的防卫素。本发明的防卫素可进一步包含相较于这些氨基酸序列的一个或多个化学修饰。

α-防卫素可定义为包含以下氨基酸序列的抗微生物肽：

C-X₁-C-X₂-C-X₃-C-X₄-C-C

-其中：

X₁代表1个氨基酸；优选地，X₁＝Y、F、A、R、I、S、T、H或V；更优选地，X₁＝Y、F、A或R；甚至更优选地，X₁＝Y或F；最优选地，X₁＝Y；

X₂代表4或5个氨基酸；优选地，X₂代表4个氨基酸；更优选地，X₂＝Z₁-Z₂-Z₃-Z₄，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝R、T或K；更优选地，Z₁＝R；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝R、I、T、K；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝R、P或G；

Z₄代表任何氨基酸；优选地，Z₄＝G、A或R；

X₃代表9个氨基酸；优选地，X₃＝Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-G-Z₈，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝K、L或R；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝R、F、A、S或G；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝R、G、P或T；更优选地，Z₃＝R或G；

Z₄代表任何氨基酸；Z₄＝E或Y；优选地Z₄＝E；

Z₅代表任何氨基酸；优选地，Z₅＝R、H或S；

Z₆代表任何氨基酸；优选地，Z₆＝R、M或L；

Z₇代表任何氨基酸；优选地，Z₇＝N、S、Y或I；

Z₈代表任何氨基酸；优选地，Z₈＝T、S、Y或A；

X₄代表9个氨基酸；优选地，X₄＝Z₁-Z₂-Z3-Z₄-Z₅-Z6-Z₇-Z₈-Z₉，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝R或I；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝K、I、Y、F或L；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝G、N、R或Q；

Z₄代表任何氨基酸；优选地，Z₄＝G、H或N；

Z₅代表任何氨基酸；优选地，Z₅＝R或L；

Z₆代表任何氨基酸；优选地，Z₆＝I、L、M、V或R；

Z₇代表任何氨基酸；优选地，Z₇＝Y、W、H或F；

Z₈代表任何氨基酸；优选地，Z₈＝T、R或A；

Z₉代表任何氨基酸；优选地，Z₉＝L、F或R；更优选地，Z₉＝L或F。

β-防卫素可定义为包含以下氨基酸序列的抗微生物肽：

C-X₁-C-X₂-C-X₃-C-X₄-C-C

-其中：

X₁代表6个氨基酸；优选地，X₁＝Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝R、V或L；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝R、I、K或Q；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝N或S；

Z₄代表任何氨基酸；优选地，Z₄＝G、K或R；

Z₅代表任何氨基酸；优选地，Z₅＝G；

Z₆代表任何氨基酸；优选地，Z₆＝Q、I、V或F；

X₂代表3或4个氨基酸；优选地，X₂代表4个氨基酸；更优选地，X₂＝Z₁-Z₂-Z₃-Z₄，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝L、V、I、H或A；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝P或Y；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝S、I、N或G；

Z₄代表任何氨基酸；优选地，Z₄＝R、A或S；

X₃代表9个氨基酸；优选地，X₃＝Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z6-Z₇-Z₈-Z₉，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝P；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝G、I、R或P；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝Y、N、P、R、F或H；

Z₄代表任何氨基酸；优选地，Z₄＝T、M或Y；

Z₅代表任何氨基酸；优选地，Z₅＝R或K；

Z₆代表任何氨基酸；优选地，Z₆＝Q或I；

Z₇代表任何氨基酸；优选地，Z₇＝I或Q；

Z₈代表任何氨基酸；优选地，Z₈＝S；

Z₉代表任何氨基酸；优选地，Z₉＝T；

X₄代表6个氨基酸；优选地，X₄＝Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝Y、F、G或L；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝G、H、P、L、R或T；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝G、P或R；

Z₄代表任何氨基酸；优选地，Z₄＝K、P、R、G或Q；

Z₅代表任何氨基酸；优选地，Z₅＝V、A、I或G；

Z₆代表任何氨基酸；优选地，Z₆＝K。

昆虫-防卫素可定义为包含以下氨基酸序列的抗微生物肽：

C-X₁-C-X₂-C-X₃-C-X₄-C-X₅-C

-其中：

X₁代表5-16个氨基酸；

X₂代表3个氨基酸；优选地，X₂＝Z₁-Z₂-Z₃，其中：

Z₁代表任何氨基酸；优选地，Z₁＝A或H；

Z₂代表任何氨基酸；优选地，Z₂＝A或R；

Z₃代表任何氨基酸；优选地，Z₃＝H；

X₃代表9-11个氨基酸；

X₄代表4-10个氨基酸；

X₅代表1个氨基酸；优选地，X₅＝V、T、I、H、K、N或L。

在一个实施方案中，本发明的防卫素具有多于一种的抗微生物活性，所述活性选自抗真菌活性、抗细菌活性和抗病毒活性。

本发明的防卫素可得自任何属的微生物。就本发明而言，本文使用的关于给定来源的术语“得自”，应指由核苷酸序列编码的防卫素是由该来源产生，或由已***来自该来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，得自给定来源的防卫素是细胞外分泌的。

本发明的防卫素可以是真菌防卫素，并且更优选是酵母防卫素，例如，念珠菌属(Candida)、克鲁弗酵母属(kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)防卫素；或更优选是丝状真菌防卫素，如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝梗霉属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、瘤胃真菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃弧菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)防卫素。

在一个优选的方面，防卫素是具有抗微生物活性的卡尔酵母(S.carlsbergensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉氏酵母(S.douglasii)、克鲁弗酵母(S.kluyveri)、诺地酵母(S.norbensis)或卵形酵母(S.oviformis)防卫素。

在另一优选的方面，防卫素是棘孢曲霉(A.aculeatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、烟曲霉(A.fumigatus)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)或米曲霉(A.oryzae)、杆孢状镰孢(F.bactridioides)、谷镰孢(F.cerealis)、库威镰孢(F.crookwellense)、大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminearum)、禾赤镰孢(F.graminum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、合欢木镰孢(F.negundi)、尖镰孢(F.oxysporum)、多枝镰孢(F.reticulatum)、粉红镰孢(F.roseum)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、肤色镰孢(F.sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(F.sporotrichioides)、硫色镰孢(F.sulphureum)、圆镰孢(F.torulosum)、拟丝孢镰孢(F.trichothecioides)、镶片镰孢(F.venenatum)、特异腐质霉(H.insolens)、棉毛土生菌(H.lanuginosa)、米赫毛霉(M.miehei)、嗜热毁丝霉(M.thermophila)、粗糙脉孢菌(N.crassa)、产紫青霉菌(P.purpurogenum)、哈茨木霉(T.harzianum)、康宁木霉(T.koningii)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、里氏木霉(T.reesei)或绿色木霉(T.viride)防卫素。

应理解的是，对于上述的物种，本发明涵盖完全阶段和不完全阶段以及其它分类上的等同物，例如，无性型，而不论它们已知的物种名称。本领域的技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。

这些物种的菌株，公众可容易地在许多的培养物保藏中心获得，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)和农业研究机构专利保藏中心北方研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center，NRRL)。

此外，这些防卫素也可从其它来源中鉴定和获得，所述其它来源包括使用上述探针从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物。用于从天然生境中分离微生物的技术是本领域公知的。然后可通过类似地筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库来获得多核苷酸。一旦以探针检测到编码防卫素的多核苷酸序列之后，可利用本领域普通技术人员熟知的技术分离或克隆多核苷酸(例如，参见SAMBROOK，.Molecular Cloning：A Laboratory Manuaal.2.，：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.ISBN0879693096)。

本发明的防卫素也包括融合的防卫素或可切割的融合防卫素，其中将另一防卫素融合到防卫素或其片段的N端或C端。融合的防卫素通过将编码另一防卫素的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)而产生。用于产生融合防卫素的技术是本领域内已知的，并且包括连接编码防卫素的编码序列，以使它们在阅读框内，并使融合的防卫素的表达在相同启动子和终止子的控制之下。

核酸序列：

本发明还涉及具有编码本发明防卫素的核苷酸序列的多核苷酸。

这些多核苷酸的实例包括但不限于，公开在PCT申请WO99/53053中的多核苷酸，其内容以引用方式纳入本文中。

在优选的实施方案中，核苷酸序列列举在本发明的SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：15中。在另外的优选实施方案中，核苷酸序列是SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的成熟防卫素编码区。本发明也包含核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的氨基酸序列的防卫素或其成熟的防卫素，由于遗传密码的简并性，这些核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15。

用于分离或克隆编码防卫素的多核苷酸的技术是本领域内已知的，并且包括从基因组DNA中分离、从cDNA中制备或其组合。从这种基因组DNA中克隆编码本发明的防卫素的多核苷酸可通过如下方法来完成：使用例如熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选，以检测具有共享结构特征的克隆的DNA片段。例如，参见Innis et al.，1990，PCR：A Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。也可使用其它的核酸扩增方法，例如，连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。多核苷酸可从散囊菌属(Eurotium)、曲霉属(Aspergillus)、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、巨牡蛎属(Crassostrea)、钳蝎属(Mesobuthus)的菌株或者其它或相关的生物体中克隆，因此可以是，例如，核苷酸序列的防卫素编码区的等位基因变体或物种变体(species variant)。

本发明还涉及多核苷酸，其具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQID NO：15的成熟防卫素编码序列具有至少60％，优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、并且最优选至少97％同一性程度的核苷酸序列，所述多核苷酸编码防卫素抗微生物多肽。

编码本发明防卫素的核苷酸序列的修饰，对于合成基本上类似于所述防卫素的防卫素可能是必要的。术语“基本上类似于”防卫素是指防卫素的非天然存在的形式。这些防卫素与从其天然来源中分离的防卫素在一些工程设计的方式上可能不同，例如，在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。变体序列可在呈现为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的防卫素编码区的核苷酸序列，例如，其亚序列的基础上构建，和/或通过引入核苷酸取代来构建，所述取代不导致由该核苷酸序列所编码的防卫素的另一种氨基酸序列，但对应于意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择，或通过引入导致不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般说明，参见，例如Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification2：95-107。

对于本领域技术人员将显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能的关键性区域之外进行，并且仍产生活性的防卫素。对于防卫素的活性所必需的氨基酸残基，并且因此优选是不进行取代的氨基酸残基，可根据本领域内已知的方法鉴定，例如，位点定向诱变或丙氨酸分区诱变(alanine-scanningmutagenesis)(参见，例如，Cunningham and Wells(1989)，Science 244：1081-1085)。在后者的技术中，将突变引入分子中每个带正电的残基处，并且测试所得突变分子的抗微生物活性，以鉴定对于分子的活性关键性的氨基酸残基。也能够通过分析三维结构确定相互作用的位点，如通过像核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术所测定的(例如，参见de Vos et al.，(1992)，Science 255：306-312；Smith et al.，(1992)，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaveret al.，(1992)，FEBS Ltr.309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明防卫素的多核苷酸，其在低严紧条件下，优选中严紧条件下，更优选中-高严紧条件下，甚至更优选高严紧条件下，并且最优选非常高严紧条件下，与以下序列杂交：(i)包含于SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：15中的成熟肽编码核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13或SEQ ID NO：15中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或其如本文所定义的等位基因变体和亚序列(Sambrook et al.，(1989)，见上文)。

本发明还涉及通过如下手段得到的多核苷酸：(a)在低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA群体与以下序列杂交：(i)包含于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中的成熟防卫素编码核苷酸序列，(ii)SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽。

核酸构建体：

本发明还涉及核酸构建体，其包含编码本发明防卫素的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到一个或多个控制序列，所述控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下表达。

可以各种方式操作编码本发明的防卫素的多核苷酸以提供防卫素的表达。在将多核苷酸序列***到载体之前，对其进行操作可能是希望的或必要的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域内熟知的。

控制序列可以是适合的启动子序列，其是由宿主细胞识别的用于表达编码本发明防卫素的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含介导防卫素表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可从编码细胞外或细胞内与宿主细胞同源或异源的多肽的基因获得。

用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是得自如下酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢黛利亚(Daria)(WO00/56900)、镶片镰孢奎因(Quinn)(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

控制序列也可以是适合的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码防卫素的核苷酸序列的3’端。在所选择的宿主细胞中发挥功能的任何终止子都可用于本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子得自如下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶。

控制序列也可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接到编码防卫素的核苷酸序列的5’端。在所选择的宿主细胞中发挥功能的任何前导序列都可用于本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞，优选的前导序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。

控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是可操作地连接到核苷酸序列的3’端的序列，并且当转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷酸残基添加到转录的mRNA的信号。在所选择的宿主细胞中发挥功能的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞，优选的聚腺苷酸化序列得自如下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

控制序列也可以是信号肽编码区，其编码连接到防卫素氨基端的氨基酸序列，并且指导所编码的防卫素进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’端可固有地包含信号肽编码区，其在翻译阅读框中与编码分泌的防卫素的编码区片段天然地连接。可选择地，编码序列的5’端可包含对编码序列而言是外源的信号肽编码区。当编码序列不天然地包含信号肽编码区时，外源的信号肽编码区可能是需要的。可选择地，外源的信号肽编码区可简单地取代天然的信号肽编码区，以增强防卫素的分泌。然而，将表达的防卫素引导至所选宿主细胞的分泌途径内的任何信号肽编码区都可用于本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞，有效的信号肽编码区是得自如下酶的基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和棉毛土生菌脂肪酶。

在优选的方面，信号肽编码区是SEQ ID NO：1的核苷酸1至69，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-55至-33；SEQ ID NO：3的核苷酸1至60，其编码SEQID NO：4的氨基酸-48至-29；SEQ ID NO：5的核苷酸1至60，其编码SEQ IDNO：6的氨基酸-50至-31；SEQ ID NO：7的核苷酸1至66，其编码SEQ ID NO：8的氨基酸-22至-1；SEQ ID NO：9的核苷酸1至72，其编码SEQ ID NO：10的氨基酸-24至-1；SEQ ID NO：11的核苷酸1至66，其编码SEQ ID NO：12的氨基酸-22至-1；SEQ ID NO：13的核苷酸1至66，其编码SEQ ID NO：14的氨基酸-22至-1；或SEQ ID NO：15的核苷酸1至54，其编码SEQ ID NO：16的氨基酸-26至-9。

控制序列也可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基端处的氨基酸序列。将所得多肽称为前多肽(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽一般是失活的，并且能够由前多肽通过催化或自催化地切割前肽而转变为成熟的活性多肽。前肽编码区可得自如下酶的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)。

在优选的方面，前肽编码区是SEQ ID NO：1的核苷酸70至165，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-32至-1；SEQ ID NO：3的核苷酸61至144，其编码SEQ ID NO：4的氨基酸-28至-1；SEQ ID NO：5的核苷酸61至150，其编码SEQ ID NO：6的氨基酸-30至-1；或SEQ ID NO：15的核苷酸55至78，其编码SEQ ID NO：16的氨基酸-8至-1。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基端时，前肽区位于紧接着多肽的氨基端，而信号肽区位于紧接着前肽区的氨基端。

加入调节序列也可能是理想的，其允许相对于宿主细胞的生长调节防卫素的表达。调节***的实例是对于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)的反应而引起基因表达开启或关闭的调节***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中，可使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是可使基因扩增的调节序列。在真核***中，这些包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)基因，和以重金属扩增的金属硫蛋白(metallothionein)基因。在这些情况下，编码防卫素的核苷酸序列将可操作地与调节序列连接。

表达载体：

本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明防卫素的多核苷酸、启动子以及转录和翻译的终止信号。可将上述各种核酸和控制序列结合在一起以产生重组表达载体，所述载体可包括一个或多个方便的限制位点，以允许编码防卫素的核苷酸序列在这些位点***或取代。可选择地，编码本发明防卫素的核苷酸序列可通过将所述核苷酸序列或包括该序列的核酸构建体***适当的表达载体来表达。在产生表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将编码序列与用于表达的适当的控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何的载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够实现核苷酸序列的表达。载体的选择将通常取决于载体与待导入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外的实体而存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含确保自复制(self-replication)的任何手段(means)。可选择地，载体可以是当被引入宿主细胞中时整合到基因组内并且与其所整合的染色体一起复制的载体。此外，也可使用单一的载体或质粒或两个或两个以上载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组内的总DNA，或可使用转座子。

用于表达本发明的防卫素的载体优选包含一个或多个选择标记，所述选择标记提供已转化细胞的简单选择。选择标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷型的原养(prototrophy to auxotroph)等。

用于丝状真菌宿主细胞的选择标记的实例包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，和吸水链霉菌(S.hygroscopicus)的bar基因。

载体优选包含可将载体整合至宿主细胞基因组的元件，或是可使载体在细胞内独立于基因组而自主复制的元件。

为了整合至宿主细胞基因组，载体可依赖编码防卫素的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合至基因组内的载体的任何其它元件。可选择地，载体可包含另外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合至宿主细胞基因组内染色体中的准确位置。为了增加在准确位置整合的可能性，整合的元件应优选包含足够数目的核酸，例如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与对应靶序列具有高度的同一性，以增强同源重组的机率。整合的元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合的元件也可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，也可通过非同源重组将载体整合至宿主细胞的基因组内。

对于自主复制，载体可进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制基因(plasmid replicator)，其可在细胞内发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制基因”在本文中定义为能够使质粒或载体在体内复制的核苷酸序列。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS(Gems et al.(1991)，Gene 98：61-67；Cullen et al.(1987)Nucl.Acids Res.15：9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883所公开的方法来完成。

可将多于一个拷贝的编码本发明防卫素的多核苷酸***至宿主细胞，以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个额外拷贝的序列整合至宿主细胞基因组中而获得，或通过将可扩增的选择标记基因包括在多核苷酸序列中，使细胞包含选择标记基因扩增的拷贝，并由此能够通过在适当选择剂(selectable agent)存在下培养细胞而筛选多核苷酸额外的拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(例如，参见Sambrook等(1989)，见上文)。

丝状真菌宿主细胞：

本发明的宿主细胞(或生物体)是丝状真菌，其包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)的丝状形式(如Kirk P.M.et al.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，9th edition，2001，CAB International，Wallingford，UK所定义的)。丝状真菌的特征在于由几丁质和葡聚糖和/或其它复杂多糖类组成的营养菌丝体，营养生长通过菌丝的延伸进行。优选的碳分解代谢是专性需氧的。

在一个实施方案中，丝状真菌宿主细胞(或生物体)属于子囊菌亚门(subdivision Ascomycota)的散囊菌目(order Eurotiales)；优选地，它更具体地属于毛发菌科(Trichocomaceae family)。

在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞(或生物体)是(但不限于)如下菌种的细胞，或其有性型(teleomorph)、无性型(anamorph)或同物异名体(synonym)：枝顶孢霉属、曲霉属、裸孢壳属(Emericella)、散囊菌属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、正青霉属(Eupenicillium)、梭孢壳属、弯颈霉属和木霉属。在还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是镰孢属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是腐质霉属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毛霉属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是脉孢菌属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是青霉菌属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是梭孢壳属。在另一还更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是弯颈霉属。在另一还要更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属。在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉或米曲霉。在另一优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是变色组(section Discolor)的镰孢属(也称为镰孢组(section Fusarium))。例如，丝状真菌宿主细胞可以是杆孢状镰孢、谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢或拟丝孢镰孢。在另一优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是尖细优雅组(section Elegans)的镰孢菌株，例如，尖镰孢。在另一最优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉或棉毛土生菌。在另一最优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是米赫毛霉。在另一最优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是嗜热毁丝霉。在另一最优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是粗糙脉孢菌。在另一最优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是产紫青霉或绳状青霉(Penicillium funiculosum)(WO00/68401)。在另一最优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是土生梭孢壳(Thielavia terrestris)。在另一最优选实施方案中，木霉属细胞是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

在具体实施方案中，丝状真菌宿主细胞是米曲霉或黑曲霉。

在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺陷的或蛋白酶负型的菌株。

例如，这可以是缺失命名为“alp”的碱性蛋白酶基因的蛋白酶缺陷菌株米曲霉JaL125。此菌株描述于WO9735956(Novo Nordisk A/S)(申请日1997年10月2日)或欧洲专利429490(Genencor)(申请日1991年6月5日)，或无TPAP的宿主细胞，具体而言是黑曲霉的菌株，其公开于WO9614404(NovoNordisk A/S)(申请日1996年5月17日)。此外，具有减少产量的转录激活因子(prtT)的宿主细胞，特别是黑曲霉或米曲霉，如WO0168864(Novo NordiskA/S)(申请日2001年9月2日)所述，特别地包含于本发明中。

内含子：

可将真核生物基因通过间插序列(内含子)中断，必须在前体转录物中将所述间插序列修饰以产生功能性的mRNA。这种内含子移除的过程已知为前-mRNA剪接。通常，内含子的分支点序列对于经由形成套索(lariat)的内含子剪接是必需的。剪接的信号直接存在于内含子剪接位点的边界处。内含子剪接位点的边界通常在它们的5’和3’端，分别具有共有内含子序列GT和AG。虽然还没有除了AG以外的3’剪接位点的报导，但有5’GT剪接位点的-些例外的报导。例如，有用CT或GC取代5’边界处GT的先例。对于跟随GT的核苷酸碱基ANGT也有强烈的偏好(其中N是A、C、G或T)(在酵母菌种中主要是A或T)，但对于GT剪接位点之前任何具体的核苷酸，则没有明显的偏好。3’剪接位点AG之前主要是嘧啶核苷酸碱基(Py)，即C或T。

可中断真菌基因的内含子数目从1到2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多的内含子变动。它们可分布在整个基因中，或位于基因的5’或3’端。在酿酒酵母中，内含子主要位于基因的5’端。内含子的大小一般少于1kb，并且在酵母中大小通常少于400bp，而在丝状真菌中大小通常少于100bp。

酿酒酵母的内含子分支点序列5’-TACTAAC-3’很少确实出现在丝状真菌的内含子中。在丝状真菌内含子的等同点处可见紧密或松散地类似TACTAAC的序列延伸，其具有一般的共有NRCTRAC，其中N是A、C、G或T，并且R是A或G。例如，在粗糙脉孢菌和构巢曲霉二者推测的共有序列中，第四位置T是不变的。此外，核苷酸G、A和C分别在超过80％的位置3、6和7中占有优势，尽管构巢曲霉中的位置7更加灵活，仅有65％的C。然而，位置1、2、5和8在粗糙脉孢菌和构巢曲霉中是较不严格的。其它的丝状真菌在它们内含子的等同位置处具有相似的分支点延伸，但取样太少以致于无法辨别任何明确的趋势。

方法和用途：

在第一方面，本发明提供重组的丝状真菌宿主细胞，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码防卫素的外源核酸序列和一个或多个内含子序列。术语“外源核酸序列”意指从外部(从外来的来源)引入的核酸序列。

丝状真菌宿主细胞可能能够以使用无内含子序列的核酸构建体，如cDNA序列时所得量的至少150％，优选200％，更优选250％，和最优选300％的量表达(产生)防卫素。

丝状真菌宿主细胞可在适当的搅拌下，于30-35摄氏度(degree Celsius)，在YPM生长培养基中生长3-5天。这种方法和其它合适的培养丝状真菌的方法是本领域内公知的。丝状真菌宿主细胞可用于防卫素的重组产生。

在第二方面，本发明提供在丝状真菌宿主细胞中重组产生防卫素的方法，其包括培养丝状真菌宿主细胞，所述细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列和一个或多个内含子序列；以及回收防卫素肽。适合的回收方法是本领域内公知的。

本发明还涉及核酸构建体的用途，所述核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列和一个或多个内含子序列，所述用途用于改进防卫素在丝状真菌宿主细胞中的重组表达水平。

防卫素的表达水平与使用不包含内含子序列的核酸构建体，如cDNA序列的情况相比，可以高至少50％，优选高至少75％，更优选高至少100％，甚至更优选高至少125％，最优选高150％，并且特别是高200％。可选择地，防卫素的表达水平可以是使用无内含子序列的核酸构建体，如cDNA序列时所得到的表达水平的至少150％，优选200％，更优选250％，并且最优选300％。表达水平以每升发酵液的防卫素蛋白质克数来测量。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含1、2、3、4或5个内含子序列，优选1、2、3或4个内含子序列，更优选1、2或3个内含子序列，甚至更优选1或2个内含子序列，并且最优选1个内含子序列。

在另一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列，和至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，并且最优选至少4个内含子序列。

内含子序列可位于本发明核酸构建体的信号肽、前肽或成熟肽的编码部分。当核酸构建体包含多于1个内含子时，内含子可位于构建体的不同部分。

事实上内含子序列可位于转录成mRNA的防卫素基因的任何部分。

药物配制物：

本发明的防卫素能够并入许多用于治疗施用的药物配制物中。更具体而言，本发明的防卫素能够通过与适当的医药上可接受的载体或稀释剂组合来配制成药物组合物，并且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如，片剂、胶囊、粉末、颗粒、油膏(ointment)、乳霜(cream)、泡沫、溶液、栓剂(suppository)、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气雾剂(aerosol)。就其本身而论，防卫素的施用能够以各种方式进行，包括口服、颊内(buccal)、直肠、非消化道(parenteral)、腹膜内(intraperitoneal)、皮内、经皮、胸腔内(intracheal)等方式施用。根据本发明，在施用之后防卫素是全身性的(systemic)。

本发明的防卫素能够单独施用、互相组合施用，或它们能够与其它已知的化合物(例如，穿孔蛋白、抗发炎剂、抗生素等)组合使用。在药物剂量形式中，防卫素可以以它们医药上可接受的盐形式施用。以下的方法和赋形剂仅作为范例，而绝非用来限制。

对于口服制剂，防卫素能够单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制造片剂、粉末、颗粒或胶囊，例如，与常规添加剂组合使用，例如，乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂组合使用，例如，晶状纤维素、纤维素衍生物、***胶(acacia)、玉米淀粉或明胶；与崩解剂(disintegrator)组合使用，例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂组合使用，例如，滑石或硬脂酸镁；并且如果需要的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和增香剂(flavoring agent)组合使用。

能够通过将防卫素溶解、悬浮或乳化于含水或非水的溶剂中来配制成用于注射的制剂，所述溶剂例如植物性或其它类似的油脂、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯；并且如果需要的话，与常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

可将本发明的防卫素用于通过吸入施用的气溶胶配制物中。可将防卫素配制在增压容许的推进剂(pressurized acceptable propellant)，例如，二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。

此外，也可将防卫素通过与各种的基底(base)混合制成栓剂，所述基底例如乳化的基底或水溶性基底。所述防卫素还能够通过栓剂直肠施用。栓剂可包括载剂，例如，可可油、碳蜡和聚乙二醇，其可在体温融化，但在室温下是固化的。

可提供用于口服或直肠施用的单位剂型，例如，糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每剂量单位，例如一茶匙量、一大汤匙量、片剂或栓剂包含预定量的含有一种或多种本发明防卫素的组合物。类似地，用于注射或静脉施用的单位剂型可在组合物中包含本发明的防卫素，所述组合物如无菌水、生理食盐水或其它医药上容许的载体中的溶液。

如本文使用的术语“单位剂型”是指适合作为人类或动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位，每单位包含以足够产生期望效果的量计算的预定量的本发明的防卫素，并结合医药上容许的稀释剂、载体或载剂。本发明单位剂型的规格(specification)取决于所使用的具体防卫素和要达到的效果，以及在宿主中与防卫素有关的药效学(pharmacodynamics)。

公众可易于获得医药上容许的赋形剂(例如，载剂、佐剂、载体或稀释剂)。此外，医药上容许的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、渗压调节剂(tonicityadjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，是公众易于获得的。

全身性施用的通常剂量范围是每次施用从0.1皮克(pg)至100毫克/公斤受试者重量。通常剂量可以是每日2至6次服用一个片剂，或每日一次服用一个包含在比例上较高含量活性成份的延时释放(time-release)胶囊或片剂。延时释放的效果可通过在不同pH值溶解的胶囊材料、通过随渗透压缓慢释放的胶囊、或通过任何其它已知的控制释放手段来获得。

本领域技术人员可易于理解的是，剂量水平可作为特定的防卫素、症状的严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而改变。某些特定的防卫素比其它防卫素更有效力。对于给定防卫素优选的剂量，本领域技术人员将通过各种方法容易地确定。优选的方法是测量给定防卫素的生理效价(physiologicalpotency)。

使用脂质体作为递送载剂是一种感兴趣的方法。脂质体与靶位点的细胞融合，并且细胞内递送腔室(lumen)的内容物。将脂质体保持与细胞接触一段足够融合的时间，使用各种方法以保持接触，例如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，将脂质体设计成气溶胶化，以用于肺部施用。脂质体可与介导膜融合的纯化蛋白或肽，例如仙台(Sendai)病毒或流感病毒等一起制备。脂质可以是已知的形成脂质体的脂质的任何有用组合，包括阳离子或两性离子的脂质，例如磷脂酰胆碱。剩余的脂质通常将是中性或酸性脂质，例如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。

对于制备脂质体，可使用由Kato等描述的方法(Expression of hepatitis Bvirus surface antigen in adult rat liver.Co-introduction of DNA and nuclearprotein by a simplified liposome method.J.boil.chem.，February vol.266，p.3361-3364.ISSN0021-9258.)。简而言之，将包含肽的脂质和腔室组合物在适当的含水介质，方便地是盐水介质中组合，其中总固体将在约1-10重量百分比的范围内。在剧烈搅拌一段短时间之后(约5-60秒)，将试管置于温水浴中(约25-40℃)，并且重复这个循环约5-10次。然后将组合物超声处理一段合宜的时间(一般约1-10秒)，并可通过漩涡震荡进一步搅拌。接着通过加入含水介质扩张体积，一般增加约1-2倍体积，然后摇动并且冷却。这种方法可使高分子量分子并入至腔室中。

与其它活性剂的配制物：

为了用于本发明的方法，可将本发明的防卫素与其它医药上的活性剂(例如，类固醇)配制，所述活性剂是本领域内熟知的，特别是其它抗微生物剂。其它有兴趣的剂包括本领域内已知的各种抗生素。抗生素的种类包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素(methicillin)、苯唑青霉素(oxacillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、乙氧萘青霉素(nafcillin)、氨苄青霉素等；青霉素组合β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素，例如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟羧氧酰胺(moxalactam)等；碳青霉烯(carbapenems)；单环内酰胺(monobactams)；氨基糖苷(aminoglycosides)；四环素；大环内酯类(macrolides)；林可霉素(lincomycins)；多粘菌素(polymyxins)；磺胺(sulfonamides)；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝基羟乙唑(metronidazole)；壮观霉素(spectinomycin)；三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)；万古霉素(vancomycin)等。

抗霉菌剂(anti-mycotic agent)也是有用的，包括多烯类，例如两性霉素B、制霉菌素；5-氟可新(5-flucosyn)；和唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)和氟康唑(fluconazol)。抗结核药物包括异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素(streptomycin)和利福平(rifampin)。也可将细胞因子纳入本发明的防卫素配制物中，例如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素12等。

本发明将通过以下实施例而进一步说明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。

实施例：

用作缓冲液和底物的化学品至少是试剂级的商业产品。

实施例1：在米曲霉中表达包含内含子的防卫素编码序列

将从淡黑假黑盘菌(P.nigrella)cDNA文库(来自WO03044049的SEQ IDNO：6，(Novo Nordisk A/S)(申请日2003年5月30日))中扩增的361bp经BamH1-Xho1消化的PCR产物克隆到曲霉属表达载体内，如先前在WO03/044049中所述，以得到质粒pMT2549。将pMT2549的菌丝霉素(Plectasin)编码序列中的内含子序列通过使用标准体外诱变和SOE来修饰，以引入单一的额外碱基，由此在内含子中产生限制位点。将所得的包含内含子(59bp)的菌丝霉素编码序列显示为SEQ ID NO：17。将对应的表达质粒命名为pMT2647。

将pMT2647转化至米曲霉BECh2，如先前在WO03/044049中所述。首先，将14个独立转化体进行两次重新分离，使其生长在YPM培养基(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨(bacto peptone)和2％麦芽糖)上，最后将10μL的样品在SDS凝胶上分析，如先前在WO03/044049中所述。对于一些转化体，从染色强度显示的所产生菌丝霉素的量，显著地超过先前具有编码菌丝霉素的无内含子cDNA表达质粒的米曲霉转化体在这些生长条件下所得的估计的50毫克/公升最大水平(参见WO03/044049)。

虽然14个pMT2549转化体中的数个似乎比先前在WO03/044049中分析的最好的30个无内含子转化体产生更高水平的菌丝霉素，但应记住的是，各乙酰胺筛选的转化体都代表单独的转化和整合事件，其导致在单独转化体之间产率的大幅差异。这些产率差异已知会发生在基于非同源重组的***中，并且一般被认为是随机整合基因座和整合的表达质粒数目的结果。因此决定还要将表达在限定基因座整合的单一拷贝表达载体中进行比较(参见实施例2)。

实施例2：在米曲霉中由限定的单一拷贝整合体表达防卫素

为了直接比较在米曲霉中菌丝霉素由无内含子cDNA的表达与包含内含子的菌丝霉素编码序列的表达，将这些分别从pMT2548(参见WO03/044049)和pMT2549(上述)以约1.1kb的BamH1-Xba1片段转移到以pJaL485为基础的载体的BamH1-Xba1片段上(8.3kb)(参见WO03008575(Novo Nordisk A/S)(申请日2003年1月30日)的实施例3)。对于筛选作用，pJaL485仅包含米曲霉niaD基因的部分，该部分编码硝酸盐还原酶的C端部分。使用宿主菌株，如JaL294的衍生物JaL507(参见WO03/008575的实施例8)，其在功能性的硝酸盐还原酶niaD基因的这个部分包含缺失，并且因此在硝酸盐作为氮源时的生长能力仅可通过同源重组恢复。已经发现大部分以此方式筛选的转化体确实是得自单一同源交换的单一拷贝整合体。在niaD位置的串联整合体确实以较低的频率发生。将无内含子和包含内含子的pJaL485衍生表达质粒分别命名为pMT2777和pMT2836。对于这些质粒中的每一种都筛选米曲霉JaL507的4个转化体，并且通过Southern分析显示在niaD基因座中包含同源整合的单一拷贝转化质粒。将pMT2777衍生的米曲霉转化体命名为MT2882-2885，并且将pMT2836衍生的转化体命名为MT2886-2889。使转化体MT2882-2889中的每一个都生长在上述的YPM，并且将生长3天和7天之后的10μL培养物上清液样品通过PAGE SDS凝胶如上所述分析。结果清楚地显示在每个质粒的转化体间几乎没有分布(spread)(如同所预期的，因为它们应该是独立但相同的菌株)。另一方面，在MT2886-2889(包含内含子)中的表达水平明显高于在MT2882-2885(无内含子)中的表达水平。

在第7天，MT2886-2889样品的相对菌丝霉素水平也已通过酶联免疫吸附测定(ELISA)而确定(参见实施例4)。

实施例3：包含在不同位置的内含子和/或不同内含子的基因的防卫素表达增加

为了促进编码菌丝霉素变体的序列从例如大肠杆菌和酿酒酵母载体转移到曲霉属表达载体，决定将菌丝霉素内含子从原来置于编码成熟菌丝霉素序列中的位置，重新安置到在前原肽(prepro-peptide)编码序列中的位置。为了进行这个重新安置，将突变通过体外诱变引入无内含子的菌丝霉素编码序列，产生位于信号肽编码序列中的MluN1位点。仅有可能通过将氨基酸在信号肽中改变(Leu17改变成Ala)来引入MluN1位点。根据常用的信号预测程序，预测这种氨基酸改变将不减弱信号肽功能。将这种无内含子、包含MluN1的编码菌丝霉素的序列显示为SEQ ID NO：18；将对应的曲霉属表达质粒称为pMT2898。

将源自黑曲霉葡糖淀粉酶第二内含子并且以使其能够从质粒pMT2374中切下作为55bp SnaB1-Pvu2而构建的内含子(参见WO03104457(NovoNordisk A/S)(申请日2003年12月18日)的实施例1)***到pMT2898的MluN1位点以得到pMT2899，其中内含子经证实以适当的方向***。将这个包含内含子的pMT2899的编码菌丝霉素的序列显示为SEQ ID NO：19。

此外，合成制备原来存在于编码成熟菌丝霉素的序列中的内含子，使其能够同样作为SnaB1-Pvu2片段移动。这仅可能通过将内含子的最后两个碱基从T改变成C。也将这个内含子转移到pMT2898的MluN1位点以得到pMT2900，其中正确的内含子方向通过测序来证实。将包含内含子的pMT2900的菌丝霉素编码序列显示为SEQ ID NO：20。

将质粒pMT2898、2899和2900转化至米曲霉BECh2，使其在乙酰胺上生长来选择。将大约20个具有每种质粒的转化体进行两次重新分离，并且使其生长在YPM培养基上，如上所述。从上清液的SDS PAGE凝胶显而易见的是，具有包含内含子的构建体pMT2899和pMT2900的转化体的平均菌丝霉素表达水平显著高于无内含子的构建体pMT2898的转化体的平均菌丝霉素表达水平。此外，由于独立乙酰胺选择的转化体间的表达水平改变很大，所以决定将MT2898-2900的表达盒转移至源自pJaL485的基于niaD的表达载体，如上述实施例2中所述。所得表达质粒是pMT2901、pMT2902和pMT2903，分别对应pMT2898、pMT2899和pMT2900。将pMT2901-2903转化至niaD缺陷的宿主JaL507，如上述实施例2中所述。将许多转化体对于每种转化重新分离。使转化体生长在YPM上，并且如上所述将上清液在SDSPAGE凝胶上跑胶。同样在这种情况下，包含内含子的构建体pMT2902和pMT2903的表达水平明显高于具有构建体pMT2901的转化体的表达水平。仍有待Southern分析证明哪些转化体确实是单一拷贝的整合体，但从经验上，在此设定(set up)中大多数硝酸盐选择的转化体都可显示为单一拷贝的整合体，即使串联整合(tandem integration)确实发生。每种质粒选择两个转化体作为代表性菌株：pMT2901(菌株MT2946和MT2947)、pMT2902(菌株MT2948和MT2949)和pMT2903(菌株MT2952和MT2953)。

也对MT2946-2949进行菌丝霉素的酶联免疫吸附测定定量(参见实施例4)。

实施例4：竞争性酶联免疫吸附测定-在米曲霉发酵中菌丝霉素产率的评估

使用对抗纯化的菌丝霉素所产生的兔多克隆抗体，应用间接竞争性酶联免疫吸附测定以评估米曲霉发酵液中的产率。这种类型的分析是一般应用在对给定的蛋白质/肽进行定量的标准方法，假定已产生抗血清。

使用以下的材料和缓冲液：

-菌丝霉素：PCT申请WO03/044049中描述的防卫素；

-F96 MaxiSorp平板(Nunc，目录编号：439454)；

-F96微孔平板(Nunc，目录编号：269787)；

-脱脂乳粉(Merck，目录编号：1.15363.0500)；

-Tween20(Merck，目录编号：8.22184.0500)；

-菌丝霉素特异性兔多克隆抗体(Novazymes)；

-猪抗兔免疫球蛋白/HRP(DAKO，P0448)；

-TMB Plus，Ready-to-Go(KemEnTek，目录编号：4390)；

-硫酸(Merck，目录编号：1.00731.1000)；

-磷酸盐缓冲溶液(PBS)，pH7.2，1L：

.8.00克氯化钠，

.0.20克氯化钾，

.1.04克磷酸氢二钾，

.0.32克磷酸二氢钾；

-封闭缓冲液：磷酸盐缓冲溶液、2％脱脂乳；

-洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲溶液、0.05％Tween20；

-稀释缓冲液：磷酸盐缓冲溶液、0.5％脱脂乳、0.05％Tween20；

简而言之，将未稀释和系列两倍稀释的培养液(culture broth)，与1∶1000的多克隆抗体于稀释缓冲液中预温育。在室温温育2小时之后，将这些样品转移至预涂覆菌丝霉素的(Plectasin pre-coated)平板(以0.1微克/毫升的菌丝霉素涂覆，并且使用封闭缓冲液封闭剩余的结合)。在室温培养1小时之后，将结合的抗体使用二次抗体(猪抗兔-HRP)并且之后使用色原(chromogen)(TMBPlus)来检测。菌丝霉素结合抗体的检测通过在450nm的吸光度来测量，其产生抗体结合的滴定曲线。

在整个分析中，将平板使用洗涤缓冲液洗涤，并且将物质稀释物(substance dilution)如制造商(DAKO&KemEnTek)所述制得。

解释：没有检测到抗体结合至孔，代表已产生抗体对未知的发酵液的完全结合(抑制)；而所测量的最大吸收等于缺失竞争者(未知的发酵液)的抑制。以此方式，我们能够评估抑制50％对孔的结合所需的量(稀释的培养液(dilutedbroth))。结果描述于下表中。结果相对于无内含子(MT2882、MT2883、MT2884和MT2885)的发酵液所测量的产率来计算。结果显示在表1。

结果显示通过使用含有内含子的基因构建体，表达水平增加至通过使用无内含子的基因构建体所获得表达水平的大约330％。

表1

内含子	培养物ID	相对产率	平均产率
内含子	培养物ID	相对产率	平均产率	-	MT2882，第7天	106	100
-	MT2883，第7天	108		-	MT2882，第7天	106	100
-	MT2883，第7天	108		-	MT2884，第7天	96
-	MT2885，第7天	91		-	MT2884，第7天	96
-	MT2885，第7天	91		+	MT2886，第7天	335	330
+	MT2887，第7天	368		+	MT2886，第7天	335	330
+	MT2887，第7天	368		+	MT2888，第7天	310
+	MT2889，第7天	320		+	MT2888，第7天	310
+	MT2889，第7天	320		-	MT2946	77	89
-	MT2947	100		-	MT2946	77	89
-	MT2947	100		+	MT2948	268	331
+	MT2949	394		+	MT2948	268	331

实施例5：来自阿姆丝特丹散囊菌(E.amstelodami)的防卫素的增加表达

来自阿姆丝特丹散囊菌的防卫素编码cDNA先前已被鉴定，并且将该防卫素命名为散囊菌素(Eurocin)(参见DK2005/000725(Novozymes A/S)的实施例；或SEQ ID NO：3)。将所述cDNA在米曲霉中表达，以得到活性的散囊菌素防卫素肽。为了增加表达水平，制备包含基因组DNA序列(包括两个内含子)的表达构建体。

阿姆丝特丹散囊菌的基因组DNA使用制备真菌基因组DNA的标准方法来制备。使用大约50ng的基因组DNA作为PCR反应中的模板，使用以下引物：

引物A：

TCTTGGATCCACCATGCACTTCACCAAGGTCTCC(SEQ ID NO：21)

引物B：

TCTTCTCGAGTTAGAAAGAACAGGTGCAGGTAC(SEQ ID NO：22)

将10pmol的每个引物用于50μL的反应体积中。退火温度是55℃，并且在72℃延伸1分钟。使用Expand High Fidelity PCR System(Roche)进行总共35个循环。将PCR产物用BamH1和Xho1消化，其在通过PCR引物引入的突出端中切割。将消化物在2％的琼脂糖凝胶上跑胶，并且分离大约400bp的条带。将分离的条带连接到经BamH1-Xho1消化的质粒pMT2786内(参见PCT/DK2005/000725的实施例2)，并且转化至选择亮氨酸原养型的大肠杆菌MT173。将BamH1-Xho1的***物测序，并且证明其编码前原-散囊菌素序列，该序列对应于先前表征的cDNA(参见PCT/DK2005/000725或SEQ IDNO：3)，但也包含分别为45和53个碱基的两个内含子序列。BamH1-Xho1***物的序列和结构示于SEQ ID NO：23。将包含***物的曲霉属表达质粒命名为pMT2945。

将pMT2945转化至米曲霉BECh2，如实施例1所述，并且如实施例1重新分离和发酵20个转化体。也如上所述在SDS凝胶上分析上清液。同前，也使用具有基于散囊菌素cDNA的表达质粒pMT2935的转化体进行平行实验(参见PCT/DK2005/000725的实施例2)。

基于cDNA构建体pMT2935和包含内含子的构建体pMT2945的转化体在SDS凝胶上均产生大小对应于散囊菌素的明显条带。

评估基于包含内含子的基因组构建体pMT2945的转化体以产生基于cDNA构建体pMT2935的转化体所得的表达水平的300-400％。

实施例6：利用来自PFAM数据库的HMM档案鉴定防卫素

使用隐蔽马尔科夫模型序型(HMM序型)的序列分析，可在互联网上在线或在计算机上本地地，利用可自由得到的软件包熟知的HMMER而进行。目前的版本是自2003年10月的HMMER2.3.2。

HMM序型可得自熟知的PFAM数据库。目前的版本是自2004年11月的PFAM16.0。对于所有的计算机平台，HMMER和PFAM都可得自例如圣路易华盛顿大学(美国)医学院(Washington University in St.Louis(USA)，School of Medicine)(http://pfam.wustl.edu和http://hmmer.wustl.edu)。

如果查询的氨基酸序列或其片段是属于以下五种PFAM家族之一，则氨基酸序列是本发明的防卫素：

·防卫素_β或“β防卫素”，登录号：PF00711；

·防卫素_propep或“防卫素前肽”，登录号：PF00879；

·防卫素_1或“哺乳动物防卫素”，登录号：PF00323；

·防卫素_2或“节肢动物防卫素”，登录号：PF01097；

·γ-硫素或“γ-硫素家族”，登录号：PF00304。

当在线使用PFAM数据库时，或当本地使用hmmpfam程序(得自HMMER软件包)时，如果氨基酸序列产生大于0.1的E值和大于或等于0的分数，则根据本发明，所述氨基酸序列属于PFAM家族。

当序列分析使用“hmmpfam”程序在本地进行时，需要从PFAM数据库获得(下载)HMM序型。对于每个家族都存在两种序型：“xxx_ls.hmm”用于全局检索，而“xxx_fs.hmm”用于局部检索(“xxx”是家族的名称)。这对于上述五个家族产生总共十种序型。

这十种序型可单独地使用或联合(附加)成单一的序型(使用文本编辑器-序型是ASCII文件)，其可命名为例如“defensin.hmm”。然后查询的氨基酸序列可通过使用以下的命令行来评估：

hmmpfam-E0.1 defensin.hmm sequence_file

-其中“sequence_file”是具有由HMMER软件包所识别的任何格式的查询氨基酸序列的文件。

如果分数大于或等于零(0.0)并且E-值大于0.1，则查询的氨基酸序列是本发明的防卫素。

PFAM数据库在Bateman等，Pfam蛋白质家族数据库，Nucl.AcidsRes.(2004年1月)，32：D138-D141(BATEMAN，.The Pfam Protein FamiliesDatabase.Nucleic acid res.，January vol.32，p.D138-D141.ISSN0305-1048.)中进一步说明。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>在丝状真菌中重组表达防卫素

<130>10789.204-WO

<160>24

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>288

<212>DNA

<213>淡黑假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(285)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(69)

<220>

<221>成熟肽

<222>(166)..(285)

<400>1

atg caa ttt acc acc atc ctc tcc atc ggt atc acc gtc ttc gga ctt 48

Met Gln Phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly Ile Thr Val Phe Gly Leu

-55 -50 -45 -40

ctc aac acc gga gcc ttt gca gca ccc cag cct gtt ccc gag gct tac 96

Leu Asn Thr Gly Ala Phe Ala Ala Pro Gln Pro Val Pro Glu Ala Tyr

-35 -30 -25

gct gtt tct gat ccc gag gct cat cct gac gat ttt gct ggt atg gat 144

Ala Val Ser Asp Pro Glu Ala His Pro Asp Asp Phe Ala Gly Met Asp

-20 -15 -10

gcg aac caa ctt cag aaa cgt gga ttt gga tgc aat ggt cct tgg gat 192

Ala Asn Gln Leu Gln Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp

-5 -1 1 5

gag gat gat atg cag tgc cac aat cac tgc aag tct att aag ggt tac 240

Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr

10 15 20 25

aag gga ggt tat tgt gct aag ggg ggc ttt gtt tgc aag tgt tac tag 288

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

30 35 40

<210>2

<211>95

<212>PRT

<213>淡黑假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)

<400>2

Met Gln Phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly Ile Thr Val Phe Gly Leu

-55 -50 -45 -40

Leu Asn Thr Gly Ala Phe Ala Ala Pro Gln Pro Val Pro Glu Ala Tyr

-35 -30 -25

Ala Val Ser Asp Pro Ghu Ala His Pro Asp Asp Phe Ala Gly Met Asp

-20 -15 -10

Ala Asn Gln Leu Gln Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp

-5 -1 1 5

Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr

10 15 20 25

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

30 35 40

<210>3

<211>273

<212>DNA

<213>阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)

<220>

<22l>CDS

<222>(1)..(270)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(60)

<220>

<221>成熟肽

<222>(145)..(270)

<400>3

atg cac ttc acc aag gtc tcc acc att ctt ttt acc atc ttc gcc gcc 48

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala

-45 -40 -35

ggc atc atg gct gct ccc acc gaa gga gtc cgt gag gaa gcc gcc cct 96

Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro

-30 -25 -20

ggc cag gag gtt tac ccc gac gaa cct cct gct tct ctg acc aag cgt 144

Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg

-15 -10 -5 -1

ggc ttc gga tgt cct ggt gat gcc tac cag tgc agt gaa cac tgc agg 192

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1 5 10 15

gcc ctg ggc ggt gga cgc act gga gga tac tgt gct gga cct tgg tat 240

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

20 25 30

ttg ggt cac cct acc tgc acc tgt tct ttc taa 273

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

35 40

<210>4

<211>90

<212>PRT

<213>阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)

<400>4

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala

-45 -40 -35

Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro

-30 -25 -20

Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg

-15 -10 -5 -1

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1 5 10 15

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

20 25 30

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

35 40

<210>5

<211>273

<212>DNA

<213>白云杉(Picea glauca)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(270)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(60)

<220>

<221>成熟肽

<222>(151)..(270)

<400>5

atg aag ttc acc atc tcc atc atc gcc gct ctc gct ttc ttc gcc cag 48

Met Lys Phe Thr Ile Ser Ile Ile Ala Ala Leu Ala Phe Phe Ala Gln

-50 -45 -40 -35

gga atc gtg gca gct cct gcg cct atc ccc gag gcc gcc gcg gtg gct 96

Gly Ile Val Ala Ala Pro Ala Pro Ile Pro Glu Ala Ala Ala Val Ala

-30 -25 -20

gcc cca gag gcc gag cca aag gcg tta gat gag ctt ccg gag ttg caa 144

Ala Pro Glu Ala Glu Pro Lys Ala Leu Asp Glu Leu Pro Glu Leu Gln

-15 -10 -5

aag cgt ggc ttt ggg tgc aac ggt tgg cct ttc gag gac gat gag cag 192

Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Trp Pro Phe Glu Asp Asp Glu Gln

-1 1 5 10

tgc cat aat cac tgc aag acc att cct ggt tat aag ggt ggc tac tgt 240

Cys His Asn His Cys Lys Thr Ile Pro Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys

15 20 25 30

gcc aac gtt ggc acc act tgc aag tgc tac tag 273

Ala Asn Val Gly Thr Thr Cys Lys Cys Tyr

35 40

<210>6

<211>90

<212>PRT

<213>白云杉(Picea glauca)

<400>6

Met Lys Phe Thr Ile Ser Ile Ile Ala Ala Leu Ala Phe Phe Ala Gln

-50 -45 -40 -35

Gly Ile Val Ala Ala Pro Ala Pro Ile Pro Glu Ala Ala Ala Val Ala

-30 -25 -20

Ala Pro Glu Ala Glu Pro Lys Ala Leu Asp Glu Leu Pro Glu Leu Gln

-15 -10 -5

Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Trp Pro Phe Glu Asp Asp Glu Gln

-1 1 5 10

Cys His Asn His Cys Lys Thr Ile Pro Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys

15 20 25 30

Ala Asn Val Gly Thr Thr Cys Lys Cys Tyr

35 40

<210>7

<211>189

<212>DNA

<213>维吉尼亚巨牡蛎(Crassostrea virginica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(186)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(66)

<220>

<221>成熟肽

<222>(67)..(186)

<400>7

atg aaa gtg ttt gta ctt ctt aca ata gca gta atg ctt atg gta tct 48

Met Lys Val Phe Val Leu Leu Thr Ile Ala Val Met Leu Met Val Ser

-20 -15 -10

gcc gac gtt gct ttg gcc ggc ttt ggc tgt cct ttg aac cgg tac cag 96

Ala Asp Val Ala Leu A1a Gly Phe Gly Cys Pro Leu Asn Arg Tyr Gln

-5 -1 1 5 10

tgt cac tca cat tgc caa tcc att ggt cgt aaa ggt gga tac tgt ggt 144

Cys His Ser His Cys Gln Ser Ile Gly Arg Lys Gly Gly Tyr Cys Gly

15 20 25

ggg tgg tgg agt ttt aca tgc aca tgc tac cgc act aaa aag tag 189

Gly Trp Trp Ser Phe Thr Cys Thr Cys Tyr Arg Thr Lys Lys

30 35 40

<210>8

<211>62

<212>PRT

<213>维吉尼亚巨牡蛎(Crassostrea virginica)

<400>8

Met Lys Val Phe Val Leu Leu Thr Ile Ala Val Met Leu Met Val Ser

-20 -15 -10

Ala Asp Val Ala Leu Ala Gly Phe Gly Cys Pro Leu Asn Arg Tyr Gln

-5 -1 1 5 10

Cys His Ser His Cys Gln Ser Ile Gly Arg Lys Gly Gly Tyr Cys Gly

15 20 25

Gly Trp Trp Ser Phe Thr Cys Thr Cys Tyr Arg Thr Lys Lys

30 35 40

<210>9

<211>189

<212>DNA

<213>吉伯斯钳蝎(Mesobuthus gibbosus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(186)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(72)

<220>

<221>成熟肽

<222>(73)..(186)

<400>9

atg aaa acc att gta ctt ctt ttc gtg ttg gct tta gta ttc tgc act 48

Met Lys Thr Ile Val Leu Leu Phe Val Leu Ala Leu Val Phe Cys Thr

-20 -15 -10

ctt gaa atg gga atg gtg gaa gcc gga ttc ggt tgt cca ttc aat caa 96

Leu Glu Met Gly Met Val Glu Ala Gly Phe Gly Cys Pro Phe Asn Gln

-5 -1 1 5

gga aga tgt cac aga cat tgt cga agt att cgt cga aga gga gga tat 144

Gly Arg Cys His Arg His Cys Arg Ser Ile Arg Arg Arg Gly Gly Tyr

10 15 20

tgc gat gga ttt ttg aaa caa aga tgt gtt tgt tat cgg aga taa 189

Cys Asp Gly Phe Leu Lys Gln Arg Cys Val Cys Tyr Arg Arg

25 30 35

<210>10

<211>62

<212>PRT

<213>吉伯斯钳蝎(Mesobuthus gibbosus)

<400>10

Met Lys Thr Ile Val Leu Leu Phe Val Leu Ala Leu Val Phe Cys Thr

-20 -15 -10

Leu Glu Met Gly Met Val Glu Ala Gly Phe Gly Cys Pro Phe Asn Gln

-5 -1 1 5

Gly Arg Cys His Arg His Cys Arg Ser Ile Arg Arg Arg Gly Gly Tyr

10 15 20

Cys Asp Gly Phe Leu Lys Gln Arg Cys Val Cys Tyr Arg Arg

25 30 35

<210>11

<211>198

<212>DNA

<213>太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(195)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(66)

<220>

<221>成熟肽

<222>(67)..(195)

<400>11

atg aaa gta ttc gtt ctt tta aca cta gct gtc ctt ctg atg gtt tct 48

Met Lys Val Phe Val Leu Leu Thr Leu Ala Val Leu Leu Met Val Ser

-20 -15 -10

gca gac atg gct ttt gct gga ttt ggg tgt ccg ggt aac cag tta aag 96

Ala Asp Met Ala Phe Ala Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asn Gln Leu Lys

-5 -1 1 5 10

tgc aac aat cac tgc aag tcc att agt tgt aga gcg ggc tac tgt gat 144

Cys Asn Asn His Cys Lys Ser Ile Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Cys Asp

15 20 25

gca gcc acg ctc tgg tta aga tgt aca tgt acc gat tgt aat gga aag 192

Ala Ala Thr Leu Trp Leu Arg Cys Thr Cys Thr Asp Cys Asn Gly Lys

30 35 40

aag taa 198

Lys

<210>12

<211>65

<212>PRT

<213>太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)

<400>12

Met Lys Val Phe Val Leu Leu Thr Leu Ala Val Leu Leu Met Val Ser

-20 -15 -10

Ala Asp Met Ala Phe Ala Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asn Gln Leu Lys

-5 -1 1 5 10

Cys Asn Asn His Cys Lys Ser Ile Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Cys Asp

15 20 25

Ala Ala Thr Leu Trp Leu Arg Cys Thr Cys Thr Asp Cys Asn Gly Lys

30 35 40

Lys

<210>13

<211>195

<212>DNA

<213>维吉尼亚巨牡蛎(Crassostrea virginica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(192)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(66)

<220>

<221>成熟肽

<222>(67)..(192)

<400>13

atg aaa gtg ttt gtt ctt cta aca ata gct gtc atg ctt ttg gta tct 48

Met Lys Val Phe Val Leu Leu Thr Ile Ala Val Met Leu Leu Val Ser

-20 -15 -10

gcc gat gta gct act gca gat aac gga tgt ccc cgt cgt ccg aga atc 96

Ala Asp Val Ala Thr Ala Asp Asn Gly Cys Pro Arg Arg Pro Arg Ile

-5 -1 1 5 10

tgt cac aat cgg tgc ata tac aaa ggt cgt aga ggc gga aaa tgt gtc 144

Cys His Asn Arg Cys Ile Tyr Lys Gly Arg Arg Gly Gly Lys Cys Val

15 20 25

gga aag tgg aga agc tta tgc gaa tgc atc tac cca tcg aag gcc ggg 192

Gly Lys Trp Arg Ser Leu Cys Glu Cys Ile Tyr Pro Ser Lys Ala Gly

30 35 40

tga 195

<210>14

<211>64

<212>PRT

<213>维吉尼亚巨牡蛎(Crassostrea virginica)

<400>14

Met Lys Val Phe Val Leu Leu Thr Ile Ala Val Met Leu Leu Val Ser

-20 -15 -10

Ala Asp Val Ala Thr Ala Asp Asn Gly Cys Pro Arg Arg Pro Arg Ile

-5 -1 1 5 10

Cys His Asn Arg Cys Ile Tyr Lys Gly Arg Arg Gly Gly Lys Cys Val

15 20 25

Gly Lys Trp Arg Ser Leu Cys Glu Cys Ile Tyr Pro Ser Lys Ala Gly

30 35 40

<210>15

<211>207

<212>DNA

<213>米曲菌(Aspergillus oryzae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(207)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(54)

<220>

<221>成熟肽

<222>(79)..(207)

<400>15

atg aaa ctt ctg acg gtc gcc ttt tcc ctt ctt ctt ctc ggg caa gtc 48

Met Lys Leu Leu Thr Val Ala Phe Ser Leu Leu Leu Leu Gly Gln Val

-25 -20 -15

cat gcc agt cct ttg gta ctc gac aaa agg tct tcc tgc cag ttg ggt 96

His Ala Ser Pro Leu Val Leu Asp Lys Arg Ser Ser Cys Gln Leu Gly

-10 -5 -1 1 5

gac gtc tgg gac ctc aat gct gca gac gcc gcc tgc agc gct tcg tgt 144

Asp Val Trp Asp Leu Asn Ala Ala Asp Ala Ala Cys Ser Ala Ser Cys

10 15 20

gcc att caa cac ggc gac aaa cac ggc gga cac tgc gat aag aac aag 192

Ala Ile Gln His Gly Asp Lys His Gly Gly His Cys Asp Lys Asn Lys

25 30 35

gtc tgc gtc tgc aat 207

Val Cys Val Cys Asn

40

<210>16

<211>69

<212>PRT

<213>米曲菌(Aspergillus oryzae)

<400>16

Met Lys Leu Leu Thr Val Ala Phe Ser Leu Leu Leu Leu Gly Gln Val

-25 -20 -15

His Ala Ser Pro Leu Val Leu Asp Lys Arg Ser Ser Cys Gln Leu Gly

-10 -5 -1 1 5

Asp Val Trp Asp Leu Asn Ala Ala Asp Ala Ala Cys Ser Ala Ser Cys

10 15 20

Ala Ile Gln His Gly Asp Lys His Gly Gly His Cys Asp Lys Asn Lys

25 30 35

Val Cys Val Cys Asn

40

<210>17

<211>362

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>具有内含子的菌丝霉素编码序列(参见实施例1)

<400>17

ggatccacca tgcaatttac caccatcctc tccatcggta tcaccgtctt cggacttctc 60

aacaccggag cctttgcagc accccagccg gtacccgagg cttacgctgt ttctgatccc 120

gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaacc aacttcagaa acgtggattt 180

ggatgcaatg gtccttggga tgaggatgat atgcagtgcc acaagtaaga atcacttata 240

actagtagat taagccaaga gtattggaac tgatgataaa tagtcactgc aagtctatta 300

agggttacaa gggaggttat tgtgctaagg ggggctttgt ttgcaagtgt tactagctcg 360

ag 362

<210>18

<211>303

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>无内含子、包含MluN1的编码菌丝霉素的序列(参见实施例3)

<400>18

ggatccacca tgcaatttac caccatcctc tccatcggta tcaccgtctt cggactggcc 60

aacaccggag cctttgcagc accccagccg gtacccgagg cttacgctgt ttctgatccc 120

gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaacc aacttcagaa acgtggattt 180

ggatgcaatg gtccttggga tgaggatgat atgcagtgcc acaatcactg caagtctatt 240

aagggttaca agggaggtta ttgtgctaag gggggctttg tttgcaagtg ttactagctc 300

gag 303

<210>19

<211>358

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>具有pMT2899内含子的编码菌丝霉素的序列(参见实施例3)

<400>19

ggatccacca tgcaatttac caccatcctc tccatcggta tcaccgtctt cggactgggt 60

atgtacacca cccccttgcg tctgatctgt gacatatgta gctgactggt cagccaacac 120

cggagccttt gcagcacccc agccggtacc cgaggcttac gctgtttctg atcccgaggc 180

tcatcctgac gattttgctg gtatggatgc gaaccaactt cagaaacgtg gatttggatg 240

caatggtcct tgggatgagg atgatatgca gtgccacaat cactgcaagt ctattaaggg 300

ttacaaggga ggttattgtg ctaagggggg ctttgtttgc aagtgttact agctcgag 358

<210>20

<211>362

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>pMT2900的编码菌丝霉素的序列(参见实施例3)

<400>20

ggatccacca tgcaatttac caccatcctc tccatcggta tcaccgtctt cggactgggt 60

aagaatcact tataactagt agattaagcc aagagtattg gaactgatga taaacagcca 120

acaccggagc ctttgcagca ccccagccgg tacccgaggc ttacgctgtt tctgatcccg 180

aggctcatcc tgacgatttt gctggtatgg atgcgaacca acttcagaaa cgtggatttg 240

gatgcaatgg tccttgggat gaggatgata tgcagtgcca caatcactgc aagtctatta 300

agggttacaa gggaggttat tgtgctaagg ggggctttgt ttgcaagtgt tactagctcg 360

ag 362

<210>21

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物A(参见实施例5)

<400>21

tcttggatcc accatgcact tcaccaaggt ctcc 34

<210>22

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物B(参见实施例5)

<400>22

tcttctcgag ttagaaagaa caggtgcagg tac 33

<210>23

<211>386

<212>DNA

<213>阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)

<220>

<221>CDS

<222>(10)..(195)

<220>

<221>信号肽

<222>(10)..(69)

<220>

<221>成熟肽

<222>(154)..(377)

<220>

<221>内含子

<222>(196)..(240)

<220>

<221>CDS

<222>(241)..(305)

<220>

<221>内含子

<222>(306)..(358)

<220>

<221>CDS

<222>(359)..(377)

<400>23

ggatccacc atg cac ttc acc aag gtc tcc acc att ctt ttt acc atc ttc 51

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe

-45 -40 -35

gcc gcc ggc atc atg gct gct ccc acc gaa gga gtc cgt gag gaa gcc 99

Ala Ala Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala

-30 -25 -20

gcc cct ggc cag gag gtt tac ccc gac gaa cct cct gct tct ctg acc 147

Ala Pro Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr

-15 -10 -5

aag cgt ggc ttc gga tgt cct ggt gat gcc tac cag tgc agt gaa cac 195

Lys Arg Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His

-1 1 5 10

gtatgtcctg ctgctatcta gagtgaatga agctaatgaa tatag tgc agg gcc ctg 252

Cys Arg Ala Leu

15

ggc ggt gga cgc act gga gga tac tgt gct gga cct tgg tat ttg ggt 300

Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr Leu Gly

20 25 30

cac cc gtatgttgcc tagatattta attgtttata gtcctttact gatgagctta 355

His Pro

35

tag t acc tgc acc tgt tct ttc taactcgag 386

Thr Cys Thr Cys Ser Phe

40

<210>24

<211>90

<212>PRT

<213>阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)

<400>24

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala

-45 -40 -35

Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro

-30 -25 -20

Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg

-15 -10 -5 -1

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1 5 10 15

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

20 25 30

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

35 40

Claims

1.一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码防卫素的外源核酸序列和一个或多个内含子序列。

2.权利要求1的宿主细胞，其是曲霉属宿主细胞。

3.权利要求2的曲霉属宿主细胞，其是黑曲霉或米曲霉宿主细胞。

4.权利要求1-3任一项的宿主细胞，其中所述防卫素是α-防卫素、β-防卫素、θ-防卫素、节肢动物防卫素、昆虫防卫素或植物防卫素。

5.权利要求1-4任一项的宿主细胞，其能够以使用无内含子序列的核酸构建体时所得量的至少150％的量产生防卫素。

6.一种在丝状真菌宿主细胞中重组产生防卫素的方法，其包括培养丝状真菌宿主细胞，该宿主细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列和一个或多个内含子序列；和回收防卫素肽。

7.权利要求6的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是曲霉属宿主细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述曲霉属宿主细胞是黑曲霉或米曲霉宿主细胞。

9.权利要求6-8任一项的方法，其中所述防卫素是α-防卫素、β-防卫素、θ-防卫素、节肢动物防卫素、昆虫防卫素或植物防卫素。

10.权利要求6-9任一项的方法，其导致防卫素以使用无内含子序列的核酸构建体时所得量的至少150％的量产生。

11.核酸构建体的用途，该核酸构建体包含编码防卫素肽的核酸序列和一个或多个内含子序列，所述用途用于改进丝状真菌宿主细胞中防卫素的重组表达水平。

12.权利要求11的用途，其中所述丝状真菌宿主细胞是曲霉属宿主细胞。

13.权利要求12的用途，其中所述曲霉属宿主细胞是黑曲霉或米曲霉宿主细胞。

14.权利要求11-13任一项的用途，其中所述防卫素是α-防卫素、β-防卫素、θ-防卫素、节肢动物防卫素、昆虫防卫素或植物防卫素。

15.权利要求11-14任一项的用途，其中所述防卫素的表达水平与使用不包含内含子序列的核酸构建体的情况相比高至少50％。