CN101139585B

CN101139585B - 用基因工程菌转化苯胺产邻苯二酚的方法

Info

Publication number: CN101139585B
Application number: CN2006101268446A
Authority: CN
Inventors: 武波; 张宗武; 张敏; 李俊芳; 梁璇; 毕洪凯
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2006-09-07
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2026-09-07
Also published as: CN101139585A

Abstract

本发明公开了一种利用苯胺双加氧酶基因工程菌AC03转化苯胺生成邻苯二酚的方法，包括步骤：1)构建基因组文库，得到阳性克隆，由此获得一个完整的苯胺双加氧酶基因簇；2)将该基因簇连接于pLAFR6载体上，并将pGXA69重组质粒电脉冲导入E.coli DH5α构建该基因工程菌；3)利用该基因簇的表达产物在苯胺浓度为0.5mg/mL、培养基为LB合成培养基、温度为37℃、pH值为7.0以及AC03接种量为3％的条件下将苯胺转化生成邻苯二酚，底物分子水平转化率高达92.4％，有效地克服了邻苯二酚生物合成方法中存在的不足。

Description

用基因工程菌转化苯胺产邻苯二酚的方法

技术领域

本发明涉及利用基因工程菌治理环境污染的方法，尤其涉及利用基因工程菌转化苯胺的方法。

背景技术

苯胺是一种重要的化工原料，广泛应用于国防、印染、塑料、油漆、农药和医药工业等，同时也是严重污染环境和危害人体健康的有害物质，是一种“三致”物质，可以被皮肤吸收或经食道吞咽或经呼吸道吸入。由于苯胺对生态生物的高度毒性作用，已经被列入“中国环境优先污染物黑名单”中，在工业排水中要求严格控制。随着化工工业的发展，苯胺的需求呈明显上升趋势，由此进入环境的量也会越来越多，对环境的毒害也会越来越大。如何减少苯胺对环境的污染，已经逐渐引起了人们的注意。

目前国内外对苯胺废水的处理主要有物理、化学、生物等方法，但基本处于研究的起步阶段。

由于苯胺废水的毒性强，生物降解性差，现有的生化处理***难以有效去除污染，但利用微生物的代谢活性处理环境中的有机污染物由于投资少、占地少也不需要特殊设备而倍受青睐，尤其是随着高效苯胺降解菌的筛选分离，生物法处理苯胺废水显示出越来越大的潜力。

在好氧菌中，苯胺双加氧酶基因簇是降解苯胺的关键基因，编码苯胺降解途径的第一个酶，可用于将苯胺转化成为邻苯二酚(Catechol，简称CAT)。

目前已在P.putida UCC22(恶臭假单胞UCC22菌株)菌株、Acinectobactersp.YAA(不动杆菌属YAA菌株)菌株及Frateuria ANA-18(弗拉特氏菌属ANA-18菌株)菌株中，克隆到苯胺双加氧酶基因簇，并对其做了功能分析。通过缺失定位、核酸序列分析和多肽分析发现，这三种菌株中六个基因tdnQTA1A2BR(atdA1A2A3A4A5R)顺序位于同一操纵元上，前五个为编码多组分的苯胺双加氧酶基因。tdnQT(atdA1A2)与苯胺的氨基转换及氨的释放有关，tdnA1A2(atdA3A4)编码苯胺双加氧酶基因的大小两个亚基，tdnB(atdA5)编码苯胺双加氧酶基因的还原酶组分。推断出的苯胺转化首先是由TdnA1和TdnA2将分子氧两原子结合到苯胺苯环的1和2号位形成二酚，氨基转移到TdnQ(在氨基酸水平上与谷氨酰胺合成酶有30％的同源性)，然后TdnT可进一步将氨基转化为一种未知底物或者释放氨。

邻苯二酚是一种重要的精细化工产品，具有广泛的应用领域，是农药、医药、香料、橡胶、染料、感光材料等行业的基本有机原料或中间体，发展潜力巨大。

目前，邻苯二酚的来源有三个：一是从焦油中分离，二是从废磺化液中抽提，三是合成法。前两种方法由于来源有限，分离设备庞大，产量较小，不能满足市场需要，因此，第三种方法合成法就显得颇为重要了。而合成法包括化学合成法和微生物合成法。

而目前邻苯二酚的工业生产主要通过化学合成，包括Rhone Poulenc法、Ube法、Brichima法以及Enichem法等。

目前世界上主要的邻苯二酚生产企业有法国罗纳-普朗克公司、日本宇部兴产公司及意大利埃尼(布列希玛)公司，且均采用化学合成法中的苯酚羟基化法。

我国的邻苯二酚工业始于20世纪70年代，多年来生产能力一直徘徊在数百吨，产量甚微，需求主要依赖进口，但前述国外3家公司均不对外转让技术，严重影响了其下游产品的发展。近些年通过不断的科技攻关，在邻苯二酚的生产技术方面，国内取得了不少突破性进展，生产工艺、生产方法日趋成熟和完善。但是，由于国内生产规模的限制，生产成本较高，产品质量水平不高，每年仍需大量的进口，使得邻苯二酚的下游企业的生产受邻苯二酚的供应量和价格的影响而产生动荡，严重制约了邻苯二酚应用领域的开拓和发展。由于受产量和价格的局限，使邻苯二酚应用领域的发展在短期内不会有太大突破，但是仍旧会保持较好的增长态势。我国邻苯二酚下游产品生产与市场潜力巨大，为我国邻苯二酚工业提供了巨大的发展空间。

生物法合成邻苯二酚与传统的化学合成法及提取法相比有很多优点，但目前国内外报道的生物法合成邻苯二酚多采用野生菌或野生菌突变体，目标产物在产生的过程中一部分被菌体所消耗，底物转化率不高。而另一方面，虽然国外已有报道克隆到完整的苯胺双加氧酶基因簇并对其功能进行研究，但尚无人利用其构建基因工程菌产生邻苯二酚。

参考文献：

[1]司航编.化工产品手册——有机化工原料(第二版).北京：化学工业出版社，1995

[2]Kearney，P.C.，and D.D.Nichols.Herbicides：chemistry，degradation，and mode of action，2nd ed.Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.1975

[3]Fukumori，F.and Saint，C.P.Nucleotide sequences and regulationanalysis of genes involved in conversion of aniline to catechol in Pseudomonasputida UCC2(pTDN1).J.Bacteriol.1997，179：399-408

[4]Fujii，T.，Takeo，M.，and Macda，Y.Plasmid-encoded genesspecifying aniline oxidation from Acinectobacter sp.strain YAA.Microbiology.1997，143：93-99

[5]Fujii，T.，Takeo，M.，and Macda，Y.Sequence analysis of the genesencoding a multicomponent dioxygenase involved in oxidation of aniline ando-toluidine in Acinectobacter sp.strain YAA.J.Ferment.Bioeng.1998，85：17-24

[6]Murakami，S.，Hayashi，M.，Aoki，K.et al.Cloning and functionalanalysis of aniline dioxygenase gene cluster，from Frateuria species ANA-18，thatmetabolizes aniline via an ortho-cleavage pathway of catechol.Biosci.Biotechnol.Biochem.2003，67：2351-2358

[7]Boon，N.，Goris，J.，and Top，E.M.et al.Genetic diversity among3-chloroaniline-and aniline-degrading strains of the Comamonadaceae.Appl.Environ.Microbiol.2001，67：1107-1115

[8]王景明.邻苯二酚的应用及合成方法探析.河北化工，1997(4)：46～48

[9]孙炜，曹贵平，张明华，等.邻苯三酚生产技术进展.化学工业与工程技术，2003，24(2)：23～28

[10]吕咏梅.邻苯二酚合成技术进展与市场分析.现代化工，2004，24(1)：60～63

[11]李江，陈劲春，曹小岗，等.生物法合成邻苯二酚.化工科技，2003，11：29-32

[12]Chuan Lu Wang，Shinji Takenaka，Shuichiro Murakami，et al.Isolationof a benzoate-utilizing Pseudomonas strain from soil and production of catecholfrom benzoate by transpositional mutants.Microbiological Research，2001，156：151-158

[13]Katsuhisa Shirai.Catechol production from benzene through reaction withresting and immobilized cells of a mutant strain of Psendomonas.Agric.Biol.Chem，1987，51(1)：121-128

[14]Toshiki Fujii，Masahiro Takeo，Yoshimichi Maeda.Plasmid-encodedgenes specifying aniline oxidation from Acinetobacter sp.strain YAA.Microbiology，1997，143：93-99

[15]Fumiyasu Fukumori，Christopher P.Saint.Nucleotide sequences andregulational analysis of gnes involved in conversion of aniline to catechol inPseudomonas putida UCC22(pTDN1).Bacteriology，1997，179(2)：399-408

[16]Shuichiro Murakami，Teruhiko Hayashi，Tetsuya Maeda，et al.Cloningand functional analysis of aniline dioxygenase gene cluster，from Frateuria speciesANA-18，that metabolize aniline via an ortho-cleavage pathway of catechol.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2003，67(11)：2351-2358

发明内容

本发明的目的，在于提供利用一种基因工程菌的构建将苯胺转化生成邻苯二酚的方法，它能克服现有的邻苯二酚生物合成方法中存在的目标产物被菌体消耗而使得底物转化率不高的不足。

本发明的利用一种基因工程菌的构建将苯胺转化生成邻苯二酚的方法，包括下列步骤：

(1)构建基因组文库，得到阳性克隆，由此获得一个完整的基因簇；

(2)将该基因簇连接于一载体上，并将重组质粒电脉冲导入宿主菌构建所述基因工程菌；

(3)利用所述基因簇的表达产物在必要的条件下将苯胺转化生成邻苯二酚。

本发明所述基因工程菌为苯胺双加氧酶基因工程菌，所述基因簇为苯胺双加氧酶基因簇；所述基因工程菌包含下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；

2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。

携带上述基因的质粒pGXA69已在中国普通微生物菌种保藏管理中心保存，保存编号为CGMCC No.1721，保存日期为2006年5月22日。

序列表中序列1的DNA是质粒pGXA69上所连接的不动杆菌ANA5(毕洪凯、武波，苯胺双加氧酶基因的克隆与序列分析，微生物学通报，2005年第32期)的DNA，由6916个碱基组成，含完整的苯胺双加氧酶基因，分为6个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第530-533位核苷酸为第1个ORF的起始密码子ATG，自5’端的第6587-6590位核苷酸为第6个ORF的终止密码子TAG。自5’端的第456-461位核苷酸为SD序列。

本发明提供的一种利用苯胺双加氧酶基因工程菌的构建将苯胺转化生成邻苯二酚的方法，该基因工程菌生成的邻苯二酚已不能被工程菌进一步利用，除因氧化损失外全部在发酵液中积累，底物分子水平转化率较高，最佳可达92.4％，有效地克服了现有的邻苯二酚生物合成方法中存在的不足。

附图说明

图1为ANA5总DNA不同限制型内切酶酶切后与探针杂交后DNA印迹图。

图2为工程菌AC03能转化苯胺生成邻苯二酚(右)，而经电脉冲导入pLAFR6质粒的E.Coli DH5α对照(CK)不能转化苯胺生成邻苯二酚(左)。

图3为不同苯胺浓度对工程菌AC03生成邻苯二酚的影响。

图4为不同宿主菌对工程菌AC03生成邻苯二酚的影响。

图5为不同培养基对工程菌AC03生成邻苯二酚的影响。

图6为不同温度对工程菌AC03生成邻苯二酚的影响。

图7为不同pH值对工程菌AC03生成邻苯二酚的影响。

图8为不同接种量对工程菌AC03生成邻苯二酚的影响。

具体实施方式

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系；载体为本实验室保存的柯斯质粒载体；购自Promega等的限制性内切酶、修饰酶等试剂。

实施例1、基因组文库的构建及阳性克隆的筛选

从长期受苯胺污染的废水排放口的活性污泥中筛选到一株高效苯胺降解细菌ANA5，能够在以苯胺为唯一碳源和氮源的无机盐培养基上生长。通过对菌株ANA5在不同温度、不同pH值以及培养基中不同苯胺浓度条件下的生长和降解苯胺的情况，初步确定了ANA5的最适生长和降解苯胺的温度为32℃～36℃，最适pH值为7.0，苯胺最高的耐受浓度为2500mg/L。通过传统表型分类法及16SrDNA编码序列同源性比较分析，鉴定该菌株为Acinetobacter sp.(不动杆菌属)。

将分别用PstI、SmaI、XbaI完全酶切的ANA5总DNA与探针杂交，结果显示XbaI酶切的ANA5总DNA在7kb左右有明显的杂交印痕，请参见图1。M为DNA标准带λDNA/HindIII，泳道1是采用PstI酶切后的ANA5的总DNA与探针杂交结果，泳道2是采用SmaI酶切后的ANA5的总DNA与探针杂交结果，泳道3是采用XbaI酶切后的ANA5的总DNA与探针杂交结果，泳道4是阳性对照。而根据已有报道，苯胺双加氧酶基因簇全长约6kb，故选用XbaI酶酶切ANA5总DNA，回收7kb左右片断，构建基因文库，共有2132个克隆。经原位杂交后从文库中筛选到阳性克隆。进一步验证后进行亚克隆测序拼接。

实施例2、基因的测序及序列分析

用双脱氧核苷酸法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。用软件DNAStar对序列进行拼接，用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

序列表中序列1的DNA自5’端的第530-533位核苷酸为基因第一个ORF的起始密码子ATG，自5’端的第6587-6590位核苷酸为基因第六个ORF的终止密码子TAA。在其推测的起始密码子ATG(核苷酸位置530)的上游相隔72bp处有一个潜在的核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS，又叫Shine-Dalgarno，SD序列)序列TGTAAA，该序列可使mRNA和细菌核糖体16S rRNA的3’端碱基互补配对。在其编码区上游，没有一个典型的σ70所识别的启动子序列(大肠杆菌的保守的σ70所识别的启动子序列为相隔17bp的TTGACA和TATAAT)。

序列表中序列2的氨基酸是由序列1分析推测而来，经Blast比对分析，发现与已报道的不动杆菌YAA的苯胺双加氧酶各组分有较高的同源性，其中ORF1与其谷氨基合成酶有94％的同源性，ORF2与其鸟苷酸合成酶有65％的同源性，ORF3与其苯胺双加氧酶的α亚基有87％的同源性，ORF4与其苯胺双加氧酶的β亚基有79％的同源性，ORF5与其苯胺双加氧酶的还原酶有79％的同源性，ORF6与其赖氨酸型调控蛋白有94％的同源性。

实施例3、基因工程菌的构建

将阳性克隆的外源片段酶切完全切下并回收，连于无启动子序列的pLAFR6载体(ELS VANBLEU，et al，genetic and physical map of the pLAFR vector，DNA sequence，2004，15(3)：225-227)上，重组质粒命名为pGXA69，重组质粒已在中国普通微生物菌种保藏管理中心完成用于专利程序的微生物保存，保存编号为CGMCCNo.1721，保存日期为2006年5月22日，该中心的地址为北京市中关村北一条13号2714信箱，邮政编码为100080，电话为010-62542758，E-mail为[email protected]。

将重组质粒pGXA69电脉冲导入E.Coli DH5α构建工程菌，工程菌命名为AC03。将构建的基因工程菌AC03点接于加了苯胺的LA平板上，与经电脉冲导入pLAFR6质粒的E.Coli DH5α对照，经过夜培养后可见AC03周围产生明显的褐色氧化圈，证明有邻苯二酚产生，而对照周围无任何变化，请参见图2，从而证明该工程菌确实能转化苯胺生成邻苯二酚。

实施例4、不同苯胺浓度对产邻苯二酚的影响

因为苯胺对菌体有一定的毒害作用，若初始浓度太高会不利菌体生长及邻苯二酚的产生，因此在相同条件下实验了不同苯胺浓度(0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL)对AC03产生邻苯二酚的影响，请参见图3，结果显示在苯胺浓度为0.5mg/mL时效果最好。

实施例5、不同宿主菌对产邻苯二酚的影响

将质粒pGXA69分别经电脉冲导入E.Coli JM109及S17-1，与AC03一起，在其它条件相同的情况下实验了3种不同的大肠杆菌对产生邻苯二酚的影响，请参见图4，结果显示以E.Coli DH5α为宿主菌效果好。

实施例6、不同培养基对产邻苯二酚的影响

在其它条件相同的情况下实验了3种常用培养基LB、YMB、M9合成培养基对AC03产生邻苯二酚的影响，请参见图5，结果显示不同培养基对邻苯二酚的产生也有一定的影响，以LB培养基效果好。

实施例7、不同温度产邻苯二酚的影响

E.Coli的最适培养温度为37℃，降低温度不利于菌体生长，但可增加邻苯二酚的稳定性，减少其自身氧化的损失，因此，在其它条件相同的情况下实验了不同温度(28℃、30℃、32℃、34℃、37℃)对AC03产生邻苯二酚的影响，请参见图6，结果发现在37℃时效果好。

实施例8、不同pH产邻苯二酚的影响

在其它条件相同的情况下实验了不同pH值(6.4、6.7、7.0、7.2、7.5)对AC03产邻苯二酚的影响，请参见图7，结果显示pH值为7.0的效果好。

实施例9、不同接种量对产邻苯二酚的影响

根据上述实验结果，在苯胺浓度0.5mg/mL，采用LB培养基，E.Coli DH5α为宿主菌，于37℃培养的条件下实验了AC03的不同接种量(1％、3％、5％)对AC03产生邻苯二酚的影响，请参见图8，结果发现3％接种量时效果好，邻苯二酚的产量在20h可达0.546mg/mL，底物分子水平转化率达92.4％。

序列表

<160>1

TCTAGAAATT TCTTTAGCAT CATATAGTAA TGTGACTCTA GCTAGCATTT GTGCATGATT 60

TACTAGATAG CTAGTATCTA AAGCATTTAT TATTTCCATT CCCATTTCAA CGTTACTTTT 120

ATCTTTAAAG ATTTTTAAGA TATCTCCTGG ATCTCTGCTC TCACATTCCT CAATAAAATA 180

TAGGAATTGC TGTGCTCTTT TATTTAATTG ATATTGAGTA AAACCTTGAT AGATACCCTT 240

CAGAGCACTA ACTATAGGGA ATGCTTTAAT AACCTCTTCT AAAGCATTTT CAGTTGTATT 300

TAGTAAAACG TTATCTACCA AATTTTCACT AACTTCTGAA GTTATTCCTA ATATTTGATT 360

TTTAGCATTC ATTAACTTAT ATCCAAGATC AAACTACTAC CCTCCCCGCG CAGCATTTTT 420

GCAAAACGGT TTTGCACAGA TGTTATAGAA CGGGGTGTAA AAACTAACTA AAGTCGAAAT 480

ATTGACATGC GTCAACAAGT GCTCGAAAAA TCATACAAAG GGATGTCCCA TGAGTGAGAA 540

ATTAGATTTT ATAACGAAAA ATAATCTTTG GACAGATAAG CAGCGAGATG CAGCCGACAA 600

AGTTCTCGCA GAAATTGATT CTTTAGGGCT TGAGATGATT CGGCTTTCTT GGGCCGATCA 660

ATACGGTCTC CTTAGAGGCA AATCACTCAC GGTTGCATCG CTTAAATCAG CCTTTAAAGA 720

AGGGTCAGAA GTTACGATGG CACCTTTCTT TTTCGACCTA GTCAGCTCAA TAGTTTTCAA 780

CCCATTTACT GCTGGTGGTG GCTTCGGAAT TGATGAGTTG AGTGGTAGCC CGAGTGTGGT 840

GATGGTTCCA GATCCTACGA CGTTCAAGGT CTTACCTTGG GCAGATAAAA CCGGCTGGAT 900

GCTGGCAGAT CTGCATTGGA AATCTGGTGA ACCATTCCCA TTATGTCCCC GCGGTATCAT 960

GAAGAAGGCT GTCAAATCGT TAAGCGATGA AGGTTACTTA TTTAAATGCG GTATTGAGCT 1020

TGAATGGTAC TTGACGAAAA TTGTTGATCG CTCACTTTCT CCAGAGAGTT TAGGTGCGCC 1080

AGGTGTACAG CCTGATACCA TTCAAGTTCA ACCCGTGGCG CAAGGGTACT CCTATCTACT 1140

TGAACATCAC TTAGATCAGG TGGACGATAT TATGTCCAAG GTTCGAAAAG GTCTTCTCGA 1200

GCTCAATCTG CCTTTGCGCT CAATAGAAGA TGAGTGGGCA CCAAGCCAAA TGGAAACCAC 1260

GTTTGATGTA ATGGAAGGTT TAGAAGCAGC CGATGCAGCG CTACTTATAA AATCGGCCAT 1320

CAAACAAATA TGTTCACGAC ATGGTTATCA CGCAACATTT ATGTGCAAGC CGGCAATTAA 1380

CGGGTTCTTT GCTTCAGGCT GGCATATGCA TCAATCACTA GTGGATAAAG ATACCCGAAA 1440

GAATCTTTTT ATACCCTCAG AAGGGGAAGT GGTATCCCCG CTAGGTCGAG CTTATGCTGG 1500

TGGATTACTT GCAAATGGTA GTGCCGCCTC GAGTTTCACA ACACCAACTG TGAATGGGTA 1560

TCGAAGACGT CAGCCGTACT CGCTTGCACC AGACCGAAGA GCTTGGGCGA AAGATAACCG 1620

GGCAGCGATG GTCCGTGTAA TTTCTGCAAC AGGCGATCCG GCTAGCCGGA TCGAAAATCG 1680

TATTGGTGAG CCCGGCGCCA ACCCTTATTT ATATATGGCA TCACAAATTG TCTCTGGGCT 1740

TGATGGCATT AAAAACAAAA AGGATCCCGG CGAGTTGCAA GAGTCTCCTT ATGATGCACA 1800

AGTACCAATG CTGCCAACGA CTTTGGCTGA GGCTCTGGAT GCTCTTGAGC ACGATTCGGA 1860

GTTGTTTAGA AGCTGCTTTG GCGACACCTT TATTAAATAT TGGCTGCAAT TAAGAAGATC 1920

CGAGTGGGCA AGATTTCTCG ATGCTGAAGG TGCTGAGGCT GCTGAGCCTA CAGGTGCTGT 1980

CACGCAGTGG GAACAAAAAG AATACTTCAA CTTACTGTGA TTTTCAGAGG TCAATATGTC 2040

TAAACGCTTT GCATTATTGT GGTGCTCTGA AGAAGAGCGC TTTGACTATA GGGAAGAAAT 2100

GATAAGCGCT TTTAAAACAG AAGATTCCGA ATGGGATGTT ATAAGCGGAT TGTCAGATCT 2160

AAGTAATATC ATTGATAATT ATGATGGGTT TGTTGTAAGT GGGAGCGAGT ATTCAGTAAA 2220

TGAAGATCGA GATCGGTTCT CGGGATTGTT TCAATTTATT CGAACTGCAT GTGATCAAAG 2280

GAAACCCATC GTAGGTATCT GTTTTGGCTG TCAAGCGCTC GCAGTTGCCC TTGGAGGGGT 2340

CGTGGGTCTG AATCCTAGCC AACAATTTAG ATTTGGGGTT GACGAGATAA GGTTTTTGAA 2400

TGATGTGAAT GGCAAAATTG GAGTCACCGA AACAAATGTC AAACTTGTTG AGAGTCATGG 2460

GGAATGTGTA CTTGAATGCC CTCCAGGAGC AGTTTTACTC GGAAATTCAG AATCCACTGA 2520

AGTGGAAGTA TTCAGTTTTG GAAGCCATGT TATTGGGTTT CAGGGGCACC CGGAATTAAG 2580

CAGAGATACA GTTGAGAACG AATTCTTAAA AGTTCACCTC GAAGACGGAA ATCTGCAAGA 2640

AGACCAAGTC CATGGCTTCA ATAAAGAATT AAAGGGTTAC GAACCTCCTG AATCAATACG 2700

GCAGTTGATA AAGGACGTTT TGCACAAAAA TGTTGACTTA CAGAGCCTTT GAGGTGATGC 2760

ATGAAAAATA TAAACAAGCT TATCCAGCCG GGACGTGTAC ATAGGTCAGT TTATACTGAT 2820

TCTGAAATAT ATGATGCGGA AATGGAGAAT ATATTCAGAG CTAACTGGGT GTTCTTGCTG 2880

CATGAAAGTC AAATTCCAAA TGTTAACGAC TTTCAGACCA TTCGAGTTGG TGGGCGACCT 2940

TTGATAGTTG TGAGAAAGGG TGATGATGAT TTTCAAGTAC TATTGAACCG ATGCCCCCAC 3000

AGAGGCGCAA AAGTGTGTCG AAACAGTTCC GGAAACTCAA AGACATTTAC TTGCCCTTAC 3060

CATGGTTGGA AATTCAGGAA CTCAGGCAAA GCTTTTGTTA TTCCTGGTGC GAATGCCTAT 3120

GGAGAGGGTT TCGATAAAGA CAATTTCTCC ATGACGGCAA TTCCACGGGT GGAAAGCTAT 3180

CGAGGTTTTG TCTTTGCTAC CAGTAATGAG AACGCTGTTT CGTTAGAGGA GCATCTTGGT 3240

AGTGCGCGCC AGTATATTGA TGAATGGTTA GCCCACCAGG GTGGTGAGAT TAAAGTATCG 3300

AAGTCTGTTC AACGTTATGA AATAAAATGT AATTGGAAGC TGGTGTTTGA TAATGCTGGT 3360

GATGGGTATC ACGTTCCGTT CTCCCACCAA TCTCTAATAC AGATGACCAC GCTTAGACAC 3420

GGTGGCGGAG ATATGCAGTA CTTTGGTAGC GCTGATGAGA CAGAAATGAA GGTTTACTCA 3480

TTGGGAAATG GCCACTCAGT GATAGATCAG CGCCCGGAAA TGCATAAAGA GTCAGGGTGG 3540

GATCAGCAGC GACCACAGCC TGGCCGCGAA AGCTATGAAA CACACGTTCG TAATAATAGT 3600

AGCCAGCCAG CAAGAGATTT AGAGCGAGCG GTTGGTGCTG GAATGAATCT TAATATTTTT 3660

CCAAACTTAC TGTTAATTGG CAACCAAATA CAGGTTATTG ATCCTATTTC TGTTAATGAA 3720

ACAGTTCTGC ATTGGCATGC AACCTTGCTT GCTGGTGATA ATGAAGAGCT CAATGCAATT 3780

CGGATGCGCA CCCAAGAAGA TTTTCCAATT ATGGGTGAGG TCGATGATGC GGCAAATTTT 3840

GAGTCCTGCC AAGAAGGTCT TGAATCTATG CCGGAGATTG AATGGGTTGA TATCAGTCGA 3900

CACATGAGTG ATACAGAAGG TGCTGGCTAC GATAATGTTT TGACGAACAA ACCGACGTCT 3960

GAAATTCATA GTCGTAGTTA TTTTGATACC TGGAAGCGAC TAATGAATGA GGAACCTGAT 4020

AGCGAAAACT TGGAGGTATA AAATGACTAA TAATAGTGAA CTTCCTATGA AAATTGCGGA 4080

TTCAAGCGTG GTGGATCTCT CTTATTACAA AGAAGTTAAG AGCTACTCTG ATCTTTTCTG 4140

GAACATTTCG AATCTTGGAG ATCCTATACA CGACAATAAG ATAGAAATGT TAGTGGCAAA 4200

AGAAGCCCGG CTTTTAGACC AGCAGAGCTT TGATGAATGG CTTTCACTGT TCCTTGAAAG 4260

TGGTTGCTAC TGGATTCCAG GGAGCTCTCC TGCTGAGTCA CCTGCTGAGG AAGTCACCCT 4320

GGAGTTTCAC GATATCAGAC GGCTTAAGGA CAGAATTGTA AGGATACAAA CAGGTTTCGC 4380

GTATTCGCAG ATACCGATCT CGAGCACTAG TAGGGTAACT GGGATTCCAG AAATATGGAA 4440

GGTACCGGGG TCAAGCGAGG GGTTTTTGGT TAGAACAAGC TTTATTGTGT TTGAAAGCCG 4500

AGATGGCAAG TCTCAAGTTT TAAGTGGTTG GTATGGTTAT GTAATTATTA AGGATAATGA 4560

TGAGCTGAAA ATAAAGATGA AGCAGATAAA TTTGAACGAC TGCCTTTCGC CGCAAGGCAA 4620

TAATTCCTTT TTTCTATAGT AGGTCTTAAA TGAATATATT AAAGTTTCGA GTTATTAATA 4680

AGATAGCGGA AACGAAGGAG TCGTTTTCAT TTGTATTAAA GCCTTTGTGC GAGGTTCCTC 4740

CTGAGCACGT GCCAGGCAAG TACCTACCAA TAAAAATTCG TACTGGTAAA AGTCTATTAT 4800

TCCGATCTTA CTCATTATCT TCTGCGGCTG CGGCCAATGA GGACTTTAAG ATCACGGTCA 4860

AGCGAGAAAA TGGCGGTAGA GGGTCGAACT GGCTGTGTGA TAATGTTAAT GTTGGCGATT 4920

TGGTCGAGAC ACTCCCTCCT GCGGGCGAGT TTTACCCGCA GAACTGGGAA AGAGACTTTA 4980

TTTTTTTTGC AGGGGGTAGT GGTATAACTC CTGTTATTTC TATTATAAAA ACAGCACTAA 5040

TTAAATATAA CAATAGGATG AAATTGTTTT ATGCTAACTC ATCTAAGGAT TCTGTTATAT 5100

TTCGTGAAGA GTTGAAGGAG CTCTCTTTGG CTCATCCAGA GCGATTTGAC ATTGAATTCT 5160

GGTCAGATGA TGAGAAGGGC ATCCCGACAT CGAGTGCGTT TGAACAATAT GTTGACGATA 5220

CTTCCGAGGT TGAATATTTT TTATGTGGAC CTGCCCCCTT CATGGGAGGT GTAGAGAATT 5280

TTTTGATCGA GTCTAAAGTC CCACCTGGAC TGATAACCAA GGAGTCTTTT GCTGGGAGTG 5340

TTTCTGATGA TAATGGCGAT AAAAATGAAA GCAAAGAAAA GAATTTTGCC GTTTCTGTTC 5400

TTTTAAATGG CAGTCGGACA GAAGTTATGT GCTCTGAAGA TAACTTTATT TTAAAAGAGA 5460

TAATAAATGC CGGAGTTAAC GTGCCCAATT CCTGTGGTGC AGGAAATTGT GGATCCTGCA 5520

TGTGCAGTCT GCTAAGTGGC GATGTAGTTC TGGAGGAAAA TACGGTTTTG GATCCCTCTG 5580

ATGAAGAGGA TGGCTGGATA TTAGCGTGTC GCTCTAAGCC CAAGTCAAGG TTTATAGAGA 5640

TATCTTTTGA CGAATAAAGC CAAGTGAGGG GTGCTATGCC TCAAAATCTG AGTTATGACA 5700

GCGCTAATTG GGATAATGTT AAGGCATTTT TGGCCCTATA TAGAGAGCGG GACTATCAGG 5760

CCGCTGCCGA AAGCCTAGGG ATCGACGGTT CTACGTTACG AAGAAAGATA CAAAGTTTAG 5820

AGGCCTTTTT AGGATATTCG TTATTCGTTA GAGAAAATAA TCGGTGGGCT TTGGCGCCAG 5880

GGACGGAAGA TGTGCTAAAA GCTGCAGTAG ATATGGAAAG CGCAACGCGT CTTTTCTTTG 5940

GTGTGACTCC GGGGGATAAG GGTGGAGTGA TTAAAGTTTC TATCCCCTTT GTACTGGTAA 6000

ATCAGTTTTC AGATGTGCTG ATAGCATTTA GAAAAATCTA CCCAGAGTTT ACATTCGATA 6060

TTTCTAGTGA TGCGCGTTTT GTTGACTTGG AGCGTGAGGG TTTCGATTTT GCAATACGGT 6120

TGGCGCGTCC CATTTCCAAT ATGAATAGTT TAAAGATAAA ACGGCTTGGT ACATTCGGTC 6180

TTGGGGTTTT TGGTTCGGCT TCATATATAG ATGATATTGT TGATGAATTT GGTAAGGACG 6240

CGTTAAGAGA TAAGTCTGAT CTTATAAAGA CGGGCATTGG CTTCTCATAT AAGACTCATG 6300

ATTTTGTTTT TGGCCTGTTA GATTGGGAAC AGCTTGGTTT TTATGGAAAT ATAAAGATTA 6360

TGTGTGATGA TTTGGAGTCT TGCGCTAGAT TTTGTGATAA AGGTGCCGGC CTTGCGATAC 6420

TCCCGAAATT TTTGGCACAT CGCTATCCGA ATATGTCCTG TGTTTATGAC GCGTCGGATA 6480

CGCTTATGGC TGAGCTTTGG CTAATAAGCC GGCTCGATAT GAAAAGCGAT TGGCAAGTTG 6540

TTCTTGGAAA TATGCTGTCT GCGAAAAGTA AAGAGATGGA AGTATCTTAG GTTGTTTATA 6600

AATAGTCAAT GAAACCTATC GTTGAATATT GATTTGGAGA GACTGCGCTA TGGGTGAGTC 6660

GTATCTGATC CTAGACAGTA TCGTGGACAA CCGATCCCTC TAAATTCTTG AAATATTTCT 6720

GTTCAAAGGC TTCTGGACTT AACCAGCCAT TTGCAGAATG CCTTCTGATT CGATTGTAGT 6780

AAACTTCAAT ATACTCAAAC AAGATAGCAT TTGCCTCTTT TCTCGTAGAA AATACACTGC 6840

CATGTACTAC ATGCCCCTTC AGGGTATGGA AGAAGCTTTC GGTCACTGCA TTGTCCCAAC 6900

AGTTTCCTCG TCTAGA 6916

<160>2

ORF1

Met Ser Glu Lys Leu Asp Phe Ile Thr Lys Asn Asn Leu Trp Thr

5 10 15

Asp Lys Gln Arg Asp Ala Ala Asp Lys Val Leu Ala Glu Ile Asp

20 25 30

Ser Leu Gly Leu Glu Met Ile Arg Leu Ser Trp Ala Asp Gln Tyr

35 40 45

Gly Leu Leu Arg Gly Lys Ser Leu Thr Val Ala Ser Leu Lys Ser

50 55 60

Ala Phe Lys Glu Gly Ser Glu Val Thr Met Ala Pro Phe Phe Phe

65 70 75

Asp Leu Val Ser Ser Ile Val Phe Asn Pro Phe Thr Ala Gly Gly

80 85 90

Gly Phe Gly Ile Asp Glu Leu Ser Gly Ser Pro Ser Val Val Met

95 100 105

Val Pro Asp Pro Thr Thr Phe Lys Val Leu Pro Trp Ala Asp Lys

110 115 120

Thr Gly Trp Met Leu Ala Asp Leu His Trp Lys Ser Gly Glu Pro

125 130 135

Phe Pro Leu Cys Pro Arg Gly Ile Met Lys Lys Ala Val Lys Ser

140 145 150

Leu Ser Asp Glu Gly Tyr Leu Phe Lys Cys Gly Ile Glu Leu Glu

155 160 165

Trp Tyr Leu Thr Lys Ile Val Asp Arg Ser Leu Ser Pro Glu Ser

170 175 180

Leu Gly Ala Pro Gly Val Gln Pro Asp Thr Ile Gln Val Gln Pro

185 190 195

Val Ala Gln Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Glu His His Leu Asp Gln

200 205 210

Val Asp Asp Ile Met Ser Lys Val Arg Lys Gly Leu Leu Glu Leu

215 220 225

Asn Leu Pro Leu Arg Ser Ile Glu Asp Glu Trp Ala Pro Ser Gln

230 235 240

Met Glu Thr Thr Phe Asp Val Met Glu Gly Leu Glu Ala Ala Asp

245 250 255

Ala Ala Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ile Lys Gln Ile Cys Ser Arg

260 265 270

His Gly Tyr His Ala Thr Phe Met Cys Lys Pro Ala Ile Asn Gly

275 280 285

Phe Phe Ala Ser Gly Trp His Met His Gln Ser Leu Val Asp Lys

290 295 300

Asp Thr Arg Lys Asn Leu Phe Ile Pro Ser Glu Gly Glu Val Val

305 310 315

Ser Pro Leu Gly Arg Ala Tyr Ala Gly Gly Leu Leu Ala Asn Gly

320 325 330

Ser Ala Ala Ser Ser Phe Thr Thr Pro Thr Val Asn Gly Tyr Arg

335 340 345

Arg Arg Gln Pro Tyr Ser Leu Ala Pro Asp Arg Arg Ala Trp Ala

350 355 360

Lys Asp Asn Arg Ala Ala Met Val Arg Val Ile Ser Ala Thr Gly

365 370 375

Asp Pro Ala Ser Arg Ile Glu Asn Arg Ile Gly Glu Pro Gly Ala

380 385 390

Asn Pro Tyr Leu Tyr Met Ala Ser Gln Ile Val Ser Gly Leu Asp

395 400 405

Gly Ile Lys Asn Lys Lys Asp Pro Gly Glu Leu Gln Glu Ser Pro

410 415 420

Tyr Asp Ala Gln Val Pro Met Leu Pro Thr Thr Leu Ala Glu Ala

425 430 435

Leu Asp Ala Leu Glu His Asp Ser Glu Leu Phe Arg Ser Cys Phe

440 445 450

Gly Asp Thr Phe Ile Lys Tyr Trp Leu Gln Leu Arg Arg Ser Glu

455 460 465

Trp Ala Arg Phe Leu Asp Ala Glu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Pro

470 475 480

Thr Gly Ala Val Thr Gln Trp Glu Gln Lys Glu Tyr Phe Asn Leu

485 490 495

Leu

496

ORF2

Met Ser Lys Arg Phe Ala Leu Leu Trp Cys Ser Glu Glu Glu Arg

5 10 15

Phe Asp Tyr Arg Glu Glu Met Ile Ser Ala Phe Lys Thr Glu Asp

20 25 30

Ser Glu Trp Asp Val Ile Ser Gly Leu Ser Asp Leu Ser Asn Ile

35 40 45

Ile Asp Asn Tyr Asp Gly Phe Val Val Ser Gly Ser Glu Tyr Ser

50 55 60

Val Asn Glu Asp Arg Asp Arg Phe Ser Gly Leu Phe Gln Phe Ile

65 70 75

Arg Thr Ala Cys Asp Gln Arg Lys Pro Ile Val Gly Ile Cys Phe

80 85 90

Gly Cys Gln Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Gly Val Val Gly Leu

95 100 105

Asn Pro Ser Gln Gln Phe Arg Phe Gly Val Asp Glu Ile Arg Phe

110 115 120

Leu Asn Asp Val Asn Gly Lys Ile Gly Val Thr Glu Thr Asn Val

125 130 135

Lys Leu Val Glu Ser His Gly Glu Cys Val Leu Glu Cys Pro Pro

140 145 150

Gly Ala Val Leu Leu Gly Asn Ser Glu Ser Thr Glu Val Glu Val

155 160 165

Phe Ser Phe Gly Ser His Val Ile Gly Phe Gln Gly His Pro Glu

170 175 180

Leu Ser Arg Asp Thr Val Glu Asn Glu Phe Leu Lys Val His Leu

185 190 195

Glu Asp Gly Asn Leu Gln Glu Asp Gln Val His Gly Phe Asn Lys

200 205 210

Glu Leu Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Glu Ser Ile Arg Gln Leu Ile

215 220 225

Lys Asp Val Leu His Lys Asn Val Asp Leu Gln Ser Leu

230 235 238

ORF3

Met Lys Asn Ile Asn Lys Leu Ile Gln Pro Gly Arg Val His Arg

5 10 15

Ser Val Tyr Thr Asp Ser Glu Ile Tyr Asp Ala Glu Met Glu Asn

20 25 30

Ile Phe Arg Ala Asn Trp Val Phe Leu Leu His Glu Ser Gln Ile

35 40 45

Pro Asn Val Asn Asp Phe Gln Thr Ile Arg Val Gly Gly Arg Pro

50 55 60

Leu Ile Val Val Arg Lys Gly Asp Asp Asp Phe Gln Val Leu Leu

65 70 75

Asn Arg Cys Pro His Arg Gly Ala Lys Val Cys Arg Asn Ser Ser

80 85 90

Gly Asn Ser Lys Thr Phe Thr Cys Pro Tyr His Gly Trp Lys Phe

95 100 105

Arg Asn Ser Gly Lys Ala Phe Val Ile Pro Gly Ala Asn Ala Tyr

110 115 120

Gly Glu Gly Phe Asp Lys Asp Asn Phe Ser Met Thr Ala Ile Pro

125 130 135

Arg Val Glu Ser Tyr Arg Gly Phe Val Phe Ala Thr Ser Asn Glu

140 145 150

Asn Ala Val Ser Leu Glu Glu His Leu Gly Ser Ala Arg Gln Tyr

155 160 165

Ile Asp Glu Trp Leu Ala His Gln Gly Gly Glu Ile Lys Val Ser

170 175 180

Lys Ser Val Gln Arg Tyr Glu Ile Lys Cys Asn Trp Lys Leu Val

185 190 195

Phe Asp Asn Ala Gly Asp Gly Tyr His Val Pro Phe Ser His Gln

200 205 210

Ser Leu Ile Gln Met Thr Thr Leu Arg His Gly Gly Gly Asp Met

215 220 225

Gln Tyr Phe Gly Ser Ala Asp Glu Thr Glu Met Lys Val Tyr Ser

230 235 240

Leu Gly Asn Gly His Ser Val Ile Asp Gln Arg Pro Glu Met His

245 250 255

Lys Glu Ser Gly Trp Asp Gln Gln Arg Pro Gln Pro Gly Arg Glu

260 265 270

Ser Tyr Glu Thr His Val Arg Asn Asn Ser Ser Gln Pro Ala Arg

275 280 285

Asp Leu Glu Arg Ala Val Gly Ala Gly Met Asn Leu Asn Ile Phe

290 295 300

Pro Asn Leu Leu Leu Ile Gly Asn Gln Ile Gln Val Ile Asp Pro

305 310 315

Ile Ser Val Asn Glu Thr Val Leu His Trp His Ala Thr Leu Leu

320 325 330

Ala Gly Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ala Ile Arg Met Arg Thr Gln

335 340 345

Glu Asp Phe Pro Ile Met Gly Glu Val Asp Asp Ala Ala Asn Phe

350 355 360

Glu Ser Cys Gln Glu Gly Leu Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Trp

365 370 375

Val Asp Ile Ser Arg His Met Ser Asp Thr Glu Gly Ala Gly Tyr

380 385 390

Asp Asn Val Leu Thr Asn Lys Pro Thr Ser Glu Ile His Ser Arg

395 400 405

Ser Tyr Phe Asp Thr Trp Lys Arg Leu Met Asn Glu Glu Pro Asp

410 415 420

Ser Glu Asn Leu Glu Val

425 426

ORF4

Met Arg Asn Leu Ile Ala Lys Thr Trp Arg Tyr Lys Met Thr Asn

5 10 15

Asn Ser Glu Leu Pro Met Lys Ile Ala Asp Ser Ser Val Val Asp

20 25 30

Leu Ser Tyr Tyr Lys Glu Val Lys Ser Tyr Ser Asp Leu Phe Trp

35 40 45

Asn Ile Ser Asn Leu Gly Asp Pro Ile His Asp Asn Lys Ile Glu

50 55 60

Met Leu Val Ala Lys Glu Ala Arg Leu Leu Asp Gln Gln Ser Phe

65 70 75

Asp Glu Trp Leu Ser Leu Phe Leu Glu Ser Gly Cys Tyr Trp Ile

80 85 90

Pro Gly Ser Ser Pro Ala Glu Ser Pro Ala Glu Glu Val Thr Leu

95 100 105

Glu Phe His Asp Ile Arg Arg Leu Lys Asp Arg Ile Val Arg Ile

110 115 120

Gln Thr Gly Phe Ala Tyr Ser Gln Ile Pro Ile Ser Ser Thr Ser

125 130 135

Arg Val Thr Gly Ile Pro Glu Ile Trp Lys Val Pro Gly Ser Ser

140 145 150

Glu Gly Phe Leu Val Arg Thr Ser Phe Ile Val Phe Glu Ser Arg

155 160 165

Asp Gly Lys Ser Gln Val Leu Ser Gly Trp Tyr Gly Tyr Val Ile

170 175 180

Ile Lys Asp Asn Asp Glu Leu Lys Ile Lys Met Lys Gln Ile Asn

185 190 195

Leu Asn Asp Cys Leu Ser Pro Gln Gly Asn Asn Ser Phe Phe Leu

200 205 210

ORF5

Met Asn Ile Leu Lys Phe Arg Val Ile Asn Lys Ile Ala Glu Thr

5 10 15

Lys Glu Ser Phe Ser Phe Val Leu Lys Pro Leu Cys Glu Val Pro

20 25 30

Pro Glu His Val Pro Gly Lys Tyr Leu Pro Ile Lys Ile Arg Thr

35 40 45

Gly Lys Ser Leu Leu Phe Arg Ser Tyr Ser Leu Ser Ser Ala Ala

50 55 60

Ala Ala Asn Glu Asp Phe Lys Ile Thr Val Lys Arg Glu Asn Gly

65 70 75

Gly Arg Gly Ser Asn Trp Leu Cys Asp Asn Val Asn Val Gly Asp

80 85 90

Leu Val Glu Thr Leu Pro Pro Ala Gly Glu Phe Tyr Pro Gln Asn

95 100 105

Trp Glu Arg Asp Phe Ile Phe Phe Ala Gly Gly Ser Gly Ile Thr

110 115 120

Pro Val Ile Ser Ile Ile Lys Thr Ala Leu Ile Lys Tyr Asn Asn

125 130 135

Arg Met Lys Leu Phe Tyr Ala Asn Ser Ser Lys Asp Ser Val Ile

140 145 150

Phe Arg Glu Glu Leu Lys Glu Leu Ser Leu Ala His Pro Glu Arg

155 160 165

Phe Asp Ile Glu Phe Trp Ser Asp Asp Glu Lys Gly Ile Pro Thr

170 175 180

Ser Ser Ala Phe Glu Gln Tyr Val Asp Asp Thr Ser Glu Val Glu

185 190 195

Tyr Phe Leu Cys Gly Pro Ala Pro Phe Met Gly Gly Val Glu Asn

200 205 210

Phe Leu Ile Glu Ser Lys Val Pro Pro Gly Leu Ile Thr Lys Glu

215 220 225

Ser Phe Ala Gly Ser Val Ser Asp Asp Asn Gly Asp Lys Asn Glu

230 235 240

Ser Lys Glu Lys Asn Phe Ala Val Ser Val Leu Leu Asn Gly Ser

245 250 255

Arg Thr Glu Val Met Cys Ser Glu Asp Asn Phe Ile Leu Lys Glu

260 265 270

Ile Ile Asn Ala Gly Val Asn Val Pro Asn Ser Cys Gly Ala Gly

275 280 285

Asn Cys Gly Ser Cys Met Cys Ser Leu Leu Ser Gly Asp Val Val

290 295 300

Leu Glu Glu Asn Thr Val Leu Asp Pro Ser Asp Glu Glu Asp Gly

305 310 315

Trp Ile Leu Ala Cys Arg Ser Lys Pro Lys Ser Arg Phe Ile Glu

320 325 330

Ile Ser Phe Asp Glu

335

ORF6

Val Arg Gly Ala Met Pro Gln Asn Leu Ser Tyr Asp Ser Ala Asn

5 10 15

Trp Asp Asn Val Lys Ala Phe Leu Ala Leu Tyr Arg Glu Arg Asp

20 25 30

Tyr Gln Ala Ala Ala Glu Ser Leu Gly Ile Asp Gly Ser Thr Leu

35 40 45

Arg Arg Lys Ile Gln Ser Leu Glu Ala Phe Leu Gly Tyr Ser Leu

50 55 60

Phe Val Arg Glu Asn Asn Arg Trp Ala Leu Ala Pro Gly Thr Glu

65 70 75

Asp Val Leu Lys Ala Ala Val Asp Met Glu Ser Ala Thr Arg Leu

80 85 90

Phe Phe Gly Val Thr Pro Gly Asp Lys Gly Gly Val Ile Lys Val

95 100 105

Ser Ile Pro Phe Val Leu Val Asn Gln Phe Ser Asp Val Leu Ile

110 115 120

Ala Phe Arg Lys Ile Tyr Pro Glu Phe Thr Phe Asp Ile Ser Ser

125 130 135

Asp Ala Arg Phe Val Asp Leu Glu Arg Glu Gly Phe Asp Phe Ala

140 145 150

Ile Arg Leu Ala Arg Pro Ile Ser Asn Met Asn Ser Leu Lys Ile

155 160 165

Lys Arg Leu Gly Thr Phe Gly Leu Gly Val Phe Gly Ser Ala Ser

170 175 180

Tyr Ile Asp Asp Ile Val Asp Glu Phe Gly Lys Asp Ala Leu Arg

185 190 195

Asp Lys Ser Asp Leu Ile Lys Thr Gly Ile Gly Phe Ser Tyr Lys

200 205 210

Thr His Asp Phe Val Phe Gly Leu Leu Asp Trp Glu Gln Leu Gly

215 220 225

Phe Tyr Gly Asn Ile Lys Ile Met Cys Asp Asp Leu Glu Ser Cys

230 235 240

Ala Arg Phe Cys Asp Lys Gly Ala Gly Leu Ala Ile Leu Pro Lys

245 250 255

Phe Leu Ala His Arg Tyr Pro Asn Met Ser Cys Val Tyr Asp Ala

260 265 270

Ser Asp Thr Leu Met Ala Glu Leu Trp Leu Ile Ser Arg Leu Asp

275 280 285

Met Lys Ser Asp Trp Gln Val Val Leu Gly Asn Met Leu Ser Ala

290 295 300

Lys Ser Lys Glu Met Glu Val Ser

305 308

Claims

1.利用一种基因工程菌的构建将苯胺转化生成邻苯二酚的方法，包括下列步骤：

(1)构建基因组文库，得到阳性克隆，由此获得一个完整的苯胺双加氧酶基因簇；该步骤包括：

(1a)通过完全酶切的不动杆菌ANA5总DNA序列构建基因组文库；

(1b)通过菌落原位杂交方法从所述基因组文库中筛选到阳性克隆；

(1c)通过基因的测序及序列分析表明获得所述完整的苯胺双加氧酶基因簇；

(2)将所述苯胺双加氧酶基因簇连接于一无启动子序列的pLAFR6载体上，并将重组质粒pGXA69电脉冲导入宿主菌构建苯胺双加氧酶基因工程菌，所述重组质粒pGXA69的保藏号为CGMCC No.1721；所述苯胺双加氧酶基因工程菌包含序列表中序列1的DNA序列，所述序列1的DNA是所述重组质粒pGXA69上连接的不动杆菌ANA5的DNA，由6916个碱基组成，含完整的苯胺双加氧酶基因，分为6个开放阅读框(ORF)；其中，所述序列1自5’端的第530～533位核苷酸为第1个ORF的起始密码子ATG，自5’端的第6587～6590位核苷酸为第6个ORF的终止密码子TAG；自5’端的第456～461位核苷酸为SD序列；

(3)将所述基因工程菌点接于加有苯胺的LA平板上，经过在必要条件下的培养后在所述基因工程菌周围产生邻苯二酚，所述必要条件包括：

所述苯胺浓度的范围为0.25mg/mL至1.50mg/mL；培养基为LB培养基或YMB培养基或M9合成培养基；温度的范围为28℃至37℃；pH值的范围为6.4至7.5；以及接种量的范围为1％至5％”。

2.如权利要求1所述的转化苯胺生成邻苯二酚的方法，其特征在于，所述ANA5适合生长和降解苯胺的温度为32℃～36℃，合适的pH值为7.0，苯胺的耐受浓度为2500mg/L。

3.按照权利要求1或2所述的转化苯胺生成邻苯二酚的方法，其特征在于，所述宿主菌为E.Coli DH5α或E.Coli JM109或S17-1。

4.按照权利要求3所述的转化苯胺生成邻苯二酚的方法，其特征在于，选择所述宿主菌为E.Coli DH5α。

5.按照权利要求1所述的转化苯胺生成邻苯二酚的方法，其特征在于：选择所述苯胺浓度为0.5mg/mL，所述培养基为LB合成培养基；控制所述温度为37℃，所述pH值为7.0，所述接种量为3％。