CN101137394A - 抗addl抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够差异识别Aβ衍生的可扩散配体、也被称为ADDLs的多维构象的抗体。本发明的抗体可以辨别阿茨海默氏病人和对照人脑的提取物，可以用于检测ADDLs和诊断阿茨海默氏病的方法中。本发明的抗体也阻断ADDLs与神经元的结合、ADDLs的聚集以及τ蛋白的磷酸化，因此可用于防止和治疗与淀粉样蛋白β1－42的可溶性寡聚体相关的疾病的方法中。

Description

抗ADDL抗体及其应用
发明简介
本申请要求2004年10月25日提交的美国临时专利申请系列号60/621,776、2005年2月14日提交的Nos.60/652,538、2005年6月30日提交的60/695,526以及2005年6月30日提交的60/695,528的优先权，这些临时申请的内容在此以其全文引为参考。
本发明是在由国家卫生研究院部分资助(资助号NIHRO1-AG18877和NIH RO1-AG22547)的研究过程中做出的。美国政府在本发明中可能有某些权利。
发明背景
阿茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)是一种进行性的退化性痴呆(Terry等(1991)Ann.Neurol.30：572-580；Coyle(1987)In：Encyclopedia of Neuroscience(神经科学百科全书)，Adelman(ed.)，Bifkhusef，Boston-Basel-Stuttgart，pp29-31)。在其早期阶段，阿茨海默氏病主要表现为形成新记忆的深度不能(Selkoe(2002)Science298：789-791)，据报道这是由从β淀粉样蛋白(Aβ)衍生的神经毒素引起的。Aβ是两亲性的肽，其丰度随着与阿茨海默氏病有关的突变和风险因素而增加。从Aβ形成的原纤维构成了淀粉样蛋白斑的核心，它是患阿茨海默氏病脑的标志。在体外产生的类似的原纤维对于培养的脑神经元来说是致死的。这些发现表明记忆的丧失是纤维状Aβ引起的神经元死亡的结果。
尽管对于纤维状Aβ和记忆丧失有有力的实验支持，但在痴呆与淀粉样蛋白斑量之间的相关性很低(Katzman(1988)Ann.Neurol.23：138-144)。此外，发展出年龄依赖性的淀粉样蛋白斑、更重要的是发展出年龄依赖性的记忆功能障碍的转基因hAPP小鼠(Dodart等(2002)Nat.Neurosci.5：452-457；Kotilinek等(2002)J.Neurosci.22：6331-6335)，表现出在接种抗Aβ单克隆抗体后24小时内，记忆的丧失可以被逆转，而同时淀粉样蛋白斑的水平没有变化。这些发现与记忆丧失依赖于淀粉样原纤维引起的神经元死亡的机制不一致。
已经提出了其它由Aβ自身聚集形成的神经活性分子。这些分子包括可溶性Aβ寡聚体、也被称为Aβ衍生的可扩散配体或ADDLs。寡聚体是亚稳定的，在低浓度Aβ1-42下形成(Lambert等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6448-6453)。Aβ寡聚体快速抑制长期增强作用(LTP)，这是记忆和突触可塑性的经典实验范例。因此，记忆丧失源自神经元死亡之前的突触损坏，而突触损坏是由Aβ寡聚体而不是由原纤维引起的(Hardy和Selkoe(2002)Science 297：353-356)。可溶性寡聚体已经在脑组织中发现，在阿茨海默氏病中显著升高(Kayed等(2003)Science 300：486-489；Gong等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：10417-10422)，在hAPP转基因小鼠阿茨海默氏病模型中也显著升高(Kotilinek等(2002)J.Neurosci.22：6331-6335；Chang等(2003)J.Mol.Neurosci.20：305-313)。
已经提出了多种阿茨海默氏病的治疗选择。疫苗临床试验表明，对疫苗有强有力免疫反应的人显示出在认知方面获益(Hock等(2003)Neuron 38：547-554)；但是，频繁的CNS炎症引起了部分试验的早期终止(Birmingham和Frantz(2002)Nat.Med.8：199-200)。作为疫苗的替代品，已经提出了针对ADDLs而不结合单体或原纤维的治疗性抗体(Klein(2002)Neurochem.Int.41：345-352)。ADDLs具有高度抗原性，在兔子中在浓度大约50μg/mL时产生寡聚体选择性的多克隆抗体(Lambert等(2001)J.Neurochem.79：595-605)。转基因小鼠模型的结果也说明抗体可以成功地逆转记忆减退(Dodart等(2002)Nat.Neurosci.5：452-457)。因此，在本技术领域内需要ADDL选择性的治疗抗体以预防和治疗阿茨海默氏病。本发明满足了这种需要。
发明简述
本发明是能够差异识别一种或多种Aβ衍生的可扩散配体的多维构象的分离的抗体或其片段。在具体的实施方案中，本发明的抗体与可药用的载体相混合。在其它的实施方案中，本发明的抗体包含在试剂盒中。
此外还提供了使用与一种或多种Aβ衍生的可扩散配体的多维构象相结合的抗体或抗体片段，防止Aβ衍生的可扩散配体与神经元结合、抑制Aβ衍生的可扩散配体的聚集、以及阻断τ蛋白在Ser202/Thr205位的磷酸化的方法。
本发明还包括了使用本发明的抗体预防或治疗与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病的方法。给药本发明的抗体可以防止Aβ衍生的可扩散配体与神经元的结合，从而预防或治疗与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病。
本发明也是对能够防止Aβ衍生的可扩散配体与神经元结合的治疗性试剂进行鉴定的方法。本发明的这种方法包括在存在试剂的情况下将神经元与Aβ衍生的可扩散配体相接触，以及使用本发明的抗体来确定在存在试剂的情况下Aβ衍生的可扩散配体与神经元的结合。
本发明还包含了在样品中检测Aβ衍生的可扩散配体的方法，以及诊断与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病的方法。这样的方法包括将样品与本发明的抗体相接触，以便Aβ衍生的可扩散配体可以被检测，以及与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病可以被诊断。
附图简述
图1显示了碱性磷酸酶分析的结果，其中抗ADDL抗体差异阻断神经元。
图2显示当B103细胞与抗ADDL抗体预先保温时bADDL结合的概要。
图3显示了能够差异识别ADDLs的多维构象的抗体的结合特征的概要。
图4显示了本文公开的抗体抑制ADDL聚集的概要。
图5显示了N2A结合与kADDL的相关性图。
图6显示了重链和轻链可变区的核酸序列，分别为鼠抗ADDL抗体20C2(图6A和6B)、5F10(图6C和6D)、2D6(图6E和6F)、2B4(图6G和6H)、4E2(图6I和6J)、2H4(图6K和6L)、2A10(图6M和6N)、3B3(图60和6P)、1F6(图6Q和6R)、1F4(图6S和6T)、2E12(图6U和6V)以及4C2(图6W和6X)。小写体字母表示抗体的前导序列，大写体字母表示抗体的可变区序列。编码互补决定区(CDRs)的核苷酸被下划线。
图7显示了小鼠抗ADDL抗体重链可变区CDR1(图7A)、CDR2(图7B)、CDR3(图7C)序列和轻链可变区CDR1(图7D)、CDR2(图7E)、CDR3(图7F)序列的比较。
图8显示了重链和轻链可变区的氨基酸序列，分别为通过CDR移植产生的人源化的抗ADDL抗体20C2(图8A和8B)、26D6(图8C和8D)、4E2(图8E和8F)、3B3(图8G和8H)、2H4(图8I和8J)和1F6(图8K)。序列被呈现为小鼠的序列、从NCBI蛋白数据库获得的最同源的人序列、最同源的人基因组序列和人源化序列的比较。在小鼠、人和人基因组序列中与人源化序列不同的氨基酸用粗体表示。CDRs被下划线。对于维持CDR环构象来说重要的残基用*指示。在VL/VH交界处发现的保守残基用#指示。潜在的糖基化位点用斜体指示。对于20C2的重链来说，产生了两个人源化序列(HCVRA和HCVRB)，它们在24位有一个氨基酸的差别。在20C2 HCVRA中使用人的氨基酸，在20C2 HCVRB中使用小鼠的氨基酸。没有为1F6设计轻链，因为它与4E2的轻链具有同样的序列。
图9显示了重链和轻链可变区的氨基酸序列，分别为通过表面修饰(veneering)产生的人源化的抗ADDL抗体20C2(图9A和9B)和26D6(图9C和9D)。序列被呈现为小鼠的序列、从NCBI蛋白数据库获得的最同源的人序列、最同源的人基因组序列和人源化序列的比较。在小鼠、人和人基因组序列中与人源化序列不同的氨基酸用粗体表示。CDRs被下划线。对于维持CDR环构象来说重要的残基用星号指示。在VL/VH交界处发现的保守残基用磅符号指示。潜在的糖基化位点用斜体指示。对于20C2的重链来说，产生了两个人源化序列(HCVRVenA和HCVRVenB)，它们在81位有一个氨基酸的差别。在20C2 HCVRVenA中使用小鼠的氨基酸，在20C2 HCVRVenB中使用人的氨基酸。对于26D6重链来说，根据表面修饰设计了3种人源化序列(HCVR Ven1、Ven2和Ven3)，它们在11、23、15、81、89和118位氨基酸不同。在HCVR Ven1中，所有的位置都使用小鼠的氨基酸。在Ven2中，81和118位残基使用小鼠的氨基酸，11、13、15和89位的残基使用人的氨基酸。在Ven3中，所有的位置都使用人的氨基酸。对于26D6轻链，设计了两个表面修饰的人源化序列(LCVR Ven1和Ven2)，它们在88和105位的氨基酸不同。在LCVR Ven1中，两个位置都使用小鼠的氨基酸，在Ven2中，两个位置都使用人的氨基酸。
图10中显示了人源化抗ADDL抗体的重链和轻链可变区(分别为HCVRs核LCVRs)的核苷酸序列。图10A到图10K中分别显示了20C2、2D6、4E2、3B3、2H4和IF6的CDR移植的HCVRs和LCVRs。图10L到图10N显示了20C2的表面修饰的HCVRs(VenA和VenB)以及LCVR，图100到图10S显示了26D6的表面修饰的HCVRs(Ven1、Ven2、Ven3)以及LCVRs(Ven1，Ven2)。大写字体表示抗体可变区序列。CDRs被下划线。可变区序列被克隆到完整的重链和轻链抗体表达载体中。
图11显示了抗ADDL抗体全长IgG1和IgG2m4人源化重链和人源化κ轻链的氨基酸序列。图11A，CDR移植的20C2 HCVRA IgG1；图11B，CDR移植的20C2 HCVRB IgG1；图11C，CDR移植的20C2HCVRA IgG2m4；图11D，CDR移植的20C2 HCVRB IgG2m4；图11E，CDR移植的20C2 LCVR κ；图11F，CDR移植的26D6 HCVR IgG1；图11G，CDR移植的26D6 HCVR IgG2m4；图11H，CDR移植的26D6LCVRκ；图11I，CDR移植的4E2 HCVR IgG1图11J，CDR移植的4E2LCVRκ；图11K，CDR移植的3B3 HCVR IgG1；图11L，CDR移植的3B3 LCVRκ；图11M，CDR移植的2H4 HCVR IgG1；图11N，CDR移植的2H4 LCVRκ；图11O，CDR移植的1F6 HCVR IgG1图11p，表面修饰的20C2 HCVR VenA IgG1；图11Q，表面修饰的20C2 HCVR VenBIgG1；图11R，表面修饰的20C2 HCVR VenB IgG2m4；图11S，表面修饰的20C2 LCVRκ；图11T，表面修饰的26D6 HCVR Ven1 Ig；图11U，表面修饰的26D6 HCVR Ven1 IgG1；图11V，表面修饰的26D6 HCVRVen2 IgG1；图11W，表面修饰的26D6 HCVR Ven3；图11X，表面修饰的26D6 LCVR Ven1κ；以及图11Y，表面修饰的26D6 LCVR Ven2κ。下划线表示可变区序列，对应于CDRs的氨基酸被双下划线。其余的氨基酸序列是恒定区序列。
图12显示了人抗体恒定区的氨基酸序列与IgG2m4序列的比较。星号表示Asn297位的糖基化位点。FcRn结合区被标明。IgG2m4中与IgG2不同的序列被下划线。
图13显示了在Fab噬菌体展示载体pFab3d中20C2人源化抗体的标注的重链(图13A)和轻链(图13B)的氨基酸序列。
图14描述了在制备两个LC-CDR3文库、名为LC3-1和LC3-2、用于产生亲和性成熟的20C2轻链CDR3中使用的设计和引物。用于克隆的限制性内切酶识别位点用斜体标明。大写体表示编码抗体可变区序列的核酸。编码CDRs的核酸被下划线。
发明详述
现在已经产生了能够差异识别Aβ衍生的可扩散配体(即ADDLs)的多维构象的单克隆抗体。有利之处在于，该单克隆抗体可以分辨阿茨海默氏病和对照的人脑提取物，并鉴定阿茨海默氏病脑切片中和培养的海马细胞中内源的寡聚体。此外，该抗体可以在溶液中中和内源的和合成的ADDLs。所谓“合成的”ADDLs是在体外通过将纯化的淀粉样蛋白β1-42在能够产生ADDLs的条件下混合来生产的。参见美国专利No.6,218,506。本文公开的具体的抗体对3-24个单体的Aβ肽表现出高度的选择性，最小可检测单体Aβ肽。此外，本发明选择的抗体对ADDLs的识别不被包括Aβ1-42或Aβ1-40的线性序列的短肽所阻断。但是，结合被Aβ1-28所阻断，表明基于构象独特的结构的表位也可以在Aβ1-28中发现。该抗体表位的概图表明这些抗体以相似的亲和性和特异性特征识别同样的核心线性序列，正如通过ELISA测定到的那样。此外，该抗体差异性阻断含有ADDL的制备物结合大鼠海马神经元和永生的成神经细胞瘤(neuroblastoma)细胞系的原代培养物的能力，也可以阻断ADDL的聚集。该发现证实了这些抗体尽管具有相同的线性序列识别力和亲和性，仍具有差异识别ADDLs的多维构象的能力。因为ADDLs已知与神经元的一个亚类相关，并破坏正常的神经元功能，因此本发明的一个用处是开发和/或鉴定能够阻止ADDLs与神经元结合的抗体。这样的抗体在治疗ADDL相关的疾病、包括阿茨海默氏病中将是有用的。对该应用的一种改良是特异性使用这些抗体的人源化和/或亲和性成熟的形式，以防止ADDL与神经元结合和ADDLs的聚集。
因此，本发明是能够差异识别ADDLs的一种或多种多维构象的分离的抗体。本发明的抗体，当它出现在基本上不含有其它同样类型的生物大分子的情况下，被称为是分离的。因此，“分离的抗体”是指基本上不含有其它抗体的抗体；但是，分子可以含有某些其它的、对抗体的基本性质(例如结合特异性、中和活性等)没有有害影响的试剂或部分(moiety)。
能够特异性结合ADDLs的一种或多种多维构象的抗体，结合从Aβ1-42寡聚化衍生而来的特定的ADDLS，但是不与其它的Aβ肽、例如Aβ1-12、Aβ1-28、Aβ1-40和Aβ12-28发生交叉反应，正如本文中公开的通过western杂交分析所确定的那样；并且倾向于在溶液中结合ADDLs(参见例如实施例21)。两个实体之间的特异性结合一般是指亲和性至少为106、107、108、109或1010M-1。为了达到特异性结合，亲和性大于108M-1是希望的。
在特定的实施方案中，能够特异性结合一种或多种ADDLs的多维构象的抗体也是由ADDLs的多维构象引发的(即用其免疫动物)。在其它的实施方案中，能够特异性结合一种或多种ADDLs的多维构象的抗体是由低n-聚体形成肽例如Aβ1-42[Nle35-Dpro37]引发的。
术语“表位”是指抗原上与B和/或T细胞反应的位点，或分子上将针对其而产生抗体的位点，或抗体将与其结合的位点。例如，表位可以被定义该表位的抗体所识别。
线性的表位是其中氨基酸的一级序列含有被识别的表位的表位。线性的表位典型地含有至少3个、更经常至少5个、例如大约8到大约10个独特的氨基酸序列。
构象表位与线性表位相反，是其中含有表位的氨基酸的一级序列不是被识别的表位的唯一决定因素的表位(例如其中氨基酸的一级序列不必需被决定表位的抗体所识别的表位)。构象表位相对于线性表位来说典型地含有更多数量的氨基酸。在构象表位的识别方面，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，当蛋白分子折叠形成三维结构时，某些形成构象决定簇的氨基酸和/或多肽骨架变得并列(juxtaposed)，从而使得抗体识别表位。确定表位的构象的方法包括但不限于例如X-射线晶体学、二维核磁共振光谱学、以及位点指导的旋转标记和电子顺磁共振光谱学。参见例如Morris主编的《分子生物学方法》(1996年)第66卷中的《表位作图方案》。
Aβ衍生的可扩散配体或ADDLs是指淀粉样蛋白β1-42的可溶性的寡聚体，理想情况下含有少于8或9个淀粉样蛋白β1-42肽的聚合体，被发现与阿茨海默氏病相关。这与高分子量的聚合中间体相反，它们形成胶束的刺，导致原纤维的形成。
正如在本文中例举的那样，本发明的抗体结合或识别ADDL的至少一种多维构象(参见例如图3)。在特定的实施方案中，该抗体结合ADDL的至少两种、至少三种、或至少四种多维构象。ADDLs的多维构象包含了二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体等，正如通过SDS-PAGE分析所确定的那样。因为三聚体、四聚体等名称可以随着所用的分析方法而变化(参见例如Bitan等(2005)Amyloid 12：88-95)，在本文种使用的三聚体、四聚体等的定义是按照SDS-PAGE分析来进行的。为了说明该抗体的差异结合能力，已经发现某些抗体将识别ADDLs的一种多维构象、例如ADDLs的四聚体(例如抗体2D6或4E2)，而其它的抗体识别ADDLs的几种多维构象、例如ADDLs的三聚体和四聚体(例如抗体2A10、2B4、5F10或20C2)。因此，本发明的抗体具有寡聚体特异的性质。在特定的实施方案中，ADDLs的多维构象与特定的多肽结构相关，该结构产生了被本发明的抗体识别的的构象表位。在其它的实施方案中，本发明的抗体与大小范围大约为三聚体或四聚体、分子量超过50kDa的多维构象ADDL特异性结合。
在某些实施方案中，除了与多维构象结合之外，本发明的抗体还与淀粉样蛋白β1-42的选定的线性表位结合。ADDLs的线性表位是位于淀粉样蛋白β1-42N末端10、11、12、15或20个氨基酸残基的4、5、6或更多个氨基酸残基的肽。在特定的实施方案中，本发明的抗体与淀粉样蛋白β1-42残基1-10、1-8、3-10或3-8中的线性表位特异性结合。淀粉样蛋白β1-42的示例的线性表位包括但不限于氨基酸残基EFRHDS(SEQ ID NO：177)、DAEFRHDS(SEQ ID NO：178)和EFRHDSGY(SEQ ID NO：179)。
尽管本发明的抗体可能具有同样的线性表位，这种线性表位并不完全表明该抗体的结合特性(即阻断ADDL与神经元结合、阻止τ磷酸化和抑制ADDL聚集的能力)，这是因为，正如本领域的专业人员所熟知的那样，线性表位可能只对应于抗原的表位的一部分(参见例如Breitling和Dübel(1999)In：Recombinant Antibodies，John Wiley &Sons，Inc.，NY，pg.115)。例如，20C2被发现能够结合电荷逆转的、截短的Aβ7-42肽的聚合体，而该肽缺少20C2的线性表位(即氨基酸残基3-8)，并含有与Aβ的残基7-16非常不同的序列。因此20C2与依赖于Aβ的残基17-42内的元件的构象表位结合，但是只是在多维构象的情况下。本发明的抗体可以与本领域内其它的抗体区分开，因为它们能够差异性地识别多维的ADDLs，因此能够差异阻断ADDL与神经元的结合、差异性地防止τ磷酸化和差异性地抑制ADDL的聚集。
在本发明中使用的抗体包括但不限于多克隆或单克隆抗体、以及嵌合的、人的(例如从B细胞分离的)、人源化的、中和的、双特异性的或其单链抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆的。为了生产抗体，可以通过用合成的或天然的ADDLs注射来免疫各种宿主，包括山羊、兔、鸡、大鼠、小鼠、人等。生产抗体的方法在本技术领域内是众所周知的。参见例如Kohler和Milstein((1975)Nature256：495-497)以及Harlow和Lane的《抗体：实验室手册》(Cold SpringHarbor Laboratory，New York(1988))。
根据宿主的种类，可以使用不同的佐剂以增强免疫反应。用于本发明的佐剂希望能够增强对ADDLs的固有反应，而不引起免疫原中构象的变化，从而影响反应的定性形式。特别适合的佐剂包括3-脱氧酰化单磷酰脂A(MPLTM；RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，MT；参见GB 2220211)和水包油乳浊液，例如鲨烯或花生油，可以与免疫刺激剂组合使用，例如单磷酰脂A(参见Stoute等(1997)N.Engl.J.Med.336：86-91)、胞壁酰肽(例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(E-PE)、N-乙酰葡萄糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP))、或其它细菌细胞壁成分。水包油乳浊液的具体的例子包括MF59(WO90/14837)，含有5％鲨烯、0.5％TWEENTM80和0.5％SPAN85(也可以含有不同量的MTP-PE)，使用微量流化装置例如110Y型微量流化装置(Microfluidics，Newton，MA)制成亚微米级的颗粒；SAF，含有10％鲨烯、0.4％TWEENTM80、5％PLURONIC阻断的聚合物L121以及thr-MDP，可以通过微量流化装置制成亚微米级的颗粒，也可以振荡以产生较大颗粒尺度的乳浊液；以及RIBITM佐剂***(RAS)(RibiImmunoChem，Hamilton，MT)，含有2％鲨烯、0.2％TWEENTM80以及一种或多种细菌细胞壁成分，例如单磷酰脂A、二霉酸海藻糖(TREHALOSE DIMYCOLATE)(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。
另一类佐剂是皂角甙佐剂，例如STIMULONTM(QS-21，Aquila，Framingham，MA)或从其产生的微粒例如ISCOMs(免疫刺激复合物)和ISCOMATRIX(CSL Ltd.，Parkville，Australia)。其它适合的佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、矿物凝胶例如氢氧化铝、以及表面活性物质例如溶血卵磷脂、PLURONIC多元醇、多聚阴离子、肽、CpG(WO98/40100)、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和细胞因子例如白细胞介素(IL-1，IL-2，和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)以及肿瘤坏死因子(TNF)。在用于人的佐剂中，BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)特别适合。
针对多维构象ADDL的抗体是通过用ADDLs免疫动物产生的。一般来说，ADDLs可以合成或通过重组片段表达和纯化来产生。合成的ADDLs可以按照本文公开的方法或美国专利No.6,218,506中或共同待决的申请USSN 60/621,776、60/652,538、60/695,526和60/695,528中的方法来制备。此外，ADDLs可以与其它蛋白例如匙孔血蓝蛋白融合以产生针对嵌合分子的抗体。ADDLs可以在构象上受到限制以形成如本文描述的那样的有用的表位，此外，ADDLs也可以与表面关联、例如以允许产生能够被本发明的抗体识别的构象的方式物理连接或化学键合到表面。
针对ADDLs的多维构象的单克隆抗体可以使用任何通过培养物中的连续细胞株提供抗体分子生产的技术来制备。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术以及EBV杂交瘤技术(Kohler等(1975)Nature256：495-497；Kozbor等(1985)J.Immunol.Methods81：31-42；Cote等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-2030；Cole等(1984)Mol.Cell Biol.62：109-120)。示例性的单克隆抗体包括命名为2A10、4C2、2D6、4E2、20C2、2B4、5F10、2H4、2E12、1F6、1F4、3B3、5G12、6B7、6B11、11B4、11B5、14A11、15G6、17G4、20C2、3B7、1E3、1A9、1G3、1A7和1E5的鼠抗体。
此外，人源化的和嵌合的抗体可以通过将小鼠抗体基因与人抗体基因拼接从而获得具有适合的抗原特异性和生物活性的分子来生产(参见Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312：604-608；Takeda等(1985)Nature314：452-454；Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10029-10033；WO90/07861)。例如，将小鼠抗体在噬菌体选择载体中表达为Fv或Fab片段。轻链的基因(在平行实验中为重链的基因)与人抗体基因文库交换。然后鉴定仍然能够结合抗原的噬菌体抗体。该方法一般被称为链重排，提供的人源化抗体将能够与其来源的小鼠抗体结合相同的表位(Jespers等(1994)Biotechnology NY12：899-903)。作为可选的方法，链重排也可以在蛋白水平上进行(参见Figini等(1994)J.Mol.Biol.239：68-78)。
人抗体也可以使用噬菌体展示方法获得。参见例如WO91/17271和WO92/01047。在这些方法中，产生的噬菌体文库在其中每个成员在它们的外表面上展示不同的抗体。抗体通常被展示为Fv或Fab片段。通过对ADDLs的亲和性富集选择具有所需特异性的噬菌体展示抗体。针对ADDLs的人抗体也可以从非人的转基因哺乳动物生产，该哺乳动物转入的基因编码人免疫球蛋白位点和失活的内源免疫球蛋白位点的至少一部分。参见例如WO93/12227和WO91/10741，它们每个在此引为参考。人抗体可以通过竞争性结合实验来选择，或者与特定的小鼠抗体具有同样的表位特异性。这样的抗体非常可能享有小鼠抗体的有用的功能性质。人多克隆抗体也可以以血清的形式从用免疫原性试剂免疫的人中提供。任选，这样的多克隆抗体也可以使用ADDLs作为亲和试剂通过亲和纯化来浓缩。
人源化抗体也可以通过鼠抗体的表面修饰或表面重建(resurfacing)来生产。表面修饰包括用同源的人抗体序列只替换小鼠重链和轻链可变区中表面固定区域的氨基酸。用同源的人序列中同样位置的人残基替代小鼠的表面氨基酸，已经被显示能够降低小鼠抗体的免疫原性同时保留其配体结合。外部残基的替换对于内部结构域或结构域间的接触一般只有很小的影响或没有影响(参见例如美国专利No.6,797,492)。
人或人源化抗体可以被设计为具有IgG、IgD、IgA、IgM或IgE恒定区，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在特定的实施方案中，本发明的抗体是IgG或IgM，或其组合。特定的组合含有的恒定区是由选择性地将人IgG4序列整合到标准的人IgG2恒定区中而形成的。示例性的突变的IgG2 Fc是IgG2m4，在本文的SEQ IDNO：254中提出。抗体可以被表达成含有两条轻链和两条重链的四聚体，表达成分离的重链和轻链，也可以被表达成单链抗体，其中的重链和轻链可变结构域通过间隔物连接。生产单链抗体的技术在本领域内是众所周知的。
示例的通过CDR移植和表面修饰产生的人源化抗体是本文公开的命名为4E2、26D6、20C2、3B3、2H4和1F6的抗体。IgG1和IgG2M4重链可变区、以及通过CDR移植和表面修饰产生的人源化4E2、26D6、20C2、3B3、2H4和1F6的κ轻链可变区的氨基酸序列显示在图11A到11Y中，并公布为SEQ ID NOs：152到176。
微型双功能抗体(diabodies)也被构思了。微型双功能抗体是指工程化的抗体构建物，它是通过将结合抗体的结合结构域(重链和轻链)分离、然后提供连接基团而制备的，该连接基团将重链和轻链结合或可操作地连接在同样的多肽链上，从而保留结合功能(参见Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123)。这就实质上形成了极为简化的抗体，只含有结合抗原所必需的可变区结构域。通过使用非常短、从而不能允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链上互补的结构域配对，并产生两个抗原结合位点。这些二体抗体片段或微型双功能抗体是二价的和双特异性的。专业技术人员将会认识到，任何能够产生微型双功能抗体的方法都可以使用。适合的方法在Holliger等(1993)同上、Poljak(1994)同上、Zhu等(1996)Biotechnology14：192-196以及美国专利No.6,492,123中有描述，在此引为参考。
本发明分离的抗体的片段也明确地包含在本发明中。构思的片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、F(ab′)片段、双特异性scFv片段、Fd片段和Fab表达文库产生的片段，以及肽适配子(aptamer)。例如，F(ab’)2片段是通过用胃蛋白酶消化本发明的抗体分子而产生的，而Fab片段是通过还原F(ab’)2片段的二硫键桥而产生的。此外，可以构建Fab表达文库以允许快速、容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(参见Huse等(1989)Science 254：1275-1281)。在特定的实施方案中，本发明的抗体片段是保留了中和抗体的可变区结合位点的中和抗体的片段。例子是F(ab′)2片段、F(ab′)片段和Fab片段。一般可以参见《免疫学基本方法》(第二版)，J.Bellanti主编，95-97页。
能够差异识别ADDLs的多维构象的肽适配子可以被合理地设计，或在适配子文库(例如Aptanomics SA，Lyon，France所提供的文库)中筛选。一般来说，肽适配子是合成的识别分子，其设计基于抗体的结构。肽适配子由可变的肽环构成，其两端与蛋白支架相连。这种双重结构限制极大地增加了肽适配子的结合亲和性，达到了可以与抗体的结合亲和性相比较的水平(纳摩尔范围)。
示例的用于生产本发明的抗体和抗体片段的编码重链和轻链可变区的核酸序列在本文中公开在图6和10中(即SEQ ID NOs：1-24和SEQID NOs：132-151)。正如专业技术人员将会理解的那样，本文公开的重链可变区可以与本文公开的任何一种轻链可变区组合使用，以产生具有修饰的亲和性、解离常数、表位等的抗体。例如，将2H4的轻链可变区(由SEQ ID NO：12编码)与2A10的重链可变区(由SEQ ID NO：13编码)组合，可以识别更大的线性表位的。
用于生产本发明的抗体或抗体片段的示例的重链和轻链CDRs被公开在图7A-7F中，它们具有SEQ ID NOs：25、26和28(重链CDR1)、SEQ ID NOs：29、30、31、33、34、35和36(重链CDR2)、SEQ ID NOs：38、39、40、41、43、44、45、46、47和48(重链CDR3)、SEQ ID NOs：49、50、51和53(轻链CDR1)、SEQ ID NOs：54、55、56和58(轻链CDR2)、以及SEQ ID NOs：59、60、61、62、63、64和66(轻链CDR3)中显示的氨基酸序列。本发明的抗体或抗体片段的重链和轻链的具体的实施方案如下。重链CDR1具有氨基酸序列Ser-Phe-Gly-Met-His(SEQ IDNO：28)或Thr-Ser-Gly-Met-Gly-Val-Xaa(SEQ ID NO：27)，其中Xaa是没有侧链或具有小侧链的氨基酸(例如丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸)。重链CDR2具有氨基酸序列His-Ile-Xaa1-Trp-Asp-Asp-Asp-Lys-Xaa2-Tyr-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys-Ser(SEQ ID NO：32)，其中Xaa1是具有芳香族侧链基团的氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)，Xaa2是丝氨酸、精氨酸或酪氨酸；或者重链CDR2具有氨基酸序列Tyr-Ile-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ser-Xaa4-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO：37)，其中Xaa1和Xaa2是具有极性侧链基团的氨基酸(例如精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸)，Xaa3是甘氨酸或缬氨酸，Xaa4是具有极性和不带电荷的侧链基团的氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)。重链CDR3具有氨基酸序列Arg-Ser-Ile-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Pro-Glu-Asp-Tyr-Phe-Xaa5-Tyr(SEQID NO：42)，其中Xaa1是具有极性和不带电荷的侧链基团的氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)，Xaa2是具有羟基侧链基团的氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)，Xaa3和Xaa4是具有脂肪族侧链基团的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸)，Xaa5是天冬氨酸或丙氨酸。轻链CDR1具有氨基酸序列Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Xaa1-Xaa2-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Xaa3(SEQ ID NO：52)，其中Xaa1和Xaa2是具有脂肪族侧链基团的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸)，Xaa3是具有带电荷侧链基团的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸或赖氨酸)。轻链CDR2具有氨基酸序列Lys-Xaa1-Ser-Asn-Arg-Phe-Xaa2(SEQ ID NO：57)，其中Xaa1是具有脂肪族侧链基团的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸)，Xaa2是丝氨酸或苯丙氨酸。轻链CDR3具有氨基酸序列Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Val-Pro-Xaa5-Thr(SEQ ID NO：65)，其中Xaa1是丝氨酸或苯丙氨酸，Xaa2是不带侧链的氨基酸(例如甘氨酸)或具有羟基侧链基团的氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)，Xaa3是具有羟基侧链基团的氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)，Xaa4是组氨酸、酪氨酸或亮氨酸，Xaa5是具有脂肪族侧链基团的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸)。正如专业技术人员将会理解的那样，抗体重链和轻链可变区中的一个或多个CDRs可以被另一个抗体中的一个或多个CDRs取代，从而产生全新的抗体或抗体片段。例如用4E2重链的CDR3代替5F10的重链CDR3(SEQ ID NO：41)可以增强5F10阻断ADDLs与神经元细胞结合的能力。
具有特定性质的抗体也被构思了。在一个实施方案中，结合Aβ1-42的3-8位氨基酸表位的抗体含有重链CDR1氨基酸序列Thr-Ser-Gly-Met-Gly-Val-Xaa(SEQ ID NO：27)，其中Xaa是没有侧链或具有小侧链的氨基酸(例如丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸)，或重链CDR2氨基酸序列His-Ile-Xaa1-Trp-Asp-Asp-Asp-Lys-Xaa2-Tyr-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys-Ser(SEQ ID NO：32)，其中Xaa1是具有芳香族侧链基团的氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)，Xaa2是丝氨酸、精氨酸或酪氨酸。在另一个实施方案中，对于大的(>50kDa)ADDL聚集体比小的(<30kDa)ADDL聚集体(即分别为SEC峰1和峰2)具有中度亲和性的抗体，含有重链CDR3氨基酸序列Arg-Ser-Ile-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Pro-Glu-Asp-Tyr-Phe-Xaa5-Tyr(SEQID NO：42)，其中Xaa1是具有极性和不带电荷的侧链基团的氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)，Xaa2是具有羟基侧链基团的氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)，Xaa3和Xaa4是具有脂肪族侧链基团的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸)，Xaa5是天冬氨酸或丙氨酸。
本发明的抗体或抗体片段可以在其上连接有附加的基团。例如，微球或微粒可以结合在抗体或抗体片段上，如美国专利No.4,493,825中描述的那样，其内容在此引为参考。
此外，本发明的抗体或抗体片段可以被突变和筛选以增加抗原亲和性、中和活性(即阻断ADDLS与神经元细胞结合的能力或阻断ADDL聚集的能力)、或获得修饰的解离常数。大肠杆菌增变株(mutatorstrains)(Low等(1996)J.Mol.Biol.260：359-368)、链重排(Figini等(1994)同上)以及PCR诱变是已建立的用于突变编码抗体的核酸分子的方法。作为说明，可以通过将大量的噬菌体抗体与少量的生物素标记的抗原相接触以便抗体竞争结合，来筛选增加的亲和性。在这种情况下，抗原分子的数量应该超过噬菌体抗体的数量，但是抗原的浓度应该稍微低于解离常数。因此，优势的具有增加的亲和性的突变的噬菌体抗体与生物素标记的抗原结合，而较大部分具有较弱亲和性的噬菌体抗体保持不结合。然后链亲和素可以帮助从混合物中富集具有较高亲和性的突变的噬菌体抗体(Schier等(1996)J.Mol.Biol.255：28-43)。本文中公开了示例的亲和性成熟的轻链CDR3氨基酸序列(参见表11和12)，在具体的实施方案中包含了轻链CDR3氨基酸序列Xaa1-Gln-Xaa2-Thr-Arg-Val-Pro-Leu-Thr(SEQ ID NO：316)，其中Xaa1是苯丙氨酸或亮氨酸，Xaa2是丙氨酸或苏氨酸。
对于某些治疗应用来说可能希望减少抗体从抗原上的解离。为了达到这个目的，将噬菌体抗体与生物素标记的抗原结合，并加入过量的未生物素标记的抗原。经过一段时间之后，有利的是(Predominantly)可以使用链亲和素收获具有较低解离常数的噬菌体抗体(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226：889-96)。
可以使用各种免疫分析方法包括本文中公开的方法进行筛选，以鉴定对ADDLs的多维构象具有所需的特异性的抗体或其片段。大量用于竞争性结合(例如ELISA)、乳胶凝集分析、免疫放射分析，使用多克隆或单克隆抗体或其片段的动力学分析(例如BIACORETM分析)的规程在本技术领域内是众所周知的。这样的免疫分析典型地包含了测量特定抗体及其相关的(cognate)抗原之间形成的复合物。使用能够与两个互相无干扰的表位反应的单克隆抗体的双位点的、基于单克隆抗体的免疫分析方法是适合的，但是竞争性结合分析也可以使用。这样的分析方法也可用于检测样品中ADDLs的多维构象。
抗体或抗体片段也可以用于其它的生物活性分析，例如代替ADDL与神经元或培养的海马细胞结合或阻断ADDL的聚集，以评估中和活性或药物活性和作为预防或治疗试剂的潜在效能。这样的分析方法在本文中进行了描述，并且在本技术领域内是众所周知的。
抗体和抗体片段可以作为杂交瘤生产和维持，也可以在任何已经建立好的表达***中重组生产，这些表达***包括但不限于大肠杆菌、酵母(例如Saccharomyces spp.和Pichia spp.)、杆状病毒、哺乳动物细胞(例如骨髓瘤、CHO、COS)、植物或转基因动物(Breitling和Dübel(1999)《重组抗体》，John Wiley & Sons，Inc.，NY，pp.119-132)。通过CDR移植和表面修饰产生的人源化的4E2、26D6、20C2、3B3、2H4和1F6的IgG1和IgG2m4的重链可变区以及κ轻链可变区的核酸序列的例子显示在图10A到10S中，在本文中被陈列为SEQ ID NOs：132到151。为了可以使用任何适当的方法、包括但不限于亲和层析、免疫球蛋白结合分子(例如蛋白A、L、G或H)来分离抗体和抗体片段，可以将标签(例如His-tag、FLAG-tag、Strep tag、c-myc tag)等与抗体或抗体片段可操作地连接。参见Breitling和Dübel(1999)同上。
本发明的抗体和抗体片段具有各种不同的应用，包括与ADDLs的积累相关的疾病的诊断、阻断或抑制ADDLs与神经元细胞的结合、阻断ADDL的聚集、与ADLLs相关的疾病的预防性或治疗性治疗、鉴定能够阻止ADDLs与神经元结合以及阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位上磷酸化的治疗试剂。
本发明的抗体和抗体片段也可用于阻断或抑制ADDLs与神经元的结合的方法中。本发明的这种方法的执行是通过在体外或体内用本发明的抗体或抗体片段与神经元相接触，以便ADDLs与神经元的结合被阻断。在具体的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段使ADDLs的结合与不存在抗体或抗体片段的情况下ADDLs的结合相比减少了至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或97％。抗体阻断ADDLs与神经元结合的程度可以按照本文公开的方法来确定，即免疫细胞化学或基于细胞的碱性磷酸酶分析方法或任何其它适合的分析方法。对于降低ADDLs与神经元结合来说特别有用的抗体包括示例的20C2、3B3、1F4、1F6、4E2、2B4、2D6和2H4单克隆抗体。
本发明的抗体和抗体片段还可用于阻断或抑制ADDLs聚集的方法。该方法包括将含有淀粉样蛋白β1-42肽的样品与本发明的抗体或抗体片段接触以便ADDL的聚集被抑制。抗体阻断ADDLs聚集的程度可以按照本文公开的方法测定，即FRET或荧光偏振或任何其它适合的分析方法。对于阻断ADDLs的聚集来说特别有用的抗体包括示例的1F4、20C2、4C2、1F6、2B4、5F10、2A10和2D6抗体。
本文公开的抗体也可用于阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位点磷酸化的方法。该方法包括将含有τ蛋白的样品与本发明的抗体或抗体片段相接触，以便ADDLs与神经元的结合被阻断，从而阻止τ蛋白的磷酸化。抗体阻止τ蛋白磷酸化的程度可以根据本文公开的方法或任何其它适合的分析方法来测定。
阻断或降低ADDLs与神经元的结合、抑制ADDLs的聚集、阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位点的磷酸化，都可以在预防性或治疗性治疗与ADDLs积累相关的疾病的方法中发现应用。因此，本发明也包含了使用本发明的抗体或抗体片段预防或治疗与ADDLs积累相关的疾病(例如阿茨海默氏病或类似的与记忆相关的紊乱)。可以治疗的病人包括有疾病风险但没有表现出症状的个体以及目前已经表现出症状的病人。就阿茨海默氏病而言，事实上任何人都有患阿茨海默氏病的风险，只要他或她活得足够长。因此，本发明的抗体或抗体片段可以不需要对受试病人进行任何风险评估就预防性用于普通人群。本方法对于已知具有阿茨海默氏病遗传风险的个体来说特别有用。这些个体包括其亲属已经被诊断患有该病、以及其风险已经通过遗传标记或生物化学标记确定了的个体。阿茨海默氏病风险的遗传标记包括APP基因中的突变，特别是717位和670与671位分别被称为Hardy和Swedish突变的突变。其它的风险标记是早老蛋白基因PS1和PS2以及ApoE4中的突变、阿茨海默氏病家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。目前患有阿茨海默氏病的个体可以根据特征性的痴呆以及上述风险因素的存在来识别。此外，有许多诊断测试可用于鉴定患有阿茨海默氏病的个体。这包括测量CSFτ和Aβ1-42的水平。患有阿茨海默氏病的个体也可以通过ADRDA判断标准或本文公开的方法来诊断。
在无症状的的病人中，治疗可以在任何年纪开始(例如10、20、30岁)。但是，通常来说在病人达到40、50、60或70岁前不必须开始治疗。典型情况下治疗需要在一段时期内使用多次剂量。治疗可以通过分析ADDLs随时间的存在而被监测。
在治疗应用中，将含有本发明的抗体或抗体片段的药物组合物或药剂给药至怀疑或已经患有与ADDLs的积累相关的疾病的病人，其剂量足够治疗或至少部分阻止疾病的症状(生物化学、组织学和/或行为学的症状)，包括其在疾病发展过程中的并发症和中间病理表现型。在预防性应用中，将含有本发明的抗体或抗体片段的药物组合物或药剂给药至怀疑患有与ADDLs的积累相关的疾病或具有这样的疾病的风险的病人，其剂量足够在病人中实现被动免疫，从而消除或减少风险、减缓病情、或延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为学症状、其在疾病发展过程中的并发症和中间病理表现型的出现。在某些方法中，在还没有发展出特征性的阿茨海默氏病病理学的病人中给药药剂降低或消除了肌认知损伤。在特定的实施方案中，有效剂量的本发明的抗体或抗体片段是在病人中能够使ADDLs与神经元的结合与不进行治疗的情况下ADDLs的结合相比减少至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或97％的剂量。同样，长期增强作用/记忆形成的损伤也降低了。
用于治疗上述病症的本发明的组合物的有效剂量随着许多不同的因素而变化，包括给药的方式、病人的生理状态、病人是人还是动物、使用的其它药剂、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常情况下，病人是人，但是非人的哺乳动物例如狗或转基因哺乳动物也可以被治疗。
治疗剂量一般被滴定以使安全性和效力最优化。对于使用抗体或抗体片段的被动免疫来说，剂量范围从大约0.0001到100mg/kg宿主体重，更通常为0.01到5mg/kg宿主体重是适合的。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方法需要每两个星期给药一次、或一月一次、或每3到6个月一次。在某些方法中，本发明的两种或多种具有不同结合特异性的抗体被同时给药，在这种情况下每种给药的抗体的剂量位于所指出的范围内。抗体通常被给药多次，其中每剂之间的间隔可以是周、月或年。间隔也可以是不规则的，正如测量病人中针对ADDLs的抗体的血液水平所显示的那样。在某些方法中，剂量被调整以获得血浆抗体浓度1-1000μg/mL，在某些方法中为25-300μg/mL。此外，抗体或抗体片段也可以作为缓释制剂被给药，在这种情况下需要的给药频率降低。剂量和频率随着抗体在病人中的半衰期而变化。一般来说，人和人源化抗体比嵌合抗体和非人抗体的半衰期长。正如上面指出的那样，给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在较长期的时间内以相对不频繁的间隔给药相对低的剂量。某些病人在它们的余生中连续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔中使用相对高的剂量，直到疾病的发展被减缓或终止，在优选情况下直到病人显示出疾病症状的部分或完全改善。之后，病人可以按照预防性方法给药。
本发明的抗体和抗体片段可以作为药物组合物组合物或药剂的成分被给药。药物组合物组合物或药剂一般含有活性治疗试剂和各种其它的可药用的成分。参见Remington的《药物学科学与实践》，AlfonsoR.Gennaro主编，第20版，Lippincott Williams & Wilkins：Philadelphia，PA，2000。优选的形式依赖于所需的给药模式和治疗应用。药物组合物依赖于所需的剂型，药物组合物可以含有可药用的、无毒性的载体或稀释剂，它们被定义为通常用于配制药物组合物用于动物和人给药的药物组合物的媒介。稀释剂被选择使其不影响组合物的生物学活性。这样的稀释剂的例子是蒸馏水、生理磷酸缓冲的盐水、林格溶液、葡萄糖溶液以及Hank′s溶液。
药物组合物组合物也可以含有大的、代谢缓慢的大分子例如蛋白、多糖例如壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸和共聚物(例如胶乳功能化的SEPHAROSETM、琼脂糖、纤维素等)、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂类聚集物(例如油滴或脂质体)。
本发明的药物组合物或药剂的给药可以通过各种途径进行，包括但不限于口服、局部、肺部、直肠、皮下、皮内、鼻内、颅内、肌肉内、眼内或关节内注射等。最典型的给药途径是静脉内，其次是皮下，尽管其它的途径也同等有效。也可以在臂部或腿部肌肉中进行肌肉内注射。在某些方法中，药剂被直接注射到沉积物积累的特定组织中，例如颅内注射。在某些实施方案中，抗体或抗体片段作为缓释组合物或装置例如MEDIPADTM装置被给药。
对于肠胃外给药来说，本发明的抗体或抗体片段可以作为物质的溶液或悬浮液的可注射的剂量进行给药，这些物质溶解或悬浮在具有药用载体的生理可接受的稀释剂中，它们可以是无菌的液体例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可以存在于组合物中。药物组合物的其它成分是石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的成分，例如花生油、大豆油和矿物油。一般来说，二羟基醇例如丙二醇或聚乙二醇是适合的液体载体，特别对于可注射溶液来说。抗体可以以推注注射液(depotinjection)或植入制备物的形式被给药，它们可以被配制成允许活性成分缓慢释放的形式。示例的组合物含有5mg/mL的抗体，配制在含有50mM L-组氨酸和150mM NaCl，用HCl调整到pH6.0的缓冲溶液中。
典型情况下，组合物被制备成可注射的，或者作为溶液或者作为悬浮液；在注射前也可以制备适合溶解或悬浮在液体媒介中的固体形式。制备物也可以被乳化或包裹在脂质体或微粒例如聚交酯、聚乙交酯或共聚物中以增强释放。
对于栓剂来说，结合物和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以从含有0.5％到10％、更理想1％到2％范围的活性成分的混合物形成。
口服制剂含有赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，含有10％到95％、更适合为25％到70％的活性成分。
局部应用可以导致透皮或皮内的释放。局部给药可以通过与霍乱毒素或其脱毒的衍生物或其亚基或其它类似的细菌毒素共同给药而便利化(参见Glenn等(1998)Nature 391：851)。共同给药可以通过将成分作为混合物或通过化学交联获得的结合分子使用、或表达为融合蛋白来实现。
此外，透皮递送可以使用皮肤途径或使用传输体(transferosome)来实现(Paul等(1995)Eur.J.Immunol.25：3521-24；Cevc等(1998)Biochem.Biophys.Acta1368：201-15)。
本发明的抗体或抗体片段也可以任选与至少对于淀粉样蛋白源性的疾病部分有效的其它试剂组合给药。
本发明的抗体和抗体片段也在鉴定阻止ADDLs与神经元(例如海马细胞)的结合、从而阻止ADDLs引起的下游事件的治疗药剂中发现了应用。这种分析方法的执行是通过在存在药剂的情况下将神经元与ADDLs相接触，使用本发明的抗体或抗体片段来确定在存在药剂的情况下ADDLs与神经元的结合。正如本领域的专业技术人员将会认识到的那样，与没有与药剂接触的神经元相比，能够阻断ADDLs与神经元的结合的试剂，能够减少结合到神经元上的ADDLs的量，这个量可以在使用本发明的抗体或抗体片段的免疫分析中被检测到。适合检测与神经元结合的ADDLs的免疫分析方法在本文中公开。
可以使用本文提供的方法来筛选的试剂包括大量的化学类别，尽管典型情况下它们是有机分子，优选为分子量大于100而小于大约2500道尔顿的小有机分子。所述试剂含有与蛋白发生结构相互作用、特别是氢键键合所必需的官能团，典型地至少包括胺、羰基、羟基或羧基基团，优选至少有两个化学官能团。该试剂通常含有环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构，被一个或多个上述官能团取代。该试剂也可以在生物分子中发现，包括肽、抗体、糖类、脂肪酸、甾体、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或其组合。试剂可以从广泛的来源获得，包括天然的或合成的化合物文库。
各种其它的试剂例如盐和中性蛋白也可以包含在筛选分析中。能够提高分析效率的试剂、例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物试剂等也可以使用。成分的混合物可以以任何次序加入，只要能够提供所需的结合。
通过本发明的筛选分析鉴定的试剂将有益于源自淀粉样蛋白的疾病和/或τ蛋白病(tauopathy)的治疗。此外，已经构思了用于示范这些概念的实验***代表了用于评估、鉴定和筛选与淀粉样蛋白β诱导的τ磷酸化相关的新的药物靶的研究工具。
本发明还提供了使用本发明的抗体或抗体片段来检测ADDLs和诊断与ADDLs的积累有关的疾病的方法。与ADDLs的积累相关的疾病打算包含任何其中ADDLs的积累导致了长期增强作用/记忆形成的生理性缺损的疾病。这种类型的疾病包括但不限于阿茨海默氏病和类似的与记忆有关的紊乱。
按照这些方法，将来自病人的样品与本发明的抗体或抗体片段相接触，抗体或抗体片段与样品的结合表明了样品中ADDLs的存在。当用于本发明中时，样品意味着任何适合于使用免疫分析方法进行分析的体液或组织。可以根据本发明的方法进行分析的适合的样品包括但不限于来自病人(例如哺乳动物例如人)脑部的活组织切片样品和液体样品。对于体外目的来说(例如在监测寡聚体的形成的分析方法中)，样品可以是神经元细胞系或组织样品。对于诊断目的来说，构思了样品可以来自怀疑患有与ADDLs的积累相关的疾病的个体，或者来自具有与ADDLs的积累相关的疾病的风险的个体，例如具有使个体易患与ADDLs的积累相关的疾病的家族史的个体。
抗体或抗体片段与样品中的ADDLS的结合的检测可以使用任何标准的免疫分析方法(例如本文中公开的方法)来进行，或者当抗体片段是例如肽适配子时，结合可以通过例如与适配子融合的可检测的标记蛋白(例如β-半乳糖苷酶、GFP或荧光素酶)被直接检测。其后，ADDL-抗体复合物的存在或不存在分别与样品中ADDLs的存在或不存在相关联，因此分别与ADDLs的积累相关的疾病的存在或不存在相关联。已经构思了本发明的一种或多种抗体或抗体片段可以与现有的非侵入性的基于免疫的成像技术相结合，以极大地增强与ADDLs的积累相关的疾病的检测和早期诊断。
为了便于诊断，本发明还配备了含有本发明的抗体或抗体片段的试剂盒。试剂盒包括容器，其中盛放能够识别ADDLs的多维构象的一种或多种抗体或抗体片段，和使用抗体来结合ADDLs以形成抗体-抗原复合物、以及检测抗体-抗原复合物的形成以便将抗体-抗原复合物的存在与否与样品中ADDLs的存在与否关联起来的说明书。容器的例子包括允许同时在大量样品中检测ADDLs的多孔板。
通过下面的非限制性的实施例，本发明将被更详细地描述。
实施例1：通用材料和方法
ADDL的制备。在F12培养基(Biosource，Camarillo，CA)中的ADDLs按照已建立的方法(Lambert等(2001)同上)从Aβ1-42制备。简单来说，将Aβ1-42肽(American Peptide Co.，Sunnyvale，CA或California Peptide Research，Inc.，Napa，CA)称重，放置在能够容纳足够量HFIP(1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇)的玻璃瓶中，使肽浓度达到10mg/mL。HFIP被加入到干燥的肽中，将玻璃瓶盖上盖子，轻柔漩涡振荡混合，将肽/HFIP溶液储存在室温至少1小时。将肽溶液的等份试样(50或100μL，分别含0.5或1.0mg)分配到一系列1.5mL的锥形离心管中。将管放置在真空离心蒸发浓缩器(speedvac)中过夜以除去HFIP。含有干燥的肽薄膜的管子被盖上盖子，在带有干燥剂的密封容器中于-70℃保存。
使用前，将Aβ1-42肽薄膜从-70℃的储存处取出，温热至室温。加入新鲜的DMSO(44μL/mg肽薄膜；5mM)，将肽/DMSO混合物在涡旋混合器上以可能的最低速度振荡10分钟。在每管DMSO/肽中加入F12培养基(2mL/mg肽)，盖上管盖，颠倒混合。将100μM的制备液储存在2-8℃18到24小时。样品在2-8℃以14,000xg离心10分钟。将上清液转移到新的管中，储存在2-8℃备用。
生物素标记的ADDL制备物(bADDLs)以与上述用于ADDL制备物相同的方法制备，使用100％N-末端生物素标记的淀粉样蛋白β肽(American Peptide Company，Sunnyvale，CA)。
ADDL原纤维制备。在室温ADDL肽薄膜中每毫克肽加入2mL 10mM盐酸。将溶液在涡旋混合器中以可能的最低速度混合5到10分钟，得到的制备物在使用前储存在37℃18到24小时。
单体制备。蒸发掉HFIP的淀粉样蛋白β(1-40)肽(Aβ1-40)的制备物按照Aβ(1-42)肽的方法制备。将肽薄膜溶解在每毫克肽2mL 25mM的硼酸缓冲液(pH8.5)中，分成等份试样，冷冻在-70℃备用。
人原纤维的制备。从冷冻的人皮层获得的样品在具有蛋白酶抑制剂(COMPLETE，Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)的冰冷的20X F12培养基中匀浆1分钟。然后将样品在4℃以10,000xg离心1小时。用F12洗两次后，将沉淀重新悬浮在2％SDS/F12中，在冰上保温30分钟。然后将样品在4℃以220,000xg离心1小时。将沉淀重新悬浮在冷的F12中，然后以15秒的脉冲超声1分钟。使用COOMASSIE PLUSTM试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)测定蛋白。
免疫。得到的可溶性Aβ寡聚物，在本文中称为“合成的”ADDLs，与完全弗氏佐剂(第一和第二次接种)或不完全弗氏佐剂(所有后续的接种)以1∶1混合，然后皮下(前两次接种)或腹膜内注射到三只小鼠中，总体积为每只小鼠大约1mL。每次注射由等同于194±25μg总蛋白的纯化的ADDLs组成。小鼠大约每三周注射一次。经过六次注射后，一只小鼠死亡，其脾脏被冷冻。然后将具有最高血清滴度的小鼠的脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞在存在聚乙二醇的情况下融合，铺在6个96孔板中。细胞在200μL的HAT选择培养基中于37℃和5％CO2下培养10天，该培养基是添加了10％胎牛血清(FBS)、1μg/mLHYBRIMAX(重氮丝氨酸-次黄嘌呤，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和30％从SP2/0细胞培养液中收集的条件培养基的ISCOV培养基。培养物在第10天时用补充有10％FBS的ISCOV培养基补料一次，在第14天时取出培养上清液在ELISA中筛选阳性孔。阳性培养物通过以概率为每个孔0.3个细胞的极限稀释进一步克隆。阳性克隆在ELISA中证实，并进一步增殖。
上清液的筛选包括5种分析：斑点印迹和western免疫印迹(Lambert等(2001)同上)，使用合成的ADDLs的非变性免疫印迹，以及使用从人组织获得的内源原纤维的斑点印迹和western印迹。这些分析测试了抗体与ADDLs的结合(斑点印迹)，并鉴定了具有最大亲和性的寡聚体(western)。在斑点印迹中使用5pmole ADDLs测试所有的抗体(第一次融合的576个上清液和第二次融合中的1920个上清液)。然后对被测试为阳性的上清液使用western印迹以10-20pmole的ADDLs进一步筛选。筛选被重复以鉴定低的阳性子或假阳性子。第一只小鼠的10个孔的上清液和第二只小鼠的45个孔的上清液被扩增。然后将扩增的孔冷冻或亚克隆。
在雌性balb/c小鼠中使用标准规程(分子生物学现代手册)生产了含有单克隆抗体的腹水。简单来说，通过腹膜内注射降植烷(pristane)使小鼠致敏(primed)。致敏后一周，用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)中的大约5x106个杂交瘤细胞通过腹膜内注射小鼠。10到14天后收集腹水。使用BIO-RADAFFI-GELProtein蛋白A MAPSII试剂盒，按照制造商的规程进行IgG的纯化。在每次运行中，将3mL腹水通过脱盐柱进行脱盐，洗脱到4mL结合缓冲液中。然后将样品上样蛋白A柱。用40mL结合缓冲液冲洗后，用洗脱缓冲液洗脱柱子，收集5mL的级分。在样品中加入60μL 10N NaOH进行中和。为了将缓冲液变换成PBS，将样品上样第二根脱盐柱，用PBS洗脱。
对照抗体。多克隆抗体M71/2和M90/1从Bethyl Laboratories，Inc.(Montgomery，TX)获得。抗Aβ单克隆抗体6E10(针对残基1-17)和4G8(针对残基17-24)从Signet Labs(Dedham，MA)获得。在本技术领域内通过western印迹分析(Ida等(1996)J.Biol.Chem.271：22908-22914)已知单克隆抗体WO-2能够识别1-40和1-42两者。单克隆抗体BAM-10(针对Aβ1-40)从ABCAM(Cambridge，MA)获得。在本技术领域内熟知单克隆抗体26D6能够识别Aβ序列的氨基酸1-12(Lu等(2000)Nat.Med.6：397-404)。
免疫印迹分析。十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用现有的方法进行(Lambert等(2001)同上)，除了使用10-20％Tris-Tricine凝胶(BIO-RAD，Hercules，CA)和在120V进行分离。凝胶按照标准方法转移，第二抗体按照常规以1∶40,000稀释度使用。
对于起始筛选来说，将2.7μg ADDLs相当于大约每条道16-20pmol，在4-20％的二维(2D)凝胶上分离。电泳和转移的方法如上所述。使用示踪染料作为指导，将硝酸纤维素膜放入Surf-blot装置(IdeaScientific，Minneapolis，MN)，在20-21个孔中的每个孔中加入200μL与阻断缓冲液混合的杂交瘤上清液，阻断缓冲液是含有5％脱脂奶粉的具有TWEENTM20的tris盐缓冲盐水(TBS-T；Lambert等(2001)同上)。在室温摇动保温1.5小时后，除去上清液，用200μL阻断缓冲液清洗孔。然后将膜从Surf-blot装置中取出，在TBS-T中清洗3次，每次15分钟。然后将第二抗体(与HRP偶联的抗小鼠IgG，1∶40,000稀释度；Molecular Probes，Eugene，OR)与膜在室温保温1小时。在清洗(3次，每次15分钟)后，使用一半强度的SUPERSIGNAL(Pierce，Rockland，IL)使寡聚体可视化。使用人原纤维的western免疫印迹以同样的方式进行，在每个2D SDS-PAGE免疫印迹中使用大约64μg人原纤维组织。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照现有的方法进行(Chromy等(2003)Biochemistry42：12749-12760)，除了在120V下进行分离。
Western印迹。将被分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。杂交用在TBS-T(含0.1％TWEENTM20的TBS)中的5％脱脂奶粉或1％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭过夜，与第一抗体保温1.5小时，清洗，与辣根过氧化物酶(HRP)结合的第二抗体(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)保温1小时。在最后的清洗后，蛋白用West Femto化学发光试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和KODAK影像工作站440CF或用胶片(HYPERFILMTM，Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)进行可视化。
海马培养物。培养物从E18胚胎按照标准的规程(Brewer(1997)J.Neurosci.Methods71：143-155；Stevens等(1996)J.Neurosci.Res.46：445-455)制备。对活细胞进行计数，铺在用聚赖氨酸(200μg/mL)包被的盖玻片上，浓度从1.5x104到106个细胞/cm2。通过除去一半的培养基并用添加NEUROBASALTM的培养基替换，将培养基改变。
原代神经元。原代海马培养物从冷冻的、解离的、新生大鼠海马细胞(Cambrex，Corp.，East Rutherford，NJ)制备，该细胞被融化并铺在96孔COSTAR板中，浓度为每个孔20,000个细胞。细胞被维持在不含L-谷氨酰胺的NEUROBASALTM(GIBCO-BRLTM，Gaithersburg，MD)，并补充B27(GIBCO-BRLTM，Gaithersburg，MD)的培养基中，细胞培养两个星期，然后用于结合研究。
B103细胞。B103成神经细胞瘤细胞株(Schubert和Behl(1993)Brain Res.629：275-82)被培养在不含有酚红的DMEM中(GIBCO-BRLTM，Gaithersburg，MD)，其中存在10％FBS(Hyclone，Logan，UT)和1％Pen-Strep(GIBCO-BRLTM，Gaithersburg，MD)。将指数生长的B103细胞分离，铺在96孔CORNING板中，浓度为每个孔5,000细胞。铺板后24小时，细胞被用来评估ADDL和bADDL的结合，以及对商业化的和新的抗ADDL单克隆抗体进行性质研究。
斑点印迹分析。斑点印迹按照Lambert等((2001)同上的方法进行，将ADDLs(每个斑点5pmole)或原纤维加到硝酸纤维素膜上。为了进行随后的斑点印迹，使用从Surf-blot设备衍生的模板将ADDLs以在0.5μL中不同的皮摩尔浓度加到干燥的硝酸纤维素膜上，每个浓度两份样。然后将样品干燥15分钟，用封闭缓冲液封闭1小时，与加或不加肽的抗体保温1.5小时，其中抗体已经在室温预保温了至少1小时。从Surf-blot设备中除去溶液，用封闭缓冲液清洗孔，从设备中取出膜。按照前面的描述将硝酸纤维素膜清洗，用第二抗体处理并可视化。
免疫细胞化学。免疫细胞化学按照现成的方法(Lambert等((2001)同上)进行，除了第二抗体与ALEXAFLUOR588(Molecular Probes，Eugene，OR)结合。在应用于21天的海马细胞培养物之前，抗体和ADDLs以抗体：ADDLs比例1∶4在室温预先保温1小时。对于内源ADDLs来说，在如前所述对细胞进行清洗、固定和可视化之前，将人脑蛋白(按照Lambert等(2001)同上的方法制备)与细胞保温1小时。
将来自阿茨海默氏病和对照海马的轻微固定的冷冻切片(4％多聚甲醛在4℃固定30小时，低温保护在40μm蔗糖中)与抗体(1∶1000稀释在磷酸盐缓冲液(PBS)中)在4℃保温过夜。除去抗体后，切片用PBS洗3次，与第二抗体在室温保温。然后使用DAB(SIGMATM，St.Louis，MO)对结合进行可视化。然后将切片用苏木精复染、封固、在带有SPOTTM INSIGHTTM数码相机(v.3.2)的NIKONECLIPSEE600光学显微镜下成像。
定量免疫细胞化学。培养的海马细胞与500nM ADDLs在37℃保温1小时。通过清洗除去ADDLs，将细胞用3.7％甲醛固定。细胞与含有0.1％TRITONTM X-100的PBS-NGS(含有10％正常山羊血清的PBS)保温30分钟，清洗一次，与所需的第一抗体(用PBS-NGS稀释)在4℃保温过夜。将样品清洗，与适合的第二抗体例如ALEXAFLUOR488或594抗小鼠和抗兔IgGs(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)在37℃保温2小时。将盖玻片清洗并封固在PROLONG抗荧光淬灭封片液(Antifade Mounting Medium)中(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)，使用LEICATCS SP2共聚焦扫描DMRXE7显微镜成像。
ELISA。多克隆抗ADDLs IgG(M90/1；Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX)以每个孔0.25mg的量被铺在IMMULONTM 3REMOVAWELLTM条板(Dynatech Labs，Chantilly，VA)中，室温放置2小时，用含有2％BSA的TBS封闭孔。在孔中加入用含有1％BSA的F12稀释的样品，允许其在4℃结合2小时，用BSA/TBS在室温清洗3次。在BSA/TBS中稀释的单克隆抗体在室温保温90分钟，用针对小鼠IgG的VECTASTAINABC试剂盒检测。使用BIO-RAD过氧化物酶底物使HRP标记可视化，在Dynex MRX-TC读板器上在405nm读数。
实施例2：抗ADDL抗体的开发和性质研究
对三只小鼠每三个星期用ADDLs(每次注射194±25μg蛋白)接种一次，共接种六次。从这些小鼠的脾脏细胞与SP2细胞融合得到的杂交瘤被培养在96孔板中。将这些孔中的上清液在斑点印迹中进行筛选，使用合成的ADDLs鉴定阳性克隆，它们可以与内源原纤维的斑点印迹进行比较以辨别出差别。寻找只与合成的ADDLs而不与内源原纤维结合的杂交瘤。为了进一步了解杂交瘤的产物结合什么以及结合在什么条件下发生，对每个阳性克隆进行3种western印迹：ADDLs的SDS-PAGE、ADDLs的非变性凝胶以及具有内源原纤维的SDS-PAGE。大约筛选出40个克隆进行进一步检查。测试了每个克隆在不同条件下对可溶性阿茨海默氏病人脑提取物的识别、与培养的海马细胞结合的ADDLs的鉴定、以及阻断ADDL结合的能力。从培养基中收集被选出的抗体，使用Protein G SEPHAROSETM进一步纯化。
每次通过斑点印迹筛选一组杂交瘤，大约30％产生阳性上清液。其中，只有一个或两个杂交瘤结合合成的ADDLs而不结合内源的原纤维。用western印迹分析测定时，大约占最初数量2％的克隆在低ADDL浓度下结合合成的ADDLs而不结合单体。克隆3B7，在western印迹中能够结合合成的ADDLs而不结合原纤维，被留下来进行进一步分析。
鉴定出1到2个克隆对较高分子量的物质(12-24个单体)的结合比对三聚体/四聚体寡聚体的结合好。鉴定出2到3个克隆在非变性条件下能够结合天然的ADDLs，但是在存在SDS的情况下不能结合ADDLs。
该分析的结果表明ADDLs在小鼠中是良好的抗原，可以产生出与合成的ADDLs的结合比与单体的结合亲和性大得多的单克隆抗体。
实施例3：与培养的海马细胞结合的内源的和合成的ADDLs的免疫组织化学分析
培养的海马细胞也被分析以确定能够区分阿茨海默氏病和对照脑提取物的单克隆抗体是否能够鉴定与培养的细胞结合的ADDLs(内源的或合成的)。海马培养物按照现有的规程制备，允许生长3-4周。合成的ADDLs按照标准规程制备(例如美国专利U.S.专利6,218,506)。内源的ADDLs从阿茨海默氏病人的脑中按照Gong等((2003)同上)的方法提取。将ADDLs(100nM在F12中，或2mg总蛋白在F12中)与细胞保温1小时，然后按照标准方法清洗和固定。清洗后，将细胞与20C2、3B7、M94、2A10、4E2、2D6、4C2、2B4、5F10或5G12单克隆抗体保温，然后与结合了ALEXAFLUOR488的抗小鼠第二抗体保温。使用带有COOLSNAPTM HQ相机的NIKONDIAPHOTTM荧光显微镜成像，使用METAMORPHTM软件(Universal Imaging，Downingtown，PA)进行分析。
当用20C2可视化时，内源的和合成的ADDLs在培养细胞中都表现出标准的热点样式。因此，单克隆抗体20C2对与培养的海马细胞结合的合成的和内源的ADDLs都能鉴定。而3B7不能结合原纤维、高分子量寡聚体和单体，3B7对ADDLs的结合热点是寡聚的ADDLs。其它的抗体表现出识别结合到细胞的ADDLs上的不同表位，其范围从突起上的热点(M94，2A10)到细胞体特异性结合(4E2)以及其它的中间状态(2D6，4C2，2B4，5F10，5G12)。
实施例4：使用鼠抗ADDL抗体抑制ADDL与神经元的结合
为了确定能够区分阿茨海默氏病和对照的脑提取物的单克隆抗体是否也能够阻断ADDLs与培养细胞的结合，将培养的海马细胞与20C2抗体预保温，通过免疫细胞化学测定ADDL的结合。海马培养物按照现成的方法制备(例如参见美国专利No.6,218,506等)。内源的ADDLs从阿茨海默氏病人的脑中按照Gong等((2003)同上)的方法提取。将ADDLs(100nM在F12中，或2mg总蛋白在F12中)在37℃与20C2抗体预保温1小时，然后加入细胞保温1小时。将细胞清洗、固定，与结合了ALEXAFLUOR488的抗小鼠第二抗体保温。
与20C2预保温能够阻断内源的和合成的ADDL与培养细胞的结合。媒介和没有第二抗体的对照的图象是黑的。
实施例5：使用生物素标记的ADDLs检测ADDL与神经元的结合
使用标准的免疫荧光方法检测了ADDLs或bADDLs(生物素标记的ADDLs)与神经元的结合。将原代海马神经元(培养了14天)或B103细胞(铺板24小时)与5-25μm ADDLs或bADDLs在37℃保温1小时，然后用温热的培养基将细胞清洗3到4次以除去未结合的ADDLs或bADDLs。然后将细胞在室温用4％多聚甲醛固定10分钟，它是从16％的多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，Fort Washington，PA)用PBS稀释而制备的。然后除去溶液，加入新鲜的固定剂，在室温继续放置10分钟。将细胞进行10分钟通透处理(含有0.1％TRITONTM-X 100的4％多聚甲醛溶液；SIGMA，St.Louis，MO)，用PBS洗6次，与封闭缓冲液(含有10％BSA的PBS；Sigma，St.Louis，MO)在37℃保温1小时。从此时起，检测结合的ADDLs和bADDLs的规程开始不同。对于检测ADDL结合来说，将细胞与4G8(以1∶1,000稀释在含有1％BSA的PBS中；Signet Labs，Dedham，MA)、6E10(1∶1,000稀释；Signet Labs，Dedham，MA)或本文公开的抗ADDL单克隆抗体中的一种(以1∶1,000稀释)在37℃保温过夜。此外，针对τ产生的多克隆抗血清(1∶1,000稀释；Sigma，St.Louis，MO)被用来使细胞突起可视化。第二天，将细胞用PBS清洗3次，在室温与ALEXA594标记的抗小鼠第二抗体(用含有1％BSA的PBS以1∶500稀释；MolecularProbes，Eugene，OR)和ALEXA488标记的抗兔第二抗体(以1∶1,000稀释；Molecular Probes，Eugene，OR)保温1小时，在PBS中洗3次，使用具有荧光能力的显微镜观察结合。对于检测bADDL结合来说，将细胞与τ抗体保温过夜。然后用PBS将细胞清洗3次，在室温与ALEXA488标记的抗兔第二抗体(同上)和ALEXA594标记的链亲和素(以1∶500稀释；Molecular Probes，Eugene，OR)保温1小时，在PBS中洗5-6次，使用荧光显微镜观察结合。如果需要对细胞核进行染色，用DAPI(1∶1000)按照标准规程对核进行染色。
对于使用ADDL特异性单克隆抗体进行的ADDLs的免疫细胞化学分析来说，细胞在与ADDLs保温后进行清洗、固定、通透处理和封闭。为了用单克隆抗体检测结合的bADDLs，将细胞与4G8、6E10或本发明的抗ADDL单克隆抗体中的一种保温过夜，然后用ALEXA488标记的抗小鼠第二抗体检测免疫反应性。结合的bADDLs使用ALEXA594标记的链亲和素进行可视化，用DAPI对核染色。染色后bADDL结合与ADDL免疫反应性的共定位(co localization)使用荧光显微镜来检测。
对于每种被评估的单克隆抗体(即20C2、2H4、2B4和2A10)都观察到了对与ADDLs保温的原代海马细胞的特异的免疫反应性。结合的ADDLs表现为沿着神经元突起和细胞体的点状染色斑。这种样式只在一种亚类的神经元上观察到，它与以前使用商业化和非商业化抗体描述ADDL与初级神经元的结合的报道相一致。染色斑的样式和许多对照研究的结果证实了这些抗体的特异性。
使用bADDLs提供了简化的方法，可以检测结合的ADDLs并评估对ADDL与单克隆抗体的结合的阻断。当bADDLs被加入到原代海马细胞中时，和用荧光标记的链亲和素评估结合，沿着培养物中一种亚类细胞的神经元突起可以看到特异性结合。如果随后将细胞固定并进行免疫细胞化学处理，使用抗ADDL抗体对结合进行可视化，可以观察到同样样式的染色斑。此外，这些染色样式的叠加表明抗体染色和结合bADDLs的完美重叠，因此证明了bADDLs和ADDLs在功能上是等价的，以及在结合分析中bADDLs的用处。
实施例6：检测和测量鼠抗ADDL单克隆抗体对bADDL与神经元结合的差异置换
使用进行了几处修改的本文描述的免疫细胞化学方法对抗体阻断ADDLs或bADDLs与神经元培养物(初级神经元或B103细胞)的结合的能力进行了性质研究。将单克隆抗体与1-10μm bADDLs以1∶1、1∶5或1∶10的摩尔比(抗体：bADDLs)进行混合，在硅烷化的微量离心管中在慢转摇床上(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)于37℃保温1小时。然后，将抗体/bADDL混合物加入到细胞中，在37℃继续保温1小时。保温后，将细胞清洗、固定、通透处理、封闭，然后与针对τ的多克隆抗血清保温过夜以使细胞突起可视化。第二天，将细胞清洗，与ALEXA488-标记的抗兔第二抗体和ALEXA594标记的链亲和素保温，细胞用DAPI染色以便检测核。染色后，结合的程度可以使用荧光显微镜进行可视评估。
为了定量评估bADDL结合的程度和抗ADDL抗体降低这种相互作用的能力，开发了基于细胞的碱性磷酸酶分析方法。将单克隆抗体或PBS与2.5-10μm(终浓度)bADDLs以1∶1(B103细胞)或1∶5(原代神经元)的摩尔比率混合，在慢转摇床上于37℃保温1小时。在预保温后，将抗体/bADDL制备物加入到B103或原代神经元培养物中，于37℃再保温1小时。保温结束后，除去bADDLs/抗体混合物，用培养基洗板6次。细胞于室温在4％多聚甲醛中固定10分钟，除去溶液，加入新鲜的固定剂，将细胞再固定10分钟。将细胞用含有0.1％TRITONTM X-100的4％的多聚甲醛进行通透处理(两次，每次室温进行10分钟)，在PBS中洗6次，用含有10％BSA的PBS在37℃处理1小时。将碱性磷酸酶结合的链亲和素(用1％BSA以1∶1,500稀释；Molecular Probes，Eugene，OR)加入到细胞中，室温保温1小时。细胞用PBS清洗6次，在细胞中加入碱性磷酸酶底物(CDP-STAR和SAPPHIRE-IITM；Applied Biosystems，Foster City，CA)，保温30分钟，然后在LJL照度计(Analyst AD；LJL Bio Systems，Sunnyvale，CA)上测量发光。
当评估bADDLs与神经元的结合时，观察到了抗体依赖性的染色样式。某些被研究的抗体显著地降低了bADDLs的结合，而其它的抗体不太有效。意外的是，第三类抗体显示出增强了bADDLs与神经元的结合。尽管这些研究的结果在本质上是定性的而不是定量的，它们仍表明抗体差异性阻断bADDL与神经元的结合。定量评估表明了相似的趋势(图1)。也就是说，某些抗体降低了bADDL与神经元的结合，某些有微弱的或几乎没有效果，有几种增强了结合(即5F10和4C2)。此外，小鼠的Fab不能阻断bADDL的结合，进一步证实了该分析方法中单克隆抗体的特异性。
在成神经细胞瘤细胞株B103中用单克隆抗体分析bADDL的结合和阻断，显示bADDL与B103细胞的特异性结合，但是不与卵巢细胞系(CHO)特异性结合。此外，当bADDLs在加入到B103细胞中之前与抗ADDL单克隆抗体预保温时，结合急剧减弱。用单克隆抗体阻断bADDL与B103细胞的结合的定量评估显示出单克隆抗体阻断bADDL与细胞结合的能力是不相等的(图2)。正如使用原代海马细胞所观察到的那样，某些抗体非常善于阻断结合，而其它的则不太有效。此外，抗体4C2也增强bADDLs与培养物中的B103细胞结合的能力。
为了显示bADDLs也结合海马参与学习和记忆的区域，使用大鼠海马切片培养物进行了一系列研究。结合研究显示出CA1-3和海马的齿状回区域中的神经元能够结合bADDLs，而其它区域中的神经元不能。当bADDLs与抗ADDL单克隆抗体预保温时，bADDL结合的程度以剂量依赖性的方式减弱。这些结果显示出单克隆抗体也能够削弱bADDLs与亚组海马神经元的结合，这些神经元对于学习和记忆来说是关键的。
实施例7：抗ADDL抗体与来自阿茨海默氏病人和对照脑的内源ADDLs的结合
为了进一步研究本文公开的单克隆抗体的性质，确定了单克隆抗体是否能够从阿茨海默氏病人脑的可溶性提取物中鉴定ADDLs(内源性ADDLs)，以及是否能够与对照脑提取物中的区分开来。合成的ADDLs和在F12中制备的人脑提取物在F12中稀释，点样(1 pmoleADDLs；0.5μg脑提取物)双份在干燥的HYBONDTM ECLTM硝酸纤维素膜上。具有相应的CERAD级别(为阿茨海默氏病人建立记录的协会)和Braak阶段的脑组织从NU脑中心银行(NU Brain Bank Core)获得。将斑点干燥20分钟，然后在含有3％H2O2的TBS(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.8％NaCl)中于室温保温20分钟。将斑点切成条，用含有5％牛奶的TBS-T(含有0.1％TWEENTM-20的TBS)在室温封闭1小时。兔多克隆抗体M71/2(1∶2500稀释，0.4μg；Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX)、单克隆抗体6E10(1∶500稀释，3μg；Signet Labs，Dedham，MA)和本文公开的单克隆抗体20C2(1.52mg/mL，5μg)、11B5(2.54mg/ml，5μg)、2B4(1.71mg/mL，5μg)和2A10(1.93mg/mL，7.5μg)(图3)被稀释在1.5mL的牛奶/TBS-T中，在室温保温1小时。斑点用TBS-T清洗3次，每次10分钟。斑点与辣根过氧化物酶(HRP)连接的第二抗体(1∶40,000稀释在牛奶/TBS-T中；Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL)在室温保温1小时。斑点用TBS-T清洗3次，每次10分钟，用dH2O洗3次，用SUPERSIGNALTM底物(用双蒸水1∶1稀释；Pierce，Rockland，IL)显色，暴露于HYPERFILMTM ECLTM(Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL)中。
除了即使在较高的蛋白浓度下测试也仅具有较弱的结合的2A10之外，所有测试的抗体都能够以强烈的结合鉴定合成的ADDLs。多克隆抗体M71/2和单克隆抗体20C2和11B5强烈结合两种阿茨海默氏病人样品，但是在对照脑中只显示出非常微弱的类似背景的结合。相反，单克隆抗体6E10、2B4和2A10显示出与阿茨海默氏病人脑的微弱结合。
该分析的结果表明两种测试的单克隆抗体能够分辨阿茨海默氏病人和对照的脑，其中与内源寡聚体的结合具有高度的特异性。此外，这些数据表明检测可以在阿茨海默氏病的早期阶段完成。
实施例8：阿茨海默氏病人和对照脑切片的免疫组织化学分析
使用本文公开的单克隆抗体进行了免疫组织化学分析以确定是否能够使用可以辨别阿茨海默氏病人和对照脑提取物的单克隆抗体在脑切片中将ADDLs可视化，并证实ADDL标记的本质(例如扩散、围绕神经元、斑点状等)及其在人组织中的分布。阿茨海默氏病人和对照脑的固定的切片(40μm)按照标准方法制备。将切片用几种单克隆抗体和一种多克隆抗体标记，然后用苏木精复染以识别细胞核。使用带有SPOTTM INSIGHTTM数码相机(v.3.2)的NIKONECLIPSEE600光学显微镜获得图像。
免疫组织化学分析表明ADDL染色出现在阿茨海默氏病人脑的海马、内嗅皮层和额中回中。在严重的阿茨海默氏病病例中，有丰富的光学ADDLs染色，主要显示为斑状分布。在一个阿茨海默氏病病例中，某些光学ADDLs染色被观察到是围绕神经元的。相反，使用任何抗体在对照样品的任何区域都没有染色，即使是很少的被点状免疫染色围绕的神经元也没有观察到。
这些数据表明多克隆抗体和单克隆抗体可用于鉴定被固定的人组织中的ADDLs，其中的标记是可变的，包括个体细胞和某些细胞群(clusters)的斑点状区域、管状区域和围绕神经元的标记。此外，在至少3个脑区域中观察到了阿茨海默氏病人脑中ADDLs的标记，而在对照脑中没有观察到，它们是海马、内嗅皮层和额中回。
实施例9：Aβ1-40单体样对照的免疫染色
Aβ1-40与ADDLs相比在DMSO/F12中寡聚化较慢。因此，确定了Aβ1-40是否能够作为单体样对照。将ADDLs在SUPERDEX75柱上进行孔径排阻层析(SEC)(ADDL063)，它分成两个峰。将Aβ1-40在DMSO/F12中(45.5mM)制备、冷冻、然后融化。将样品用F12稀释，与Tricine样品缓冲液(BIO-RAD，Waltham，MA)以大约2∶1的比例混合。SDS-PAGE在10-20％Tris-Tricine凝胶(BIO-RAD，Waltham，MA)上进行，使用Tris/Tricine/SDS缓冲液(BIO-RAD，Waltham，MA)于室温和120V下进行80分钟。将凝胶用SILVERXPRESSTM(INVITROGENTM，Carlsbad，CA)银染(60 pmolesAβ1-40或ADDLs；40pmoles峰1或峰2)。此外，将凝胶(20 pmolesAβ1-40或ADDLs；30 pmoles峰1或峰2)电转印到HYBONDTM ECLTM硝酸纤维素膜上，使用25mM Tris-192mM甘氨酸，20％v/v甲醇，pH8.3，0.02％SDS，在8℃和100V下进行1小时。将斑点用含有5％牛奶的TBS-T(含有0.1％TWEENTM-20的20mM Tris-HCl，pH7.5，0.8％NaCl)在8℃封闭过夜。将单克隆抗体6E10(1∶2000稀释；Signet Labs，Dedham，MA)、单克隆抗体20C2(1.52mg/mL，1∶2000稀释；图3)或多克隆抗体M71/2(1∶4000稀释，Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX)用牛奶/TBS-T稀释，与斑点在室温保温90分钟。斑点用TBS-T洗3次，每次10分钟，然后与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(1∶40,000稀释在TBS-T中；Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL)在室温保温1小时。在用TBS-T清洗3次、每次10分钟后，将斑点用dH2O洗3次，用SUPERSIGNALWest Femto最高灵敏度底物(用双蒸水1∶1稀释；Pierce，Rockland，IL)显色，暴露于HYPERFILMTM ECLTM(Amersham Life Science，Inc.，ArlingtonHeights，IL)。
银染分析显示Aβ1-40为深的单体条带。相反，ADDLs和峰1显示为单体、三聚体和四聚体，尽管四聚体较少。峰2的银染分析显示出深的单体和较浅的三聚体和非常浅的四聚体条带。
Aβ1-40用6E10的免疫染色仅显示出浅的单体条带。ADDLs和峰1用6E10的免疫染色显示出单体、三聚体、四聚体和12-14mer。峰2用6E10染色显示出深的单体和一些浅的三聚体和四聚体，没有12-24mer。用20C2或M71/2染色Aβ1-40没有单体。尽管20C2和M71/2对ADDLs和峰1仅显示极小的或没有单体染色，这些样品用20C2和M71/2有三聚体、四聚体和12-24mer染色。峰2用20C2和M71/2染色显示出浅的单体、三聚体和四聚体，没有观察到12-24mer。Aβ1-40与ADDL单体相比用6E10免疫染色较浅，尽管银染较深。
这些结果表明，与显示出对单体好的识别的6E10抗体相反，用含有0.02％SDS的转移缓冲液转移的凝胶用寡聚体特异的抗体显示出极小的单体检测。SEC级份的免疫染色显示出峰2主要含有单体以及少量的三聚体和四聚体，没有12-24mer，而峰1有单体、三聚体、四聚体和12-24mer。
为了进一步研究单克隆抗体结合峰1和峰2的性质，开发了使用多克隆抗体M90作为捕获抗体检测ADDLs的夹心ELISA。SEC峰1和峰2在本文中是指ADDLs在SEPHADEXTM75柱上分级形成的两个主要级份，以区别具有潜在生物活性或无活性的寡聚体。非变性凝胶电泳证实分离成大的(>50kDa)和小的(<30kDa)聚集体，它们在37℃下稳定。这些峰被分别用作克隆上清液的检测物质。结合用VECTASTAIN试剂盒可视化。用所有的抗体都观察到了对两个峰识别的差异。例如比较峰1和峰2对抗体2B4和20C2的比率(图3)。只有一个抗体反映出对峰2的对照抗体优选性(6E10)。
实施例10：检测从Aβ1-42形成ADDL
在斑点印迹中使用了多克隆抗体来显示时间依赖性的从Aβ1-42形成ADDL。因此，证实了当从Aβ1-42形成ADDLs时，优选结合寡聚体的单克隆抗体20C2也能够显示出随时间增加的信号。将Aβ1-42、大约750 pmoles的HFIP薄膜溶解在1.5mL DMSO(0.5mM)中，将2μL等份试样用F12(10nM)稀释到终体积100μL，在冰上保温。在特定的时间点将2μL(20fmol)反应混合物转移到干燥的HYBONDTM ECLTM硝酸纤维素膜上(Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL)。将硝酸纤维素膜用含有5％脱脂奶粉的TBS-T(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.8％NaCl，0.1％TWEENTM-20)在室温封闭1小时。将多克隆抗体M90/1(Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX)或单克隆抗体20C2(1.52mg/mL)在奶粉/TBS-T中以1∶2000稀释，在室温下与斑点保温90分钟，然后用TBS-T清洗3次，每次10分钟。将HRP结合的第二抗体(Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL)在奶粉/TBS-T中以1∶40,000稀释，将斑点在室温保温60分钟，然后同上述进行清洗。在用蒸馏水简单清洗后，将斑点与SUPERSIGNALWest Femto最高灵敏度底物(用双蒸水1∶1稀释；Pierce，Rockland，IL)保温60秒，暴露于HYPERFILMTM ECLTM(Amersham Life Science，Inc.，ArlingtonHeights，IL)中。将斑点印迹扫描，使用ADOBEPHOTOSHOP测定斑点的强度。
两种抗体都检测到了时间依赖性的从Aβ1-42形成ADDL，其中20C2的结果显示出较好的信号和一致性。没有抗体能够在与ADDL相当的浓度下检测Aβ1-40。这些数据进一步证实了该抗体的寡聚体特异性，因为单体总是存在，而寡聚体随时间形成。此外，M90/1和20C2对Aβ1-40单体显示出极小的识别，即使在比ADDLs高100倍的浓度下。
实施例11：竞争性斑点印迹分析
为了确定本文公开的单克隆抗体是否能够结合单体，使用合成的ADDLs、20C2和Aβ1-40进行了竞争性斑点印迹分析。ADDLs以10pmol/0.5μL的浓度加到干燥的硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在5％NDM/TBS-T中封闭1小时，然后将各200μL5％NDM/TBS-T中的20C2(终浓度1.5μg/mL)与不同浓度的ADDLs和新鲜的Aβ1-40保温1小时。然后将这些溶液使用SURF-BLOT装置加在硝酸纤维素膜上，在室温摇动保温1.5小时。然后用抗小鼠IgG-HRP和化学发光剂使斑点可视化。使用KODAKIMAGESTATION440和EXCEL进行定量。
这些分析的结果表明溶液中合成的ADDLs能够有效和特异地阻断20C2与固定在硝酸纤维素膜上的ADDLs的结合，对ADDLs观察到的半最大抑制小于50nM。相反，溶液中的Aβ1-40不能阻断20C2与固定的ADDLs的结合。
为了确定哪个部分构成Aβ1-42分子的结合表位，使用ADDLs、20C2和肽进行了竞争性斑点印迹分析。ADDLs以每0.5μL中的四种浓度(各1、0.5、0.25和0.125pmole)点样到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在5％NDM/TBS-T中封闭2小时后，50、100和200pmol的肽被加入到200μL 20C2中(1.52μg/mL，终浓度1.9pmol，于5％NDM/TBS-T中)，在室温摇动。然后将溶液使用SURF-BLOT设备与硝酸纤维素膜在室温保温1.5小时。用抗小鼠IgG-HRP和化学发光剂使结合可视化。
该分析的结果表明与ADDLs的结合被ADDLs本身和Aβ1-28所阻断，但不被其它的肽的组合阻断。因此，结合表位需要某些Aβ1-28能够实现、但在Aβ1-12和Aβ12-28或其组合上不能提供的构象。此外，Aβ1-28形成二聚体，通过空间位阻阻断ADDLs的结合。
为了确定Aβ1-28是否聚集(与Aβ1-42相似)或折叠以至于阻断对于20C2的结合表位，对SDS-PAGE凝胶进行银染，并进行western印迹分析。使用10-20％Tris-Tricine SDS-PAGE对ADDLs和Aβ1-28(银染时两条道中的每条用60pmol，其它情况用20pmol)进行分离。60pmol的道被切下，用SILVERXPRESSTM(INVITROGENTM，Carlsbad，CA)染色；此外，将凝胶(20pmoles ADDLs和Aβ1-28)电转印到HYBONDTM ECLTM硝酸纤维素膜上，使用25mM Tris-192mM甘氨酸，20％v/v甲醇，pH8.3，0.02％SDS，在8℃和100V下进行1小时。斑点用含有5％奶粉的TBS-T(含有0.1％TWEENTM-20的20mM Tris-HCl，pH7.5，0.8％NaCl)封闭。样品与20C2(1∶1000，1.52mg/mL)或20C2+Aβ1-28(2nmol，预保温2小时)在上述的封闭缓冲液中于室温保温1.5小时。用抗小鼠IgG-HRP(1∶40,000稀释在TBS-T中)和化学发光剂使结合可视化。
银染显示出ADDL道中的单体、三聚体和四聚体，但是Aβ1-28道只有一种，运行在大约二聚体的位置。ADDLs而不是Aβ1-28被20C2可视化，20C2与所有ADDL类型的结合都被Aβ1-28阻断。此外，当20C2结合表位被Aβ1-28阻断时，20C2在western印迹中不能识别Aβ1-28肽。
实施例12：抗ADDL抗体的同种型分析
为了进一步研究本文公开的单克隆抗体的性质，使用含有小鼠单克隆抗体同种型分型试剂的SIGMA IMMUNOTYPETM试剂盒，按照制造商的说明书(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)进行了同种型分析。该分析的结果显示在图3中。
实施例13：抗ADDL抗体的核心线性表位作图
在标准ELISA分析中检测了抗ADDL单克隆抗体与淀粉样蛋白β肽的特异性相互作用。简单来说，合成的肽、或者在某些情况下是ADDL或原纤维被用作抗原，以4μg/mL(大约800到1200nM)的浓度包被在NUNCTM MAXISORBTM板上。除非另外指明，肽被包被在5mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中，于4℃过夜。在用含有0.05％TWEENTM20和3％(w/v)脱脂奶粉的PBS封闭板1小时后，在封闭缓冲液中以确定的浓度滴定单克隆抗体，然后将板在环境温度下保温1小时，轻柔摇动。在清洗后，将用封闭缓冲液稀释的HRP结合的山羊抗小鼠IgG(H+L)加入到板中。在经过大量清洗除去未结合的HRP结合物后，在板中加入显色底物TMB。在读板器上于450nm波长测量吸光度。
为了对抗ADDL单克隆抗体的核心线性表位进行作图，合成了一组重叠的、覆盖了Aβ1-42的10个氨基酸的肽(表1)。三个具有Aβ1-42颠倒的氨基酸序列的14个氨基酸的肽也被合成，作为非特异性的对照肽。
表1
Figure A20058003671700491
所有的肽都溶解在DMSO中，浓度大约为400到500μM(1mg/mL)，分成多个等份试样储存在-20℃。肽被用于ELISA分析以确定抗ADDL单克隆抗体的核心表位。每种单克隆抗体在四种浓度下(3、1、0.3和0.1μg/mL)针对N末端肽的组(从残基1到25)或C末端肽的组(从残基17到42)和对照肽进行测试。单克隆抗体组的核心线性表位列于表2中。几种商业化单克隆抗体(6E10、BAM-10、4G8和WO-2)也包含在试验中以验证分析的格式，结果证实它们的核心线性表位与发表的文献中报道的相同。
表2
Figure A20058003671700501
*在Aβ1-42中的位置。aIgG1，bIgG2b，cIgG2a.nd，未测定。
12个被评估的ADDL特异性单克隆抗体中的9个被作图到Aβ1-42的N末端区域，它们中的7个作图于氨基酸残基3-8。两个单克隆抗体2H4和2E12倾向于稍微较大的表位。三种单克隆抗体1F4、1F6和3B3不能与重叠的肽的组结合，即使是在3μg/mL的高浓度下，但是它们的表位被估计位于Aβ1-42的N末端，因为它们可以结合Aβ1-20肽，该肽在实验中用作阳性对照。
实施例14：小鼠抗ADDL抗体的亲和性和特异性
发展了基于溶液的结合分析来确定抗ADDL抗体对不同淀粉样蛋白β肽制备物(ADDL、原纤维、Aβ1-40、Aβ1-20)的亲和性和特异性。建立了定量ELISA，它能够捕获单克隆抗体针对包被在NUNCTM板上的ADDL的剂量反应的线性范围。在该信息的基础上，选择固定浓度的单克隆抗体，在该浓度下能够在ELISA中产生刚刚高于分析噪声(OD450nm的读数大约为0.2到0.5)的始终一致的OD信号。然后将该固定浓度的IgG与20个滴度点的不同的淀粉样蛋白β肽底物(ADDL、原纤维、Aβ1-40、Aβ1-20)在溶液中于室稳下保温过夜以达到平衡。混合物中游离的IgG的量在第二天被测定，使用定量ELISA在常规ELISA板上保温1小时来进行。使用GraFit程序(ErithacusSoftware，Surrey，UK)计算被结合的IgG部分，并将结合的IgG与游离配体(底物)的滴度的相关性用于推算KD。因此，每种抗体对不同的淀粉样蛋白β肽制备物的底物优选性被表示为固有亲和性值(KD)。
使用这种分析形式有几个优点。首先，抗体和底物的相互作用是在溶液相中进行，因此没有任何在例如常规的ELISA分析或BIACORETM实验中的那种固相表面的限制，在那些分析或实验中来自ELISA板或传感器芯片的固相表面对单克隆抗体和底物的相互作用的潜在影响在解释数据时必需被考虑进去。第二，允许相互作用达到平衡。因此，IgG和底物的相互作用可以在两种成分的有限的浓度下发生，因此不用考虑由于高的实验浓度导致的IgG的沉淀或附加的淀粉样蛋白β肽的寡聚化。第三，分析的读数不依赖于溶液中的抗原；因此，不同肽制备物(例如ADDL或原纤维)中淀粉样蛋白β肽的任何异源性不将影响数据的解释和数学模型的建立。分析灵敏度限于ELISA分析检测的限度，允许该分析方法在纳摩尔的范围内用KD值评估单克隆抗体。构思了替代的底物例如荧光试剂来提高灵敏度范围。据信在定量ELISA中，在捕获游离IgG的1小时保温时间内，免疫复合物被破坏得最少。
游离IgG的量通过标准曲线确定，并对不同底物的滴度作图。与不同底物结合的IgG的量被作图，信息被用于GraFit中使用适当的数学模型进行曲线拟合。本文公开的单克隆抗体组的KD的概要显示在表3中，以nM范围表示。
表3
Figure A20058003671700521
*所有的抗体都是IgG。
用斜体列表的值具有高标准误差，并且拟合不好。
IC：无说服力的数据。
N/T：未测试。
实施例15：τ磷酸化的检测和测量
高度磷酸化的τ(pTau)是阿茨海默氏病的标志，尽管对于引起这种高度磷酸化的事件了解很少。不希望受到任何理论的束缚，据信ADDLs可能在该磷酸化事件中发挥重要作用。为了对此进行研究，按照前面的描述培养了神经元培养物(原代神经元和B103细胞)，在培养基中加入1μm bADDLs或媒介，然后将培养继续进行1、6或24小时。在每种培养结束时，将细胞清洗、固定、通透处理、阻断，然后与针对pTau的单克隆抗血清(AT8，1∶500；Pierce，Rockland，IL)保温过夜。第二天，将细胞清洗，与ALEXA488标记的抗小鼠第二抗体和ALEXA594标记的链亲和素进行保温，细胞用DAPI染色以允许检测核。然后使用荧光显微镜评估细胞的pTau染色程度，在每个时间点注意到了与bADDL结合的相关性。
该分析的结果表明bADDL与B103细胞的结合与媒介处理的细胞相比增加了细胞突起中pTau的水平。在原代海马细胞中也注意到了类似的变化。当细胞暴露于bADDLs6小时时，在也结合bADDL的细胞亚群中观察到了pTau染色的增加。用B103细胞进行的时间过程研究进一步研究了bADDLs被pTau的调节。加入bADDLs在1小时内导致了pTau的边际增加。但是，在加入bADDLs6小时后pTau染色急剧增加，并保持升高直到24小时后。因此，这些数据表明ADDL与神经元的结合可能启动了细胞内事件的级联，导致了τ的高度磷酸化、神经原纤维缠结的积累以及最终的细胞死亡。所以，本领域的专业技术人员将会认识到阻断ADDLs与神经元的结合，将反过来阻止这些下游的事件，从而对于源自淀粉样蛋白的疾病和/或与τ蛋白有关的疾病的治疗是有益的。此外，对ADDL结合启动的和导致pTau产生的信号传导事件的更好的了解也可能能够阐明其它的途径，它们可能可以作为开发新的治疗方法的适合的靶。
实施例16：Aβ肽/ADDL与抗体的相互作用和对聚集的抑制
通过荧光共振能量传递(FRET)和荧光偏振(FP)，使用1∶4的荧光素标记的Aβ1-42单体与天然肽单体的混合物，在存在本文公开的选定的单克隆抗体的情况下观察了ADDL聚集动力学和寡聚化大小的变化。由于FRET，单体整合到ADDLs中时荧光素发射的自身淬灭导致了荧光强度在小时级的短时间跨度中降低3到5倍。此外，当单体聚集成寡聚体ADDL时大小的增加导致了FP增加两倍。在存在各种新的和商业化的抗ADDL和抗Aβ肽抗体的情况下ADDL聚集的FRET和FP动力学进展曲线，显示出了抗体在抑制ADDL聚集和/或结合肽寡聚体的能力中的差别(图4)。
分析在384孔CORNINGNon-Binding Surface黑色不透明微孔板中进行。分析缓冲液含有50mM MOPS-Tris(pH8.0)和100mM MgCl2。分析体积是50μL，包含0.2μM FITC-Aβ1-42和0.8μM Aβ1-42，分析温度是37℃。ADDL的聚集用Tecan GENios Pro读板器监测，激发波长为485nm，发射检测波长为515nm。动力学踪迹通过在6小时的时间过程中每5分钟记录荧光强度和偏振读数来收集。在这段时间内未明显聚集成ADDLs的阴性对照反应缺少MgCl2，但是含有所有其它的缓冲液和肽成分。阳性对照反应含有所有的缓冲液成分，但是不含添加的单克隆抗体试剂。为了测试ADDL的结合和聚集的抑制，将抗体与肽混合物在从500nM减小到5nM的8种浓度下保温。
该分析可用于对ADDL结合行为和ADDL聚集的抑制的不同概况(profile)进行分类。较大的ADDL类型通过与ADDL特异性的表位和/或构象表位的相互作用发生的结合和中和，可以用作可行的治疗策略。此外，通过结合在暂时(transient)的中等的(intermediate)ADDL聚集聚集体类型(非单体)中存在的ADDL特异性的和/或构象表位来抑制聚合成更大的ADDL，为抗ADDL疗法提供了另一种可选的策略。表明了抗体间存在显著区别的FP进展曲线，指示了这种中间类型或稳定类型的结合。用其它功能的、细胞的和体外的效果校正了单克隆抗体的FP/FRET行为后，允许选择所需的免疫疗法作用模式。
本文公开的分析的结果表明1F6、2A10、5F10、2D6和2B4表现出潜在的聚集抑制，而20C2、1F4和4C2表现出中等聚集抑制，2H4、3B3和4E2显示出微弱的聚集抑制(图4)。正如在表4中概述的和图5中图示的那样，20C2、4E2、3B3和5F10显示出不同的生物化学行为。
表4
用FP/FRET检测到的潜在的聚集抑制 用FP/FRET检测到的微弱的或没有聚集抑制
在30分钟时的FP阶次 20C2 4E2
在30分钟时较低的或没有FP阶次 5F10，1A9 3B3
此外，针对低形成单体数的肽Aβ1-42[Nle35-Dpro37]产生的5种纯化的抗体(即1A9、1E3、1G3、1A7和1E5)之一的抗体1A9，根据其聚集抑制和FP行为与5F10分开。
此外，当用SEC/ICC测定时，发现20C2能够与带相反电荷的、截短的Aβ7-42肽聚集聚集体结合，表明缺少与Aβ7-42带相反电荷的肽结合的常规的线性表位，该肽在对应于Aβ的残基7-16的位置具有非常不同的序列，即Aβ(7-42)[Orn7Orn11D13D14E16Nle35]。因此，20C2与依赖于Aβ的残基17-42中的元件的构象表位结合，但是仅仅是在聚集后。
实施例17：分离小鼠抗体可变区序列
在使用特别设计的引物进行聚合酶链反应(PCR)后，为小鼠抗体可变结构域编码的CDNAs被克隆和测序，这些引物能够与小鼠恒定区的5′-末端和V区上游的鼠前导序列杂交。这样确保了获得的小鼠可变区序列是完整和准确的。简单来说，从小鼠杂交瘤细胞株使用QIAGENOLIGOTEXDirect mRNA Mini Kit提取mRNA，然后使用第一链cDNA合成试剂盒转变成cDNA。然后将cDNA作为模板在PCR反应中获得抗体可变区序列。
为了获得轻链可变区序列，使用11个轻链5’PCR引物(MKV-1到MKV-11)中的每个和3’PCR引物MKC-1(表5)建立了11个独立的PCR反应。
表5
5’引物 序列 SEQ IDNO：
MKV-1MKV-2MKV-3MKV-4MKV-5MKV-6MKV-7MKV-8MKV-9MKV-10MKV-11 GAT CTC TAG ATG AAG ATT GCC TGT TAG GCT GTT GGTGCT GGAT CTC TAG ATG GAG WCA GAC ACA CTC CTG YTATGG GTGGAT CTC TAG ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GSGTTGGAT CTC TAG ATG AGG RCC CCT GCT CAG WTT YTTGGM WTC TTGGAT CTC TAG ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTCAGC TTCGAT CTC TAG ATG AGG TKC YYT GYT SAY CTY CTCTGR GGGAT CTC TAG ATG GGC WTC AAA GAT GGA GTC ACAKWY YCW GGGAT CTC TAG ATG TGG GGA YCT KTT TYC MMT TTTTCA ATGGAT CTC TAG ATG GTR TCC WCA SCT CAG TTC CTT GGAT CTC TAG ATG TAT ATA TGT TTG TTG TCT ATT TCTGAT CTC TAG ATG GAA GCC CCA GCT CAG CTT CTC TTCC 223224225226227228229230231232333
3’引物 序列 SEQ IDNO：
MKC-1 GAT CGA GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG 234
下划线和斜体序列分别表示XbaI和SacI限制性位点。W＝A或T，M＝A或C，K＝G或T，Y＝C或T，以及R＝A或G。
为了获得重链可变区序列，使用12个重链5’PCR引物(MHV-1到MHV-12)中的每个与适合的同种型特异性3’PCR引物(MHCG-1，MHCG-2A，MHCG-2B，MHCG-3)(表6)建立了12个独立的PCR反应。
表6
5’引物 序列 SEQIDNO：
MHV-1MHV-2MHV-3MHV-4MHV-5MHV-6MHV-7MHV-8MHV-9MHV-10MHV-11MHV-12 GAT CTC TAG ATG AAA TGC AGC TGG GGC ATS TTC TTCGAT CTC TAG ATG GGA TGG AGC TRT ATC ATS YTC TTGAT CTC TAG ATG AAG WTG TGG TTA AAC TGG GTT TTTGAT CTC TAG ATG RAC TTT GGG YTC AGC TTG RTT TGAT CTC TAG ATG GGA CTC CAG GCT TCA ATT TAG TTTTCC TTGAT CTC TAG ATG GCT TGT CYT TRG SGC TRC TCT TCTGCGAT CTC TAG ATG GRA TGG AGC KGG RGT CTT TMT CTTGAT CTC TAG ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGGAT CTC TAG ATG GMT TGG GTG TGG AMC TTG CTTATT CCT GGAT CTC TAG ATG GGC AGA CTT ACC ATT CTC ATT CCTGGAT CTC TAG ATG GAT TTT GGG CTG ATT TTT TTT ATTGGAT CTC TAG ATG ATG GTG TTA AGT CTT CTG TAC CTG 235236237238239240241242243244245246
3’引物 序列 SEQIDNO：
MHCG-1MHCG-2AMHCG-2BMHCG-3 GCATC GAG CTC CAG TGG ATA GAC AGA TGG GGGGCATC GAG CTC CAG TGG ATA GAC CGA TGG GGGGCATC GAG CTC CAG TGG ATG AGC TGA TGG GGGGCATC GAG CTC CAA GGG ATA GAC AGA TGG GGC 247248249250
下划线和斜体序列分别表示XbaI和SacI限制性位点。W＝A或T，M＝A或C，K＝G或T，Y＝C或T，以及R＝A或G。
每个轻链PCR反应含有46μL INVITROGENTM PLATINUMPCRSuper Mix、1.0μL 100μM5’引物(MKV-1到MKV-11)之一、1.0μL100μM3’引物(MKC-1)、以及2.0μL杂交瘤cDNA。类似的PCR反应被用于克隆小鼠重链可变区序列。反应被放置在DNA热循环仪中，在经过起始变性步骤97℃2.0分钟后，进行30个如下的循环：95℃30秒，55℃45秒，和72℃90秒。在最后一个循环后，使用最后的延伸步骤72℃10分钟。为了确定哪个PCR反应产生了产物，从每个反应取5μL等分样品在1.5％(w/v)琼脂糖/1XTAE缓冲液凝胶上分离，胶中含有0.5μg/mL溴化乙锭。然后从产生预期大小(420到500bp)的片段的反应中通过凝胶纯化PCR产物，用XbaI和SacI消化，连接到质粒pNEB193(New England Biolabs，Beverly，MA)的多克隆区中的XbaI和SacI位点中。此外，PCR产物也可以使用INVITROGENTM TACLONING试剂盒直接连接到质粒pCR2.1中。然后将连接产物转化到XL-1细胞中，将转化的大肠杆菌的等分试样铺在含有50μg/mL氨苄青霉素并覆盖有40μL X-Ga1储液(50mg/mL)和40μL IPTG(100mM)溶液的LB琼脂平板上，以进行蓝/白斑筛选。将平板在37℃保温过夜，潜在的克隆被鉴定为白色的菌落。使用用于pNEB193和pCR2.1的通用正向和反向引物，从每个PCR产物的至少24个独立的克隆获得的DNA对两条链测序。然后将获得的序列聚集成毗连序列群(contig)，以产生每个抗体轻链和重链可变区的共有序列。使用该方法测定了杂交瘤20C2、5F10、2D6、2B4、4E2、2H4、2A10、3B3、1F6、1F4、2E12和4C2的轻链和重链抗体可变区的序列(图6A-6X)。
在图6A-6X中，6个互补性决定区(CDRs)被下划线，它们形成了与抗原互补的结构。在分析了CDRs和相应的抗原表位(表2)后，观察到了序列相似性。共享Aβ1-42的3-8位氨基酸表位的抗体(即2A10、4C2、2D6、4E2、20C2、2B4和5F10)共享了重链的高度同源的CDR1(图7A)和CDR2(图7B)序列。抗体2H4被发现能够识别Aβ1-42的1-8位氨基酸表位，显示出具有独特的重链CDR3(图7C)序列和独特的轻链CDR1(图7D)、CDR2(图7E)和CDR3(图7F)序列。相似地，抗体2E12被发现能够识别Aβ1-42的3-10位氨基酸表位，具有独特的重链CDR3序列(图7C)。此外，抗体2A10、2B4、4C2和4E2对SEC峰1和峰2ADDLs具有相似的亲和性(参见图3)，共享重链的高度同源的CDR3序列(图7C)。此外，抗体4E2的重链CDR3中的氨基酸取代显示出增强了对ADDLs阻断与神经元细胞结合，因为4E2与抗体2D6相比能够更加有效地阻断ADDL与神经元的结合，而4E2和2D6的重链和轻链的序列除了重链CDR3中的3个氨基酸残基之外是完全相同的，它们对于2D6和4E2分别是Ser对Asn、Thr对Ser和Ile对Val(图7C)。
实施例18：小鼠抗ADDL抗体可变区序列的人源化
从小鼠杂交瘤细胞系20C2、26D6、4E2、3B3、2H4和1F6获得的小鼠抗体重链和轻链可变结构域核酸使用CDR移植方法进行了人源化，在20C2和26D6的情况下是通过表面修饰策略进行的。本领域的专业技术人员将会理解，小鼠抗体序列的人源化可以通过提高其血清半衰期和Fc效应器功能从而减小抗球蛋白反应来使抗体的治疗潜力得到最大化。
通过CDR移植进行人源化是通过从NCBI蛋白数据库中选择与小鼠可变结构域具有最高同源性的人轻链和重链可变区来实施的。使用蛋白-蛋白基本本地比对搜索工具(BLAST)在数据库中将小鼠可变区序列与所有人可变区序列进行比较。然后，将小鼠的CDRs掺入到人框架区中，对初步的氨基酸序列进行分析。框架区中小鼠和人序列之间的所有区别被评估，特别是如果它们是环状结构的典型序列的一部分或是位于VL/VH界面的残基的话(O’Brien和Jones(2001)《抗体工程》，Kontermann和Dubel主编，Springer实验室手册)。也对框架区进行扫描以寻找与人亚类的共有序列相比不常见或稀少的氨基酸以及潜在的糖基化位点。当小鼠和人框架区序列之间存在的氨基酸序列差别被发现不包含在典型序列中、或不位于VL/VH界面上时，在该位置选择人的残基。当存在关键残基的区别时，产生两种版本的可变区序列用于评估。CDR移植策略对人框架区进行了最少数量的改变，使得在达到好的抗原结合的同时，能够能够维持人框架区接近匹配于来自天然人抗体的序列。使用CDR移植的人源化氨基酸序列的设计显示在图8中。
对于20C2和26D6来说也使用表面修饰策略(参见例如美国专利No.6,797,492)设计了人源化的序列。人源化通过从NCBI蛋白数据库中选择与小鼠可变结构域、以及与最接近的人抗体种系家族(参见Kabat等(1991)《具有免疫重要性的蛋白的序列》，第5版，美国卫生与人服务部，NIH，Washington DC)具有最高同源性的人轻链和重链可变区来实施。使用蛋白-蛋白BLAST在数据库中将小鼠可变区序列与所有人可变区序列进行比较。鼠可变区序列和它们的最接近的人同源物按照最接近的被结晶的人抗体进行塑造，所述抗体通过本技术领域内进行的计算机模拟所确定。根据鼠VH和VL序列的模型构建了表面图谱，它描述了小鼠重链和轻链可变区中的氨基酸的溶剂可接近性。为了证实该模型，将这些暴露的残基与已知的表面可接近残基进行逐个位置的比较(参见例如Padlan(1994)Mol.Immunol.31(3)：169-217)。按照现有的方法(参见美国专利No.6,797,492)对序列中的每个残基进行打分，将它指派为暴露的、大部分暴露的、部分埋藏的、大部分埋藏的和埋藏的。小鼠框架残基中被打分为暴露的或大部分暴露的和与同源的人序列不同的残基，在该位置上被改变成人残基。设计的表面修饰的序列保留了小鼠的CDRs、靠近CDRs的残基、已知包含在典型序列中的残基、位于VL/VH界面的残基以及位于小鼠重链和轻链N末端序列中的残基。已知N末端序列与CDR表面是邻接的，并可能参与了配体结合。相似地，仔细地限制了Pro、Gly或带电荷残基的改变。一旦表面修饰的序列被完成，它们被重新模拟以寻找任何可能的明显的结构问题。在某些情况下，产生了一种以上的表面修饰的序列进行分析。使用表面修饰方法人源化氨基酸序列的设计显示在图9中。
一旦选定了人源化氨基酸序列，将该序列反向翻译以获得相应的DNA序列。使用本技术领域现有的技术(Lathe(1985)J.Mol.Biol.183(1)：1-12)对DNA序列的密码子进行最适化，并在两侧设计限制性酶位点用于克隆到人抗体表达载体中。合成的DNA序列显示在图10A到10S中。对于用CDR移植和表面修饰设计的20C2人源化抗体来说，构建了人IgG1/κ和IgG2m4/κ版本，其中IgG2m4表示在标准的人IgG2恒定区中选择性地加入了人IgG4的序列。对于26D6的CDR移植抗体来说，也制造了IgG1/κ和IgG2m4/κ版本。对于所有其它抗体来说，只制造了IgG1/κ版本。得到的抗体的完整的氨基酸序列显示在图11A-11Y中。
通过将分离的轻链和重链表达质粒共同瞬时转染到293 EBNA细胞中使抗体得到表达。在对于给定的抗体设计了一个以上人源化重链或轻链序列的情况下，所有的重链和轻链组合被组合以产生相应的抗体。在转染后7-10天从培养上清液中使用蛋白A柱纯化抗体，用于后面的分析。
实施例19：IgG2m4抗体的产生
制备了IgG2m4抗体衍生物以减少Fc受体的接合、C1q的结合、不需要的细胞毒性或免疫复合物的形成，同时维持了典型的人抗体的长的半衰期和药物动力学性质。IgG2m4的基本的抗体格式是IgG2的格式，IgG2已经显示出在实验模型中具有优良的半衰期(Zuckier等(1994)Cancer Suppl.73：794-799)。通过选择性地加入IgG4的序列对IgG2的结构进行修饰，从而消除了C1q的结合，同时维持了典型的低水平的FcγR结合(Canfield和Morrison(1991)J.Exp.Med.173：1483-1491)。这是通过使用其中IgG2和IgG4的序列相同之处的交叉点来实现的，从而产生了含有天然的Fc序列而不是任何人工突变的序列的抗体。
人抗体恒定区的IgG2m4形式是通过在标准的人IgG2恒定区中选择性地加入人IgG4序列来形成的，如图12中所示。从概念上说，IgG2m4来自于图12中显示的CH2结构域中的一对链交换。与IgG4序列相比产生了4个单一突变。在IgG2中突变的Fc残基包括His268Gln、Val309Leu、Ala330Ser和Pro331Ser，它们使得新表位的可能性最小化。放入IgG2恒定区中的具体的IgG4氨基酸残基显示在表7中，同时显示了基本结构中的其它替换。
表7
残基(Kabat编号) IgG2中的残基 IgG4中的残基 IgG2m4中的残基 IgG2m4中的替换残基 注释
189 Pro或Thr* Pro Thr Pro IgG2的主要多态性；Pro残基出现在IGHG*01同种异型中，Thr残基出现在IGHG2*02同种异型中a，b。
268 His Gln Gln -- B/C环中的改变已知参与了FcγRII结合c。
309 Val Leu orVal Leu Val FcRn结合结构域
330 Ala Ser Ser -- Clq结合的关键残基d；也可能参与了FcγRII和FcγRIII的结合e。
331 Pro Ser Ser -- Clq结合d，f和FcγRI结合g的关键残基；也可能参与了FcγRII和FcγRIII的结合e。
397 Met或Val* Val Met Val Val残基出现在IGHG*01同种异型中，Met残基出现在IGHG2*02同种异型中a。
*星号标记的位置发生了等位基因变异。
aHoHgs等(2001)Immunogenetics52(3-4)：242-8。
bWO97/11971.
cMedgyesi等(2004)Eur.J.Immunol.34：1127-1135。
dTao等(1991)J.Exp.Med.173：1025-1028。
eArmour等(1999)Eur.J.Immunol.29：2613。
fXu等(1994)J.Biol.Chem.269：3469-3474。
gCanfield和Morrison(1991)J.Exp.Med.173：1483。
实施例20：人源化的抗ADDL抗体的结合亲和性
为了评估人源化抗体的ADDL结合亲和性，按照本文的公开进行了滴度ELISAs。链亲和素包被的96孔微孔板(Sigma，St.Louis，MO)用10％生物素标记的ADDL抗原(1μM)包被。从500ng/mL开始的一系列2倍稀释的纯化抗体被加入到ADDL捕获的板中，将板在25℃保温2小时。在洗板机(Bio-Tek，Winooski，VA)中用PBS溶液清洗5次后，加入用3％脱脂奶封闭剂稀释2000倍的多克隆山羊抗人k轻链抗体(Biomeda，Foster City，CA)，在室温保温1小时。然后加入用封闭溶液稀释2000倍的HRP结合的兔抗山羊IgG(H+L)(BethylLaboratories，Inc.，Montgomery，TX)检测抗体，在室温保温1小时。在用PBS清洗后，加入HRP的底物3，3’，5’5-四甲基联苯胺(随需随用的TMB；Sigma，St.Louis，MO)，10分钟后用0.5N H2SO4终止反应。在读板机(型号VICTOR V；Perkin Elmer，Boston，MA)中读取450nm波长的吸收，使用EXCEL工作图表处理数据。不同板之间的分析差异估计在20％内。
在不同实验中比较了不同组的人源化抗体。通过CDR移植人源化的IgG1抗体20C2A、20C2B、3B3、4E2、1F6和2H4的比较表明所有的抗体都能够结合ADDLs，其中1F6的结合比大多数的弱，20C2A的结合最强。20C2 IgG1抗体的4种不同的人源化版本(两种CDR移植的版本和两种表面修饰的版本)也被比较，发现它们表现出非常相似的ADDL结合曲线，所有的结合都比嵌合的20C2抗体稍微好一些。26D6 IgG1的7种不同的人源化版本(一种CDR移植版本和6种表面修饰版本)也被比较。所有都被发现具有与嵌合形式的26D6相似的ADDL结合曲线。通过CDR移植人源化的两种20C2版本的IgG1和IgG2m4抗体也被分析，发现与通过CDR移植人源化的26D6的IgG1和IgG2m4同种型具有可比较的结合曲线。
实施例21：使用人源化的抗ADDL抗体抑制ADDL与神经元的结合
使用本文公开的方法进一步评估了人源化抗ADDL抗体阻断ADDL与原代海马神经元结合的能力。将相关的抗体或作为对照的PBS以1∶1(B103成神经细胞瘤细胞)或1∶5(原代海马神经元)的摩尔比率与2.5-10μm(终浓度)的bADDLs混合，在37℃在缓慢摇床上保温1小时。在预保温后，将抗体/bADDL制备物加入到B103或原代神经元培养物中，在37℃继续保温1小时。保温结束后，除去bADDLs/抗体混合物，将板用培养基清洗6次。然后将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟，除去溶液，加入新鲜的固定剂，将细胞再固定10分钟。使用含有0.1％TRITONTM X-100的4％的多聚甲醛使细胞通透(室温两次，每次10分钟)，在PBS中洗6次，然后用含有10％BSA的PBS在37℃处理1小时。然后在细胞中加入碱性磷酸酶结合的链亲和素(用1％BSA稀释1,500倍；Molecular Probes，Eugene，OR)，室温放置1小时。细胞用PBS清洗6次，在细胞中加入碱性磷酸酶底物(CDP-STAR和SAPPHIRE-IITM；Applied Biosystems，Foster City，CA)，保温30分钟，然后在LJL照度计(Analyst AD；LJL Biosystems，Sunnyvale，CA)上测定发光度。使用鼠抗体时，人源化的26D6、20C2、4E2、3B3、2H4和1F6版本能够抑制ADDL制备物与B103成神经细胞瘤细胞和原代神经元的结合。
实施例22：人源化抗ADDL抗体的亲和性成熟
只编码人源化的20C2版本A重链可变区、轻链可变区、或为重链和轻链可变区同时编码的核酸分子被克隆到Fab噬菌体展示载体pFab3d中。核酸序列分析证实了pFab3d中的序列和方向。在pFab3d中注释的20C2 Fab序列显示在图13中，在本文中重链显示为SEQ IDNO：255，轻链显示为SEQ ID NO：256。利用本技术领域内现有的噬菌体展示Fab文库方法将3种构建体用于20C2成熟程序中。
简单来说，设计了两个文库来突变20C2轻链(κ)的CDR3的9个野生型氨基酸(即Phe-Gln-Gly-Ser-Leu-Val-Pro-Leu-Thr；SEQ IDNO：60)。这些文库被命名为LC3-1和LC3-2，分别代表轻链CDR3序列Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Val-Pro-Leu-Thr(SEQ ID NO：257)和Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(SEQ ID NO：258)。生物素标记的反向引物20C2LC3-1(SEQ ID NO：259)和20C2LC3-2(SEQ IDNO：260)与正向引物20C2LC3F(SEQ ID NO：261)组合起来，用于产生LC3-1和LC3-2文库(参见图14)。引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，载体DNA通过凝胶电泳和电洗脱来纯化。两个轻链文库被设计为随机突变。三个10G5H6 LC3文库的最终多样性分别为4.76x108和7.45x108(表8)。从文库中选取的大约100个克隆的序列分析显示出突变克隆在设计的氨基酸位置有100％的多样性。
表8
Figure A20058003671700651
*通过浓缩或噬菌体拯救获得了较高的滴度。
完成了两个20C2轻链文库对高分子量bADDL的可溶性淘选。简单来说，使用生物素标记的高分子量ADDL(bADDL)进行了4轮淘选。前3轮使用大约1.5μM的抗原浓度(输入＝1x1010到1x1011)来进行。在完成第三轮后，将两个文库的输出合并，分成三组，用10nM、100nM和大约1.5μM的抗原进行分析以增加淘选的严紧性。这样，在噬菌体ELISA分析中测试了总共58个输出板，即在第一轮中每个文库两个板(总共4个板)，在第二轮中每个文库6个板(总共12个板)，在第三轮中LC3-1文库8个板、LC3-2文库10个板(总共18个板)，第四轮中每种抗原浓度8个板(总共24个板)。
淘选产生了1000个点(bit)，其中436个被测序(表9)。
表9
Figure A20058003671700661
a20C2LC3-1对高分子量的10％bADDL。
b20C2LC3-2对高分子量的10％bADDL。
c20C2LC3-1+20C2LC3-2对高分子量的10％bADDL。
*每个菌落总数的点。
高度富集的克隆的序列和频率被显示在表10中。
表10
克隆名称 CDR3 SEQ ID NO： 第2轮 第3轮 第4轮 总共
Hu20C2LCSJ-p1-31SJ-p1-144P2-12-E3SJ-p1-384P3-59SJ-p2-144P3-114P3-1SJ-p2-10SJ-p2-11SJ-p2-60SJ-p1-18SJ-p3-51SJ-p3-16SJ-p8-8FSJ-p3-26SJ-p3-15SJ-p2-70SJ-p3-24SJ-p3-33SJ-p3-14SJ-p2-1F4P1-22SJ-p2-44SJ-p1-564P1-40SJ-p2-20SJ-p1-41SJ-p2-134P1-26SJ-p1-33SJ-p2-27SJ-p2-624P2-26-E54P1-32SJ-p2-37SJ-p2-644P1-20SJ-p2-39SJ-p2-52SJ-p2-6L4P1-77SJ-p1-59SJ-p2-23SJ-p1-9MSJ-p2-28SJ-p1-214P1-17SJ-p2-66SJ-p1-49SJ-p2-244P1-41SJ-p2-514P1-64SJ-p2-55SJ-p1-25 FQGSLVPLTADTTHVPLTAHSTFVPLTAQASFVPLTAQATKVPLTAQSSKVPLTAQSTLVPLTFAASSVPLTFESTYVPLTFESSRVPLTFNATWVPLTFQASRVPLTFQATRVPLTFQGSFIGLSFQGSFIPGTFQGSFLPPSFQGSFLPQLFQGSLFPPVFQGSLFSPSFQGSRIPISFQGSRLPVSFQGSRVPLVFQSSFVPLTFQSSRVPLTGQTTLVPLTHESTLVPLTHQSSKVPLTIQTSLVPLTIQAALVPLTLQSSFVPLTLETSRVPLTLASSHVPLTLNSTTVPLTLQSKSVPLTLQSVRVPLTLQSSLVPLTLQTGRVPLTLQTSFVPLTLQTSNVPLTLQTTRVPLTLS STFVPLTLSSTHVPLTLTSSAVPLTLVSSLVPLTMETANVPLTMQSSFVPLTMQSSLVPLTMQTSKVPLTSQARMVPLTSQASRVPLTTQSTQVPLTVCATFVPLTVQSSAVPLTVQTSLVPLTVQTSVVPLTVQTTAVPLTLQTARVPLT 60262263264265266267268269270271272273274275276277278279280281282283284285286287288289290291292293294295296297298299300301302303304305306307308309310311312313314315316317 6111111 15111112112122512261221422223232221111211221 1422212222155131131815314131435256112321321123133 3534222322226625233625314154342253362354358432224323332243324
根据富集频率排列的前10个克隆的Fab片段被制备，总共15个克隆被转化成IgG1人源化A版本，两个克隆20C2-6和20C2-8被转化为IgG1人源化B版本。使用生物素-β1-20(表11)和bADDL(表12)作为抗原通过BIACORETM计算了这些克隆的KD值。当与父本人源化20C2A和20C2B以及小鼠20C2抗体相比时，观察到了亲和性的急剧增加。特别是使用轻链CDR3序列Xaa1-Gln-Xaa2-Thr-Arg-Val-Pro-Leu-Thr(SEQ ID NO：318)时，可以获得低的从纳摩尔到低于皮摩尔的KDs，其中Xaa1是Phe或Leu，Xaa1是Ala或Thr。此外，使用生物素-Aβ1-20和bADDL通过BIACORETM获得的KD值之间的比较进一步证实了抗ADDL抗体例如20C2优选结合ADDLs的多维构象，而不是单体Aβ肽。
表11
表12
Figure A20058003671700701
序列表
<110>默克制药公司(Mcrck ＆ Co.，lnc.)
西北大学(Northwestern University)
<120>抗ADDL抗体及其应用(ANTI-ADDL ANTIBODTES AND USES THEREOF)
<130>SCT071719-47
<150>US 60/621.776
<151>2004-10-25
<150>US 60/652，538
<151>2005-02-14
<150>US 60/695，528
<151>2005-06-30
<150>US 60/695，526
<151>2005-06-30
<160>322
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>459
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>1
Figure A20058003671700711
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<213>Mus musculus
<400>2
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<210>3
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<213>Mus musculus
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<213>Mus musculus
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa denotes an amino acid with hyroxyl side chain group
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(7)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(7)
<223>Xaa denotes an amino acid with an aliphatic side chain group
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa denotes an amino acid with a charged side chain group
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Figure A20058003671700914
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR2
<400>55
Figure A20058003671700923
<210>56
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR2
<400>563
Figure A20058003671700924
<210>57
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Consensus light chain CDR2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa denotes Ser or Phe
<400>57
Figure A20058003671700925
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR2
<400>58
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<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>59
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<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>60
Figure A20058003671700934
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>61
Figure A20058003671700935
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>62
Figure A20058003671700941
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>63
Figure A20058003671700942
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Scquencc
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>64
Figure A20058003671700943
<210>65
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Consensus light chain CDR3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa denotes Ser or Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa denotes an amino acid with no side chain or hyroxyl sidechain group
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa denotes an amino acid with a hyroxyl side chain group
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa denotes His，Tyr or Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa denotes an amino acid with an aliphatic side chain group
<400>65
Figure A20058003671700951
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Light chain CDR3
<400>66
Figure A20058003671700952
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<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>67
Figure A20058003671700953
<210>68
<211>130
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>68
Figure A20058003671700954
Figure A20058003671700961
<210>69
<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>69
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<211>124
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>70
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<210>71
<211>123
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>71
Figure A20058003671700972
Figure A20058003671700981
<210>72
<211>105
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>72
Figure A20058003671700982
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<211>115
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>73
Figure A20058003671700983
Figure A20058003671700991
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<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>74
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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<400>75
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Figure A20058003671701001
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<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>76
Figure A20058003671701002
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<211>123
<212>PRT
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<400>77
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<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>78
Figure A20058003671701012
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<211>122
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>79
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<211>115
<212>PRT
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<400>80
Figure A20058003671701022
Figure A20058003671701031
<210>81
<211>115
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>81
Figure A20058003671701032
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<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>82
Figure A20058003671701041
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<211>114
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
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<211>124
<212>PRT
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<400>84
Figure A20058003671701043
Figure A20058003671701051
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<211>130
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>85
Figure A20058003671701061
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<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>86
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<211>124
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
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Figure A20058003671701063
Figure A20058003671701071
<210>88
<211>115
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>88
Figure A20058003671701072
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<211>115
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>89
Figure A20058003671701073
Figure A20058003671701081
<210>90
<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>90
Figure A20058003671701082
<210>91
<211>114
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>91
Figure A20058003671701083
Figure A20058003671701091
<210>92
<211>117
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>92
Figure A20058003671701092
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<211>117
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>93
Figure A20058003671701101
<210>94
<211>98
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>94
Figure A20058003671701102
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<211>117
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>95
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<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>96
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<211>115
<2l2>PRT
<213>Homo sapiens
<400>97
Figure A20058003671701122
<210>98
<211>l00
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>98
Figure A20058003671701123
Figure A20058003671701131
<210>99
<211>114
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>99
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<211>121
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>100
Figure A20058003671701141
<210>101
<211>121
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>101
<210>102
<211>98
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>102
Figure A20058003671701151
<210>103
<211>121
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>103
Figure A20058003671701152
Figure A20058003671701161
<210>104
<211>110
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>104
Figure A20058003671701162
<210>105
<211>110
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>105
Figure A20058003671701163
Figure A20058003671701171
<210>106
<211>95
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>106
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<211>110
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>107
Figure A20058003671701173
Figure A20058003671701181
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<211>122
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>108
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<211>122
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>109
Figure A20058003671701183
<210>110
<211>98
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>110
Figure A20058003671701192
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<211>122
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>111
Figure A20058003671701193
Figure A20058003671701201
<210>112
<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>112
Figure A20058003671701202
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<211>130
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>113
Figure A20058003671701211
<210>114
<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>114
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<211>123
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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<211>123
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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<400>116
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Figure A20058003671701231
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<211>113
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<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>118
Figure A20058003671701233
Figure A20058003671701241
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<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>119
Figure A20058003671701242
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<211>112
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>120
Figure A20058003671701251
<210>121
<211>113
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>121
Figure A20058003671701252
Figure A20058003671701261
<210>122
<211>123
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>122
<210>123
<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>123
Figure A20058003671701263
Figure A20058003671701271
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<211>123
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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<211>123
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>125
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Figure A20058003671701281
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<211>122
<212>PRT
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<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
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<211>112
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>128
Figure A20058003671701292
<210>129
<211>100
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>129
<210>130
<211>112
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>130
Figure A20058003671701302
<210>131
<211>111
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>131
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<211>463
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<220>
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<220>
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Figure A20058003671701331
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<211>463
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<211>389
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<220>
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<220>
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Figure A20058003671701361
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<211>389
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<220>
<223>Humanized light chain variable region
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<211>457
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<220>
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Figure A20058003671701371
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<220>
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Figure A20058003671701382
Figure A20058003671701391
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<211>463
<212>DNA
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<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
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<211>389
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>146
Figure A20058003671701393
Figure A20058003671701401
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<211>447
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>147
Figure A20058003671701402
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<211>447
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>148
Figure A20058003671701411
<210>149
<211>447
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized heavy chain variable region
<400>149
Figure A20058003671701412
Figure A20058003671701421
<210>150
<211>371
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>150
<210>151
<211>371
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized light chain variable region
<400>151
Figure A20058003671701423
Figure A20058003671701431
<210>152
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>152
Figure A20058003671701432
Figure A20058003671701441
Figure A20058003671701451
<210>153
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>153
Figure A20058003671701452
Figure A20058003671701461
<210>154
<211>449
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgG2M4 heavy chain variable region
<400>154
Figure A20058003671701471
Figure A20058003671701481
<210>155
<211>449
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgG2M4 heavy chain variable region
<400>155
Figure A20058003671701482
Figure A20058003671701491
Figure A20058003671701501
<210>156
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>156
Figure A20058003671701502
Figure A20058003671701511
<210>157
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>157
Figure A20058003671701512
Figure A20058003671701521
Figure A20058003671701531
<210>158
<211>449
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized lgG2M4 heavy chain variable region
<400>158
Figure A20058003671701532
Figure A20058003671701541
<210>159
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>159
Figure A20058003671701552
Figure A20058003671701561
<210>160
<211>454
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>160
Figure A20058003671701562
<210>161
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>161
<210>162
<211>447
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>162
Figure A20058003671701591
Figure A20058003671701601
<210>163
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variale region
<400>163
Figure A20058003671701602
Figure A20058003671701611
<210>164
<211>451
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>164
Figure A20058003671701612
Figure A20058003671701621
Figure A20058003671701631
<210>165
<211>214
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>165
Figure A20058003671701632
<210>166
<211>452
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>166
Figure A20058003671701642
Figure A20058003671701651
Figure A20058003671701661
<210>167
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>167
Figure A20058003671701671
<210>168
<211>452
<212>PRT
<213>Artifical Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>168
Figure A20058003671701682
<210>169
<211>449
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized TgG2M4 heavy chain variable region
<400>169
Figure A20058003671701701
Figure A20058003671701711
<210>170
<211>449
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgG2M4 heavy chain variable region
<400>170
Figure A20058003671701712
Figure A20058003671701721
Figure A20058003671701731
<210>171
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>171
Figure A20058003671701732
Figure A20058003671701741
<210>172
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>172
Figure A20058003671701751
Figure A20058003671701761
<210>173
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized IgGl heavy chain variable region
<400>173
Figure A20058003671701762
Figure A20058003671701771
Figure A20058003671701781
<210>174
<211>453
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanied IgGl heavy chain variable region
<400>174
Figure A20058003671701782
Figure A20058003671701791
<210>175
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>175
Figure A20058003671701801
<210>176
<211>219
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Humanized kappa light chain variable region
<400>176
<210>177
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>177
Figure A20058003671701821
<210>178
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>178
Figure A20058003671701822
<210>179
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>179
Figure A20058003671701823
<210>180
<211>42
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>180
Figure A20058003671701824
<210>181
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>181
Figure A20058003671701825
<210>182
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>182
Figure A20058003671701831
<210>183
<211>10
<212>PRT
<213>Artificia1 Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>183
Figure A20058003671701832
<210>184
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>184
Figure A20058003671701833
<210>185
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>185
<210>186
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>186
Figure A20058003671701835
<210>187
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>187
Figure A20058003671701841
<210>188
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>188
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<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>189
Figure A20058003671701843
<210>190
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>190
<210>191
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>191
Figure A20058003671701845
<210>192
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>192
<200>193
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>193
Figure A20058003671701852
<210>194
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>194
Figure A20058003671701853
<210>195
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>195
Figure A20058003671701854
<210>196
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>196
Figure A20058003671701855
<210>197
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>197
Figure A20058003671701861
<210>198
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>198
Figure A20058003671701862
<210>199
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>199
Figure A20058003671701863
<210>200
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>200
Figure A20058003671701864
<210>201
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>201
Figure A20058003671701865
<210>202
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>202
<210>203
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>203
Figure A20058003671701872
<210>204
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>204
<210>205
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>205
<210>206
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>206
Figure A20058003671701875
Figure A20058003671701881
<210>207
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>207
<210>208
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>208
Figure A20058003671701883
<210>209
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>209
Figure A20058003671701884
<210>210
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>210
Figure A20058003671701885
<210>211
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>211
Figure A20058003671701891
<210>212
<211>10
<242>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>212
Figure A20058003671701892
<210>213
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>213
Figure A20058003671701893
<210>214
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>214
<210>215
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>215
Figure A20058003671701895
<210>216
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>216
Figure A20058003671701901
<210>217
<211>14
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>217
<210>218
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>218
Figure A20058003671701903
<210>219
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>219
Figure A20058003671701904
<210>220
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>220
Figure A20058003671701905
<210>221
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>221
Figure A20058003671701911
<210>222
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>222
Figure A20058003671701912
<210>223
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>223
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<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>224
Figure A20058003671701914
<210>225
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>225
Figure A20058003671701915
<210>226
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>226
Figure A20058003671701921
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<211>39
<212>DNA
<213>Artificil Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>227
Figure A20058003671701922
<210>228
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>228
Figure A20058003671701923
<210>229
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>229
Figure A20058003671701924
<210>230
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>230
Figure A20058003671701925
<210>231
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>231
Figure A20058003671701931
<210>232
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>232
Figure A20058003671701932
<210>233
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>233
Figure A20058003671701933
<210>234
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>234
Figure A20058003671701934
<210>235
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>235
Figure A20058003671701935
<210>236
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>236
Figure A20058003671701941
<210>237
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>237
Figure A20058003671701942
<210>238
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Syntheti coligonucleotide
<400>238
Figure A20058003671701943
<210>239
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>239
Figure A20058003671701944
<210>240
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>240
Figure A20058003671701945
<210>241
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>241
<210>242
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>242
Figure A20058003671701952
<210>243
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Scquence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>243
<210>244
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>244
Figure A20058003671701954
<210>245
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>245
Figure A20058003671701955
<210>246
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>246
Figure A20058003671701961
<210>247
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>247
Figure A20058003671701962
<210>248
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonuucleotide
<400>248
<210>249
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>249
<210>250
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
<400>250
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<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>251
Figure A20058003671701971
Figure A20058003671701981
<210>252
<211>326
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>252
Figure A20058003671701982
Figure A20058003671701991
<210>253
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>253
Figure A20058003671701992
Figure A20058003671702001
<210>254
<211>326
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic immunoglobulin constant region
<400>254
Figure A20058003671702011
Figure A20058003671702021
<210>255
<211>492
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic protein
<400>255
Figure A20058003671702022
Figure A20058003671702031
Figure A20058003671702041
<210>256
<211>243
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic protein
<400>256
Figure A20058003671702042
Figure A20058003671702051
<210>257
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Xaa denotes any amino acid residue
<400>257
Figure A20058003671702052
<210>258
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(9)
<223>Xaa denotes any amino acid residue
<400>258
Figure A20058003671702053
<210>259
<211>82
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(58)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(60)..(61)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(64)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(66)..(67)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(70)
<223>n denotes any nucleotide
<400>259
Figure A20058003671702061
<210>260
<211>82
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(46)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(49)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(52)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(55)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(58)
<223>n denotes any nucleotide
<400>260
Figure A20058003671702071
<210>261
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic primer
<400>261
Figure A20058003671702072
<210>262
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>262
<210>263
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>263
<210>264
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>264
Figure A20058003671702075
<210>265
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>265
Figure A20058003671702081
<210>266
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>266
Figure A20058003671702082
<210>267
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>267
Figure A20058003671702083
<210>268
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>268
Figure A20058003671702084
<210>269
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>269
<210>270
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>270
Figure A20058003671702091
<210>271
<211>9
<212>PRT
<213>Artficial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>271
Figure A20058003671702092
<210>272
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>272
Figure A20058003671702093
<210>273
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>273
Figure A20058003671702094
<210>274
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>274
Figure A20058003671702095
<210>275
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>275
<210>276
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>276
Figure A20058003671702102
<210>277
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>277
Figure A20058003671702103
<210>278
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>278
Figure A20058003671702104
<210>279
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>279
Figure A20058003671702105
<210>280
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>280
Figure A20058003671702111
<210>281
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>281
Figure A20058003671702112
<210>282
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequcnce
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>282
Figure A20058003671702113
<210>283
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>283
<210>284
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>284
Figure A20058003671702115
<210>285
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>285
Figure A20058003671702121
<210>286
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>286
Figure A20058003671702122
<210>287
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>287
Figure A20058003671702123
<210>288
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>288
Figure A20058003671702124
<210>289
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>289
Figure A20058003671702125
Figure A20058003671702131
<210>290
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>290
Figure A20058003671702132
<210>291
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>291
Figure A20058003671702133
<210>292
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>292
Figure A20058003671702134
<210>293
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>293
<210>294
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>294
Figure A20058003671702141
<210>295
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>295
<210>296
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>296
<210>297
<211>9
<212> PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>297
Figure A20058003671702144
<210>298
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>298
Figure A20058003671702145
<210>299
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>299
Figure A20058003671702151
<210>300
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>300
<210>301
<211>9
<212>PRT
<213>Articial Sequence
<220>
<223>Synthetic  peptide
<400>301
Figure A20058003671702153
<210>302
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>302
<210>303
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>303
<210>304
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>304
Figure A20058003671702161
<210>305
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>305
Figure A20058003671702162
<210>306
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>306
Figure A20058003671702163
<210>307
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>307
Figure A20058003671702164
<210>308
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>308
Figure A20058003671702165
<210>309
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>309
Figure A20058003671702171
<210>310
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>310
Figure A20058003671702172
<210>311
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>311
Figure A20058003671702173
<210>312
<211>9
<212>PRT
<213>Articfial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>312
Figure A20058003671702174
<210>313
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequcnce
<220>
<223>Synthetic  peptide
<400>313
<210>314
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>314
Figure A20058003671702181
<210>315
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>315
<210>316
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>316
Figure A20058003671702183
<210>317
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>317
Figure A20058003671702184
<210>318
<211>9
<212>PRT
<213>Arificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa denotes Phe or Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa denotes Ala or Thr
<400>318
<210>319
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthctic peptide
<400>319
Figure A20058003671702192
<210>320
<211>398
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic nuclcic acid
<400>320
Figure A20058003671702193
<210>321
<211>398
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic nucleic acid
<220>
<221>misc_feature
<222>(329)..(330)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(332)..(333)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(335)..(336)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(338)..(339)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(341)..(342)
<223>n denotes any nucleotide
<400>321
Figure A20058003671702201
<210>322
<211>398
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic nucleic acid
<220>
<221>misc_feature
<222>(341)..(342)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(344)..(345)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(347)..(348)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(350)..(351)
<223>n denotes any nucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(353)..(354)
<223>n  denotes any nucleotide
<400>322
Figure A20058003671702211

Claims (10)

1.分离的抗体或其片段，其能够差异识别一种或多种Aβ衍生的可扩散配体的多维构象。
2.含有分离的抗体或其片段的药物组合物，该抗体或其片段能够差异识别一种或多种Aβ衍生的可扩散配体的多维构象，并与可药用的载体混合。
3.阻止Aβ衍生的可扩散配体与神经元结合的方法，包括将神经元与权利要求1的抗体相接触，从而阻止Aβ衍生的可扩散配体与神经元的结合。
4.抑制Aβ衍生的可扩散配体聚集的方法，包括将含有淀粉样蛋白β1-42肽的样品与权利要求1的抗体相接触，从而抑制Aβ衍生的可扩散配体的聚集。
5.阻断τ蛋白在Ser202/Thr205位点的磷酸化的方法，包括将含有τ蛋白的样品与权利要求1的抗体相接触，从而阻断τ蛋白在Ser202/Thr205位点的磷酸化。
6.预防性或治疗性治疗与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病的方法，包括给药有效量的权利要求2的药物组合物。
7.鉴定阻止Aβ衍生的可扩散配体与神经元结合的治疗试剂的方法，包括将神经元与Aβ衍生的可扩散配体在存在试剂的情况下相接触，以及使用权利要求1的抗体确定在存在该试剂的情况下Aβ衍生的可扩散配体与神经元的结合。
8.检测样品中Aβ衍生的可扩散配体的方法，包括将样品与权利要求1的抗体相接触，从而检测Aβ衍生的可扩散配体。
9.诊断与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病的方法，包括将样品与权利要求1的抗体相接触，从而诊断与Aβ衍生的可扩散配体相关的疾病。
10.用于检测Aβ衍生的可扩散配体的试剂盒，含有权利要求1的分离的抗体或其片段。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101965365A (zh) * 2007-10-19 2011-02-02 伊缪纳斯制药株式会社 能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用
CN102123728A (zh) * 2008-06-12 2011-07-13 阿费里斯股份公司 用于治疗淀粉样变的化合物
CN102167746A (zh) * 2010-11-11 2011-08-31 姜东成 Spg-抗体多聚体及其制备方法和应用
CN102459335A (zh) * 2009-04-17 2012-05-16 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
CN102597233A (zh) * 2009-08-07 2012-07-18 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
CN102597234A (zh) * 2009-08-07 2012-07-18 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
CN103140500A (zh) * 2010-07-14 2013-06-05 默沙东公司 抗addl单克隆抗体及其用途
CN103524617B (zh) * 2006-07-14 2016-12-28 Ac免疫有限公司 针对淀粉状蛋白β的人源化抗体
WO2021160151A1 (zh) * 2020-02-13 2021-08-19 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在***中的用途
WO2021160152A1 (zh) * 2020-02-13 2021-08-19 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在治疗神经内分泌瘤中的用途
CN114953087A (zh) * 2022-04-22 2022-08-30 西双版纳雨林拾光科技有限公司 一种用于数码打印影像的实木切片及其生产工艺

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103524617B (zh) * 2006-07-14 2016-12-28 Ac免疫有限公司 针对淀粉状蛋白β的人源化抗体
CN101965365A (zh) * 2007-10-19 2011-02-02 伊缪纳斯制药株式会社 能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用
CN102123728A (zh) * 2008-06-12 2011-07-13 阿费里斯股份公司 用于治疗淀粉样变的化合物
CN102123728B (zh) * 2008-06-12 2017-05-31 阿费里斯股份公司 用于治疗淀粉样变的化合物
US9090679B2 (en) 2009-04-17 2015-07-28 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
CN102459335A (zh) * 2009-04-17 2012-05-16 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
CN102459335B (zh) * 2009-04-17 2015-11-25 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
CN102597233A (zh) * 2009-08-07 2012-07-18 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
CN102597234B (zh) * 2009-08-07 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
CN102597233B (zh) * 2009-08-07 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
CN102597234A (zh) * 2009-08-07 2012-07-18 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
CN103140500B (zh) * 2010-07-14 2015-09-09 默沙东公司 抗addl单克隆抗体及其用途
CN103140500A (zh) * 2010-07-14 2013-06-05 默沙东公司 抗addl单克隆抗体及其用途
CN102167746A (zh) * 2010-11-11 2011-08-31 姜东成 Spg-抗体多聚体及其制备方法和应用
WO2021160151A1 (zh) * 2020-02-13 2021-08-19 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在***中的用途
WO2021160152A1 (zh) * 2020-02-13 2021-08-19 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在治疗神经内分泌瘤中的用途
CN114953087A (zh) * 2022-04-22 2022-08-30 西双版纳雨林拾光科技有限公司 一种用于数码打印影像的实木切片及其生产工艺

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