CN101132812A - Hiv进入抑制剂的聚合物基组合物和结合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了HIV进入抑制剂的水溶性聚合物结合物和聚合物基组合物。本发明还提供了所述结合物和组合物的合成和给药方法。

Description

HIV进入抑制剂的聚合物基组合物和结合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年3月15日提交的美国临时申请60/553,146的优先权，其被全文并入本文作为参考。

技术领域

本发明总地涉及HIV进入抑制剂(El)的缓释给药。更具体地，本发明涉及HIV进入抑制剂的水溶性聚合物结合物(conjugate)和聚合物基组合物。另外，本发明包括合成这种结合物和组合物的方法，以及通过给药本文中所述组合物抑制HIV感染的方法。

背景技术

在1981年在美国首次报告的AIDS(获得性免疫缺乏综合症)是世界性的流行病。AIDS由人类免疫缺陷性病毒(HIV)引起，HIV通过杀死或破坏身体免疫***的细胞而进行性地破坏身体对抗感染和某些类型的癌症的能力。据估计，在美国目前有接近一百万人感染HIV。

当AIDS首次在美国被发现时，没有对抗HIV的药物；然而，在过去的11年中，已经开发了药物用于对抗HIV感染及其相关的感染和癌症。这些药物可以根据它们的作用方式分为不同类别。有三类抗HIV药物，尽管在病毒生命周期的不同时期起作用，但在病毒已感染T细胞之后中断病毒复制。这些抗HIV药物类别包括核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)。这些不同类别的药物包括AZT、扎西他滨(双去氧胞苷)、双去氧肌苷(dideoxyinosine)、司他夫定(stavudine)和拉米夫定(核苷类逆转录酶抑制剂)；delvaridine、奈维拉平(nevirapine)、和依非韦伦(efravirenz)(非核苷类逆转录酶抑制剂)；和利托那韦(ritonavir)、saquinivir、和茚地那韦(indinavir)(蛋白酶抑制剂)。然而，还有另一类抗逆转录病毒药，即，进入抑制剂，其以与前述常规类别的抗HIV药物不同的方式起作用。与对抗T细胞感染后的HIV不同，进入抑制剂实际上首先防止HIV感染T细胞。更具体地，进入抑制剂通过使其本身依附于T细胞表面上的蛋白质或HIV表面上的蛋白质而起作用。为了使HIV结合于T细胞，HIV外被上的蛋白质必须结合于T细胞表面上的蛋白质。进入抑制剂防止这种结合的发生。一些进入抑制剂靶向HIV表面上的gp120或gp41蛋白质，而其它进入抑制剂靶向T细胞表面上的CD4蛋白质或CCR5或CXCR4受体。进入抑制剂包括T-20(也称为恩夫韦地(enfuvirtide))、PRO-542、SCH-C、SCH-D、和T-1249。至今，只有一种进入抑制剂T-20得到FDA的批准。T-20抑制HIV-1与CD4+细胞的融合。

进入抑制剂(包括融合抑制剂)是有前途的新型抗HIV药物。进入抑制剂如T-20对于在单独或联合治疗中使用常规抗HIV药物如，PI、NRTI和NNRTI没有响应的HIV阳性个体特别有吸引力。T-20为36个氨基酸的合成肽，其具有乙酰化N-末端和改性为羧酰胺的C-末端。T-20(FUZEON^TM)在2003年3月收到FDA的上市批准。令人遗憾的是，尽管期望很高，该药物的销售受到其不合理的价格的阻碍，并且更重要的是，其难以给药。T-20皮下注射，每天两次。这种对患者的频繁给药非常不受患者的欢迎-由于高频率的剂量给药、给药方式、和与制备和给药该药物相关的全面疲惫感，其中许多患者最终没能维持必要的剂量给药方案。实际上，98％的FUZEON^TM患者报告了疼痛的或麻烦的局部注射部位反应(ISR)的至少一种情况。ISR症状包括疼痛/不适、硬化、红斑、和小结/囊肿。报告的过敏性反应包括皮疹、发烧、恶心和呕吐、寒战、强直、和低血压。越来越显而易见，药物如T-20不是可为患者所容易接受的药物。与ISR有关的疼痛被认为是轻微的到中度的，并且各种ISR的平均持续时间为约7天。此外，如果没有连贯地接受全部的剂量，T-20可相当迅速地形成抗药性。(GMHC TreatmentIssues，Vol.17，No.1/2，Jan/Feb 2003)。因此，本领域中需要改善的抗HIV药物，并且特别是，需要改善的进入抑制剂，其在血流中有更长久的循环半衰期、同时维持可测量的，并且更优选是显著的活性程度，从而可以较低频率对患者剂量给药并从而减少局部注射部位反应的发生。本发明满足这些需要。

发明内容

因此，在一个方面，本发明提供抗逆转录病毒HIV药物的缓释给药组合物，抗逆转录病毒HIV药物具体地为肽酰基进入抑制剂如T-20和T-1249。本发明的结合物和组合物具有缓释释放性质，如，比它们的未改进的EI对应物相比具有更长久的血流半衰期，从而解决了与未改进的EI如T-20有关的一些给药相关性问题。

本文中所述的结合物和组合物有利地降低免疫原性。同样重要的是，本发明的结合物和组合物与不含水溶性聚合物的常规EI组合物相比(结合形式或非结合形式)需要降低的剂量给药频率。因此，本文提供的结合物和组合物通过它们的用于提供延长和治疗水平的血流EI(优选多肽基EI)的缓释释放性质而有利地减少接受相应的不含与其共价连接或与其结合的水溶性聚合物的进入抑制剂药物的HIV-1感染主体通常所承受的令人痛苦的注射次数和相关的局部注射部位反应。

在一个方面，本发明涉及水溶性聚合物和进入抑制剂化合物的结合物。本发明这个方面的示例性结合物在本文中的表格中提供。

在优选的实施方案中，本发明的结合物和组合物为可降解，也就是说，其包括至少一个可降解的键合，优选可水解的键合。

例如，本发明的结合物或组合物中包含的可水解键合可包含可水解部分，如羧酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、硫代酸酯、硫羟酸酯、或碳酸酯。

在一个优选的实施方案中，可水解部分为可水解的氨基甲酸酯、酯或碳酸酯。

在另一个实施方案中，本发明的结合物具有以下结构：

其中POLY为水溶性聚合物，L_D为可降解的键合，EI为进入抑制剂，k相当于EI上与独立聚合物片段(POLY-L_D)共价连接的活性部位数。每个聚合物片段(即，聚合物片段的单独组分)进行独立地选择，虽然优选共价连接于EI的每个聚合物片段都相同。通常，k为约1到约8，也就是说，k选自1、2、3、4、5、6、7和8。优选地，k为1、2、3或4，更优选k为1。

在本发明的这方面和其它方面的优选实施方案中，水溶性聚合物为聚乙二醇。

水溶性聚合物如聚乙二醇通常具有处于以下范围内的分子量：约500道尔顿到约100,000道尔顿、约2,000道尔顿到约85,000道尔顿、约5,000道尔顿到约60,000道尔顿、约10,000道尔顿到约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿到约40,000道尔顿，并且可具有多种结构中的任一种(如，线型、支化、叉形、等等)。

本发明的结合物和组合物中使用的进入抑制剂包括例如T-20、T-1249、PRO 542(又名CD4-IgG2)、PRO-140、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、GSK-140、PA9、PA10、PA11、和PA12。在具体的实施方案中，进入抑制剂为T-20、T-1249、PRO 542、或PRO-140。

在另外的实施方案中，如上述结构I中所示的聚合物片段所连接的EI活性部位独立地选自N末端、C末端、氨基、羟基和硫羟基。

通常，L_D具有例如约1到约20个原子、约2到约15个原子、或约3到约10个原子的长度。也就是说，L_D通常具有选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20个原子的总原子长度。

本发明的又一个具体实施方案包括具有以下通用结构之一的结合物：

其中结构II中的L为-O-或-NH-C(O)，Ar为芳基如邻位、间位、或对位取代的苯基、-NH-为得自EI的氨基残基，结构III中的P为间隔基，Z为-O-、-NH-、或-CH₂-，和O为EI的羟基残基。

在更具体的实施方案中，在结构III中，当合起来考虑-NH-P-Z-C(O)-时，P为天然或非天然存在的氨基酸的残基。

还构成本发明这个方面的一部分的是对应于结构III的结合物，其中“POLY-NH-”相当于不存在EI部分的表1中的聚合物1-1到1-40。

仍在又一个的实施方案中，本发明的结合物的特征在于以下的结构：

或

或

其中n为2到约3400。

还构成本发明的一部分的是多臂型(multi-armed)水溶性聚合物的结合物。

在本发明这个方面的一个具体实施方案中，多臂型聚合物包括中心核心，从中心核心伸出至少三个通常为均聚或共聚形式的聚合物臂。

在本发明的多臂型聚合物的结合物的又一个实施方案中，各个聚合物臂包括这样的共聚物，该共聚物包括与中心核心共价连接的内部多肽片段和与所述多肽片段共价连接的外部亲水性聚合物片段。

本发明这个方面的示例性结合物通常包括以下结构：

其中R为核心分子，POLY为水溶性聚合物，L_D为可降解的键合，EI为进入抑制剂，和y为约3到15。

或者，结合物可包括以下结构：

其中m选自3、4、5、6、7和8。

仍在又一个和更具体的实施方案中，这种类型的结合物可相当于以下结构：

其中P为间隔基，Z为-O-、-NH-、或-CH₂-，O为得自EI的羟基残基。在优选实施方案中，当合起来考虑-NH-P-Z-C(O)-时，P为天然或非天然存在的氨基酸的残基。

在又一个方面，本发明包括含多种单一聚物EI结合物的组合物，这是指EI结合物各自具有一个聚合物试剂共价连接于EI，但是连接在EI上的不同活性部位或位置。

在本发明的另一个方面，将EI与水凝胶混合，水凝胶更优选为可水解降解的水凝胶，即，在生理条件下降解的那种。这种水凝胶可为交联的或非交联的。在优选实施方案中，水凝胶是包括进入抑制剂并且包括聚氧化烯烃作为凝胶组合之一的非可逆胶凝(non-reversegelation)水凝胶。在具体的实施方案中，进入抑制剂为水溶性聚合物结合物形式。或者，进入抑制剂任选地共价连接于一种或多种凝胶组分。

还构成本发明的一部分的是生产聚合物结合物的方法。该方法包括在结合条件下使进入抑制剂与水溶性聚合物试剂接触以形成聚合物进入抑制剂结合物的步骤。优选这种结合物包括可降解的键合。

在又一个方面，提供了制备包括进入抑制剂的非可逆胶凝水凝胶的方法。这种方法包括在有效促进适当的水凝胶前体试剂胶凝的条件下使所述适当的水凝胶前体试剂彼此接触和与所述进入抑制剂接触，从而形成其中包埋有进入抑制剂的非可逆胶凝水凝胶的步骤。进入抑制剂为结合形式或非结合形式，并且水凝胶前体试剂不表现出可逆胶凝性质。

在本发明的又一个实施方案中，提供了包括与可药用赋形剂组合的本发明的结合物的组合物。所述组合物包括所有类型的制剂，特别是适合于注射的那些制剂，如可以重新构建的粉末、以及液体(如，悬浮液和溶液)。

在本发明另外的实施方案中，提供了抑制HIV感染的方法。在该方法中，将EI-结合物或包括治疗有效量的这种结合物的药物组合物对感染HIV-1的主体或细胞给药。通常，给药EI结合物或组合物的步骤通过注射(如，肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射等途径)进行。

本发明另外的目的、优点和新的特征在以下描述中阐述，并且其在某种程度上对于阅读了以下描述的本领域技术人员来说是显而易见的，或者可通过实践本发明获悉。

附图说明

图1为得自实施例1(第4泳道)和实施例2(4∶1摩尔比)(第3泳道)的示例性结合物样品的SDS-PAGE电泳凝胶。第2泳道相当于游离的肽T-1249，用作参考。第1泳道相当于MARK 12标准品。

图2为得自实施例2(DMSO溶剂***)和实施例3(混合的含水DMSO溶剂***)的示例性结合物样品的SDS-PAGE电泳凝胶。第1泳道相当于MARK 12标准品。第2泳道相当于游离的肽T1249；第3泳道相当于1∶1摩尔比的DMSO反应物(实施例2)；第4泳道相当于1∶2摩尔比的DMSO反应物(实施例2)；第5泳道相当于使用4∶1摩尔比的水/DMSO混合反应物(1∶1)(实施例3)。

图3说明实施例3的1∶1摩尔比的结合物混合物的HPLC色谱。注射的样品为1∶1摩尔比的水/DMSO反应物，并且表现出类似于图2的第3泳道中所见的肽和产物分布。

图4相当于实施例5A中所述的纯化的单-PEG T1249的SDS-PAGE电泳凝胶。第1泳道为标准品，第2泳道为单独的T1249，第3和4泳道表示最终纯化的制剂的不同的载荷量；和

图5为表示使用共价连接于示例性的可降解mPEG试剂(mPEG-琥珀酰亚胺基苯基-碳酸酯，20kDa)的模型肽制备的单PEG化结合物(实施例5.D)的体外水解图。

发明的详细说明

定义

在详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于具体的聚合物、水凝胶、合成技术、进入抑制剂等，因而可有变化，如从随后的描述和附图显而易见的。

需要指出的是，如本说明书和权利要求中所用的，单数形式“一”、“一个”、和“该”包括复数对象，除非上下文清楚地表示不是这样。因此，例如，“聚合物”包括单个的聚合物以及两种或多种相同和不同的聚合物，“任选的赋形剂”是指单一的任选赋形剂以及两种或多种相同或不同的任选赋形剂，等等。

在描述和主张本发明时，以下术语以如下所述定义使用。

如本文中使用的，“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”可互换使用，是指包括任何水溶性聚(环氧乙烷)。通常，用于本发明的PEG包括以下结构“-(OCH₂CH₂)n-”，其中n为2到约4000。如本文中使用的，术语“PEG”也可指具体结构“-CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-”或“-(OCH₂CH₂)nO-”，取决于末端氧是否已经被替代。贯穿说明书和权利要求，应该记住，术语“PEG”包括具有多种末端或“封端”基团等的结构。术语“PEG”是指包含大多数(大于50％)的-OCH₂CH₂-重复亚单元的聚合物。对于具体的形式，PEG可呈现多种不同的分子量、以及结构或几何学，如“支化”、“线型”、“叉形”、“多官能的”等，其在以下更具体地描述。

术语“封端的”和“末端封端的”在本文中可交换地使用，是指具有封端部分的聚合物末端或终端。通常，虽然不是必须地，封端部分包括羟基或C_1-20烷氧基或苄氧基，更优选C_1-10烷氧基，更优选C_1-5烷氧基。因此，封端部分的例子包括烷氧基(如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)，以及芳基、杂芳基、环基、杂环基、等等。必须记住的是，封端部分可包括聚合物中末端单体的一个或多个原子[如，CH₃(OCH₂CH₂)n-中的封端部分“甲氧基”]。另外，考虑了前述每一种的饱和的、不饱和的、被取代的和未被取代的形式。此外，封端基团也可为硅烷。封端基团也可有利地包括可检测标记。当聚合物具有包括可检测标记的封端基团时，可通过使用适当的检测器测定聚合物和/或聚合物所结合的部分(如，活化剂)的量或位置。这种标记包括但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记的部分、比色(如，染料)标记、金属离子、放射性部分、等等。适当的检测器包括光度计、薄膜、分光计等。封端基团也可有利地包括磷脂。当聚合物具有包括磷脂的封端基团时，其赋予聚合物和得到的结合物以独特的性质。示例性的磷脂包括但不限于选自被称作磷脂酰胆碱的磷脂类别的那些。具体的磷脂包括但不限于选自二月桂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、山俞酰基磷脂酰胆碱、花生四烯酰基磷脂酰胆碱、和卵磷脂的那些。

本文中关于聚合物所述的“非天然存在的”是指聚合物作为整体在自然界中完全没有发现过。然而，本发明的非天然存在的聚合物可包含一种或多种天然存在的单体或单体的片段，只要总的聚合物结构在自然界中没有发现过即可。

“水溶性聚合物”中的术语“水溶性”是指聚合物是在室温下可溶于水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物将透射由经过滤之后的相同溶液所透射的光的至少约75％、更优选至少约95％。以重量计，优选水溶性聚合物以最少约35％(重量)可溶于水，更优选以最少约50％(重量)可溶于水，更优选以最少约70％(重量)可溶于水，更优选以最少约85％(重量)可溶于水。然而，更优选地，水溶性聚合物以约95％(重量)可溶于水或完全可溶于水。

在本发明的水溶性聚合物的上下文中，分子量(如PEG的分子量)可表示为数均分子量或重均分子量。除非另有陈述，本文中关于分子量的所有描述都是指重均分子量。数均分子量和重均分子量的测定都使用凝胶渗透色谱法或其它液相色谱技术测量。也可使用其它的分子量值测定方法，如使用端基分析或测量依数性质(如，凝固点降低、沸点升高、或渗透压)测定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心或粘度测定法测定重均分子量。本发明的聚合物通常为多分散性的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有较低的多分散性值，优选小于约1.2，更优选小于约1.15，更优选小于约1.10，更优选小于约1.05，最优选小于约1.03。

在本发明的连接基的描述中，总原子长度是指单个链的原子数，不算取代基。例如，-CH₂-算作是一个原子的总连接基长度，-CH₂CH₂O-算作是3个原子长度，非直链基团如苯基环算作是4个原子长度。

术语“活性的”或“活化的”在用于具体的官能团时，是指容易与另一个分子上的亲电体或亲核体反应的活性官能团。这与需要强催化剂或非常不实用的反应条件起反应的那些基团(即，“非活性的”或“惰性的”基团)相反。

如本文中使用的，术语“官能团”或其任何同义词是指包括其被保护的形式和未被保护的形式。

本文中使用的术语“键合”或“连接基”是指任选用于连接互相连接的部分如聚合物片段的末端与进入抑制剂(如，T-20或T-1249)的一个原子或多个原子的集合。连接基可具有水解稳定性，或者可以包括生理学可水解的或酶促可降解的键合。

“烷基”是指烃链，通常具有约1到15个原子的长度。这种烃链优选但非必须为饱和的，并且可为支链或直链，虽然通常优选为直链的。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。如本文中使用的，“烷基”包括环烷基以及含亚环烷基的烷基。

“低级烷基”是指包含1到6个碳原子的烷基，并且其可为直链或支链的，示例如甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。

“环烷基”是指饱和或不饱和的环烃链，包括优选由3到约12个碳原子、更优选3到约8个碳原子构成的桥接、稠合、或螺环的环状化合物。“亚环烷基”是指通过在环状***中任二个碳结合于链而***在烷基链中的环烷基。

“烷氧基”是指-O-R基团，其中R为烷基或被取代的烷基，优选为C_1-6烷基(如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。

如“被取代的烷基”中的术语“被取代的”是指被一个或多个互不干扰的取代基取代的部分(如，烷基)，取代基例如但不限于：烷基；C_3-8环烷基，如环丙基、环丁基等；卤代，如氟代、氯代、溴代、和碘代；氰基；烷氧基、低级苯基；被取代的苯基；等等。“被取代的芳基”为具有一个或多个互不干扰的基团作为取代基的芳基。对于苯基环上的取代，取代基可为任何定位(即，邻位、间位、或对位)。

“互不干扰的取代基”是当存在于一个分子中时通常不与分子内包含的其它官能团反应的那些基团。

“芳基”是指各自具有5或6个核碳原子的一个或多个芳环。芳基包括多个芳基环，它们可为稠合形式如萘基，或未稠合形式如联苯基。芳基环也可为与一个或多个环烃、杂芳基、或杂环稠合的或未稠合的形式。如本文中使用的，“芳基”包括杂芳基。

“杂芳基”是指包含一到四个杂原子的芳基，优选杂原子为硫、氧、或氮、或其组合。杂芳基环也可为与一个或多个环烃、杂环基、芳基、或杂芳基稠合的或未稠合的形式。

“杂环”或“杂环基”是指有或者没有不饱和性或芳香性并且具有至少一个非碳环原子的含5-12个原子、优选5-7个原子的一个或多个环。优选的杂原子包括硫、氧和氮。

“被取代的杂芳基”为具有一个或多个互不干扰的基团作为取代基的杂芳基。

“被取代的杂环”是指具有一个或多个由互不干扰的取代基形成的侧链的杂环。

“亲电体”和“亲电基团”是指离子或原子或多个原子的集合，其可为离子性的，并且具有亲电中心，即，能够与亲核试剂反应的追求电子的中心。

“亲核体”和“亲核基团”是指离子或原子或多个原子的集合，其可为离子性的，并且具有亲电中心，即，能够追求亲电中心或与亲电试剂反应的中心。

“生理学可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键为在生理条件下与水反应(即，被水解)的键。键在水中水解的趋势不仅取决于连接两个中心原子的键合的一般类型，而且取决于连接于这些中心原子的取代基。适当的水解不稳定键的或者弱键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和低聚核苷酸。在本发明的某些实施方案中，优选在pH 8、25℃条件下的水解半衰期小于约30分钟的键，虽然这种优选不在任何情况下中具有限制性。

“可酶促降解的键合”是指容易被一种或多种酶降解的键合。

“水解稳定的”键合或键是指在水中基本上稳定的化学键，通常指共价键，其在延长的时段内在生理条件下不经历达到任何可觉察程度的水解。水解稳定的键合的例子包括但不限于以下：碳-碳键(如，在脂肪族链中)、醚、酰胺、氨基甲酸酯、等等。通常，水解稳定的键合是在生理条件下表现出每天低于约1-2％的水解速率的那些键合。典型的化学键的水解速率可以在大多数标准的化学教科书中找到。

“可药用的赋形剂或载体”是指可以任选包括在本发明的组合物中并且不对患者造成显著不利的毒理学作用的赋形剂。“药理学有效量”、“生理学有效量”和“治疗有效量”在本文中可交换地使用，是指提供理想的在血流或靶组织中的结合物(或相应的非结合的进入抑制剂)水平所需的进入抑制剂结合物或组合物(如，水凝胶)的量。精确的量取决于许多因素，如，具体的进入抑制剂、治疗组合物的组分和物理性质、目标患者群、单个患者的考虑、等等，并且可由本领域技术人员根据本文中提供的信息容易地决定。

关于聚合物的几何结构或整体结构所提及的“支化”是指具有从分支点伸出的至少两个聚合物“臂”的聚合物。支化聚合物可具有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、6个聚合物臂、8个聚合物臂、或更多个聚合物臂。支化聚合物的子集为多臂型聚合物，也就是说，具有从中心核心伸出的至少3个臂的聚合物。

“分支点”是指包括一个或多个原子的分叉点，聚合物或连接基团在此从直链结构分开或分叉为一个或多个另外的聚合物臂。

术语“活性的”或“活化的”是指在常规的有机合成条件下容易地或以实用速率起反应的官能团。这与不反应或需要强催化剂或不实用的反应条件起反应的那些基团(即，“非活性的”或“惰性的”基团)相反。

“被保护的形式”中所提及的官能团是指代带有保护基的官能团。如本文中使用的，术语“官能团”或其任何同义词是指包括其被保护的形式。典型的保护基在Greene，T.、Wuts，P.G.，″Protective Groups inOrganic Synthesis″，第三版，John Wiley & Sons，Inc.，1999中描述。“多官能的”是指具有至少三个官能团的聚合物，其中官能团可相同或不同。本发明的多官能的聚合试剂通常在聚合物主链内包含约3-100个官能团，或3-50个官能团，或3-25个官能团，或3-15个官能团，或3到10个官能团，或包含3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。

“进入抑制剂”为特定类别的抗逆转录病毒药物，它们靶向病毒感染靶细胞之前发生的HIV生命周期中的一个或多个步骤。具体地，它们是设计用于破坏HIV-1复制功能的化合物，最显著地，它们破坏HIV-1的细胞融合和进入。进入抑制剂包括融合抑制剂、连接抑制剂、和共受体抑制剂。所有的进入抑制剂通过阻断HIV成功进入并从而感染靶细胞的能力而起作用。通常，虽然不是必须地，本发明的进入抑制剂为肽或被修饰的肽，如杂交融合蛋白，或其它嵌合肽，其具有至少一个适合于与聚合物试剂反应的亲电基团或亲核基团。术语“进入抑制剂”或“EI”包括结合之前以及结合之后的进入抑制剂。

“水凝胶”为吸收溶剂(如，水)、经历迅速的膨胀而没有可觉察的溶解、并且维持能够可逆变形的三维网络的材料。水凝胶可为未交联的或交联的。亲水性聚合物如PEG的共价(化学)交联的网络可以形成水合状态的水凝胶。未交联的水凝胶通常为具有亲水区域和疏水区域的嵌段共聚物。由于由离子吸引、氢键合、范德华力等形成的物理交联力，这些未交联的物质可以在被置于水相环境中时形成水凝胶。由于疏水区域和亲水区域的存在，它们能够吸水而不溶解。

“基本上”或“本质上”是指接近全部或完全，例如某一给定量的至少95％。

术语“患者”是指患有或倾向于患有可以通过给用本发明的活性剂(如，结合物)预防或治疗的状况的活生物体，包括人和动物。

“任选的”或“任选地”意思是随后描述的情况可能发生或可能不发生，使得该描述包括其中该情况发生和不发生的情况。

肽中的氨基酸残基缩写为单个字母缩写形式或相应的氨基酸缩写如下：

F    Phe    苯丙氨酸

L    Leu    亮氨酸

I    Ile    异亮氨酸

M    Met    甲硫氨酸

V    Val    缬氨酸

S    Ser    氨酸

P    Pro    脯氨酸

T    Thr    苏氨酸

A    Ala    丙氨酸

Y    Tyr    酪氨酸

H    His    组氨酸

Q    Gln    谷氨酰胺

N    Asn    天冬酰胺

K    Lys    赖氨酸

D    Asp    天冬氨酸

E    Glu    谷氨酸

C    Cys    半胱氨酸

W    Trp    色氨酸

R    Arg    精氨酸

G    Gly    甘氨酸

综述：进入抑制剂的缓释释放聚合物组合物

如前所述，本发明提供用于HIV进入抑制剂化合物如T-20、T-1249及其它的缓释给药的组合物和方法。本文中描述的是用于在给药时延长短效进入抑制剂化合物(特别是那些肽基化合物)的半衰期同时还维持至少可测量的、更优选显著程度的它们的逆转录病毒活性的示例性的聚合物、结合物和组合物。在某些情况中，优选具有一个或多个设计用于在体内释放结合物的聚合物部分的可水解键合的聚合物结合物，或可降解的水凝胶基组合物，如本文中更具体地描述的。特别是对于药物如进入抑制剂，由于聚合物连接的可降解性质，具有一个或多个可降解键合的结合物具有延长的循环半衰期和在体内表现出生物活性的优点，因为聚合物在水解时释放进入抑制剂。因此，在这种实施方案中，聚合物连接的大小和位置对EI防止HIV进入T细胞的能力的影响不具有特别的利害关系，因为所述分子的聚合物部分在身体内脱离(fall off)以释放进入抑制剂。

进入抑制剂

进入抑制剂

本发明的结合物和组合物包括至少一种抗HIV药物，优选为进入抑制剂。进入抑制剂在本文中在结构上统称为“EI”。优选用于本发明的进入抑制剂为肽基化合物，也就是说，包括至少三个邻接的氨基酸残基。这种EI包括T-20、T-1249、PRO 542(又名CD4-IgG2)、PRO-140、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、和GSK-140。

对于上述讨论到的第一个进入抑制剂T-20，其是具有乙酰化N-末端并且在其C-末端具有羧酰胺基团的线型36个氨基酸的合成肽。T-20的分子量为4492。T-20由天然存在的L-氨基酸残基组成，并且具有以下表示为SEQ ID NO：1的主要的氨基酸序列：

SEQ ID NO：1.乙酰基-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂

使用氨基酸缩写，SEQ ID NO：1可以替代地表示为：

SEQ ID NO：1.YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF。

T-20通过抑制病毒与细胞膜的融合而干扰HIV-1进入细胞中。T-20结合于病毒包膜糖蛋白的gp41亚单元中的第一个七肽重复区域(HR1)，从而防止膜融合所需的构象变化。HR1只有在gp120结合CD4之后才变为T-20可接近的。共受体结合被认为是诱导引起膜融合的最终的构象变化。T-20似乎在融合过程中结合于结构中间体，并且似乎具有极窄的其中将其自身***到合并细胞中的动力学窗。由于其作用机理，本发明的一个实施方案中优选用于共价连接于融合抑制剂如T-20的低分子量聚合物，或者在替代性实施方案中，优选具有一个或多个可水解键合的聚合物，使得T-20对gp41的第一个螺旋区域(HR1)的结合不被阻止，因为聚合物在体内水解时离开。

为了用于本发明，可将T-20多肽序列在其氨基或羧基末端的一端或两端进行封闭和/或衍生化，如美国专利5,464,933中所述的，或者可在一个或多个赖氨酸位置具有封闭基团，如，用于帮助位置选择性的聚合物连接，根据将聚合物连接于EI所采用的化学作用而定。T-20的序列在Lys18和Lys28处包含赖氨酸，在本发明的某些实施方案中，优选其每个或两者用于水溶性聚合物的共价连接。

具体地，可将酪氨酸氨基末端用芳基封闭或衍生化，并且将苯丙氨酸的羧基末端用氨基封闭或衍生化。

考虑用于本发明的另外的类似T-20的序列包括HIV-1_LAI gp41蛋白质的氨基酸638到673、及其片段、类似物、和同系物，如美国专利5,464,933中所述的，该文献被特别地并入本文作为参考。特别优选的肽序列对应于如美国专利5,464,933中所述的SEQ ID NO：1、3、4、5、6和7，其分别相对于本文中的SEQ ID No：1到6。优选的水溶性聚合物连接位点包括赖氨酸的氨基、存在于酪氨酸、苏氨酸、或丝氨酸上的N末端、C末端、羟基。

如上所述，用于本发明组合物中的另外的类似T-20的多肽包括：

SEQ ID NO：2 YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

SEQ ID NO：3 YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF

SEQ ID NO：4 YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

SEQ ID NO：5 LEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIFGNWF

SEQ ID NO：6 LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL，

其中各个氨基酸残基以其单字母代码存在。

T-1249表示用于本发明的结合物中的另一种进入抑制剂。与T-20相似，T-1249也衍生自不同的逆转录病毒包膜(gp41)蛋白质序列，但是比T-20具有某些改善的药代动力学性质。T-1249为杂交多肽，其包含连接于增强器肽序列的核心多肽序列。T-1249具有39个氨基酸，并且结合于与T-20不同的HIV gp41区域。T-1249的氨基酸序列在美国专利6,656,906的图13B中表示。T1249表现出体内抗HIV-1、HIV-2、和SIV隔离活性。

T1249的多肽序列为：

SEQ ID NO.7WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF。

从上述序列可以看出，N-末端氨基酸为色氨酸，C末端氨基酸为苯丙氨酸。如美国专利6,348,568的表1中所述，(SEQ.ID NO.1071)，可将T-1249序列在其氨基和羧基末端进行封闭和/或衍生化。例如，可用酰基将色氨酸末端封闭或衍生化，并用氨基将苯丙氨酸羧基末端封闭，从而形成酰胺官能度。T-1249的序列在以下四个位置包含赖氨酸，根据所采用的聚合物试剂的类型而定，它们可适合于水溶性聚合物的共价连接(Lys7、Lys21、Lys28和Lys31)。

用于本发明的另外的示例性进入抑制剂序列(与T-1249的序列相似)在美国专利6,656,906中描述，其内容被特别地并入本文作为参考。特别优选的序列在美国专利6,656,906的图13A-C中表示。用于测定任一种上述杂交gp-41衍生化多肽序列的抗病毒活性、及其相应的聚合物结合物或组合物的活性的方法也在美国专利6,656,906中描述。

另一种优选的肽基进入抑制剂为PRO-542，为将CD4受体的HIV-结合区域与人抗体分子组合的杂交融合蛋白。PRO-542通过结合于gp120从而预防病毒对宿主细胞的连接而抵消HIV。更具体地，PRO-542为具有如美国专利6,187,748所述的氨基酸序列的CD4-IgG2嵌合杂四聚体，所述专利的内容被特别地并入本文作为参考。更具体地，PRO-542由稠合于IgG2的轻链和重链恒定区的人CD4的N末端区域组成。PRO-542被认为是连接抑制剂，并且在病毒进入过程的极早期起作用。试验如合胞体抑制试验和用于测定这种杂交融合蛋白的抗病毒性质的方法在美国专利6,187,748中描述，并且可由本领域技术人员采用，以类似地测定相应的聚合物结合物或组合物的抗病毒活性。发明的优选实施方案为其中水溶性聚合物如PEG通过以下更具体描述的可降解共价键合而共价连接于PRO-542或本文所述的其它抑制剂中的任一种的那些。

用于本发明的肽基进入抑制剂的另外的非限制性例子包括CCR5肽，包括其磺酸酯和非磺酸酯形式，如PRO 140、和PRO 367。硫酸化CCR5肽在美国专利申请公开2003/0139571中描述。

PRO 140(以前称为PA14)为小鼠免疫球蛋白G1人源化单克隆抗体，其分类为CCR5共受体抑制剂。PRO 140、和抗-CCR5单克隆抗体结合于跨越CCR5上的多个胞外域的复合表位。其在不阻止CC-趋化因子信号的浓度下有力地抑制CCR5-介导的HIV-1进入到靶细胞即CD4+T细胞和巨噬细胞上(Trkola，A.等人，Journal of Virology，January 2001，Vol.75，No.2，579-588)。PRO 140的制备、分离、和纯化通常如Olson，W.C.等人的1999，J.Virol.，73：4145-4155中所述进行。单克隆抗体，PRO 140，也对应于Olsen等人在美国专利申请公开2004/0228869中所述的ATCC保藏号HB-12610。

适合用于本发明的另外的单克隆抗体包括如Olsen等人在美国专利申请公开2004/0228869中所述的命名为PA8(ATCC保藏号HB-12605)、PA9(ATCC保藏号HB-12606)、PA10(ATCC保藏号HB-12607)、PA11(ATCC保藏号HB-12608)、和PA12(ATCC保藏号HB-12609)的抗体。这些抗体包括结合于趋化因子受体5(CCR5)表位的互补性决定区域(CDR)。CCR5为趋化因子受体，其结合趋化因子的C-C组成员，并且其氨基酸序列包括在Genbank保藏号1705896中提供的氨基酸序列。本发明的表位包括存在于i)CCR5的N-末端、ii)CCR5的三个细胞外环状区域之一、或iii)(i)和(ii)的组合中的连续的氨基酸残基。

也可将至少保持一定程度的抗逆转录病毒活性的上述任一种的生物学活性片段、缺失变体、替代变体或加合变体用作本发明的EI。本发明的EI可重组生产或使用本领域公知的合成方法生产。

如有必要，可有利地将本发明的EI进行修饰，以包括一个或多个氨基酸残基，诸如例如，赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以提供聚合物对氨基酸侧链内原子的容易的连接。用于加合氨基酸残基的技术为本领域技术人员公知的。参见J.March的Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure，第四版。

肽基EI上的用于共价连接水溶性聚合物的优选位置包括N-末端或C-末端；赖氨酸的氨基；存在于酪氨酸、苏氨酸、或丝氨酸上的羟基；和半胱氨酸的巯基。

EI的制备

上述进入抑制剂的任一种都可以使用一种或多种本领域中公知的通常用于合成和制备多肽的以下合成方法制备。例如，EI可使用常规的逐步溶液或固相合成、片段缩合、F-MOC或T-BOC化学合成，如Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，William等人编著，1997，CRC Press，Boca Raton Fla，及其中引用的参考文献；和Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，Atherson &Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England；和Sheppard，R.C.等人，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，pp.165-166(1985))，使用例如得自Advanced Chemtech.，Louisville，Ky.的Advanced Chemtech model 200、得自Millipore，Bedford Mass.的Millipore 9050+、或其它可用的仪器。

或者，本发明的EI化合物可通过将cDNA编码序列结合在功能性病毒或循环质粒DNA载体中重组生产。然后使用载体或质粒用于转染或转化选择的微生物。将经转化或转染的微生物在有益于表达携带载体的DNA序列的条件下培养，然后从生长培养基分离所需的肽。参见例如美国专利5,955,422。可使用的载体包括得自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的包那些。例如，可使用质粒载体如pcDNA3、pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列的载体。噬菌体载体包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R和EMBL系列的噬菌体载体。可利用的粘粒载体包括但不限于pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、和pNNI。

也可使用的重组病毒载体包括得自疱疹病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、或杆状病毒的那些。

本发明的EI化合物也可使用本领域中公知的标准重组DNA技术制备，如在Sambrook等人的Molecular Clotting：A Laboratory Manual，第二版，((Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)或在Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology中所述的那些，其两者都被并入本文作为参考。制备T-1249和T-20的说明性方法在美国专利6,767,993、美国专利6,015,881(T-20)、美国专利6,258,782(T-1249)和美国专利6,348,568(T-1249)中描述。

在裂解和脱保护之后，多肽EI可通过例如离子交换色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、沉淀等纯化。或者，可采用正相或反相HPLC用于从较小片段纯化/分离出全长多肽。

进入抑制剂的氨基酸序列可以使用标准氨基酸分析、以及使用例如自动氨基酸序列分析仪(例如由Applied Biosystems制造的那些)进行手动或自动的Edman降解和各个氨基酸的测定进行证实和鉴定。适当的自动化序列分析仪包括Applied Biosystems 476A Protein Sequencer或the Procise 494 Protein Seuqencer。两种分析仪都使用标准气相或脉冲液体Edman降解化学作用。也可使用HPLC分析或质谱法证实给出的EI的同一性。

如Olsen，W.C.等人的J.of Virol.，May 1999，p.4145-4155，Vol.73，No.5和美国专利申请公开2004/0228869中所述制备人源化单克隆抗体如PRO 140、PA 8、PA 9、PA 10、PA 11或PA 12。简而言之，例如这些单克隆抗体可使用与人源化抗体生产用技术组合的标准杂交瘤技术从鼠科L1.2-CCR5⁺细胞制备(Wu，L.等人，Nature，384：179-183，1996)。描述如何生产人源化抗体的说明性的出版物包括美国专利4,816,567、美国专利5,225,539、美国专利5,585,089、美国专利5,693,761、和WO 90/07861。

PRO-542，CD4-IgG2嵌合杂四聚体，可使用在美国专利6,451,313中所述的技术和表达载体制备。

另外的进入抑制剂如硫酸化CCR4肽如美国专利申请公开2003/0139571中所述制备。

聚合物

如前所述，本发明的一个方面涉及EI如T-20或T-1249等(如上所述)与水溶性聚合物(在本文中通常简称为POLY)连接的结合物。对于水溶性聚合物，水溶性聚合物为非肽类的、无毒的、非天然存在的和生物相容的。如果在生命组织方面结合使用单独物质或该物质与另一种物质(如，活化剂如进入抑制剂)(如，对患者给药)产生的有益效果胜过由临床医师如医生评价的任何有害影响，则认为该物质为生物相容的。对于非免疫原性，如果某物质在体内的预定使用没有产生不期望的免疫反应(如，抗体形成)，或者如果产生了免疫反应但是这种反应不被临床医师评价为具有临床显著性或重要性，则认为该物质为非免疫原性的。特别优选的是本发明的水溶性聚合物既是生物相容的又是非免疫原性的。

这种聚合物的例子包括但不限于聚(烷撑二醇)如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等；聚(乙氧基化的多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯酰基吗啉)、和上述任意的组合。本发明的聚合物可为由前述聚合物的任何单体形成的均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、无规三聚体、或嵌段三聚体。优选地，聚合物为如聚乙二醇的共聚物，或者，更优选地，为其均聚物。虽然本文中的大部分讨论集中在将PEG作为说明性的水溶性聚合物，但是本文提供的讨论和结构意在包括任何上述的水溶性聚合物。更具体地，对于表示作为水溶性聚合物的“PEG”的示例性结构和图，术语“PEG”还指被本文中所述的任何替代性水溶性聚合物代替，使得本文中提供的结构和图明确地延伸到这种替代性的水溶性聚合物。

在结合于EI之前，聚合物本身通常表征为具有2到约300个末端，更优选地，具有约2到约25个末端，更优选地，具有2、3、4、5、6、7、8、9、或10个末端。

聚合物不限于具体的结构，并且可为线型(如，封端PEG或线型双官能PEG)、支化或多臂型。通常，在与EI结合之前，用适合于偶联到EI上所需位置的适当的活化基团将PEG和其它水溶性聚合物活化。代表性的聚合物试剂和用于将这些聚合物结合于活性部分的方法为本领域中已知的，并且进一步在Zalipsky，S.等人的″Use of FunctionalizedPoly(Etlaylene Glycols)for Modification of Polypeptides″in PolyethyleneGlycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992)中；在Zalipsky(1995)Advanced DrugReviews 16：157-182中；在Roberts，M.等人的″Chemistry for Peptide andProten PEGylation″，Advanced Drug Delivery Reviews 54(2002)：459-476中；和在″Nektar Advanced PEGylation：Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced PEGylation″，Catalog 2004中描述。

通常，结合物中的非肽水溶性聚合物的重均分子量为约100道尔顿到约150,000道尔顿。然而，示例性的范围包括约500道尔顿到约100,000道尔顿、约2,000道尔顿到约90,000道尔顿、约5,000道尔顿到约85,000道尔顿、约10,000道尔顿到约50,000道尔顿、或约15,000道尔顿到约40,000道尔顿的重均分子量。

当通过可水解键合共价连接于EI时，优选更高分子量的聚合物，如，分子量大于约20,000道尔顿或更高、或30,000道尔顿或更高、或40,000道尔顿或更高、或50,000道尔顿或更高。在一个实施方案中，优选使用高分子量和/或支化的可降解聚合物，因为由于对多肽基EI的空间限制，有可能只将一个或两个高分子聚合物分子连接于EI。这样，有利于形成可水解的单聚合物结合物(即，只有一个聚合物分子共价连接于EI)或二聚合物结合物。这可有利地得到较高的收率，以及更洁净的结合物合成和随后的分离、纯化、和表征，由于没有形成多种结合物物质，虽然不同的PEG-基体(其中活化剂共价结合有1-、2-、3-或更多个聚合物链的结合物)可如以下更具体描述是可分离的。此外，当考虑结合物在体内的作用时，单聚合物结合物的水解特别有利，因为只涉及单一的水解反应，即，有效水解以释放EI和聚合物，其与其中聚合物或药物的释放伴随有多个水解步骤所涉及的动力学和中间体物质的聚合物对EI上的多个活性部位或者多个EI药物共价连接于多臂型聚合物的可降解的共价连接相反。虽然使用可降解的更大分子量的聚合物可以在某些情况中提供优于替代性的结合物结构或结构的某些优点，但并不是说替代性的实施方案如使用单个或多个结合于EI的较小聚合物，或如本文中描述的其它另外的实施方案，没有各自的有关优点，如本文以下更详细描述的。

水溶性聚合物片段的示例性重均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约5,000道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、和约75,000道尔顿。也可使用具有上述任何的总分子量的水溶性聚合物的支链或其它多臂型形式(如，具有两个20,000道尔顿聚合物“臂”的支化的40,000道尔顿的水溶性聚合物)。

在其中聚合物为PEG的情况中，PEG通常包括许多(OCH₂CH₂)单体。如贯穿说明书中所用的，重复单元数目由“(OCH₂C2)n”中的下标“n”确定。因此，n的值通常落入一个或多个以下范围：2到约3400、约100到约2,300、约100到约2,270、约136到约2,050、约225到约1,930、约450到约1,930、约1,200到约1,930、约568到约2727、约660到约2730、约795到约2730、约909到约2730、和约1,200到约1,900。对于其中分子量已知的任何给定聚合物，有可能通过用聚合物的总分子量除以重复单元的分子量测定重复单元的数目(即，“n”)。

用于本发明的特别优选的聚合物为封端聚合物，即，具有至少一个末端被相对惰性的基团如C_1-6烷氧基或苄氧基封端的聚合物，虽然也可使用羟基。当聚合物为例如PEG时，在许多情况中优选使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，其为PEG的一种形式，通常为线型，其中聚合物的一个末端为甲氧基(-OCH₃)，而另一个末端为可以任选进行化学修饰的羟基或其它官能团，

mPEG的结构如下。

CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-，其中n的值如上所述。

或者，不是被封端，聚合物反应物(和相应的产物)可具有哑铃样或双官能的线型结构，使得得到的结合物为其中EI通过中心的线型POLY如PEG互相连接的那种。更具体地，在一个实施方案，这种结合物表示为结构EI-PEG-EI，其中EI可相同或不同。也就是，各个独立的EI选自：T-20、T-1249、PRO 542、PRO-140、PA 8、PA 9、PA 10、PA 11、PA 12、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、和GSK-140。优选地，本发明的结合物为其中聚合物POLY共价连接于选自T-20、T-1249、PRO-542和PRO-140的EI的那种。在其中联合治疗是有利的情况中，例如，当联合治疗用于预防HIV-抗药性时，或当存在协同效应时，包括共价连接于聚合物的两种不同的EI药物的结合物为优选实施方案。例如，T-20与PRO 542和PRO 140组合，其协同起作用以阻断健康细胞的感染(4^th Annual Fortis Bank BiotechnologyConference，London，May 4，2004)。因此，本发明这一方面的示例性实施方案包括具有T-20和PRO-542连接于相对的末端、或T-20和PRO-140连接于相对的末端、或PRO-542和PRO 140连接于相对的末端的哑铃聚合物结构，而第三种EI简单地与其共同给药。在又一个实施方案中，采用三臂型聚合物结构，三个EI药物各自共价连接于每个聚合物臂。在又一个实施方案中，本发明的结合物具有哑铃结构，T-20在一个聚合物末端，T-1249在在另一末端。在又一个实施方案中，线型双官能结合物具有结构EI-POLY-A，其中A在广义上表示适合连接于另一个部分的官能团。优选地，A为逆转录病毒药物，最优选地，为与EI协同起作用的抗HIV药物。

用于本发明的聚合物可具有2个臂、3个臂、4个臂、5个臂、6个臂、7个臂、8个臂、或更多个臂。多臂型聚合物可用于形成结合物，或者可用于形成水凝胶，并且可具有大约2到300个活性末端。

在本发明的一个实施方案中，优选具有2或3个聚合物臂的支化聚合物片段。如美国专利5,932,462中所述的说明性的支化POLY相当于以下结构：

在这种表现形式中，R″为非活性部分，如H、甲基或PEG，P和Q为非活性键合。在上述具体的支化结构中，支化聚合物片段具有从“C”分支点伸出的单个活性部位用于EI的定位，任选地通过可任选包括可降解键合的连接基。

在说明性的实施方案中，支化PEG聚合物片段为具有单个用于共价连接EI的连接位点的甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸。取决于EI上的连接位点，可将二取代赖氨酸的活性酯基进一步修饰或活化，以形成适合于与EI药物上的目标基团反应的官能团。

用于本发明的具有上述通用结构的支化PEG通常具有少于4个PEG臂，更优选地，具有2或3个PEG臂。这种支化PEG提供具有单个活性部位、以比它们的线型PEG对应物具有更大更密集的聚合物密度(cloud)偶联的优点。支化PEG-EI结合物的一个具体类型相当于以下结构：(MeO-PEG-)iG-，其中i等于2或3，G为具有适合连接EI的位点的赖氨酸或其它适当的氨基酸残基。

用于本发明的另外的支化PEG包括在国际专利申请公开WO2005/000360中描述的那些。例如，用于制备EI结合物的另外的支化聚合物具有以下结构：

其中POLY¹为水溶性聚合物；POLY²为水溶性聚合物；(a)为0、1、2或3；(b)为0、1、2或3；(e)为0、1、2或3；(f)为0、1、2或3；(g)为0、1、2或3；(h)为0、1、2或3；(i)为0、1、2或3；(j)为0到20；每个R¹独立地为H或选自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基和取代芳基的有机基；X¹，在存在时，为第一间隔基部分；X²，在存在时，为第二间隔基部分；X⁵，在存在时，为第五间隔基部分；X⁶，在存在时，为第六间隔基部分；X⁷，在存在时，为第七间隔基部分；X⁸，在存在时，为第八间隔基部分；R⁵为支化不过软那；和Z为用于连接EI的活性基团，任选地通过***间隔基进行连接。优选地，前述支化聚合物结构中的POLY¹和POLY²为相同的，即，具有相同的聚合物类型(结构)和分子量。

属于上述分类、适用于本发明的代表性的支化聚合物为：

其中(m)为2到4000，(f)为0到6，和(n)为0到20。

用于制备本发明的结合物或水凝胶的支化聚合物另外包括一般地由式R(POLY)y表示的那些，其中R为伸出至少两个POLY臂如PEG的中心或核心分子。变量y表示POLY臂的数目，其中每个聚合物臂可以独立地被封端或在其末端具有活性官能团。本发明这一实施方案的更清楚的结构为结构R(POLY-Z)y，其中各个Z独立地为封端基团，或活性基团，如适合与交联剂或与EI反应的活性基团。在其中当Z为活性基团的又一个实施方案中，在与例如交联剂或EI反应时，产生的键合可为水解稳定的，或者可为可降解，即，可水解的。通常，至少一个聚合物臂具有适合与EI反应的末端官能团。上述的支化PEG，如式R(PEG)y表示的那些，具有2个聚合物臂到约300个聚合物臂(即，y为2到约300)。优选地，这种支化PEG具有2到约25个聚合物臂，更优选2到约20个聚合物臂，更优选2到约15个聚合物臂，或3到约15个聚合物臂，或更少。最优选的是具有3、4、5、6、7或8个臂的多臂型聚合物。

上述支化PEG中优选的核心分子为多元醇，然后将其进一步官能化。这种多元醇包括具有1到10个碳原子和1到10个羟基的脂肪族多元醇，包括乙二醇、链烷二醇、烷基二醇、烷叉烷基二醇、烷基环烷烃二醇、1，5-十氢化萘二醇、4，8-双(羟甲基)三环癸烷、亚环烷基(cycloalkylidene)二醇、二羟基烷、三羟基烷、等等。也可采用环脂族多元醇，包括直链或闭环的糖和糖醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、白雀木醇、苏糖醇、阿糖醇、赤藓糖醇、福寿糖醇、半乳糖醇、岩藻糖(facose)、核糖、***糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、万寿菊糖(tagitose)、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖、等等。另外的脂肪族多元醇包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖的衍生物，和相关的立体异构体。可使用的其它核心多元醇包括冠醚、环糊精、糊精、和其它碳水化合物如淀粉和直链淀粉。优选的多元醇包括甘油、季戊四醇、山梨糖醇、和三羟甲基丙烷。

相当于本发明的多臂型聚合物结合物的代表性的多臂型结构显示如下，其中优选y为约3到约8，R的定义同上，L为将各个聚合物臂共价连接于EI的连接基，任选通过可水解键合连接。如以下在连接基部分中更详细描述的，虽然多种键合中的任一种都可以用于将聚合物或聚合物臂共价连接于EI，但是在某些情况中，优选键合为可降解的，在本文中称为L_D，即包含至少一个可在生理条件下水解的键或部分，如酯、可水解的氨基甲酸酯、碳酸酯、或其它这种基团。

RPOLY-L-EI)_y。

用于形成本发明的多臂型EI-结合物或水凝胶的另外的多臂型聚合物包括得自Nektar(Huntsville，Alabama)的多臂型PEG。用于本发明方法的优选的多臂型活化聚合物相当于以下结构，其中E表示适用于连接EI的活性基团。在一个实施方案中，优选E为-OH(用于与羧基或等价物反应)、羧酸或等价物、或碳酸(用于与EI-OH基团反应)、或氨基(用于与C末端反应)。

PEG为-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂-，m选自3、4、5、6、7和8。当然，相应的EI聚合物结合物产物具有不同之处在于活性基团E被“-L-EI”代替的以上所示的结构，其中L表示由E与EI上的活性基团反应形成的键合。如前所述，在某些实施方案中，优选的键合为酯、羧基和可水解的氨基甲酸酯，使得结合物的聚合物部分在体内水解以释放EI和聚合物。在这种情况中，连接基L命名为L_D。

或者，聚合物结合物可具有总的叉形结构。叉形PEG的例子相当于以下通用结构，其中第一个结构表示活化的叉形PEG，第二个结构表示叉形EI聚合物结合物：

其中PEG为本文中所述的任何PEG形式，E为适用于与EI共价结合的活性基团，A为连接基团，优选为水解稳定的键合如氧、硫、或-C(O)-NH-，F和F′为任选存在的水解稳定的间隔基，L定义同上。在优选实施方案中，连接基L包含至少一个可水解的官能团。在右面的结合物结构中，EI可相同或不同。如前述实施方案中，虽然没有明确地表示，但是也考虑了其中一个EI被另一种逆转录病毒药物或抗HIV药物代替的叉形结构。对应于A、F和F′的示例性的连接基和间隔基在美国专利6,362,254中描述，并且可用于形成本发明的聚合物结合物。F和F′为可相同或不同的间隔基。在上述的一个具体的实施方案中，PEG为mPEG，A相当于-C(O)-NH-，F和F′都是亚甲基或-CH₂-。这类聚合物片段可用于与两个活化剂反应，其中两个活化剂以精确的或预定的距离间隔定位，根据F和F′的选择而定。

在本文中提供的任何代表性结构中，可另外地在聚合物片段POLY中包含一个或多个可降解键合，以允许在体内产生具有比在最初给药的结合物中产生的更小的PEG链的结合物。适当的生理学可裂解的键合包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸盐、酰氧基烷基醚、缩醛和缩酮。当包含在给定的聚合物片段中时，优选这种键合在储存和当最初给药时为稳定的。

更具体地，如上所述，由可水解键合连接的两个或多个聚合物片段可由以下结构表示：PEG1-W-PEG2(其中PEG1和PEG2可相同或不同)，W表示弱的可水解键合。这些聚合物结构包含可在体内去掉(即，可裂解的)的PEG片段，如美国专利申请公开US 2002/0082345中具体公开的。

用于制备本发明的结合物的PEG聚合物可以包括沿着PEG的长度而不是在PEG链的端部共价连接的具有活性基团如羧基的侧基PEG分子。侧基活性基团可直接或通过间隔基部分如亚烷基连接于PEG。

用于制备本发明的结合物的具有线型或支化结构的另外的代表性PEG可购自Nektar Therapeutics(原来的Shearwater Corporation，Huntsville，Alabama)。说明性的结构在Nektar的2004目录中描述，其内容被特别地并入本文作为参考。

不仅可用作聚合物主链内的可降解键合，而且在本发明的情况中优选用于将聚合物共价连接于EI的水解可降解键合包括：碳酸酯；由例如胺和醛的反应产生的亚胺(参见例如，Ouchi等人(1997)PolymerPreprints，38(1)：582-3)；通过例如醇与磷酸基反应形成的磷酸酯；通过例如酰肼和醛的反应形成的腙；通过例如醛和醇反应形成的缩醛；通过例如甲酸酯和醇之间的的反应形成的原酸酯；和某些尿烷键合。

用于本发明的另外的PEG试剂包括可水解的PEG和连接基，如在国际专利申请公开WO 04/089280中描述的那些。在利用这种方法时，将本文中所述的EI内的一个或多个游离的官能团如氨基、羟基、巯基、磷酸酯和/或羧基用对温和的碱性条件敏感的基团如9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)衍生化，即共价连接于聚合物片段如PEG部分。在得到的结合物中，EI和聚合物各自共价连接于Fmoc或FMS支架(scaffold)结构的不同位置，并且能够在生理条件下释放。

聚合物结合物的这种任选的特征，即，将一个或多个可降解键合引入到聚合体链中，可提供对当结合物给药时最终的理想药理学性质的另外的控制。例如，可以给药大的和相对非活性的结合物(即，具有一个或多个高分子量PEG链连接于其上，例如分子量大于约10,000的一个或多个PEG链，其中结合物基本上没有活性或具有微不足道的生物活性)，其水解以产生具有一部分初始PEG链的生物活性EI结合物。或者，如果使用可降解键合将EI共价连接于聚合物，水解引起最初的EI离开聚合物片段，或者聚合物片段的水解留下具有短标签部分的被修饰的EI药物，其中被修饰的EI仍保留其HIV-进入抑制剂的性质。这样，可以更有效地调节结合物的性质，以平衡给药时的结合物的药理学性质。

本领域技术人员应该认识到，主要涉及基本上为水溶性聚合物片段的以上所述在任何意义上都不是详尽的，而只是说明性的，本发明考虑了具有上述性质的所有的聚合物材料。如本文中使用的，术语“聚合物试剂”泛指完整的分子，其可以包括水溶性聚合物片段和官能团。

键合和示例性的EI结合物

如上所述，本发明的结合物包括共价连接于EI的水溶性聚合物POLY。通常，对于任何已知的结合物，由一到约四个水溶性聚合物共价连接于EI，其中聚合物可具有本文中所述的任何形式。在优选实施方案中，EI具有共价连接于其上的1或2个聚合物。

将EI共价连接于聚合物的具体的键合取决于许多因素。这些因素包括例如缩采用的具体的键合化学、具体的EI、EI内用于共价连接的可用的官能团、EI内可能任选需要保护基的其它活性官能团的潜在存在、等等。

虽然不是必要地，但是本发明的结合物可为前药，其意思指聚合物和EI之间的键合为水解可降解的，以允许释放EI部分。这种键合可以通过用本领域中通常采用的偶联方法结合本申请的教导适当修饰肽基EI(如，蛋白质的羧基C末端或蛋白质内包含的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基)和/或聚合物试剂容易地制备。然而，最优选的是通过适当活化的聚合物与EI内包含的未被修饰的官能团的反应形成的可水解键合，任选通过***连接基。

或者，也可采用水解稳定的键合，如酰胺、尿烷(又名氨基甲酸酯)、胺、硫醚(又名硫化物)、或脲(又名碳酰二胺)键合作为用于连接EI的键合。优选的水解稳定的键合为酰胺。

结合物(与未结合的EI相反)可能具有或可能不具有可测量程度的逆转录病毒活性，取决于聚合物是否通过可降解的或水解稳定的连接基共价连接。也就是说，本发明的聚合物结合物无论何时将具有未被修饰的母体EI的从约0.1％到约100％或更高的抗HIV活性。优选地，具有很少活性或没有活性的结合物包含将聚合物连接于EI的可水解键合，使得尽管结合物没有活性，但是在水诱导可水解键合裂解时释放活性EI(或其衍生物)。

对于具有将EI与聚合物连接的水解稳定性键合的结合物，结合物通常具有可测量程度的抗病毒活性。例如，当在例如本领域中公知的适当的模型中测量时，这种聚合物结合物通常的特征为具有相对于未被修饰的母体EI为至少约2％、5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或更高的活性。优选地，具有水解稳定性键合(如，酰胺键)的结合物具有至少某种程度的未被修饰的母体EI的生物活性。

现在描述本发明的示例性的聚合物结合物。

有许多可用于与包含在EI内的活性氨基形成共价键合的适当的水溶性聚合物试剂的例子。具体的例子以及相应的结合物在以下表1中提供。在表中，变量(n)表示重复的单体单元的数目，“-NH-EI”表示结合于水溶性聚合物之后的EI，其中“NH-”表示EI上的氨基。虽然表1中的各个聚合物部分以“CH₃”基团结束，但是可以将其替换为其它基团(如H、乙基和苄基)。此外，虽然本文中的表格一般表示连接于EI药物的单个聚合物试剂，但是这只是用于说明性的目的。应该理解，给出的聚合物试剂可共价连接于EI上的多个位点，根据所采用的活性基团、合成策略、聚合物的大小、等等而定。为了简化起见，以下表中的说明性结构表示共价连接于EI上一个位点的一个聚合物试剂，虽然这种结构意在另外地包括所述聚合物试剂共价连接于超过一个的位点。

另外，如果如所示的为不可降解的，可将表1中的任何聚合物结合物进行修饰以形成包括以下可降解键合的结合物。例如，双官能间隔基，优选可脱离地(releasably)连接于EI的那种如氨基酸，共价连接于EI上的活性部位。优选地，双官能间隔基在一端为氨基，使得与表1中的示例性聚合物试剂的反应容易地得到促进。在双官能间隔基的另一端为例如在与存在于EI化合物上的一个或多个羟基反应时有效形成可水解酯的羧基，使得聚合物和间隔基在水解时裂解，引起母体EI药物的释放。

表1

胺选择性聚合物试剂及其各自的EI结合物

在本发明的一个优选实施方案中，提供具有以下结构的结合物，其中结合物为EI的前药：

其中POLY为本文中所述的水溶性聚合物，L为连接基团，Ar为芳基，NH-EI一起表示具有氨基的EI。这个具体结构具有可水解的氨基甲酸酯键，使得在水解时释放EI。优选地，在水解时释放母体EI、以及CO₂和相应的芳香醇。优选的芳族基团为邻、间、或对位取代的苯基。对于本发明的这一具体实施方案，优选的L基团为-O-和-NH-C(O)-。这种结合物的具体实施方案存在于上表1中。上述还包括具有通过同一键合连接于POLY末端的EI或其它抗HIV药物的哑铃型结构。属于上述通用结构的具体聚合物和结合物在美国专利6,413,507中描述，其内容被特别地并入本文作为参考。优选的聚合物试剂包括在美国专利6,413,507的实施例中描述的和在上述表1中表示的那些。

对于采用如上所述的那些氨基选择性试剂且其中可水解的结合物是理想的本发明的实施方案，采用具有可水解的间隔基可脱离地连接于其上的进入抑制剂化合物，例如由实施例11-15举例说明的。通常，这种策略包括以下合成步骤：1)采用常规的保护基化学，如Boc，最初保护任何EI伯胺，即赖氨酸，2)通过可降解键合如羧基为EI的酪氨酸、丝氨酸、或苏氨酸的羟基官能度附加适当的间隔基(如，甘氨酸、丙氨酸等)，3)将间隔基脱保护，和4)随后与胺选择性PEG试剂结合，和5)伯胺的最终脱保护。通常，根据本发明的优选实施方案，这种间隔基方法适合于修饰本文中所述的任何聚合物试剂，特别是表1中的那些，从而赋予其可释放的性质。

采用上面刚刚描述的类型的聚合物的凝胶制剂在以下章节中更具体地描述。

以下提供EI与同具体的可降解的氨基甲酸酯连接的PEG结合的另外的图示表示，其中PEG试剂包含对位取代的苯基环。例如，当EI为T-20时，说明性的PEG试剂可能连接于肽的一个或两个赖氨酸氨基。

虽然将mPEG表示为POLY部分，但是可利用本文中所述的任何POLY结构。在其中期望将水溶性聚合物连接于EI内所含的仅一个氨基的情况中，或者当在EI上存在超过一个活性氨基时，可以如本领域通常已知的那样采用保护/脱保护策略，或者采用分离/纯化技术以分离由随机PEG化方法产生的所需的结合物或结合物类型(如，单-PEG基体、二-PEG基体、三-PEG基体等)。

在本发明的结合物的一个优选实施方案中，当EI为T-20或T-1249、以及水溶性聚合物通过与醛封端的水溶性聚合物反应连接于N末端时，这种水溶性聚合物缺少内部酰胺基，更具体地，具有不同于以下结构类型的结构：PEG-O-(CH₂)m-C(O)-NH-(CH₂)p-CHO，其中m为约1-17，n为约10到1,000，p为约1到3。在其中优选使用醛封端的聚合物的情况中，示例性的聚合物为在标题为″Water-Soluble PolymerAlkanals″的共有的国际专利申请PCT/US03/28221中描述的那些，其内容被特别地并入本文作为参考。

用于将PEG与EI连接的反应条件随EI、所需的PEG化程度、和所采用的具体试剂而定。通常，聚合物试剂对EI的氨基的结合在室温下在pH约5到约9.5、优选pH约8到约9.5进行，反应时间为约30分钟到几小时。PEG试剂与蛋白质的优选的摩尔比为约1∶1到5∶1，或者10∶1，和甚至最高为100∶1。提高pH增加反应速率，而降低pH降低反应速率。选择性反应(如，在N-末端)可特别地通过与用酮或α-甲基支化醛官能化的聚合物反应和/或在具体的反应条件下(如，降低pH)进行。参见例如实施例1-3和6-15，其表示随机的和位置选择性的聚合物连接，以形成说明性的本发明的EI聚合物结合物和组合物。

羧基表示可充当EI上的连接点的另一种官能团。在结构上，该结合物包括以下结构：

其中EI和相邻的羰基相当于包含羧基的EI，X为键合，优选为选自O、N(H)、和S的杂原子，POLY为水溶性聚合物如PEG，其任选以封端部分结束。

C(O)-X键合由带有末端官能团的聚合物试剂和包含羧基的EI之间的反应产生。如上所述，具体的键合根据所采用的官能团类型而定。如果聚合物由羟基进行末端官能化或“活化”，则产生的键合为羧酸酯，并且X将是O。如果聚合物由硫羟基进行官能化，则产生的键合为硫代酸酯，并且X将是S。当采用某些多臂型、支化或叉形聚合物时，C(O)X部分，特别是X部分，可相对更加复杂，并且可包括更长的连接结构。

包含酰肼部分的水溶性聚合物也可用于在羧基处的结合。可通过连接包含羧基官能度的小型间隔基如氨基酸或通过羟基的氧化将这种基团引入到EI中。这种衍生物的例子包括具有以下结构的聚合物：

EI内包含的或引入的硫羟基可以充当连接水溶性聚合物的有效位置。特别是，在EI为肽或包括肽部分时，半胱氨酸残基提供硫羟基。然后这种半胱氨酸残基中的硫羟基可与对于与硫羟基的反应为特异性的活化PEG反应，如，N-马来酰亚胺基聚合物或其它衍生物，如美国专利5,739,208和6,602,498、和国际专利申请公开WO 01/62827中所述的。

具体的例子以及相应的结合物在以下表2中提供。在表中，变量(n)表示重复单体单元的数目，“-S-EI”表示结合于水溶性聚合物之后的EI。虽然表2中的各个聚合物部分以“CH₃”基团结束，但是可以将其替换为其它基团(如H、乙基和苄基)。

表2

硫羟基特异性的聚合物试剂及其各自的EI结合物

对于由带有一个或多个马来酰亚胺官能团的水溶性聚合物形成的结合物(无论马来酰亚胺是否与EI上的胺或硫羟基反应)，相应的水溶性聚合物的马来酰胺酸形式也可与EI反应。在某些条件下(如，pH约7-9和在水的存在下)，马来酰亚胺环“打开”形成相应的马来酰胺酸。马来酰胺酸又可与例如EI上的胺或硫羟基反应，如国际专利申请公开WO 04/060966中所述的。示例性的马来酰胺酸基反应如以下图解表示。POLY表示水溶性聚合物，EI表示进入抑制剂。

在又一个实施方案中，本发明的代表性的结合物具有以下结构：

POLY-L_0，1-C(O)Z-Y-S-S-EI

其中POLY为水溶性聚合物，L为任选的连接基，Z为选自O、NH、和S的杂原子，Y选自C_2-10烷基、C_2-10取代烷基、芳基、和取代芳基。可与EI反应并且形成这种类型的结合物的聚合物试剂在2004年1月6日提交的标题为“Thiol-Selective Water Soluble Polymer derivatives”的待决申请和相当于国际专利申请WO 04/063250的转让的美国专利申请10/753,047中描述。

对于聚合物试剂，本文和别处描述的那些可购自商业来源(如，Nektar Therapeutics，Huntsville AL)。另外，制备聚合物试剂的方法在文献中有所描述。

通常，虽然不是一定地，EI和聚合物试剂之间的键合包括一个或多个原子，如一个或多个碳、氮、硫、及其联合。例如，优选的水解稳定性键合包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、或二硫基。任选地，可由另外的原子将所述键合连接于聚合物试剂内的重复单体链。这也适用于其中键合为可降解的，即包括水解可降解部分的实施方案。通常，当被全面地考虑时，可降解键合包含将可降解部分本身连接于聚合物和/或EI的另外的原子或原子的组合。将EI连接于本文中指定为POLY的重复单体链的原子的具体系列包括选自以下的那些：-O-，-S-，-S-S-，-C(O)-，-O-C(O)-，-C(O)-O-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-C(S)-，-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-O-CH₂-，-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-C(O)-NH-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH₂-，-CH₂-C(O)-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-，-C(O)-O-CH₂-CH₂-，-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-NH-CH₂-，-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-CH₂-，-C(O)-CH₂-，-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-[CH₂]_0-6-(OCH₂CH₂)_0-2-，-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-，-O-C(O)-CH₂-，-O-C(O)-CH₂-CH₂-，和-O-C(O)-CH₂-CH₂-CH₂-.。另外，双官能连接基如氨基酸或双官能PEG低聚物可用于将EI连接于聚合物试剂。

结合物通常为组合物的一部分。组合物可包含单一类型的聚合物结合物，如单PEG-EI单体(即，只有一个PEG链共价连接于EI，虽然PEG可共价连接于EI内的不同位置，如，在序列内的不同氨基酸处连接)，或者组合物可包含多个结合物，优选地但不是一定地，各个结合物具有共价连接于一个EI的约1到约3个水溶性聚合物。

如上简述的，对于任何给出的EI，可以通过选择适当的聚合物试剂、聚合物试剂与EI的比、温度、pH条件、和结合反应的其它方面实现对所需聚合物数目的控制。另外，可以通过纯化实现不希望有的结合物(如，具有至少四个连接聚合物的那些结合物)的减少或消除。

另外的多臂型聚合物结合物

用于形成具有多个EI或其它抗HIV药物共价连接于其上的结合物的多臂型聚合物已经在本文中前面描述了。如果需要高剂量的EI以递送治疗有效量的如T-20或T-1249，则多臂型聚合物是特别有吸引力的。这样，将药物“加载”(优选可脱离地加载)到具有几个适于共价连接的活性部位的单个聚合物分子上。

用于实现最大EI加载的一个优选的多臂型聚合物类型为具有由中心核心分子(中心核心分子上共价连接有多肽片段)限定的内核区域和由亲水性聚合物片段(亲水性聚合物片段共价连接于各个多肽聚合物片段)限定的外部亲水区域的多臂型嵌段共聚物。因此，多臂型结构的各个臂是包括内部(即离中心核心分子更近或邻近)的多肽聚合物片段和外部(即离中心核心分子更远或远侧)的亲水性聚合物片段的嵌段共聚物。这种多臂型嵌段共聚物非常适于在内核区域内包封或包埋生物学活性分子。如本发明中使用的，“包封”或“包埋”意思是提将EI物理限制在共聚物的内核区域内，无论通过共价连接、电荷相互作用、金属-酸复合物、范德华力、或其它吸引力或键合力。这种单分子的多臂型嵌段共聚物通常具有约5,000Da到约120,000Da、优选约10,000Da到约100,000Da、更优选约20,000Da到约80,000Da的总的数均分子量。

优选外部亲水性聚合物片段为聚(乙二醇)，虽然也可使用其它亲水性聚合物片段。使用多肽聚合物片段作为单分子的多臂型结构的内核区域的一部分为设计和调整多臂型结构的药物递送性质提供了极大的灵活性。EI与单分子的多臂型结构的核心区域之间的相互作用可以大大地影响药物加载和药物释放特征。在本发明中，取决于多肽聚合物片段的结构，内核区域可为疏水性的、带电的、适合与药物分子共价连接、或其任何组合。

优选地，中心核心分子是具有至少三个带有胺基团的末端的聚胺的残基。优选使用聚胺核心是因为核心的胺基团容易地与氨基酸的羧酸基团反应以形成酰胺键合。然而，也可使用具有可用于与共聚物臂连接的其它官能团的核心分子。在采用聚胺核心的实施方案中，胺基团的数目将决定多臂型结构中共聚物臂的数目。优选地，聚胺包括3到约25个胺基团。在不同的实施方案中，聚胺包括至少约5个胺基团、至少约8个胺基团、或至少约10个胺基团。具有这类结构的多臂型聚合物在2003年12月24日提交的标题为“Multi-arm PolypeptidePoly(ethylene Glycol)Block Copolymers as Drug Delivery Vehicles”的共有专利申请中详细描述，其对应于国际专利申请公开WO/04060977，其内容被特别地并入本文作为参考。本发明这一方面的代表性的实施方案在实施例14.c中提供。

说明性的聚合物结构包括多臂型(3、4、5、6、7、8、9、10或12-臂)聚(苄基天冬氨酸)-PEG、聚(天冬氨酸)-PEG(其具有多个优选地但不是一定地通过可降解键合如酯和可水解的氨基甲酸酯共价连接于结构的多肽核心的EI)。或者，不是共价连接，而是EI可能被包埋在内核区域内。

以下提供表示EI的具体羟基对多臂型聚合物的共价连接的说明性图解。聚合物在EI内的一个羟基位置处的选择性连接通过在其末端具有活性基团如胺的间隔基分子实现。参见例如，实施例11-15。

更具体地，在本发明的这一实施方案中，将EI中的羟基如酪氨酸羟基用作选择性的点，用于通过在其游离的未偶联的终端具有例如活性氨基的间隔基连接和引入可水解键合(如碳酸酯或酯)。这种方法利用酪氨酸和丝氨酸羟基之间反应性的差异，从而实现在酪氨酸羟基处的位置选择性反应。在酪氨酸羟基处反应之前，将EI内的氨基使用本领域已知的任何适当的氨基保护基进行保护或封闭以避免偶联。以下图解中使用t-Boc仅是说明性的。在以下实施方案中，间隔基在距离EI较远处具有活性基团如胺，其适于结合于例如多臂型PEG或如上所述的具有内部疏水性区域和外部亲水性区域的共聚物PEG-基***。EI中另一个活性胺的保护允许选择性地引入从EI伸出的一个特别的氨基位置，并且此外，该方法提供用于将可降解共价键合引入到分子中的机制。然后其上共价连接有延长的连接基或间隔基的被修饰的EI共价连接于本文中所述的水溶性聚合物。该方法不同于本文中前述的那些，在于首先将“连接基”或“连接基前体”引入到EI中，优选以选择性的方式引入，以形成示例性的EI中间体(EI-O-C(O)-Z-间隔基-NH₂)，然后其适合连接于可为线型、支化、或多臂型聚合物。在这种结构中，EI-O-表示存在于EI内的羟基的残基。

在这一点上，可以常规方式将EI的单-氨基衍生物连接于例如多臂型聚合物中。在完成结合之后，使用已知的技术除去t-Boc基团。在上述图中，优选Z为O、NH、或CH₂，并且间隔基可为例如氨基酸或氨基酸的片段、或者为低聚PEG如双官能PEG或具有1到约20个单体亚单元(优选1-10个单体亚单元，更优选具有1、2、3、4、5、6、7、和9个亚单元)的聚合物连接基。

在稍有不同的方法中，当希望利用例如包含在谷氨酸或天冬氨酸氨基酸中的那些羧酸基团时，优选将所有的活性氨基和羟基保护起来。在-COOH基团与羟基封端的间隔基进行单结合以形成可水解的羧酸酯之后，以类似方式完成对多臂型PEG等的共价连接。诸如这些方法的合成方法可由本领域技术人员通过考虑本说明书的教导和本领域中通常可获得的知识来确定。该方法可以延伸到制备具有其它(如，可降解或不可降解的)键合的类似的多臂型结合物。

水凝胶

与前面所述的结合物或共价连接的EI组合物相对，本文中另外提供了其中EI不必要地共价连接于一种或多种聚合物组分的以凝胶形式存在的水凝胶-EI组合物。这种水凝胶可为交联的或未交联的，并且优选包含PEG-组分。在一个具体的实施方案中，水凝胶组分为未交联的，或者为略微交联的，以促进EI的释放。EI可以结合形式和/或未结合形式存在。

说明性的水凝胶具有如上所述的芳香族的可水解氨基甲酸酯片段。具体地，水凝胶由通过可水解的氨基甲酸酯键合与交联剂结合的聚合物组成。优选实施方案中的交联剂为具有下式的上述双官能聚合物：

其中POLY、POLY′、L、L′、X、X′、Ar和Ar′如前述定义。在优选实施方案中，交联剂为下式：

其中X和L如上所述。因此，具有多个氨基的聚合物与上述交联剂的交联说明如下：

其中锯齿形符号表示具有胺基团的聚合物，其中L如上所述。

显而易见，聚合物部分和交联剂之间的氨基甲酸酯键合为可水解的。因此，由于氨基甲酸酯键合的水解，该水凝胶在体内逐渐地分解或降解。

用于制备缓释递送EI组合物的另一种有利的水凝胶具有碳酸酯键合。更具体地，提供了由两个或多个低聚物组成的水溶性的非肽类聚合物，两个或多个低聚物由水解可降解的碳酸酯键合连接在一起，如共有的美国专利6,348,558中所述的，其内容被特别地并入本文作为参考。该聚合物可在水相环境如在体内水解降解为小的低聚物，并且可用于制备可降解的水凝胶。

代表性的这类聚合物由下式表示：

X-O-[(-CH₂CH₂-O-)n-CO₂-]m-(CH₂CH₂O)n-Y，其中n为约2到约2,000的整数，m为约2到约200的整数，并且其中X和Y各自独立地为H、烷基、烯基、芳基、或活性部分，并且可为相同的或不同的。在其中X或Y(或两者)与EI的官能团有反应性的情况中，则在本发明的又一个实施方案中，EI可任选地共价连接于其上。

在又一个实施方案中，用于制备EI组合物的水凝胶为2003年12月31日提交的标题为“Methods for the Formation of Hydrogels UsingThiosulfonate Compositions and Uses Thereof”的共有实用新型专利申请中所述的硫代磺酸酯(thiosulfonate)凝胶，该文献的内容作为参考被并入本文。

更具体地，根据本发明的这一实施方案，优选形成水凝胶的组分为多臂型硫代磺酸酯聚合物衍生物，其在暴露于碱下时形成交联的聚合物组合物而无需第二种交联剂、氧化还原催化剂、或辐射的存在。这种硫代磺酸酯聚合物衍生物也可通过与具有至少两个硫羟基的水溶性聚合物反应形成水凝胶。

通常，这种组合物包括下式所示的水凝胶形成组分：

其中POLY为水溶性聚合物，n为3到约100，X为连接基团，Y为衍生自具有至少三个亲核基团的部分，R为烷基或芳基。示例性的连接基团在文章中别处描述。聚合物可任选地包含至少一个可降解的键合，如酯、碳酸酯、缩醛、原酸酯、磷酸酯、或硫羟酸酯。一个或多个可降解键合的存在允许聚合物链伴随水凝胶的破坏和溶解而降解(如，通过水解或者酶促降解)。在优选实施方案中，特别是当EI为T-20或T-1249时，水凝胶或含有效形成水凝胶的组合物的聚合物为不表现出可逆胶凝性质的那种，即，在低于生理学温度下为液体，但是在生理学温度形成水凝胶。例如，这种水凝胶或水凝胶形成组合物通常由不同于Poloxomer 407^TM的聚合物组成。

本发明的水凝胶组合物可在使用之前被制备。形成的水凝胶组合物可任选经过脱水或冷冻干燥，以除去结合的水并且用作完整的水凝胶或缩小为粉末或微粒形式。本发明的水凝胶组合物也可不经脱水或冷冻干燥作为形成的物体使用，并且可被引入到包括但不限于以下的给药***中：眼嵌入物、栓剂、***栓、透皮贴片、或填充了水凝胶组合物的胶囊。

无论水凝胶形成组合物或水凝胶组合物的形式如何，都有可能将所述组合物包装在单次应用、多次应用、或散装容器中。可以任选地通过本领域公知的方法将制剂灭菌。在一个优选实施方案中，将所述物质包装在无菌的单次应用容器中。在其它实施方案中，将所述物质包装在单次或多次应用的容器中，以便于通过加入水、水溶液或悬浮液进行重新构建。在另一个实施方案中，所述物质作为与用于引起凝胶形成的碱的试剂盒形式被销售。

结合物的纯化

可将本发明的聚合物-EI结合物进行纯化，以得到/分离不同的结合物质。具体地，可以将产物混合物纯化以得到每EI平均具有一个、两个、或三个或过多个PEG。优选具有一个聚合物分子连接于其上的EI结合物。用于纯化最终的结合物反应混合物的策略根据许多因素而定，包括例如所采用的聚合物试剂的分子量、具体的EI、所需的剂量给药方案、和单独的结合物的残余活性和体内性质。

如果期望，可使用凝胶过滤色谱法和/或离子交换色谱法分离具有不同分子量的结合物。即，根据它们的不同分子量(其中差异基本上对应于水溶性聚合物部分的平均分子量)，将数目不同的聚合物对EI的比(如，1-基体、2-基体、3-基体等，其中“1-基体”表示一个聚合物连接于EI，“2-基团”表示两个聚合物连接于EI，等等)使用凝胶过滤色谱法分级。例如，在其中将100,000道尔顿的多肽随机地结合于分子量为约20,000道尔顿的聚合物试剂的示例性反应中，得到的反应混合物可以包含未被修饰的蛋白质(分子量约100,000道尔顿)、单PEG化的蛋白质(分子量约120,000道尔顿)、二PEG化的蛋白质(分子量约140,000道尔顿)、等等。

虽然这种方法可用于分离PEG-EI结合物和具有不同分子量的其它聚合物-EI结合物，但是该方法对于分离在EI内具有不同聚合物连接位点的位置异构体通常是无效的。例如，凝胶过滤色谱法可用于将PEG的1-基体、2-基体、3-基体等的混合物彼此分离，虽然每种回收的PEG-基体组合物可包含连接于不同活性氨基(如，赖氨酸残基)或EI的其它官能团的PEG。

适于进行这类分离的凝胶过滤柱包括Superdex^TM和Sephadex^TM柱，其得自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)。具体的柱的选择根据所需的理想分级范围而定。洗脱通常使用适当的缓冲液进行，如磷酸盐、乙酸盐等。收集的级分可通过许多不同的方法进行分析，例如(i)在280nm的光密度(OD)用于分析蛋白质含量，(ii)牛血清白蛋白(BSA)蛋白质分析，(iii)碘试验用于分析PEG含量(Sims等人(1980)Anal.Biochem，107：60-63)，和(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，随后用碘化钡染色。

位置异构体的分离通过使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)的反相色谱法进行，和通过使用得自Amersham Biosciences的离子交换柱如Sepharose^TM离子交换柱的离子交换色谱法进行。任一种方法都可用于分离具有相同分子量的聚合物-活化剂异构体(位置异构体)。

优选得到的纯的组合物基本上不含无抗逆转录病毒活性的蛋白质。另外，优选该组合物基本上不含所有其它的非共价连接的水溶性聚合物。

活性的评价

本发明的结合物和组合物的抗病毒活性可使用适当的体内和体外模型进行测定，根据所采用的具体EI的已知活性而定。用于测定本发明的EI结合物或组合物的抗病毒活性的方法包括细胞融合试验、无细胞的病毒感染试验、逆转录酶试验、等等，都是抗逆转录病毒活性的适当的指标。用于测定本文中所述的任一种T-20或T-20相关序列、或相应的聚合物结合物或组合物的活性的方法在美国专利5,464,933中描述。另外，适合于测定抗病毒活性的体内试验在实施例16中描述。作为比较用标准，T-1249本身的IC50为0.003μg/ml；其IC90为0.023μg/ml。另外，当作为90mg的单次皮下剂量给药时(N＝12)，T-20表现出3.8±0.6h的平均消除半衰期，和24.8±4.1mL/h/kg的平均±SD表观清除率(Fuzeon^TM的包装说明书)。抗-CCR5鼠源单克隆抗体PA8、PA9、PA10、PA11、PA12、和PA 14(PRO 140)的结合物或组合物的抗病毒活性使用例如在Olson，W.等人的J.of Virology，May 1999，73(5)，4145-4155中描述的gp120-sCD4结合试验和RET试验(用于检测包膜介导的膜融合和HIV-1进入)进行评价，或通过如Trkola，A.等人的J.ofVirology，2001，75(2)，579-588中所述方法通过评价在PBMC培养物或在巨噬细胞培养物中的HIV-1复制的抑制进行评价。使用如美国专利申请公开2003/0139571中所述的用于检测复合肽结合的固相ELISA评价硫酸化CCR5肽的聚合物结合物和组合物的抗病毒活性。使用例如ELISA方法评价单体gp120的结合亲合力、和/或使用无病毒的合胞体试验检查HIV-1包膜介导的合胞体形成的抑制、和/或使用适应实验室的菌株和HIV-1的初次分离物的中和试验(如美国专利6,451,313中提供的)检查CD4-IgG2嵌合体的聚合物结合物和组合物的抗病毒活性。

药物组合物

任选地，本发明的组合物可另外包括一种或多种可药用的赋形剂，以提供药物组合物。示例性的赋形剂包括但不限于碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、及其组合。适合于可注射组合物的赋形剂包括水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷脂、和表面活性剂。

可存在碳水化合物如糖、衍生化的糖如醛醇、醛糖糖酸、酯化的糖、和/或糖聚合物作为赋形剂。具体的碳水化合物赋形剂包括例如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、等；和醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。

赋形剂也可包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、及其组合。

组合物也可包括抗微生物剂用于预防或阻止微生物生长。适合本发明的抗微生物剂的非限制性例子包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、十六烷基氯化吡啶鎓、氯丁醇、酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞、及其组合。

也可在组合物中存在抗氧化剂。抗氧化剂用于防止氧化，从而防止结合物或制剂的其它组分变质。用于本发明的适当的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、及其组合。

也可存在表面活性剂作为赋形剂。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，如“Tween 20”和“Tween 80”、和pluronics如F68和F88(其两者都得自BASF，Mount Olive，New Jersey)；山梨糖醇酐酯；脂质，如磷脂如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(虽然优选不是脂质体体(liposomal)形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；甾族化合物，如胆固醇；和螯合剂，如EDTA、锌和其它这种适当的阳离子。

可存在酸或碱作为组合物中的赋形剂。可使用的酸的非限制性例子包括选自盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸、及其组合的酸。适当的碱的例子包括但不限于选自氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾、及其组合的碱。

组合物中结合物(即，在EI和聚合物试剂之间形成的结合物)的量根据多种作用剂而定，但是当将组合物储存在单位剂量容器(如，小瓶)中时，其最好处在治疗有效剂量。另外，可以将药物制剂容纳在注射器中。治疗有效剂量可通过增加结合物或组合物的量的重复给药以测定产生临床所需目标的量的实验方法测定。

组合物中任何单独的赋形剂的量根据赋形剂的活性和对组合物的具体需要而定。通常，任何单独的赋形剂的最佳量通过常规试验测定，即，通过制备包含不同量(从低到高)的赋形剂的组合物、检查稳定性和其它参数、然后确定获得最佳性能而没有显著副作用的范围。

然而，通常，赋形剂以约1重量％到约99重量％、优选约5重量％到约98重量％、更优选约15到约95重量％的量存在于组合物中，最优选低于30重量％的浓度。

这些前述的药用赋形剂以及其它赋形剂在“Remington：TheScience & Practice of Pharmacy”，第19版，Williams & Williams，(1995)；the″Physician′s Desk Reference″，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)；和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第三版，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中描述。

组合物包括所有类型的制剂，特别是适合于注射的那些制剂，如可以构新构建的粉末或冻干物、以及液体。用于在注射之前重新构建固体组合物的适当的稀释剂的例子包括抑菌的注射用水、含5％右旋糖的水、磷酸盐缓冲水、林格溶液、盐水、无菌水、去离子水、及其组合。对于液体药物组合物，考虑了溶液和悬浮液。

优选地，本发明中所述的EI组合物为单位剂型，意思指为预定的或预包装的形式的适合于单次剂量给药的量的本发明的结合物或组合物。

给药

本发明的组合物通常但并非必要地通过注射给药，因此在即将给药前通常为液体溶液或悬浮液。药物制剂也可为其它形式，如糖浆、乳剂、膏剂、片剂、粉末、等等。其它给药方式还包括例如肺、直肠、透皮、经粘膜、经口、鞘内、皮下、动脉内、等等。

本发明还提供将本文提供的结合物对患有对使用结合物的治疗有反应的状况的患者给药的方法。该方法包括给药(通常通过注射)治疗有效量的结合物(优选作为药物组合物的一部分提供)。如前所述，结合物可以通过静脉注射以非肠道方式注射给药，或者次之优选通过肌肉内或皮下注射。用于非肠道给药的适当的制剂类型包括即用型(ready-for-)注射溶液、用于在使用之前与溶剂组合的干粉、备用于注射的悬浮液、用于在使用之前与介质组合的干燥不溶性组合物、和用于在给药之前稀释的乳剂和液体浓缩物、和其它。

该给药方法可用于治疗可通过给药EI结合物进行治疗或预防的任何状况。本领域技术人员应该知道具体的结合物可以有效进行治疗的状况。例如，结合物可用于治疗感染HIV的个体。给药的实际剂量将根据主体的年龄、体重、和一般状况、以及待治状况的严重程度、保健专业人员的判断和给药的结合物而定。治疗有效量可由本领域技术人员确定并可根据各个具体情况的具体需要进行调节。通常，治疗有效量为约0.001mg到300mg的EI，优选为0.01mg/每天两次到200mg/每天两次的剂量，优选约0.01mg/天到200mg/天的剂量，更优选0.10mg/天到100mg/天的剂量。

任何给出的结合物的单元剂量(同样，优选作为药物制剂的一部分提供)可根据临床医师的判断、患者的需要等按照不同的剂量给药时间表给药。具体的剂量给药时间表为本领域技术人员已知的，或者可以使用常规方法用实验方法测定。示例性的剂量给药时间表包括但不限于每天给药五次、每天给药四次、每天给药三次、每天给药两次、每天给药一次、每周给药三次、每周给药两次、每周给药一次、每月给药一次、或其任何组合。优选的结合物和组合物是需要比每天一次给药的频率更低的频率给药的那些。即，优选地，本发明的组合物每天给药两次、每天给药一次、每隔一天给药一次、每周给药两次、每周给药一次、每两周给药一次、或每月给药一次。更优选的是不比每周一次更频繁给药的结合物和组合物，更优选不比每月两次(每两周一次)更频繁给药的那些。

给药本发明的某些结合物的一个优点在于包括完整的聚合物的单独的水溶性聚合物部分可以裂开。这种结果当由于聚合物的大小而使从身体的清除是潜在问题时是有利的。最佳地，每个水溶性聚合物部分的裂解通过使用生理学可裂解的和/或酶促可降解的键合如安氨基甲酸酯、碳酸酯或者含酯的键合而变得受到促进。这样，可以通过选择聚合物分子的大小和类型、提供所需的清除性质的官能团而调整结合物的清除(经由单独的水溶性聚合物部分的裂解)。本领域技术人员可以确定聚合物的最佳分子大小以及可裂解的官能团。例如可以通过制备具有不同聚合物重量和可裂解官能团的多种聚合物衍生物然后进行如本文中所述的体外或体内试验以评价效力，从而确定优选的聚合物分子大小、结构、和/或可裂解的官能团。或者，可使用适当的体内模型得到清除图形(如，通过周期性地采血样或采尿样)。

本发明的EI结合物和组合物可在通常被称为联合治疗的方法中与一种或多种其它抗病毒药物或抗逆转录病毒药物共同给药。可存在于本发明的组合物中的或可以共同给药的其它抗病毒药包括DP107、rIFNα、rIFNβ、rIFNγ、AZT、3TC、d4T、ddI、阿德福韦、阿巴卡韦、甲磺酸delaviridine、奈维拉平、依发韦仑、病毒唑、利托那韦、甲磺酸奈非那韦、安普那韦、沙奎那韦、茚地那韦、ABT538、两性霉素B、和栗精胺、或任何的本文中所述的EI。

应该理解，虽然已经结合优选的具体实施方案描述了本发明，但是上述说明及以下实施例意在用于说明目的，而不是用于限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和变体对于本发明所属领域的技术人员来说是显而易见的。

本文中引用的所有的文章、书记、专利和其它出版物都被全文并入本文作为参考。

缩写

EI           进入抑制剂

AIDS         获得性免疫缺乏综合症

HIV          人类免疫缺陷性病毒

NRTT         核苷类逆转录酶抑制剂

PI           蛋白酶抑制剂

NNRTI        非核苷类逆转录酶抑制剂

AZT          叠氮胸苷(也称为齐多夫定或3′-

             叠氮基-3′-脱氧胸苷)

PEG          聚乙二醇

trt          三苯甲基

Boc          叔丁氧羰基

PBS          磷酸盐缓冲盐水

Troc         氨基甲酸-2，2，2-三氯乙基酯

Teoc         氨基甲酸-2-三甲基甲硅烷基乙

             基酯

TEA          三乙胺

DMAP         4-二甲氨基吡啶

DIC          1，3-二异丙基碳二亚胺

DCC          环己基碳二亚胺

DCM          二氯甲烷

TFA          三氟乙酸

PTSA         对甲苯磺酸

4-臂PEG-SCM

PG         聚谷氨酸

IPA        异丙醇

实施例

材料

除非另有陈述，在随后的实施例中涉及的所有化学试剂都是市售的，或者可根据本领域中可获得的信息制备。

除非另有陈述，在随后的实施例中涉及的所有的PEG试剂都得自Nektar，Huntsville，AL。所有的¹H NMR数据都由Bruker生产的300或400MHz的核磁共振波谱仪生成。

实施例1

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯20kDa(MPEG-SBC 20kDa)在水相反应中的PEG化

将得自Nektar Therapeutics(Huntsville，Alabama)的在氩气下在-20℃下储存的mPEG-SBC 20kDa回温到环境温度。反应在室温下进行。将计算量的经回温的mPEG-SBC 20kDa(414mg，以得到基于绝对肽含量为8倍摩尔过量的mPEG-SBC 20kDa)称重到含磁力搅拌棒的5mL玻璃小瓶中。加入4.5mg/mL的T1249肽溶液(N-末端被乙酰化；C-末端用酰胺基修饰，在磷酸盐缓冲盐水PBS pH 7.4中制备)的2.0mL小份并补充另外的PBS使体积达到4.5mL。使用磁力搅拌器以最大速度搅拌混合物，直到PEG完全溶解。将搅拌速度降低到50％，并将反应进行2.5小时，得到结合物溶液。反应结束时结合物溶液的pH为6.1，用0.1M HCl使其pH进一步降低到5.5。

将该结合物溶液通过SDS-PAGE(图1，第4泳道)和RP-HPLC(C18)进行分析。如图1所示，水相反应没有进行完全，因为还可见游离的肽、单-、二-、和三-PEG化的物质。

实施例2

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯20kDa在DMSO反应混合物中的PEG化

将在-20℃储存的mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯(20kDa)回温到环境温度。反应在室温下进行。使用三个不同摩尔比(1∶1、1∶2、和1∶4的肽∶mPEG-SBC 20kDa)。将计算量的经回温的mPEG-SBC 20kDa(对于1∶1、1∶2和1∶4的比例分别为29mg、58mg、和116mg)称重到上述实施例1中的玻璃小瓶中。在各个小瓶中将PEG-SBC 20kDa溶解(通过搅拌)在1mL的DMSO中，然后加入也溶于DMSO中的5mg/mL T1249肽溶液的1mL小份。使反应继续进行3小时，产生结合物溶液。

将该结合物溶液通过SDS-PAGE(图1，第3泳道，4∶1摩尔比)和RP-HPLC进行分析。从图1第3泳道可以看出，结合反应完全，因为没有游离的肽剩余，并且可看见大部分是三-和更高的PEG基体(在66.3kDa标记物以上)。

实施例3

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯20kDa在1∶1的水/DMSO反应混合物中的PEG化

将在氩气下在-20℃储存的mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯(20kDa)回温到环境温度。反应如上述实施例2中所述在室温下进行，不同之处在于将肽溶解于1X PBS中。

为了总结在以上实施例1-3中所述的实验，使用1∶1、2∶1和4∶1的摩尔比进行反应，使用水相/DMSO混合反应条件(实施例3)和纯的DMSO反应条件(实施例2)；两种方法的结果相似。典型的结果如图2中所示。以1∶1比(第3泳道)得到收率最高的单PEG化的肽，其中＞50％的产物为单PEG化的。在图2中，在所示的三-PEG化的物质上方可见四-PEG化的结合物的痕迹。

图3说明得自实施例3的摩尔比为1∶1的结合物混合物的HPLC色谱图。曲线下面积的计算显示在任何的另外纯化之前为51％收率的单-PEG化的T1249、17％收率的二-和三-PEG化的T1249和32％收率的游离肽。注射的样品为1∶1摩尔比的水/DMSO反应混合物，并且表现出类似于图2中第3泳道中所见的肽和产物分布。

实施例4

结合物混合物的分析

通过SDS PAGE分析在实施例1、2和3中制备的结合物溶液。

SDS-PAGE

使用MES缓冲液在4-12％Novex双-Tris凝胶(Invitrogen)上拆分肽和结合物。电泳运行时间为35分钟。使用Simply Blue凝胶染色(Invitrogen)根据生产商的说明书将凝胶染色。在所有的凝胶上使用蛋白质标准品MARK 12(Invitrogen)。

实施例5

示例性的PEG-EI结合物混合物的纯化

对得自实施例3(混合的水相/DMSO反应液，1∶1摩尔比)的结合物组合物进行另外的纯化。

A.阴离子交换色谱法

使用5ml的Q-HP柱(Pharmacia)纯化得自实施例3的T1249的PEG化形式。使用两种缓冲液用于纯化：缓冲液A为20mM MES(pH 6.0)，缓冲液B为20mM MES(pH 6.0)和0.5M NaCl。使用Akta Purifier(Pharmacia)进行纯化。将5ml的Q-HP柱(Pharmacia)在14％B(在所有情况中，缓冲液A等于100-％B)中平衡。样品被注射并通过泵送5个柱体积的14％B通过柱而将未结合的级分洗脱。通过增加缓冲液B含量到17％(5个柱体积)从柱洗脱包含至少两个PEG部分的PEG化的T1249(“高-基体(himer)”)。通过提高缓冲液B含量到45％(5个柱体积)洗脱单PEG化的形式。最后将缓冲液B含量提高到70％(5个柱体积)以洗脱未PEG化的T1249。收集级分并通过SDS PAGE进行分析。

单PEG化的收集物的SDS PAGE如图4中所示。在收集的物质中有极低量(＜10％)的二-和三-PEG化的物质。

进行其它的纯化以除去其余的二-和三-PEG化的物质。

B.AMICON浓缩

收集包含单-PEG化的T1249的色谱级分并使其通过Amicon过滤浓缩(YM 10膜，10,000MWCO)(Millipore)。

C.HPLC方法

将Zorbax 80A Extend-C18柱(Agilent)4.6×250mm与Agilent1100HPLC一起使用流动相A为含0.1％TFA的Milli-Q水，流动相B为含0.1％TFA的乙腈。柱维持在58℃的温度。时间表如下：

时间，分钟	％A	％B
			0	55	45
4	55	45
			24	45	55
25	0	100
			26	0	100
27	55	45

该方法包括4分钟的柱后时间。

在所述条件下，游离的T1249肽具有4.5±0.1分钟的保留时间。游离的PEG具有18.0±0.1分钟的保留时间。纯化的单-PEG化的制剂表现出在19.8和20.6分钟处的两个主峰。这两个峰大概相应于单-PEG化的物质的两种位置异构体。二-和三-PEG化的物质分别在21.6和22.6分钟的保留时间作为两个峰洗脱。

D.单PEG化的T1249的降解

将单PEG化的T1249样品(450μl)与1/10体积(50μl)的10X PBS合并。将pH提高到7.4并将样品在37℃培养过夜。样品通过HPLC进行分析。

HPLC分析证实结合物样品的体外水解。图5中提供说明模型肽-SPC单-PEG结合物在体外(即，在pH 7.4的PBS中和37℃下)的水解图形。从该图中可以看出，随着单-PEG结合物水解，通过HPLC分析测定到游离肽的出现。在384小时(即，16天)，约50％的结合物水解释放游离的肽，显示本文中提供的代表性的结合物的缓释释放图。

在上述说明性例子中，看来好像4个赖氨酸中只有3个可容易地用于PEG化，在单独的DMSO中或混合反应物(水相/DMSO)中4∶1比的反应当反应完成时都主要得到三-PEG化的物质，虽然观察到痕量的四-PEG化的物质。T-1249上的两个赖氨酸(Lys 28和31)是仅有的两个相隔的氨基酸，并且在任一个上的PEG化都可能潜在地影响在另一个位置上的PEG化，例如由于位阻。

在采用的离子交换纯化方法中，至少3个单PEG化的峰有意地合并为一个峰。这些单独的峰代表着位置异构体，如果期望，可以通过制造肽图对其进行进一步的纯化和表征。

实施例6

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯30kDa(mPEG-SBC 30kDa)的PEG化

如上述实施例1-3所述使用不同的溶剂***(水相、DMSO、含水的DMSO)将T-1249进行PEG化，不同之处在于采用的PEG试剂具有30kDa的分子量。将得到的结合物混合物如上述实施例4和5中所述进行分析和进一步纯化。

实施例7

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯甲酰胺-碳酸酯40kDa(mPEG-SBC 40kDa)的PEG化

如上述实施例1-3所述使用不同的溶剂***(水相、DMSO、含水的DMSO)将T-1249进行PEG化，不同之处在于采用的PEG试剂具有40kDa的分子量。将得到的结合物混合物如上述实施例4和5中所述进行分析和进一步纯化。

实施例8

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯基-碳酸酯20kDa(mPEG SPC 20kDa)在水相反应中的PEG化

′SPC′聚合物试剂

将得自Nektar Therapeutics(Huntsville，Alabama)的在氩气下在-20℃储存的mPEG-SPC 20kDa回温到环境温度。反应在室温下进行。使用(基于绝对的肽含量的)绝对8倍摩尔过量的mPEG-SPC试剂。将PEG试剂称重到含磁力搅拌棒的5mL玻璃小瓶中。加入4.5mg/mL的T1249肽溶液(N-末端被乙酰化；C-末端用酰胺基修饰，在磷酸盐缓冲盐水PBSpH 7.4中制备)的2.0mL小份并补充另外的PBS使体积达到4.5mL。使用磁力搅拌器以最大速度搅拌混合物，直到PEG完全溶解。将搅拌速度降低到50％并使反应进行约2.5到3小时，以形成结合物产物。测量反应结束时结合物溶液的pH，并且根据需要通过加入0.1M的HCl进一步酸化，以使最终溶液的pH为约5.5。

然后通过SDS-PAGE和RP-HPLC(C18)对结合物溶液进行分析以测定反应程度(即，反应是否完成)。

使用得自Nektar Therapeutics，Huntsville，Alabama的(i)mPEG-SPC 30kDa、和(ii)mPEG-SPC 40kDa如上所述进行另外的反应。

实施例9

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯基-碳酸酯20kDa(mPEG SPC 20kDa)在DMSO反应混合物中的PEG化

将在氩气下在-20℃储存的mPEG-琥珀酰亚胺基苯基-碳酸酯(20kDa)回温到环境温度。反应在室温下进行。使用三个不同的摩尔比(1∶1、1∶2、和1∶4的肽∶mPEG-SPC 20kDa)。如上述实施例8中所述将相应的计算量的经回温的mPEG-SPC 20kDa(分别用于1∶1、1∶2和1∶4的比)称重到玻璃小瓶中。在各个小瓶中将PEG-SPC 20kDa溶解(通过搅拌)在1mL的DMSO中，然后加入也溶于DMSO中的5mg/mL T1249肽溶液的1mL小份。使反应继续进行约3-5小时，产生结合物溶液。

然后通过SDS-PAGE和RP-HPLC分析每个反应得到的结合物溶液，以测定反应程度。

实施例10

T1249与mPEG-琥珀酰亚胺基苯基-碳酸酯20kDa在1∶1的水/DMSO反应混合物中的PEG化

将在氩气下在-20℃储存的mPEG-琥珀酰亚胺基苯基-碳酸酯回温到环境温度。反应如上述实施例9中所述在室温下进行，不同之处在于将肽溶解于1X PBS中。

如上述实施例4和5中所述对得自实施例8-10的产物组合物进行另外的分析、纯化、和水解。

实施例11-15涉及以下提供的通用图解。在该方法中，经由连接基的连接将可降解的键合引入到最终的聚合物结构中，在这种情况下，经由可降解的酯键将示例性的氨基酸(甘氨酸)连接于肽药物。以下实施例描述用于产生本发明这一方面的进入抑制剂结合物的合成步骤。

说明性的反应图解：

关于T-1249而具体描述的上述反应图解适用于本文所述的其它进入抑制剂，使得上述图解中的名称“T-1249”可被通用术语“EI”(进入抑制剂)代替。

实施例11

T-1249伯胺基的最初保护

N^ε-Troc-T-1249：向搅拌的肽T-1249的水(30mL/g肽药物)和(THF，12mL/g肽)溶液中加入三乙胺(TEA，20eq)和2，2，2-三氯乙基琥珀酰亚胺基碳酸酯(Troc-OSu，20eq)。将混合物在室温下搅拌16小时。在将溶液用浓盐酸(HCl)酸化到pH 4-6之后，减压除去有机溶剂，并将水层冻干至干燥。然后将残余物在***中沉淀(300mL/g肽)。在将肽以12,000rpm离心5分钟之后将***倾析掉并将沉淀物用冷***洗涤(2×100mL/g肽)。或者，通过抽滤收集产物并用冷***洗涤(2×100mL/g肽)。基于最初的分析，根据需要进行另外的纯化，如，通过制备性HPLC进行。将药物产物N^ε-Troc-T-1249在真空中干燥过夜。通过质谱法(MS)表征并通过HPLC测定纯度。

N^ε-Teoc-T-1249：如以上关于N^ε-Troc-T-1249所述进行胺基团的保护，不同之处在于使用不同的保护基1-[(2-三甲基甲硅烷基)乙氧羰基氧基]吡咯烷-2，5-二酮(Teoc-OSu)。

实施例12

对胺保护的T-1249附加保护的氨基酸间隔基

在存在于T-1249主链中的三种不同的羟基(丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)中，预计丝氨酸的伯醇羟基表现出最高的反应性，虽然可以调节反应条件以有利于在其它的前述位置进行取代。

N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249：将N^ε-Troc-T-1249溶解于二氯甲烷(DCM，35mL/g肽)中并加入少量的二甲亚砜(DMSO，＜3mL/g肽)以增加肽的溶解性。加入N^α-叔丁氧羰基甘氨酸(N^α-Boc-甘氨酸-OH，1.2eq)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，1.2eq)并将反应在室温下搅拌约10分钟。加入1，3-二异丙基碳二亚胺(DIC，2eq)并使反应在室温下继续进行约16小时。将DCM溶液减压浓缩并将残余物用在冰浴中冷却的***沉淀(300mL/g肽)。在将肽以12,000rpm离心5分钟之后将有机相倾析掉并将沉淀物用冷***洗涤(2×80mL/g肽)。作为离心的替代法，可通过抽滤收集产物并用冷***洗涤(2×100mL/g药物)，随后任选另外通过制备性HPLC纯化，如基于对产物的分析而正当进行的。将肽产物N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249在真空中干燥过夜。通过质谱法(MS)进行表征，同时通过HPLC测定产品纯度。

实施例13

N^α-BOC-GLY-N^ε-TROC-T-1249中的间隔基的脱保护

A.Gly-N^ε-Troc-T-1249：将N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249溶解于DCM(30mL/g肽)并加入少量的DMSO(＜3mL/g肽)以增加肽的溶解性。加入无水的三氟乙酸(TFA，4mL/g肽)并将反应在室温下搅拌2小时。减压除去TFA/DCM溶剂并将残余物用***洗涤(2×80mL/g肽)并在其每次在***(300mL/g肽)中沉淀之前将其蒸发到干燥。在将肽以12,000rpm离心5分钟之后将有机相倾析掉并将沉淀物用冷***洗涤(2×100mL/g肽)。作为离心的替***法，通过抽滤收集产物并用冷***洗涤(2×100mL/g肽)。如有必要，可通过例如制备性HPLC进行另外的纯化。将产物Gly-N^ε-Troc-T-1249的TFA盐在真空中干燥过夜。通过质谱法(MS)进行表征并通过HPLC测定纯度。

B.Gly-N^ε-Troc-T-1249：将N^α-Boc-Gly-N^ε-Troc-T-1249溶解于THF(40mL/g)和DMSO(5mL/g肽)的混合物中。加入对甲苯磺酸(PTSA，1.0eq)的乙醇溶液(6mL/g药物)。将溶液置于旋转蒸发器上并除去溶剂混合物。将浴温升高到60-65℃并在该温度保持另外的20分钟。在冷却到室温后，将残余物在***中沉淀(300mL/g药物)。在将药物以12,000rpm离心5分钟之后将有机相倾析掉并将沉淀物用冷***洗涤(2×100mL/g药物)。作为离心的替***法，通过抽滤收集产物并用冷***洗涤(2×100mL/g药物)。任选进行另外的纯化，如，通过制备性HPLC进行。将产物Gly-N^ε-Troc-T-1249de PTSA盐在真空中干燥过夜。通过质谱法(MS)进行表征并通过HPLC测定纯度。

实施例14

Gly-N^ε-Troc-T-1249对示例性的PEG试剂的共价连接，以提供可降解的PEG-T-1249结合物

a.1)线型PEG结合物(CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249，其中“NH-Gly-”表示对甘氨酸氨基的共价连接)：将得自上述实施例13的Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DCM(30mL/g药物)并加入少量的DMSO(＜3mL/g药物)以增加药物的溶解性。加入三乙胺(TEA，10eq)并将反应溶液在室温下搅拌5分钟。加入含PEG_20kD-SCM(1eq)，CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂C(O)-琥珀酰亚胺)的DCM(10mL/g药物)并使反应在室温下进行约16小时。减压除去溶剂并将残余物通过加入***进行沉淀(300mL/g药物)。在抽滤和真空干燥过夜后，收集简称为PEG_20kD-Gly-N^ε-Troc-T-1249(其中确切的结构如上所述)的所需产物。

a.2)线型PEG结合物(CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：将得自上述实施例13的Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DCM(30mL/g药物)中并加入少量的DMSO(＜3mL/g药物)以增加药物溶解性。加入三乙胺(TEA，10eq)并将反应溶液在室温下搅拌5分钟。加入含PEG_30kD-SCM(1eq)，CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂C(O)-O-琥珀酰亚胺)的DCM(10mL/g药物)并使反应在室温下进行约16小时。减压除去溶剂并将残余物通过加入***(300mL/g药物)沉淀。在抽滤和真空干燥过夜之后收集简称为PEG_30kD-Gly-N^ε-Troc-T-1249(其中确切的结构如上所示)的所需产物。

a.3).线型PEG结合物，CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：将得到上述实施例13的Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DCM(30mL/g药物)并加入少量的DMSO(＜3mL/g药物)以增加药物溶解性。加入三乙胺(TEA，10eq)并将反应溶液在室温下搅拌5分钟。加入含PEG_30kD-SPA(1eq)、PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯，CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂C(O)-O-琥珀酰亚胺)的DCM(10mL/g药物)并使反应在室温下继续约16小时。减压除去溶剂并将残余物通过加入***沉淀(300mL/g药物)。在抽滤和真空干燥过夜之后，收集产物CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)。

a.4).线型PEG结合物，CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：将得自上述实施例13的Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DCM(30mL/g药物)中并加入少量的DMSO(＜3mL/g药物)，以增加药物溶解性。加入三乙胺(TEA，10eq)并将反应溶液在室温下搅拌5分钟。加入含PEG_20kD-SPA(1eq)、PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂CH₂C(O)-O-琥珀酰亚胺)的DCM(10mL/g药物)并使反应在室温下继续进行约16h。减压除去溶剂并将残余物通过加入***(300mL/g药物)沉淀。在抽滤和真空干燥过夜之后收集产物CH₃O-(CH₂CH₂O)_20kD-CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)。

a.5).线型PEG结合物，CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-CH₂-C(O)-NH-Gty-N^ε-Troc-T-1249)：将得自上述实施例13的Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DCM(30mL/g药物)并加入少量的DMSO(＜3mL/g药物)以增加药物的溶解性。加入三乙胺(TEA，10eq)并将反应溶液在室温下搅拌5分钟。加入含PEG_30kD-SBA(1eq)、PEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯、CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂C(O)-O-琥珀酰亚胺)的DCM(10mL/g药物)并使反应在室温下继续进行约16小时。减压除去溶剂并将残余物通过加入***(300mL/g药物)沉淀。在抽滤和真空干燥过夜之后收集产物CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH₂-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)。

a.6).线型PEG结合物，CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂-CH(CH₃)-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：将得自上述实施例13的Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DCM(30mL/g药物)并加入少量的DMSO(＜3mL/g药物)以增加药物的溶解性。加入三乙胺(TEA，10eq)并将反应溶液在室温下搅拌5分钟。加入含mPEG_30kD-SMB(1eq)、mPEG-琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯、CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH(CH₃)C(O)-O-琥珀酰亚胺)的DCM(10mL/g药物)并使反应在室温下继续进行约16小时。减压除去溶剂并将残余物通过加入***(300mL/g药物)沉淀。在抽滤和真空干燥过夜之后收集产物CH₃O-(CH₂CH₂O)_30kD-CH₂CH₂CH(CH₃)-C(O)-NH-Gly-N^ε-Troc-T-1249)。

b)多臂型PEG(4-臂-PEG_20k-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：

将4-臂-PEG_20k-SCM(参见上述缩写一节中的结构)溶解于无水二氯甲烷中。在单独的圆底烧瓶中，将Gly-N^ε-Troc-T-1249盐(1.0当量)溶解于DCM中并用TEA处理，在室温下搅拌5分钟。然后向4-臂-PEG_20k-SCM的二氯甲烷溶液中加入T-1249溶液并将反应在室温下搅拌约15小时。将产物4-臂-PEG_20k-Gly-N^ε-Troc-T-1249在***中沉淀并通过抽滤收集。肽药物加载的纯度和程度通过HPLC分析测定。

c)“核心连接”(核心连接-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：

术语“核心连接”对应于以下结构，为国际专利公开WO 04/060967中所述的4-臂PEG-PGA-PEG聚合物***，在本文中也称为4-臂-PEG2K-PG-PEG 10k(MW～47k)。

1.4-臂PEG-NH₂的合成：将4-臂-PEG(20g，MW＝2,000Da)(Nektar Therapeutics，Huntsville Alabama)在甲苯(100ml)中共沸脱水直到得到油状稠度。将粗油状物溶解于甲苯(100ml)以及三乙胺(12.9ml)中并搅拌五分钟。然后向溶液中加入甲磺酰氯(6.5ml)并将得到的溶液在室温下搅拌16小时。在加入乙醇之后，通过旋转蒸发除去溶剂并将PEG-甲磺酸盐干燥过夜。将氯化铵(每克PEG为6克)溶解于氢氧化铵(每克PEG为40ml)中，向其中加入PEG甲磺酸盐并将得到的溶液在室温下搅拌48小时。向溶液中加入氯化钠(10％溶液)然后用二氯甲烷提取。除去溶剂并将4-臂-PEG-NH₂在真空下干燥。产物收率为约85-90％。

2.Glu-NCA(BLG-NCA)的合成：将苄基-L-谷氨酸酯(BLG，1.0当量)溶解于四氢呋喃(10ml/克)以及三光气(1.2当量)中。将溶液在60℃下搅拌三小时。然后向溶液中加入己烷以使固体沉淀，然后将其过滤。将回收的沉淀物溶解于氯仿并再次用己烷沉淀。然后将沉淀物过滤并在真空下干燥。收率：90％。

3.PEG-PBLG的合成：将4-臂-PEG_2K-NH₂(700mg)在甲苯(50ml)中共沸脱水两次，然后在真空下干燥过夜。将4-臂-PEG_2K-NH₂(700mg)溶解于二甲基甲酰胺(7ml)中。然后将得自上述的BLG-NCA(3.68g)加入到溶液中。将溶液在氮气下搅拌三小时。然后从溶液除去样品并使其沉淀。产物通过混合-D和NMR方法表征，以确保核心的形成，随后用活化的PEG试剂PEG-SCM(CH₃O-(CH₂CH₂O)_10kD-CH₂C(O)-O-琥珀酰亚胺)进行聚合物的PEG化。将m-PEG10K-SCM(14g)溶解于另外包含二环己基碳二亚胺(335mg)和4-(二甲氨基)吡啶(20mg)的二氯甲烷中，向其中加入得自上述的BLG-NCA。将得到的溶液在室温下搅拌过夜。4.PEG-PBLG的脱苄基化以形成“核心连接”，4-臂-PEG_2K-PG-PEG_10k(MW～47k)

将PEG-PBLG(16g)溶解于乙酸(16ml)、去离子水(16ml)、和二甲基甲酰胺(80ml)。向该溶液中加入甲酸铵(16g)和钯/炭(1.6g)。将溶液在室温下搅拌48小时，随后过滤通过硅藻土垫以除去大部分的炭粒子。然后将溶液在水中透析，从溶液除去溶剂。在使用30,000MW过滤器进行超滤之后，从溶液除去未结合的PEG。然后将溶液以20,000RPM离心3小时，以除去其余的炭粒子。产物收率为45％到55％。

5.核心连接-Gly-N^ε-Troc-T-1249)：将4-臂-PEG_2K-PG-PEG_10k(MW～47k)溶解于DMF，在室温下向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺和DCC。将反应搅拌过夜。将Gly-N^ε-Troc-T-1249盐溶解于DMF并用TEA处理，然后将其加入到多-臂PEG试剂(″核心连接″)溶液。将反应在室温下搅拌约36小时，然后在***中沉淀。通过抽滤收集产生的固体产物。药物加载的纯度和程度通过HPLC分析测定。

实施例15

可降解的Gly-N^ε-Troc-T-1249PEG结合物的最终的脱保护

对于实施例14中的各个结合物(上述a.1到a.6到c)：在室温下将相应的PEGn-Gly-N^ε-Troc-T-1249溶解于乙酸-水-四氢呋喃(3∶1∶1)的混合物中并搅拌24小时。减压除去有机溶剂并通过冷冻干燥除去水。首先将得到的残余物在***中沉淀并进一步在甲醇(10mL/g药物)和IPA(30mL/g药物)中纯化。通过HPLC分析测定纯度和水解速率。

对于实施例14中的每个结合物(上述a.1到a.6到c)：将PEGn-Gly-N^ε-Teoc-T-1249溶解于THF(30mL/g药物)和磷酸二氢钾(1.0M，30mL)的混合物中。加入新鲜的锌粉(60eq)并将混合物在室温下搅拌24小时，然后将其用水(100mL/g药物)稀释。过滤Zn固体并用THF洗涤。减压除去有机溶剂并将水相用DCM提取(3×25mL/g)。将合并的有机相用冰冷的5％NaOH(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用MgSO₄干燥，并在减压下除去溶剂。首先将得到的残余物在***中沉淀并在甲醇(10mL/g药物)和IPA(30mL/g药物)中进一步纯化。通过HPLC分析测定纯度和水解速率。

实施例16

体外试验评价抗病毒活性

使用评分试验提供本发明的结合物/组合物的抗病毒活性指标，所述试验采用指示细胞系(MAGI(半乳糖苷酶指示剂的多核活化)、或表达CCR5的衍生物(cMAGI)对病毒感染滴度的降低进行评分。

MAGI细胞系通过引入CD4和HIV-1LTR-驱动的具有双嗜性逆转录病毒载体的β-gal报道基因的基因而衍生自亲代海拉细胞(如KimptonJ，Emerman M，J Virol，66：2232-9，1992中所述)。CMAGI细胞系通过使用双嗜性逆转录病毒载体PA317引入CCR5而衍生自MAGI细胞系(如Chackerian B等人，J Virol 71：3932-9，1997中所述)。cMAGI细胞支持原代NSI(R5)隔离物和实验室改造的X4病毒的复制，而MAGI细胞只支持X4病毒的复制。两个细胞系都利用HIV-1tat反式激活由HIV-LTR驱动的β-半乳糖苷酶报道基因表达的能力。将β-gal报道基因进行修饰以定位在原子核中，并且可以随着在感染的几天内的强烈的核染色而用X-gal底物检测到。如果在染色之前只有一轮感染，则被染色原子核的数目解释为等于攻击接种物中传染性病毒粒子的数目。

在感染24小时之后，加入感染和细胞-细胞融合的抑制剂如T-1249或T-20(Wild C等人，AIDS Res Hum Retroviruses，9：1051-3，1993)或者本文中所述的另一种EI，以允许读取单独一轮感染的读数。使用CCD-成像器计算被感染的细胞。在MAGI和cMAGI试验中，感染滴度的50％降低(Vn/No＝0.5)具有显著性，并且提供用于评价抗病毒活性的最初的截止值。将感染滴度的90％降低(Vn/No)用作评价抗病毒活性的另外的截止值。

将每个试验化合物的稀释物一式两份进行对抗病毒接种物的试验，调节病毒接种物以得到48孔微量滴定板的每个孔为约1500-2000个被感染细胞。向cMAGI或MAGI细胞加入试验化合物，随后加入病毒接种物，24小时后，加入感染和细胞-细胞融合的已知抑制剂(Wild C，等人，AIDS Res Hum Retroviruses 9：1051-3，1993)以预防第二轮的感染和细胞-细胞病毒传播。通常将细胞再培养2天，固定并用X-gal底物染色以检测被感染的细胞。然后用CCD-成像器测定每个对照和试验化合物稀释物的被感染细胞的数目，然后测定相应的IC50和IC90值，并与例如没有聚合物的进入抑制剂本身相比较。数值通常报告为μg/ml。IC50定义为引起病毒感染滴度50％降低的试验化合物的稀释物，IC90定义为引病毒滴度90％降低的试验化合物的稀释物。

实施例17

药代动力学

9只雄性Wistar大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，Del.)(n＝3/时间点)接受T1249或T-20的聚合物结合物/组合物(如本文中诸如实施例1、2、3、6、7、8、9、10和11-15中所述的)的单次皮下剂量给药。

将试验用mPEG结合物与生理盐水或5％葡萄糖注射液混合。用NaOH或HCl的稀溶液调节pH，以制备pH为约6.2-7.4和重量克分子渗透压浓度为约290mOsm/kg的药物溶液。采用的结合物的量为足够在最终制剂中提供每毫升为约50-250mg结合物的浓度。对大鼠剂量给药8mg活性成分/kg体重。

在剂量给药之后，在每个时间点从后眼窝采血约0.2到0.5ml。时间点为剂量给药后的0.5、1、3、6、8、16、24、32、48、72、96和120小时。将每个样品立即处理以收集血浆或血清并且在分析之前储存在-70℃下。通过使用允许通过吸光度检测(280nm)进行主要分析物和代谢物检测的反相方法的液相色谱或通过质谱法(单-或三-四极)分析每个样品。从使用加入结合物和EI本身的血清提取物作为校准用标准的图外推得到浓度。然后使用收集的结合物、释放的EI、可检测的代谢物、及其组合的血清浓度从浓度-时间图导出药代动力学参数。使用市售的药代动力学分析软件包如得自Pharsight Corporation，Mountain View，Calif.的WIN-NONLIN从非房室分析报告PK分析参数。

Claims (50)

1.结合物，其包括通过可降解的键合与水溶性聚合物共价连接的进入抑制剂。

2.权利要求1的结合物，其中所述可降解的键合是可水解的键合。

3.权利要求1的结合物，其中所述可水解的键合包括选自以下的部分：羧酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、硫代酸酯、硫羟酸酯和碳酸酯。

4.权利要求3的结合物，其中所述部分选自可水解的氨基甲酸酯、酯和碳酸酯。

5.权利要求1的结合物，其具有以下结构

其中POLY为水溶性聚合物，L_D为可降解的键合，EI为进入抑制剂，k相当于EI上与聚合物片段(POLY-L_D)共价连接的活性部位数。

6.权利要求5的结合物，其中k的值为1到8。

7.权利要求6的结合物，其中k的值选自1、2、3、4、5和6。

8.权利要求7的结合物，其中k选自1、2、3和4。

9.权利要求5的结合物，其中L_D包括选自以下的部分：羧酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、硫代酸酯、硫羟酸酯和碳酸酯。

10.权利要求5的结合物，其中POLY选自聚氧化烯烃、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚唑啉和聚丙烯酰基吗啉。

11.权利要求10的结合物，其中POLY为聚氧化烯烃。

12.权利要求11的结合物，其中聚氧化烯烃为聚乙二醇。

13.权利要求12的结合物，其中聚乙二醇由选自以下的封端部分进行封端：羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。

14.权利要求1 3的结合物，其中聚乙二醇由甲氧基进行封端。

15.权利要求12的结合物，其中聚乙二醇的分子量选自以下范围：约500道尔顿到约100,000道尔顿、约2,000道尔顿到约85,000道尔顿、约5,000道尔顿到约60,000道尔顿、约10,000道尔顿到约50,000道尔顿、和约15,000道尔顿到约40,000道尔顿。

16.权利要求5的结合物，其中POLY具有选自以下的结构：线型、支化和叉形。

17.权利要求5的结合物，其中所述EI选自：T-20、T-1249、PRO542(又名CD4-IgG2)、PRO-140、PRO-367、SCH-417690、TXN-355、UK-427、UK-857、GSK-873、GSK-140、PA9、PA10、PA11和PA12。

18.权利要求17的结合物，其中EI选自：T-20、T-1249、PRO 542和PRO-140。

19.权利要求5的结合物，其中与聚合物片段连接的EI活性部位独立地选自：N末端、C末端、氨基、羟基和硫羟基。

20.权利要求19的结合物，其中与聚合物片段连接的EI活性部位为氨基或者羟基。

21.权利要求5的结合物，其中L_D具有选自约1到约20个原子、约2到约15个原子、和约3到约10个原子的长度。

22.权利要求5的结合物，其包括选自以下的结构：

和

其中：

结构II中的L为-O-或-NH-C(O)，

Ar为芳基，

-NH-为得自EI的氨基残基，

结构III中的P为间隔基，

Z为-O-、-NH-、或-CH₂-，和

O为得自EI的羟基残基。

23.权利要求22的结合物，其中在结构III中，当合起来考虑-NH-P-Z-C(O)-时，P为天然或非天然存在的氨基酸的残基。

24.权利要求22的结合物，其中Ar为邻位、间位或对位取代的苯基。

25.结构III所示的结构，其中“POLY-NH-”选自不存在EI部分的表1中的聚合物1-1到1-40。

26.权利要求22的结合物，其对应于以下结构：

或

其中n为2到约3400。

27.权利要求5的结合物，其包括以下结构：

其中n为2到约3400。

28.权利要求5的结合物，其中k等于1。

29.权利要求1的结合物，其中所述水溶性聚合物为多臂型聚合物。

30.权利要求29的结合物，其中所述多臂型聚合物包括中心核心，从所述中心核心伸出至少三个聚合物臂。

31.权利要求30的结合物，其中所述聚合物臂为均聚的或共聚的。

32.权利要求31的结合物，其中每个聚合物臂包括这样的共聚物，该共聚物包括与所述中心核心共价连接的内部多肽片段和与所述多肽片段共价连接的外部亲水性聚合物片段。

33.权利要求31的结合物，其包括以下结构：

RPOLY-L_D-EI)_y

              VII

其中：

R为核心分子，

POLY为水溶性聚合物，

L_D为可降解的键合，

EI为进入抑制剂，和

y为3到15。

34.权利要求33的结合物，其包括以下结构：

其中m选自3、4、5、6、7和8。

35.权利要求32的结合物，其中所述EI通过可降解的键合共价连接于内部多肽片段。

36.权利要求33的结合物，其包括以下结构：

其中：

P为间隔基，

Z为-O-、-NH-、或-CH₂-，和

O为得自EI的羟基残基。

37.权利要求36的结合物，其中当合起来考虑-NH-P-Z-C(O)-时，P为天然或非天然存在的氨基酸的残基。

38.包括多种单一聚物EI结合物的组合物。

39.包括权利要求1所述的结合物的药物组合物。

40.权利要求39的药物组合物，进一步包括可药用的赋形剂。

41.非可逆胶凝水凝胶，其包括进入抑制剂和作为凝胶组分之一的聚氧化烯烃。

42.权利要求41的水凝胶，其中所述水凝胶为交联的。

43.权利要求41的水凝胶，其中所述水凝胶为未交联的。

44.权利要求41的水凝胶，其中所述进入抑制剂为权利要求1所述的水溶性聚合物结合物形式。

45.权利要求41的水凝胶，其在生理条件下可降解。

46.权利要求41的水凝胶，其中所述进入抑制剂任选共价连接于一种或多种凝胶组分。

47.生产权利要求1所述的聚合物结合物的方法，包括在结合条件下使进入抑制剂与水溶性聚合物试剂接触形成包括可降解键合的聚合物进入抑制剂结合物。

48.制备包括进入抑制剂的非可逆胶凝水凝胶的方法，所述方法包括：

在有效促进适当的水凝胶前体试剂胶凝的条件下使所述适当的水凝胶前体试剂彼此接触并与所述进入抑制剂接触，从而形成其中包埋有所述进入抑制剂的非可逆胶凝水凝胶，

其中所述进入抑制剂为结合形式或非结合形式，并且所述水凝胶前体试剂不表现出可逆胶凝性质。

49.抑制HIV感染的方法，包括给药包括治疗有效量的权利要求1所述的结合物和可药用赋形剂的组合物。

50.权利要求49的方法，其中所述结合物与一种或多种其它抗病毒药组合给药。

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