CN101130075A - ***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

一种***O、A、Asia－1型三价灭活疫苗，由O型***病毒抗原、A型***病毒抗原、Asia－1型***病毒抗原和佐剂按抗原∶佐剂＝1∶1比例，其中抗原配比：45％的已灭活并经3倍浓缩的O型病毒抗原O/china/99、20％的A型病毒抗原AF/72和35％的Asia－1型病毒抗原Asia－1/XJ/KLAMY/04混合而成；经：毒种、制苗材料的制备、病毒的增殖、病毒灭活的程序、菌检、浓缩、疫苗配制和疫苗检验步骤制备而成。本发明一次接种可同时预防O、A、Asia－1型三个血清型的***，具有现用疫苗无法达到的便捷性和实用性，可降低用于防疫的人力、物力和财力，具有广阔的应用前景。

Description

***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗

技术领域

本发明涉及兽医生物制品技术领域，具体说是一种***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗。

背景技术

***是由***病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。***的暴发将严重影响到一个国家的经济发展、国际贸易、社会稳定和国际声誉。1997年我国台湾暴发***，导致养猪业及相关产业倒闭，70万人失业，总经济损失达80亿美元。2001年，***首先在英国暴发，造成直接损失达几亿英镑，但外贸和相关产业的间接损失多达90亿英镑，当年经济增长率下调1.5个百分点。Blackwell(1984)曾引用一个经济分析报告称：如果畜牧业十分发达的美国发生***，当年的直接损失和间接损失将分别是40亿和400亿美元。鉴于***不仅会造成巨大经济损失和社会影响，而且会影响一个国家在国际上的声誉和形象，素有“政治经济病”之称，被***粮农组织(FAO)、世界动物卫生组织(OIE)和我国政府列为A类和一类动物传染病之首，并列入重大跨国动物疫病全球消灭行动计划，这充分显示了国内外对***的关注程度。目前，世界***流行的总格局是，发达国家继续享受无***地位，发展中国家仍未摆脱***的危害。根据OIE和世界***咨询实验室的疫情通报和检测统计，2003～2005年间报告***发病的国家和地区有82个(次)，其中Asia-占56.1％(46/82)。在发生***的国家和地区中，有10个与我国接壤，疫情非常严重，常年流行O、A和Asia-1型***，绵延两万多公里长的国境线，传入因素很多，所受威胁很大。我国自解放以来***流行不断，以前以O型为主，主要感染牛猪，近年来随着改革开放的发展，国际交流频繁，人流物流加快，虽然已投入大量的人力物力控制和扑灭***，但国内疫情不断复杂化，不仅有O型***流行，局部地区还有Asia-1型***流行，严重妨碍我国畜牧业健康发展。

疫苗接种是防止疫病暴发和避免造成巨大损失的主要措施、关键环节和最后防线。在有***流行的国家每年都要进行有计划的免疫预防接种；无***流行或已消灭了***的国家在疫苗库中也储备了一定数量的战备疫苗；受***威胁国家除进行严格的进口检疫外，对边境地区亦进行定期的疫苗预防接种。***病毒属小RNA病毒科，病毒基因组具有小RNA病毒准种的特性，压力选择导致病毒在毒力和抗原性方面极易变异。根据交叉保护试验已确定了O、A、C、Asia-I、SATI、SATII、SATIII等7个血清型，型间无交叉保护，型内不同毒株之间的遗传变异可导致抗原差异。***是世界性传染病，各国流行的血清型及毒株由于上述原因存在着较大差异，因此，均纷纷研制适合于自己国家的疫苗，以预防和控制这一世界性重大动物疫病的流行。国际上曾研究应用和正在研制的***疫苗综括起来有弱毒疫苗、灭活疫苗和新型疫苗三大类。从***疫苗的整个研究和应用情况看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷，已经被世界上许多国家摈弃。新型疫苗虽然取得一些非常有前途的结果，但在免疫效力和经济上目前尚不存在与常规疫苗竞争的能力。在新型疫苗进入实际应用前，还需对此类疫苗的免疫机制和分子生物学特性作更深入地研究。常规灭活疫苗仍然是当前世界***免疫防控的最主要疫苗。在灭活疫苗的研制方面，国际上具有代表性的疫苗生产工艺是：“筛选优异的制苗毒株，用转瓶单层传代细胞培养法或悬浮培养法生产制苗用***病毒抗原；用乙酰基乙烯亚胺AEl或二乙烯亚胺BEl对病毒进行灭活；利用油佐剂乳化配制疫苗。”我国已研制成功并用于实际防疫的灭活疫苗有：牛***O型灭活疫苗、猪***O型灭活疫苗、猪***O型灭活疫苗(II)即猪***O型高效灭活疫苗等。

由于我国目前局部地区还有有O型和Asia-1型***流行，与我国毗邻的周边国家O型、A型和Asia-1型***大肆流行，从而形成了在***防控方面内忧外患、腹背受敌的态势。鉴于我国目前还没有同时预防O、A、Asia-1型三型***的灭活疫苗，以及国际上常用安全、高效、优质的多价灭活疫来有效防控多血清型***的成功经验，研制出安全、高效、可同时预防O、A、Asia-1型三型***的灭活疫苗是预防***急需解决的问题，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同时预防O、A、Asia-1三型***的高效、安全、可靠的三价灭活疫苗，用于O、A、Asia-1型***的免疫预防。

本发明通过下述技术方案实现其发明目的：

一种***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗，由O型***病毒抗原、A型***病毒抗原、Asia-1型***病毒抗原和佐剂按下述配比制成：

疫苗配制的比例为，抗原∶佐剂＝1∶1；

其中抗原按下述重量百分含量配制：

45％的已灭活并经3倍浓缩的O型病毒抗原O/china/99、20％的A型病毒抗原AF/72和35％的Asia-1型病毒抗原Asia-1/XJ/KLAMY/04混合而成；

佐剂：采用蒙太得206佐剂——Montanide ISA 206佐剂；

上述原料按照下述工艺方法和顺序制备而成：

a、毒种

a.1、O型毒种：牛源O型***病毒O/china/99株细胞毒；

a.2、A型毒种：牛源A型***病毒AF/72株细胞毒；

a.3、Asia-1型毒种：牛源Asia-1型***病毒Asia-1/XJ/KLAMY/04株细胞毒；

b、制苗材料的制备

制苗材料为BHK-21单层细胞，细胞的培养按一般组织培养方法进行；

c、病毒的增殖

用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法分别增殖制苗用O、A、Asia-1型病毒抗原，转瓶机转速为10～12r/h，收获病毒液，在-15℃下冻结保存；

d、病毒灭活的程序，包括：

d.1过滤；将冻结的O、A、Asia-1型制苗病毒液分别融化，经60～80目铜纱网过滤除细胞碎片，用7.5％NaHCO₃调PH至7.6～7.8，并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的链霉素；

d.2灭活；向已过滤的O、A、Asia-1型病毒液中分别加入BEI二乙烯亚胺使其浓度达到2mmol/L，在37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃，并在30℃下持续灭活26h，其间每4h摇振1次，灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2％，置2～8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检；

d.3安检；对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别进行安检，用每型灭活病毒液，颈背部皮下注射2～3日龄乳鼠，0.2mL/只，设对照乳鼠，观察7d，全部乳鼠不出现***症状和发病死亡，方为灭活彻底；

d.4菌检；

对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别按《中国兽药典》进行无菌检验；

e.浓缩  将O型、A型、Asia-1型制苗病毒液分别物理浓缩3倍；

f、疫苗配制

疫苗乳化，先将油佐剂相真空负压进料到乳化机内，搅拌过程中，将灭活的病毒液按比例真空负压进料到油佐剂相中，循环搅拌至抗原与佐剂充分混合后，通过均质机乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗；

g、疫苗检验，包括：

g.1、物理性状检查；该疫苗为矿物油乳剂型，外观呈白色或淡粉红色略带粘滞性流体。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散；吸取疫苗10mL，加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，水相析出应不超过0.5mL；用1mL吸管(出口内径1.2mm)吸取25±1℃的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL，所需时间应小于或等于8s；

g.2、无菌检验；

g.3、安全检验

g.3.1用体重350～450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2mL；用体重18～22g的小鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5mL，连续观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身反应；

g.3.2用至少6月龄的健康易感牛3头，每头舌背面皮内注射20个点，每点0.1mL疫苗，逐日观察至少4d，之后，每头牛肌肉注射疫苗9mL，继续逐日观察6d，均不出现***症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应；

g.4、效力检验：用至少6月龄的健康易感牛45头，分为3组，每组15头。将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射15头牛，接种21d后，将各剂量组免疫牛随机等分为O型、A型、Asia-1型三个玫毒组，连同对照牛各2头，分别进行攻毒；O型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***O型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；A型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***A型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；Asia-1型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***Asia-1型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；连续观察10d；对照牛至少3蹄出现水泡或溃疡，免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其它部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型***水泡或溃疡时判为不保护；根据免疫牛的保护数，按Karber法计算被检疫苗的PD₅₀每头份疫苗对O型、A型、Asia-1型***的免疫效力应至少分别达到3PD₅₀。

我国是畜牧业大国，畜牧业产值已占农业总产值的1/3以上。据统计，到2004年底全国主要家畜存栏数，猪4.82亿头、牛1.38亿头、羊3.66亿只，分别比上年增长3.4％、2.3％、7.6％。国家已经把发展畜牧业提高到了调整农业产业结构和增加农民收入、解决“三农问题”和建设***新农村的战略地位。***是最重要的世界性动物疫病之一，被称为畜牧业的“头号杀手”，每年因该病造成的经济损失达数百亿元。此外，还涉及食品安全和公共卫生。我国***流行流行历史已久，疫情比较复杂。目前，除流行O型***外，局部地区还流行Asia-1型***。严重制约着畜牧业的健康、持续发展，极大影响着动物及其产品的国际贸易。而与我国接壤的许多国家，常年流行O、A和Asia-l型***，疫情非常严重。为了应对我国***突发事件，也为了提供拒邻国***于国门之外的战略技术储备，我们借鉴国际上多血清型***流行国家大多采用多价灭活疫苗防控***的成功经验，在中国农业科学院兰州兽医研究所所长基金项目和农业部动物疫情监测项目的资助下，研制成功了***O、A、Asia-I型三价灭活疫苗。

该疫苗系将牛源O型***病毒株、牛源A型***病毒株和牛源Asia-1型***病毒株的细胞适应毒，接种BHK-21细胞，收获细胞培养物，经二乙烯亚胺(BEI)灭活和物理浓缩后，加油佐剂混合乳化制成，用于O型、A型和Asia-1型***的免疫预防，对***易感动物安全。一次接种有效免疫期6个月；2～8℃下疫苗保存期12个月；免疫剂量为每头牛3mL。按国际通用标准PD₅₀法进行效力检验，4批疫苗(040920、041213、050112和050401)免疫牛，抗***O型同源强毒攻击的免疫效力分别为6.50、4.65、3.74和5.80 PD₅₀/头份，平均5.17 PD₅₀/头份；抗A型同源强毒攻击的免疫效力分别为7.22、5.19、8.10、7.22 PD₅₀/头份，平均6.93 PD₅₀/头份；抗Asia-1型同源强毒攻击的免疫效力分别为7.22、8.10、8.10、8.10 PD₅₀/头份，平均7.88 PD₅₀/头份，而对照牛则均2/2四蹄发病。表明，该疫苗对O、A、Asia-1型***的免疫效力超过了“不低于3个PD₅₀/头份”的国内和国际标准。

与国内外现有***灭活疫苗相比，该疫苗具有以下特点：

1)本疫苗制苗毒种是经先进的***病毒毒株库技术筛选确定的，不仅免疫原性好、抗原谱广、遗传性能稳定、对实验动物和制苗材料具有良好适应性，而且是近年来***流行代表毒株。以其作为制苗毒株，对实际防疫更具针对性。

2)疫苗制造采用BHK-21细胞浓缩培养法繁殖病毒抗原、二乙烯亚胺(BEI)灭活和双相油佐剂乳化技术。此外，将***病毒抗原浓缩、保存、稀释技术应用于疫苗制造，完善和优化了疫苗生产工艺。为保证产品质量、规范毒种管理，建立了制苗和攻毒用毒种及制苗细胞种子批，制订了与国际标准接轨的疫苗质量标准。

3)该疫苗的安全性达国际同类产品先进水平；对A型和Asia-1型***的平均免疫效力分别为6.93和7.88PD₅₀/头份，超过了国际上战略应急疫苗的标准(6 PD₅₀/头份)，对O型FMD的平均免疫效力为5.17PD₅₀/头份，超过了国际上常规预防用苗的标准(3PD₅₀/头份)。因此，是高效的***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗，具有广阔的应用前景。

4)一次接种可同时预防O、A、Asia-1型三个血清型的***。因此，具有现用疫苗无法达到的便捷性和实用性，可降低用于防疫的人力、物力和财力。

具体实施方式

实施例1

一种***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗，由已灭活并经3倍浓缩的O型***病毒抗原O/China/99占疫苗总量的22.5％、A型***病毒抗原AF/72占疫苗总量的10％、Aisa-1型***病毒抗原Asia-1/XJ/KLAMY/04占疫苗总量的17.5％与由法国SEPPIC公司生产的Montanide ISA 206佐剂，经高压灭菌而成，占疫苗总量的50％共同配制而成，通过下述工艺方法和顺序实现：

1毒种

1.1O型毒种：O/china/99，系1999年分离的O型***牛源舌皮毒，由中国农业科学院兰州兽医研究所国家***参考实验室鉴定、保存和供应。将该毒种1∶10000倍稀释后，接种无***O型血清抗体的黄牛，于48h内4蹄出现典型***水泡病变，对牛的半数感染量ID₅₀/0.1mL为10^-9.00；将牛舌皮毒种1∶10倍稀释后，接种2～3日龄乳鼠，于24h内出现明显的麻痹症状并最终死亡，盲传至第3代时，发病死亡时间为18～20h，对乳鼠的半数致死量LD₅₀/0.2mL为10^-8.50；用该毒种适应BHK-21细胞，第5代毒培养时间为8h，对细胞的半数感染量TCID₅₀/mL为10^-8.60；经核苷酸序列分析，该毒种在遗传学分类上属“PanAsia”谱系，与国际上发表的泛亚型毒株的VP1基因核苷酸序列同源性在95％以上；在PK15细胞上连传60代后，主要免疫基因的核苷酸序列与传代前相比同原性为99.22％，说明该毒种的遗传性能稳定；通过细胞中和试验分析，该毒种与我国其它O型***分离毒株抗原关系密切，对其它O型病毒的r值为0.66～1.13，平均0.98。

1.2A型毒种：AF/72，系1972年分离的A型***牛源舌皮毒，由中国农业科学院兰州兽医研究所国家***参考实验室鉴定、保存和供应。将该毒种1∶10000倍稀释后，接种无***A型血清抗体的黄牛，于48h内4蹄出现典型***水泡病变，对牛的半数感染量ID₅₀/0.1mL为10^-8.00；将牛舌皮毒种1∶10稀释后接种2～3日龄乳鼠，于48h内出现明显的麻痹症状并最终死亡，盲传至第3代时，发病死亡时间为21～23h，对乳鼠的半数致死量LD₅₀/0.2mL为10^-7.67；用该毒种适应BHK-21细胞，第8代毒培养时间为12h，对细胞的半数感染量TCID₅₀/mL为10^-7.67；经核苷酸序列分析，该毒种与周边国家及我国20世纪50～60年代牛源A型***分离毒株的同源性在91％以上，在遗传学分类上属相同的基因亚型；通过细胞中和试验分析，该毒种与我国其它A型***分离毒株抗原关系密切对其它A型病毒的r值为0.78～1.00，平均0.88。

1.3Asia-1型毒种：Asia-1/XJ/KLAMY/04，系2004年分离的Asia-1型***牛源舌皮毒，由中国农业科学院兰州兽医研究所国家***参考实验室鉴定、保存和供应。将该毒种1∶10000倍稀释后，接种无***Asia-1型血清抗体的黄牛，于48h内4蹄出现典型***水泡病变，对牛的半数感染量ID₅₀/0.1mL为10^-7.50；将牛舌皮毒种1∶10倍稀释后，接种2～3日龄乳鼠，于48h内出现明显的麻痹症状并最终死亡，盲传至第3代时，发病死亡时间为25～30h，对乳鼠的半数致死量LD₅₀/0.2mL为10^-8.00；用该毒种适应BHK-21细胞，第5代毒培养时间为8h，对细胞的半数感染量TCID₅₀/mL为10^-8.33；经核苷酸序列分析，该毒种与跟我国毗邻的塔吉克斯坦、印度、巴基斯坦等国的流行毒同源性为97.8％～99.1％，属于高度同源毒；通过细胞中和试验分析，该毒种与我国其它Asia-1型***分离毒株抗原关系密切，对其它Asia-1型病毒的r值为0.82～1.00，平均0.89。

2增殖病毒的程序

2.1制苗材料的制备：制苗材料为BHK-21单层细胞，细胞种子由中国兽医药品监察所提供。细胞制备所用犊牛血清，经检查应无***病毒抗体，每批血清均应过滤除菌、无菌检验。营养液配制及BHK-21细胞的培养按一般组织培养方法进行。

2.2病毒的增殖：用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法(薛景山，[21]ZL专利号93114885.5)分别增殖制苗用O、A、Asia-1型病毒抗原，但转瓶机转速为10～12转/h。在培养过程中镜检转瓶细胞CPE，当达到90％时即可收获病毒液，在-15℃下冻结保存。抽样测定，TCID₅₀均不低于10^-7.0。

3病毒灭活的程序

3.1过滤：将冻结的O、A、Asia-1型制苗病毒液分别融化，经60～80目铜纱网过滤除细胞碎片，用7.5％NaHCO3调PH至7.6～7.8，并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的链霉素。

3.2灭活：向已过滤的O、A、Asia-1型病毒液中分别加入BEI使其浓度达到2mmol/L，在37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃，并在30℃下持续灭活26h，其间每4h摇振1次，灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2％。抽样，并置2～8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检。

3.3安检：对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别进行安检。用每型灭活病毒液，颈背部皮下注射2～3日龄乳鼠4只，0.2mL/只，设对照乳鼠1只，观察7d，全部乳鼠均不出现***症状和发病死亡，方为灭活彻底。

3.4菌检：对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别按《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。

4浓缩：将O型、A型、Asia-1型制苗病毒液，分别物理浓缩3倍。

5疫苗配制程序：疫苗配制比例为，V(抗原)∶V(佐剂)＝1∶1；疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206(法国SEPPIC公司产品)；疫苗乳化用抗原为灭活彻底、菌检合格、并经浓缩的O、A、Asia-1型混合***病毒抗原，三种抗原的比例为“O∶A∶Asia-1型＝45％∶20％∶35％”。乳化时，先将油佐剂相真空负压进料到乳化机内，搅拌过程中，将灭活的病毒液按比例缓慢真空负压进料到油佐剂相中。投料后，循环搅拌至抗原与佐剂充分混合后，通过均质机，乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗。

6疫苗检验

6.1物理性状检查：该疫苗为矿物油乳剂型，外观呈白色或淡粉红色略带粘滞性流体。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散；吸取疫苗10mL，加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，水相析出应不超过0.5mL；用1mL吸管(出口内径1.2mm)吸取25℃左右的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL，所需时间应小于或等于8s。

6.2无菌检验：按《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。

6.3安全检验：1)用体重350～450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2mL；用体重1 8～22g的小鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5mL。连续观察7d，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身反应。2)用至少6月龄的健康易感牛(***细胞中和抗体滴度小于或等于1∶8或乳鼠中和抗体滴度小于或等于1∶4)3头，每头舌背面皮内注射20个点，每点0.1mL疫苗，逐日观察至少4d。之后，每头牛肌肉注射疫苗9mL，继续逐日观察6日。均不应出现***症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。

6.4效力检验：用至少6月龄的健康易感牛45头，***细胞中和抗体滴度小于或等于1∶8或乳鼠中和抗体滴度小于或等于1∶4，分为3组，每组15头。将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射15头牛。接种21d后，将各剂量组免疫牛随机等分为O型、A型、Asia-1型三个攻毒组，连同对照牛各2头，分别进行攻毒。O型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***O型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；A型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***A型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；Asia-1型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***Asia-1型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀。连续观察10d。对照牛均应至少3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其它部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型***水泡或溃疡时判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Karber法计算被检疫苗的PD₅₀，每头份疫苗对O型、A型、Asia-1型***的免疫效力至少分别达到3PD₅₀。

Claims (1)

1.一种***O、A、Asia-1型三价灭活疫苗，由O型***病毒抗原、A型***病毒抗原、Asia-1型***病毒抗原和佐剂按下述配比制成：

疫苗配制的比例为，抗原∶佐剂＝1∶1；

其中抗原按下述重量百分含量配制：

45％的已灭活并经3倍浓缩的O型病毒抗原O/china/99、20％的A型病毒抗原AF/72和35％的Asia-1型病毒抗原Asia-1/XJ/KLAMY/04混合而成；

佐剂：采用蒙太得206佐剂——Montanide ISA 206佐剂；

上述原料按照下述工艺方法和顺序制备而成：

a、毒种

a.1、O型毒种：牛源O型***病毒O/china/99株细胞毒；

a.2、A型毒种：牛源A型***病毒AF/72株细胞毒；

a.3、Asia-1型毒种：牛源Asia-1型***病毒Asia-1/XJ/KLAMY/04株细胞毒；

b、制苗材料的制备

制苗材料为BHK-21单层细胞，细胞的培养按一般组织培养方法进行；

c、病毒的增殖

用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法分别增殖制苗用O、A、Asia-1型病毒抗原，转瓶机转速为10～12r/h，收获病毒液，在-15℃下冻结保存；

d、病毒灭活的程序，包括：

d.1过滤；将冻结的0、A、Asia-1型制苗病毒液分别融化，经60～80目铜纱网过滤除细胞碎片，用7.5％NaHCO₃调PH至7.6～7.8，并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的链霉素；

d.2灭活；向已过滤的O、A、Asia-1型病毒液中分别加入BEI二乙烯亚胺使其浓度达到2mmol/L，在37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃，并在30℃下持续灭活26h，其间每4h摇振1次，灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2％，置2～8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检；

d.3安检；对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别进行安检，用每型灭活病毒液，颈背部皮下注射2～3日龄乳鼠，0.2mL/只，设对照乳鼠，观察7d，全部乳鼠不出现***症状和发病死亡，方为灭活彻底；

d.4菌检；

对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别按《中国兽药典》进行无菌检验；

e.浓缩将O型、A型、Asia-1型制苗病毒液分别物理浓缩3倍；

f、疫苗配制

疫苗乳化，先将油佐剂相真空负压进料到乳化机内，搅拌过程中，将灭活的病毒液按比例真空负压进料到油佐剂相中，循环搅拌至抗原与佐剂充分混合后，通过均质机乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗；

g、疫苗检验，包括：

g.1、物理性状检查；该疫苗为矿物油乳剂型，外观呈白色或淡粉红色略带粘滞性流体。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散；吸取疫苗10mL，加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，水相析出应不超过0.5mL；用1mL吸管(出口内径1.2mm)吸取25±1℃的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL，所需时间应小于或等于8s；

g.2、无菌检验；

g.3、安全检验

g.3.1用体重350～450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2mL；用体重18～22g的小鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5mL，连续观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身反应；

g.3.2用至少6月龄的健康易感牛3头，每头舌背面皮内注射20个点，每点0.1mL疫苗，逐日观察至少4d，之后，每头牛肌肉注射疫苗9mL，继续逐日观察6d，均不出现***症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应；

g.4、效力检验：用至少6月龄的健康易感牛45头，分为3组，每组15头。将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射15头牛，接种21d后，将各剂量组免疫牛随机等分为O型、A型、Asia-1型三个攻毒组，连同对照牛各2头，分别进行攻毒；O型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***O型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；A型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***A型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；Asia-1型攻毒组，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛***Asia-1型病毒强毒，每点0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；连续观察10d；对照牛至少3蹄出现水泡或溃疡，免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其它部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型***水泡或溃疡时判为不保护；根据免疫牛的保护数，按Karber法计算被检疫苗的PD₅₀，每头份疫苗对0型、A型、Asia-1型***的免疫效力应至少分别达到3PD₅₀。