CN101124239A - 调节*** - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴定GDF－9和GDF－9B分子上具有功能显著性的新的结合结构域，以及与所述结构域相互作用以调节这些分子的生物活性来改变哺乳动物卵巢功能和***率的肽和抗体。
Description
发明领域
本发明涉及鉴定GDF-9和GDF-9B分子上具有功能显著性的新结构域，并涉及与其相互作用以调节这些分子的生物活性来改变哺乳动物卵巢功能和***率的激动剂和拮抗剂。
发明背景
GDF-9和GDF-9B(也称为BMP15)在发育卵泡的***中表达并对哺乳动物繁殖力起着作用(Fitzpatrick等，1998)。GDF9是转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员(McPherron和Lee，1993)，其在来自卵泡发育初级阶段的***中表达，直到***(McGrath等，1995；Laitinen等，1998)。GDF9B与GDF9密切相关(Dube等，1998；Laitinen等，1998)，并在小鼠***中与GDF9同时期表达，但在人初级卵泡中稍晚于GDF9表达。在卵巢中，GDF9和GDF9B现在已经显示出能在人(Aaltonen等，1999)、啮齿动物(Laitinen等，1998；Dube等，1998；Jaatinen等，1999)、反刍动物(Bodensteiner等，1999；Bodensteiner等，2000；Galloway等，2000)和有袋类动物(Eckery等，2002)的发育***中表达。在绵羊中，在原始卵泡中可见到GDF9的表达，而GDF9B在初级卵泡中表达(Bodensteiner等，1999；Galloway等，2000)。
GDF9和GDF9B，像TGFβ家族的大多数其它成员一样，由包含信号肽、原区域和作为生物活性肽的C-末端成熟区域的前原肽编码。通过细胞内弗林蛋白酶样蛋白酶将成熟区域从原区域上裂解下来，裂解发生在保守的弗林蛋白酶裂解位点上。TGFβ超家族的大多数成员在二聚体时有生物活性，虽然GDF9和GDF9B不包含该家族几乎所有成员中都能见到的进行共价链内二硫键连接的半胱氨酸分子，但是这些分子被认为在二聚体时有生物活性(Galloway等，2000；Yan等，2001)。可是不清楚有生理活性的二聚体是同二聚体(GDF9-GDF9和GDF9B-GDF9B)还是异二聚体(GDF9-GDF9B)，或者所有三种二聚体形式都起作用。基于以上模型已假定GDF9同二聚体在小鼠中起更重要的作用，而在绵羊中GDF9B同二聚体最有生物活性(Yan等，2001)。不清楚是否这些差异与绵羊是单***动物(每个周期通常仅成熟一个卵)、而鼠是多***的事实有关。清楚的是，GDF9和GDF9B都在控制和保持哺乳动物的繁殖力中起着关键的作用，而且理解它们的作用性质对疗法的开发来说是必需的。
Jeffery等(2003)使用了生物信息学工具(GoCore)在许多不同TGF-β家族成员中分析保守的区域，并在不同物种中针对GDF-9和GDF-9B分析，尝试着鉴定具有功能显著性的区域。可是，该研究没有将鉴定为可能功能显著性位点的区域与体内调节***的效果关联起来。
本发明的目的是鉴定GDF-9和/或GDF-9B分子上具有功能显著性的结构域，并鉴定与这些结构域相互作用或模拟这些结构域以调节它们的生物活性从而体内调节哺乳动物的卵巢功能和***率的激动剂和拮抗剂；和/或向公众提供有用的选择。
用于本说明书和权利要求书的术语″包含″指“至少部分由...组成”，就是说当解释包括该术语的独立权利要求时，每个权利要求中在该术语之后的特征都需要出现，但其他特征也可以出现。
发明简述
本发明基于对GDF-9和GDF-9B分子上具有功能显著性的新结构域的鉴定，并涉及与其相互作用的激动剂和拮抗剂。
更具体地，本发明基于对成熟GDF-9和GDF-9B分子N-末端附近具有功能显著性的结构域的鉴定和表征，其中GDF-9的N-末端结构域包含氨基酸序列：
DQESASSELKKPLVPASVNLSEYFKQFLFPQNEC(SEQ ID NO：1)；而且
GDF-9B的N-末端结构域包含氨基酸序列：
QAGSIASEVPGPSREHDGPESNQC(SEQ ID NO：2)。
因此，本发明涉及GDF-9N-末端结构域的分离片段，其具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述GDF-9N-末端结构域由氨基酸序列DQESASSELKKPLVPASVNLSEYFKQFLFPQNEC(SEQ ID NO：1)组成，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
肽片段优选包含来自SEQ ID NO：1第1-9或25-34位的至少一个氨基酸。
本发明也涉及GDF-9B N-末端结构域的分离的肽片段，其具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述GDF-9B N-末端结构域由氨基酸序列QAGSIASEVPGPSREHDGPESNQC(SEQ ID NO：2)组成，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
肽片段优选包含来自SEQ ID NO：2第1-5或21-23位的至少一个氨基酸。
氨基酸符号与下表1给出的单字码一致。
本发明的分离的肽片段优选包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少5个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。更优选地，所述肽片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或至少20个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
最优选地本发明的肽片段选自包含下列序列的组：
DQESASSELKKPLV(C)(SEQ ID NO：3)；
SEYFKQFLFPQNEC (SEQ ID NO：4)；
QAGSIASEVPGPSR(C)(SEQ ID NO：5)；和
SREHDGPESNQC (SEQ ID NO：6)；
或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
括号中的氨基酸指可为缀合目的而任选添加的氨基酸。
本发明也涉及与本发明肽片段中一种或多种结合的抗体或抗体片段。
在另一方面，本发明提供了调节雌性哺乳动物***率的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本发明的一种或多种能与如上定义的GDF-9和/或GDF-9B N-末端结构域相互作用、并改变其生物活性的分离的肽片段和/或抗体或抗体片段的步骤。
本发明优选提供调节雌性哺乳动物***率的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的选自SEQ ID NO 3-6的一种或多种肽，或其功能变体、和/或与其结合的抗体或抗体片段。
在另一方面，本发明提供了本发明的一种或多种分离的肽片段和/或与其结合的抗体或抗体片段在制备调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途。
本发明优选提供选自包括SEQ ID NO 3-6的组的一种或多种肽或其功能变体、和/或与其结合的抗体或抗体片段在制备调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途。
在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的能与如上定义的GDF-9和/或GDF-9B N-末端结构域相互作用的一种或多种分离的肽片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
组合物优选包含选自包括SEQ ID NO 3-6的组的一种或多种肽或其功能变体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。组合物可额外地或选择性地包含与所述肽中一种或多种结合的抗体或抗体片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
附图说明
本发明现在将通过参考所附的附图来具体描述，其中：
图1显示了GDF-9上SEQ ID NO 3和4的肽的位置；
图2显示了GDF-9B上SEQ ID NO5和6的肽的位置；
图3a和3b显示了来自各种不同物种的GDF9和GDF-9B的序列同源性和N-末端结构域的共有序列；
图4显示了用GDF-9和GDF-9B肽处理对牛的窦卵泡产生的影响。(A＝对照，仅用匙孔血蓝蛋白(KLH)；B＝KLH-GDF-9(SEQ ID NO：7)；C＝KLH-GDF-9B(SEQ ID NO：5)；D＝KLH-GDF-9和KLH-GDF-9B(SEQ ID NO：5和7)；
图5显示来自用绵羊GDF-9肽SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4、或GDF-9B肽SEQ ID NO 5免疫的绵羊的多克隆抗体当直接加入到生物测试中时对绵羊(o)GDF-9和oGDF-9B刺激的大鼠颗粒细胞3H-胸腺嘧啶核苷掺入的影响。水平线显示用对照培养基(即无oGDF-9或oGDF-9B的培养基)处理的颗粒细胞的应答水平。提供的数据是平均4次重复实验的平均值和标准差。相对于对照培养基处理的细胞*P＜0.05、**P＜0.01，相对于oGDF-9+oGDF-9B处理而未接受抗体的细胞aP＜0.05、bP＜0.01；
图6显示来自用绵羊GDF-9肽SEQ ID NO 4免疫的绵羊的多克隆抗体当直接加入到生物测试中时对小鼠(m)GDF-9和绵羊(o)GDF-9B刺激的大鼠颗粒细胞3H-胸腺嘧啶核苷掺入的影响。水平线显示用对照培养基(即无mGDF-9或oGDF-9B的培养基)处理的颗粒细胞应答水平。提供的数据是平均3次重复实验的平均值和标准差。相对于对照培养基处理的细胞*P＜0.05、**P＜0.01，相对于mGDF-9+oGDF-9B处理而未接受抗体的细胞bP＜0.01；
图7显示来自用绵羊GDF-9肽SEQ ID NO 4免疫的绵羊的多克隆抗体的不同剂量当直接加入到生物测试中时对绵羊(o)GDF-9和oGDF-9B刺激的大鼠颗粒细胞3H-胸腺嘧啶核苷掺入的影响。提供的数据是由同一群颗粒细胞分装的4个重复孔的平均值和标准差；和
图8显示来自用绵羊GDF-9B肽SEQ ID NO 5免疫的绵羊的多克隆抗体的不同剂量当直接加入到生物测试中时对绵羊(o)GDF-9和oGDF-9B刺激的大鼠颗粒细胞3H-胸腺嘧啶核苷掺入的影响。提供的数据是由同一群颗粒细胞分装的4个重复孔的平均值和标准差。
发明详述
本发明提供了GDF-9和GDF-9B N-末端具有功能显著性的新结构域。推定通过与该结构域相互作用的激动剂或拮抗剂来刺激或抑制该结构域，将有效调节雌性哺乳动物的***率。
N-末端结构域序列与许多不同物种中的GDF-9和GDF-9B蛋白的相应序列以及分别如图3a和3b所示为GDF-9和GDF-9B确定的共有序列进行比较。
然后合成大量肽，其与N-末端结构域中的序列一致，而且预计其在体内施用时对GDF-9和/或GDF-9B的生物活性具有激动剂或拮抗剂作用。尤其是，将肽设计成在根据其三维结构的分子的外侧；在分子的柔性区域内；长度至少为9个氨基酸；与其它TGFβ家族成员不同源；不与其他已知蛋白质趋同(convergent)；在不含糖基化位点的区域；并由此它们能偶联到载体蛋白上。要考虑到，这些因素的组合会产生在物种间有高度特异性并且不会有交叉反应性问题的肽。
因此，在第一个具体实施方式中，本发明涉及GDF-9N-末端结构域的分离片段，其具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述GDF-9N-末端结构域由氨基酸序列DQESASSELKKPLVPASVNLSEYFKQFLFPQNEC(SEQ IDNO：1)组成。氨基酸符号与下表1给出的单字码一致。
分离的肽片段优选包含来自SEQ ID NO：1第1-9或25-34位的至少一个氨基酸。
肽优选包含SEQ ID NO：1的至少5个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。更优选地，肽包含SEQ ID NO：1的至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或至少20个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
最优选地，肽选自包含下列序列的组：
DQESASSELKKPLV(C)(SEQ ID NO：3)；和
SEYFKQFLFPQNEC (SEQ ID NO：4)；
或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。括号中的氨基酸指可为缀合目的而任选添加的氨基酸。
本发明也涉及与本发明的一种或多种GDF-9肽结合的抗体或抗体片段。
在第二个具体实施方式中，本发明涉及GDF-9B N-末端结构域的分离的肽片段，其具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述GDF-9B N-末端结构域由以下氨基酸序列组成：
QAGSIASEVPGPSREHDGPESNQC(SEQ ID NO：2)，
或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。氨基酸符号与下表1给出的单字码一致。
分离的肽片段优选包含来自SEQ ID NO：2第1-5或21-23位的至少一个氨基酸。
肽优选包含SEQ ID NO：2的至少5个连续的氨基酸，或其功能衍生物、类似物、同源物、或模拟物。更优选地，肽包含SEQ ID NO：2的至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或至少20个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
最优选地，肽选自下组：
QAGSIASEVPGPSR(C)(SEQ ID NO：5)；和
SREHDGPESNQC (SEQ ID NO：6)；
或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
本发明也涉及与本发明的一种或多种GDF-9B肽结合的抗体或抗体片段。
括号中的氨基酸指为缀合目的而任选添加的氨基酸。
本发明的肽可以利用已知的技术合成。
本发明肽的类似物、衍生物或变体可包括序列修饰或非序列修饰。非序列修饰可包括乙酰化、甲基化、磷酰甲基化、羧化或糖基化。
本发明示例的特定N-末端肽根据分别如图1和2所示的GDF-9和GDF-9BN-末端部分上的它们的位置显示。
优选的类似物包括肽，其序列与本发明的那些肽有一个或多个不影响肽的生物活性的保守氨基酸取代、缺失或***。保守取代典型地包括将一个氨基酸取代为另一个有相似特征的氨基酸，如，在以下组内进行取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。保守取代的例子也可以在图3a至3b中GDF-9和GDF-9B序列中找到，其中显示与共有序列相比较在不同哺乳动物物种中的取代。其他保守取代可得自下表1。
表1
保守氨基酸替换
| 氨基酸 | 代码 | 用以下...之任意替换 |
| 丙氨酸精氨酸天冬酰胺天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸 | ARNDCQEGHILKMF | D-Ala，Gly，β-Ala，L-Cys，D-CysD-Arg，Lys，D-Lys，高-Arg，D-高-Arg，Met，Ile，D-Met，D-Ile，Orn，D-OrnD-Asn，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Gln，D-GlnD-Asp，D-Asn，Asn，Glu，D-Glu，Gln，D-GlnD-Cys，S-Me-Cys，Met，D-Met，Thr，D-ThrD-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-AspD-Glu，D-Asp，Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-GlnAla，D-Ala，Pro，D-Pro，β-Ala，AcpAsp，D-Asp，Lys，D-Lys，TyrD-Ile，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-MetD-Leu，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-MetD-Lys，Arg，D-Arg，高-Arg，D-高-Arg，Met，D-Met，Ile，D-Ile，Orn，D-OrnD-Met，S-Me-Cys，Ile，D-Ile，Leu，D-Leu，ValD-ValD-Phe，Tyr，D-Thr，L-多巴，His，D-His，Trp， |
| 脯氨酸丝氨酸苏氨酸酪氨酸缬氨酸 | PSTYV | D-Trp，反式-3，4，或5-苯基脯氨酸，顺式-3，4，或5-苯基脯氨酸D-Pro，L-1-噻唑烷-4-羧酸，D-或L-1-噁唑烷-4-羧酸D-Ser，Thr，D-Thr，别-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，L-Cys，D-CysD-Thr，Ser，D-Ser，别-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，Val，D-ValD-Tyr，Phe，D-Phe，L-多巴，His，D-HisD-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Met，D-Met |
其它类似物包括带有影响肽稳定性的修饰的肽。该类似物可包括如，在肽序列中的一个或多个非肽键(其代替肽键)。还包括类似物，该类似物包括天然存在的L-氨基酸之外的残基，如D-氨基酸，或非天然存在的合成的氨基酸，如β或γ氨基酸和环状类似物。
在另一方面中，本发明提供了本发明的激动剂和拮抗剂在调节雌性哺乳动物(包括人和非人哺乳动物)***率的方法中的用途。该非人哺乳动物包括绵羊、牛、山羊、鹿、猪、马、骆驼类(camelid)、负鼠、诸如狨猴的非人灵长动物、猫、狗和其它商业上重要的物种。
该方法可包括向所述哺乳动物施用有效量的一种或多种所述激动剂或拮抗剂、或其功能变体、或与其结合的抗体或抗体片段。
要认识到，要治疗的特定哺乳动物的GDF-9和GDF-9B的等价N-末端结构域肽将可用于本发明的方法中。来自不同物种的GDF-9和GDF-9B肽的实例如下表1a所示，其与SEQ ID NO 3-6的特定N-末端肽一致。
表1A
| GDF-9B | Seq ID NO 5QAGSIASEVPGPSR(C) | Seq ID No 6SREHDGPESNQC |
| 奶牛鹿狗 | QAGSIASEVPGPSRQAGSIASEVPGPSRQAGSITSGVPSSSR | SREHDGPESNLCSREHDGPESNQCSRDHDGPKSNQC |
| 猫负鼠黑猩猩人小鼠大鼠兔猪山羊绵羊共有 | QTDSITSGVPGPFRQVGPVRSEAPGQSQADGISAEVTASSSQADGISAEVTASSSQACSIESDASCPSQQTCSIASDVPCPSQQAGSIASEVPGSSRQAGSIASEVLGPSRQAGSIASEVPGPSRQAGSIASEVPGPSRQAGSIASEVPGPSR | FREHDGLKSNQCS-----LEQTQCSSKHSGPENNQCSSKHSGPENNQCSQEHDGSVNNQCSQEQDRSVNNQCSRVHDGTENNQCSREHDGPESNQCSREHDGPESNQCSREHDGPESNQCSREHDGPESNQC |
| GDF-9 | Seq ID NO 3DQESASSELKKPLV(C) | Seq ID No 4SEYFKQFLFPQNEC |
| 奶牛狗黑猩猩猫山羊人小鼠绵羊猪负鼠兔大鼠共有 | DQESVSSELKKPLVGQDTVSLELHKPLAGQETVSSELKKPLGGQETIGLEPQKPLVDQESVSSELKKPLVGQETVSSELKKPLGGQKAIRSEAKGPLLDQESASSELKKPLVAQDTVSSELKKPLVDERTGDPKAKSPKMGQDAVGSQLKQPLVGQKTLSSETKKPLTGQETVSSELKKPLV | SEYFKQFLFPQNECSEYLKHFLFPQHECSEYFKQFLLPQNECSEYFKQFLFPQNECSEYFKQFLFPQNECSEYFRQFLLPQNECSEYFKQFLFPQNECSEYFKQFLFPQNECSEYFKQFLFPQNECSEYFKQFLFPENECSEYFKQFVFPQDECSEYFRQFLFPQNECSEYFKQFLFPQNEC |
若干物种的成熟GDF-9和GDF-9B的氨基酸比对如图3a和3b所示。用Vector NTI的多重比对程序产生出了这些比对序列。该程序使用Clustal W算法(Thompson等，1994)。鉴定出编码蛋白质成熟区的区域并用该核苷酸序列产生预测的蛋白质序列。用于比对的序列(GenBank登录号)如下。GDF-9：奶牛(NM_174681)，山羊(AH014112)，绵羊(AF078545)，猪(NM_001001909)，狗(XM_538624)，猫(内部数据库中)，负鼠(AY033826)，兔(内部数据库中)，小鼠(NM_008110)，大鼠(NM_021672)，黑猩猩(XM_527008)和人(NM_005260)。GDF-9B：奶牛(AY572412)，鹿(内部数据库中)，狗(XM_549005)，猫(内部数据库中)，负鼠(AH012378)，黑猩猩(XM_529247)，人(AF082350)，小鼠(NM_021670)，兔(内部数据库中)，猪(AF458070)，山羊(内部数据库中)和绵羊(AF236079)。
调节***率可包括，通过向所述动物施用本发明的一种激动剂或拮抗剂，导致体内产生针对所述激动剂或拮抗剂的抗体，所述抗体接着结合GDF-9和/或GDF-9B N-末端结构域来影响其生物活性，从而增加或降低雌性哺乳动物的***率。
不受理论所限，要考虑到激动剂/拮抗剂、尤其是针对选自包括SEQ IDNO：3-6的组的一种或多种肽而产生的一种或多种抗体与GDF-9和/或GDF-9B的N-末端结构域结合，会导致有生物活性的GDF-9和/或GDF-9B的循环浓度改变。当该降低包括GDF-9B活性降低约50％的时候，以前观察到过***率的增加，尤其在Hanna绵羊中，其中GDF-9B基因的单个点突变将造成杂合动物中活性GDF-9B的量减半并造成***率增加和双生情况。在没有或仅有很少循环活性GDF-9B的纯合动物中，动物是不育的(Galloway等；2000)。相似地，在绵羊中观察到GDF-9基因中的点突变和相伴的***率调节(WO 03/102199；Hanrahan等，2003)。
因此推定，造成活性GDF-9和/或GDF-9B的循环水平降低约50％的本发明的激动剂或拮抗剂将导致增加***率，同时，造成将活性GDF-9和/或GDF-9B的循环浓度降低至约0的激动剂或拮抗剂将造成***的减少和雌性哺乳动物的不育。
本发明的激动剂或拮抗剂优选是抗体，其结合SEQ ID NO：1和2的GDF-9和/或GDF-9B的共有N-末端结构域。应当明白的是，术语“抗体”包括保留结合本文定义的共有结合结构域的能力的抗体片段或类似物，包括而不限于Fv、Fc、F(ab)2片段、ScFv分子，等等。抗体可以是多克隆或单克隆的，但优选是单克隆的。该抗体可通过现有已知的任何技术例如(Juengel等，2002)来制备，用于向动物施用，即用于被动免疫。可选地，该抗体可通过施用溶于合适佐剂中的抗原而在体内产生，即用于自动免疫。合适的佐剂包括福氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。本发明的抗体也可通过基因工程方法来生产，例如包括人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体，其能利用标准重组DNA技术来制备。
本发明进一步预期，本发明的一种或多种激动剂和/或拮抗剂与一种或多种已知能调节***率的活性成分的组合用于增强***的效果的用途。活性成分可选自包括下列的组：GDF-9；GDF-9B；BMPRII；BMPIB受体(ALK6)；ALK 5和BMP6；或其功能片段或变体。尤其是，本发明预期，BMP1B受体与结合SEQ ID NO：5或6肽的抗体或抗体片段(Fc)的组合用于调节雌性哺乳动物***的用途。
本发明进一步提供了药物组合物，其包括本发明的至少一种激动剂或拮抗剂连同药学上可接受的载体，用于调节***率。
可预期的是，将在动物模型或体外模型中测试本发明的激动剂或拮抗剂的生物活性，并且将合适的活性化合物配制入药物组合物。除了本发明的一种或多种激动剂或拮抗剂，本发明的药物组合物可包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其它本领域公知的材料。该材料应是无毒的并应当不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质将取决于药物组合物所需的性质和施用途径，如口服、静脉内、透皮、皮下、皮内、肌肉内或腹膜内。
口服施用的药物组合物可以是片剂、锭剂、胶囊、粉剂、颗粒剂或液体形式。片剂或其它固体口服剂型通常将包括固体载体，如明胶、淀粉、甘露醇、结晶纤维素、或其它药物制备中常用的惰性材料。相似地，液体药物组合物，如糖浆剂或乳剂，一般将包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。
对于静脉内、透皮、皮下、皮内或腹膜内注射，活性成分将是可接受的非肠道水溶液的形式，其不含热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。
在另一个具体实施方式中，本发明预期，一种或多种额外的***调节剂与本发明的药物组合物联合施用以赋予治疗方案额外或协同效果的用途。该额外的***调节剂的例子包括卵泡刺激激素、Androvax(雄甾烯二酮蛋白疫苗缀合物)、和类固醇激素。该调节剂可以分开、相继或同时与本发明的至少一种激动剂或拮抗剂施用，这取决于***是增加还是减少，这对技术人员来说是能理解的。
施用本发明的药物组合物优选是以“治疗有效量”进行，这是足以显示出个体所需的益处的剂量。实际施用量、和施用速率和时间进程，将取决于雌性哺乳动物遭受的病况的性质和严重性。开治疗处方，如决定剂量等，是在开业医生和其它内科医生的职责范围内，其典型地将考虑要治疗的病症、个体病患状况、递送位点、施用方法和医师所知的其它因素。上述技术和规程的例子可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.(编)，1980中找到。
本发明现在将通过参考特定实施例来更详细地描述，其不应被理解为以任意方式对本发明的范围构成了限制。
实施例
实施例1
GDF-9和GDF-9B N-末端结构域的肽和抗体在调节绵羊***中的用途。
合成了4个12-15mer肽，其与GDF-9和GDF-9B蛋白序列的N-末端结构域一致，并在需要时包括额外的残基从而促进其缀合到匙孔血蓝蛋白(KLH)上以产生抗原。所述肽序列是：
DQESASSELKKPLV(C) (SEQ ID NO：3)；
SEYFKQFLFPQNEC (SEQ ID NO：4)；
QAGSIASEVPGPSR(C) (SEQ ID NO：5)；和
SREHDGPESNQC (SEQ ID NO：6)；
在本研究中，向几组非发情期Romney母羊、每组10只以0.4mg/只母羊的量注射溶于福氏完全佐剂的每种肽-KLH缀合抗原，并向10只非发情期Romney母羊以0.4mg/只母羊的量注射KLH抗原作为对照组。接着在以月为间隔的4个时间点上，再用溶于斯盘/吐温/油混合物中的额外的抗原(每个时间点上0.2mg/只母羊)强化免疫动物(皮下)，并在繁殖期利用切除了输精管的公羊监测发情活跃度。通过在四个连续的发情周期中的腹腔镜检查来评估***率，并且在最近的一次腹腔镜检查后约20-30天终止实验时再一次评估***率。通过对每只母羊的这5次观察进行平均来确定平均***率。
所有对照母羊显示出周期性发情活跃性。SEQ ID NO：3-6肽对***率影响的结果显示相对于对照母羊，肽处理的母羊***停止，其与如下表2所示的抗GDF-9和抗GDF-9B的血清抗体水平的显著增加相关。如前所述(Juengel等，2002)，绵羊血浆以1∶20,000稀释后，抗体水平用ELISA法测定。
第一次加强免疫注射后2周内，SEQ ID NO：3-5的肽使大多数动物的***停止。停止***一直保持到实验结束。SEQ ID NO：6的肽直到第三次观察(3次加强免疫注射后)才达到显著的***停止，并且仅仅在50％的动物中实现了停止。可是，到最后一次加强免疫注射时，10只动物中的9只显示出了***停止(表3)。通过观察卵巢是否缺少表面可见的黄体来测量***的停止。通过观察子宫而评估出被认为处于发情期的母羊，将其排除出表3的结果。
表2
| 处理 | ***率(平均值±SEM) | 抗体滴度(平均值±SEM) | |
| 处理前 | 处理后 | ||
| KLH(对照)KLH-肽(SEQ ID NO：3)KLH-肽(SEQ ID NO：4)KLH-肽(SEQ ID NO：5)KLH-肽(SEQ ID NO：6) | 1.26±0.080.34±0.23++0.16±0.09+++0.08±0.05+++1.32±0.37 | 0.023±0.004(GDF9)0.019±0.003(BMP15)0.024±0.0020.030±0.0050.035±0.0170.018±0.002 | 0.058±0.030(GDF9)0.040±0.14(BMP15))2.355±0.337***2.182±0.250***1.193±0.272**2.621±0.244*** |
利用Mann-Whitney测验，相对于KLH(对照)时，++P＜0.01、+++P＜0.001
在利用成对T-检验的处理中，处理前相对于处理后，**P＜0.01、***P＜0.001
表3显示不活动的卵巢的母羊数/检测的母羊数。
| 处理 | 观察 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| KLH(对照)KLH-肽(SEQ ID NO：3)KLH-肽(SEQ ID NO：4)KLH-肽(SEQ ID NO：5)KLH-肽(SEQ ID NO：6) | 0/108/10***8/10***8/10***1/10 | 0/88/10***9/10***10/10***2/10 | 0/98/10***10/10***10/10***5/10* | 0/910/10***10/10***10/10***5/10* | 0/1010/10***10/10***10/10***9/10*** |
利用x2，相对于KLH(对照)时，*P＜0.05、***P＜0.001
这些数据无可争辩地显示出，通过施用靶向于GDF-9或GDF-9B N-末端结构域的肽抗原可诱导***率显著降低。在该特定实施例中，通过自动免疫(即施用抗原以在体内产生抗体)会引起该效果。然而，可预计通过被动免疫，即施用抗体本身，也将见到相似效应。
实施例2
GDF-9和GDF-9B N-末端结构域的肽和抗体对牛***的调节。
合成了2个15mer肽，其与牛GDF-9和GDF-9B蛋白序列的N-末端结构域一致，并在需要时包括额外的残基从而促进其缀合到KLH上以产生抗原。所述肽序列是：
DQESVSSELKKPLV(C)(SEQ ID NO：7)；和
QAGSIASEVPGPSR(C)(SEQ ID NO：5)。
注意，SEQ ID NO：7是SEQ ID NO：3的功能变体，其包含单氨基酸改变(氨基酸第5位上A→V)。
在本研究中，几组弗里斯兰杂交小母牛、每组10只以0.4mg/只小母牛的量注射溶于2ml福氏完全佐剂的每种肽-KLH缀合抗原，进行4次每次0.5ml量的注射；向10只小母牛以0.4mg/只小母牛的量注射肽-KLH缀合抗原，并向10只小母牛注射KLH抗原作为对照组。接着在以月为间隔的2个时间点上，再用溶于斯盘/吐温/Marcol混合物中的额外抗原(每个时间点上0.2mg/只母牛)强化免疫动物(皮下)。第二次强化免疫后约2周屠宰动物并收集卵巢。通过直观卵巢检查来确定卵巢活性。根据卵巢表面上可见的黄体数量来评估***率。如果它通过形态学标准(小、缺少血管形成、颜色黯淡)并具有额外的功能性黄体显示出无功能，或通过形态学(小、缺少血管形成、颜色黯淡)和内分泌学标准(在收集卵巢时以及2周前收集的血样中***水平低)显示是没有功能的，则确定该黄体为退化的(因而不计入***率分值)。在用苏木精和曙红染色的5μm组织切片上评估卵泡的发育。
在初次免疫和第一次和第二次加强免疫时、以及第一次加强免疫后12天、和宰杀前，收集外周静脉血样(通过有肝素的vaccutainer收集10ml)。分析血浆样品的抗体滴度和***浓度。
所有小母牛在免疫前都显示出有正常的卵巢活性。如所测得的***率所示，用SEQ ID NO：5肽单独或与SEQ ID NO：7肽一起处理造成了显著的卵巢活性的改变。用SEQ ID NO：7肽单独处理，显示了有30％的双***(异常地高)，然而这与所检测的动物数量相比并不是统计学上显著的。有趣的是，注意到了SEQ ID NO：5肽单独处理，会造成3只动物的卵巢活动停止，即显著降低***率，这与绵羊中所见到的结果相似(参见下表4)。
表4
| 处理 | ***率 | ||||
| 0 | 1 | 2 | ≥3 | x2 | |
| KLH(对照) | 0 | 9 | 1 | 0 | |
| KLH-肽(SEQ ID NO：5) | 3 | 3 | 4 | 0 | ＜0.01 |
| KLH-肽(SEQ ID NO：7) | 0 | 7 | 3 | 0 | NS |
| KLH-肽(SEQ ID NO：5)和KLH-肽(SEQ ID NO：7) | 0 | 4 | 2 | 4 | ＜0.05 |
对于x2分析，在每个处理组与KLH对照组作比较时，动物被分成正常(***率为1)或受影响的(***率为0或≥2)。NS＝无显著不同。
收集时，注意到用缀和于KLH的GDF-9B肽(SEQ ID NO：5)、缀和于KLH的GDF-9肽(SEQ ID NO：7)、或缀和于KLH的GDF-9肽(SEQ ID NO：7)和缀和于KLH的GDF-9B肽(SEQ ID NO：5)的组合进行免疫的小母牛的卵巢，与用KLH免疫的对照小母牛的卵巢有形态差异。GDF-9和/或GDF-9B免疫的小母牛的卵巢几乎没有表面可见的窦卵泡。当比较卵巢的组织切片时，得到相似的观察(参见图4)。在用苏木精和曙红染色的5μm组织切片上定量该观察结果，测定窦空间所占切片总面积的百分比、每单位面积上的窦卵泡数和卵泡的平均大小(面积)(参见下表5)。用SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7的肽或这两者处理，会减少(P＜0.01)窦空间所占切片的总面积、每单位面积上的窦卵泡数和卵泡的平均大小(参见下表5)。因而，这些结果显示，如果用本发明的肽片段所进行的免疫持续更长时间，则会降低***率。事实上，有些用SEQ ID NO：5肽(GDF-9B)处理的动物证明会相对于对照而增加卵巢停止的几率(参见上表4)。
表5
用匙孔血蓝蛋白(KLH)、缀和于KLH的生长分化因子9(GDF9；SEQID NO 7：DQESVSSELKKPLV(C))肽、缀和于KLH的生长分化因子9B(GDF-9B，SEQ ID NO 5；QAGSIASEVPGPSR(C))和缀和于KLH的GDF-9肽+缀和于KLH的GDF-9B肽免疫对窦空间所占组织切片面积的百分比、面积校正的卵泡总数和平均卵泡面积的影响。
| 处理 | 检测的卵巢数 | 检测的切片总数 | 窦空间所占组织切片的面积％ | 面积校正的卵泡总数 | 平均卵泡面积(mm2) |
| KLH | 10 | 72 | 27.4±2.0 | 7.3±0.6 | 4.0±0.5 |
| KLH-肽(SEQ ID NO：5) | 8 | 47 | 1.0±0.3** | 2.2±0.4** | 0.4±0.1** |
| KLH-肽(SEQ ID NO：7) | 8 | 46 | 1.1±0.4** | 2.3±0.6** | 0.4±0.1** |
| KLH-肽(SEQ ID NO：5)KLH-肽(SEQ ID NO：7) | 9 | 66 | 1.6±1.0** | 1.6±0.3** | 0.8±0.4** |
**P＜0.01
提供的值是平均值±平均值的标准差
这些结果证明了，N-末端肽有调节牛的***和卵泡发育的活性。施用剂量与绵羊的相同，可是牛的总体结果是***增加，而不是减少。这可能归因于“绵羊剂量”，其造成弱的免疫，导致活性GDF-9和/或GDF-9B的循环水平降低约50％，如上所述，这会造成***率的增加。
通过前述(Juengel等，2002)稍微修改的ELISA的抗体滴度数据证实了这，可参见下表6。包被在微滴定板上的抗原是200ng绵羊GDF-9成熟蛋白或100ng绵羊GDF-9B成熟蛋白。利用1∶20,000稀释度的兔抗牛IgG来检测抗体。母牛血清被稀释成1∶500。这较以上实验1中绵羊血清所需的稀释度少40倍，提示了施用给牛的GDF-9和/或GDF-9B肽剂量是“微弱的”剂量。
可是，如上所述，考虑到卵泡发育的降低，通过持续更长期的免疫疗法可能诱导出牛的***率下降。
表6
当用ELISA测量以确定免疫应答时免疫前或免疫后(就在收集卵巢前)收集的牛血清的平均光密度读数。
| 免疫处理 | 包被的抗原 | |||
| GDF-9 | GDF-9B | |||
| 免疫前 | 免疫后 | 免疫前 | 免疫后 | |
| KLH(对照) | 0.40+0.09 | 0.32+0.05 | 0.05+0.01 | 0.23+0.18 |
| KLH-肽(SEQ ID NO：7) | 0.46+0.17 | 1.90+0.26* | 0.25+0.13 | 0.42+0.20 |
| KLH-肽(SEQ ID NO：5) | 0.37+0.05 | 0.35+0.04 | 0.12+0.01 | 1.61+0.27* |
| KLH-肽(SEQ ID NO：7)KLH-肽(SEQ ID NO：5) | 0.39+0.07 | 1.15+0.16* | 0.13+0.01 | 1.12+0.28* |
利用成对T检验在处理组内比较免疫前和免疫后，*P＜0.01。
预计牛中较大的剂量，即足以将活性GDF-9和/或GDF-9B循环水平降低至约为0，或免疫更长时期，将显著降低牛的***率。
这些数据无可争辩地显示出，通过施用靶向于GDF-9或GDF-9B N-末端结构域的抗原肽可诱导***率的显著调节和窦卵泡发育，显示了GDF-9和GDF-9B N-末端成熟区域对于在牛中的生物活性是重要的。在该特定实施例中，通过自动免疫(即施用抗原以在体内产生抗体)会产生该效果。然而，预计通过被动免疫，即施用抗体本身，也将见到相似效应。
实施例3
针对GDF-9和GDF-9B肽片段而产生的抗体对3H胸腺嘧啶核苷体外掺入大鼠颗粒细胞的作用。
利用前述方法(McNatty等，2005)，当直接加入颗粒细胞培养物时，测试各种抗体制品对绵羊或鼠GDF-9和绵羊GDF-9B对大鼠颗粒细胞的影响加以中和的能力。每次处理中总共加入100μg/ml IgG，其由纯化自用GDF-9或GDF-9B肽片段免疫的绵羊的IgG组成，用纯化自用KLH免疫的绵羊的IgG作对比。抗体能中和它们所针对的生长因子的效应(参见图5和6)。另外显示出，该应答在受测试的2个抗绵羊GDF-9和GDF-9B的抗体样本中是剂量依赖性的(P＜0.001，参见图7和8)。
绵羊和鼠GDF-9和绵羊GDF-9B对针对蛋白质N-末端区域肽片段(如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5)的抗体对大鼠颗粒细胞胸腺嘧啶核苷掺入作用的中和作用，再加上这些肽在绵羊(参见实施例1)和牛(参见实施例2)中自动免疫的效应，显示了蛋白质的该区域对于在多种物种中的生物活性是重要的。这些结果也显示了，抗GDF-9和GDF-9B成熟区域的N-末端结构域的抗体能有效地被动中和GDF-9和GDF-9B。
对所属领域技术人员显而易见的是，尽管为了清楚和理解的目的而详细描述了本发明，然而还可以实施本文所述的具体实施方式和方法的各种修改和备选方案而不偏离所附权利要求限定的本发明范围。
工业实用性
本发明提供了用于在包括人的雌性哺乳动物中调节***率并进而调节繁殖力的组合物和方法。
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所有参考文献都全文纳入本说明书参考。
Claims (34)
1.GDF-9 N-末端结构域的分离的片段，所述片段具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述GDF-9 N-末端结构域由氨基酸序列DQESASSELKKPLVPASVNLSEYFKQFLFPQNEC(SEQ ID NO：1)组成，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
2.权利要求1所述的分离的肽片段，所述片段包含来自SEQ ID NO：1第1-9或25-34位的至少一个氨基酸。
3.GDF-9B N-末端结构域的分离的肽片段，所述片段具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述GDF-9B N-末端结构域由氨基酸序列QAGSIASEVPGPSREHDGPESNQC(SEQ ID NO：2)组成，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
4.权利要求3所述的分离的肽片段，所述片段包含来自SEQ ID NO：2的第1-5或21-23位的至少一个氨基酸。
5.GDF-9 N-末端结构域的分离的肽片段，所述片段具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述片段包含来自SEQ ID NO：1的第1-9或25-34位的至少一个氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
6.GDF-9B N-末端结构域的分离的肽片段，所述片段具有调节雌性哺乳动物***的能力，其中所述片段包含来自SEQ ID NO：2的第1至5或21至23位的至少一个氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
7.权利要求1至6任一项所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的至少5个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
8.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少8个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
9.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少10个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
10.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少12个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
11.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少14个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
12.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少16个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
13.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少18个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
14.权利要求7所述的分离的肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少20个连续的氨基酸，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
15.权利要求1至14任一项所述的分离的肽片段，所述片段选自下组：
DQESASSELKKPLV(C) (SEQ ID NO：3)；
SEYFKQFLFPQNEC (SEQ ID NO：4)；
QAGSIASEVPGPSR(C) (SEQ ID NO：5)；和
SREHDGPESNQC (SEQ ID NO：6)；
或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
16.与权利要求1至15任一项的一种或多种肽片段结合的抗体或抗体片段。
17.调节雌性哺乳动物***率的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求1-15任一项所述的一种或多种分离的肽片段的步骤。
18.调节雌性哺乳动物***率的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求16的一种或多种抗体或抗体片段的步骤。
19.调节雌性哺乳动物***率的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求1至15任一项所述的一种或多种分离的肽片段、连同权利要求16所述的一种或多种抗体或抗体片段的步骤。
20.调节雌性哺乳动物***率的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的选自SEQ ID NO 3-6的一种或多种肽片段，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物、和/或与其结合的抗体或抗体片段。
21.权利要求1至15任一项所述的一种或多种分离的肽片段在制备用于调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途。
22.权利要求16所述的一种或多种抗体或抗体片段在制备用于调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途。
23.a)权利要求1-15任一项所述的一种或多种分离的肽片段和b)权利要求16所述的一种或多种抗体或抗体片段在制备用于调节雌性哺乳动物***的药物中的用途，其中药物被配制成用于分开、相继或同时施用a)和b)。
24.权利要求21至23任一项所述的用途，其中分离的肽片段选自包括SEQID NO 3-6的组，或其功能衍生物、同源物、类似物或模拟物。
25.药物组合物，其包含权利要求1至15任一项所述的一种或多种分离的肽片段，连同药学上可接受的载体或赋形剂。
26.药物组合物，其包含权利要求16所述的一种或多种抗体或抗体片段，连同药学上可接受的载体或赋形剂。
27.药物组合物，其包含权利要求1至15任一项所述的一种或多种分离的肽片段和权利要求16所述的一种或多种抗体或抗体片段，连同药学上可接受的载体或赋形剂。
28.药物组合物，其包含选自包括SEQ ID NO 3-6的组的一种或多种肽或其功能变体、和/或与其结合的抗体或抗体片段，连同药学上可接受的载体或赋形剂。
29.调节雌性哺乳动物***率的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求25至28任一项所述的组合物，并组合以选自包括GDF-9、GDF-9B、BMPRII、BMPIB受体(ALK6)、ALK5和BMP6或其功能性片段或变体的组的一种或多种化合物。
30.调节雌性哺乳动物***率的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的与SEQ ID NO：3至6任一项肽结合的抗体或抗体片段(Fc)，并组合以BMP1B受体(ALK6)。
31.调节雌性哺乳动物***率的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求25-28任一项所述的组合物，并组合以选自由FSH、androvax和类固醇激素组成的组的***调节剂。
32.a)权利要求25至28任一项所述的组合物和b)选自下组的一种或多种化合物：GDF-9、GDF-9B、BMPRII、BMPIB受体(ALK6)、ALK5和BMP6或其功能片段或变体在制备调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途，其中所述药物被配制成用于分开、相继或同时施用a)和b)。
33.a)与SEQ ID NO：3-6任一项的肽结合的抗体或抗体片段(Fc)和b)BMP1B受体(ALK6)在制备用于调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途，其中所述药物被配制成用于分开、相继或同时施用a)和b)。
34.a)权利要求25至28任一项所述的组合物和b)选自由FSH、androvax和类固醇激素组成的组的***调节剂在制备调节雌性哺乳动物***率的药物中的用途，其中所述药物被配制成用于分开、相继或同时施用a)和b)。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
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