CN101122603A - 可溶性协同信号分子在检测类风湿关节炎中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定液体样品中可溶性信号分子方法，并且公开了使用PD－1或其配体的抗体可制备体外辅助检测类风湿关节炎的试剂和试剂盒。利用本发明提供的检测方法，首次证实了人体中可溶性PD－1和可溶性PD－L1的存在。本发明提供的试剂盒有利于临床检验及实验室研究。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测样品的方法，更具体地涉及运用免疫学技术检测可溶性的协同信号分子的方法。
背景技术
自身免疫病严重危害人类身体健康，以类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)为例，它呈世界性分布，热带少见，温带、寒带多见。在中国人群发病率为0.3％-0.5％，患者约有400～500万，随年龄增加，患病率有增高的趋势，女性与男性发病率比例为3∶1。
自身免疫应答紊乱是导致这类疾病病情持续进展的重要原因。以RA为例，浸润在滑膜组织中的自身反应性T细胞在细胞免疫和体液免疫中发挥关键的致病作用。自身反应性T细胞由外源性抗原或改变的自身抗原所活化，通过粘附分子的作用进入关节，介导细胞免疫和体液免疫，造成滑膜组织损伤。这群T细胞表达活化/记忆性的标志如CD45R、CD44、HLA-DR以及VLA-1等，表明它们处于持续的高活化状态。
对于自身反应性T细胞的持续活化原因，经典的双信号学说认为，T细胞的活化需要TCR与抗原肽：MHC分子复合物介导的第一信号以及由协同信号分子B7-CD28通路提供的第二信号介导。协同信号分子是表达在细胞表面的糖蛋白，它们参与调控TCR信号而促进或抑制T细胞的致敏、活化、生长和分化。根据其对T细胞功能发挥正性或负性调控作用，可将其分为协同刺激分子或协同抑制分子。
PD-1(程序性死亡-1，Programmed death-1)蛋白是表达于活化T、B细胞以及髓系细胞表面的协同抑制受体。PD-1是一种具有免疫调节功能的协同抑制分子，与其配体结合可抑制下游信号事件而抑制T、B细胞增殖和细胞因子的产生。抑制性信号通路受胞浆区ITSM的介导，磷酸化的酪氨酸残基募集SHP-2磷酸酶，使TCR、BCR信号通路成分脱磷酸化而发挥抑制效应。PD-1的作用与抗原剂量密切相关，对低浓度抗原刺激所致的增殖反应有较强的抑制效应。
协同抑制分子CTLA-4、PD-1等在T细胞活化后表达上调而抑制T细胞免疫应答，在维持外周免疫耐受中发挥重要作用。协同刺激信号与抑制信号的平衡一旦打破将会导致自身免疫病等免疫病理现象的发生。
然而，目前仅部分研究了CD28、ICOS在RA患者滑膜液浸润细胞中的表达情况，尚且缺乏深入的机理研究。协同信号分子如PD-1等与RA的确切关系尚不为人们所知，对协同信号分子以及它们的可溶性形式在RA中的***研究亟待进行。
由此可见，可溶性PD-1及其配体是进一步了解研究RA等自身免疫疾病的自身免疫应答紊乱状态的关键因素之一，因此本领域迫切需要提供一种方法，用此方法可以检测到人体内天然的可溶性PD-1及其配体PD-L1，从而更有效地开展与此类疾病相关的研究。
发明内容
本发明旨在提供一种体外检测液体样品中的可溶性PD-1(sPD-1)及其配体的方法。
本发明的另一个目的是提供这种方法的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种体外检测液体样品中可溶性PD-1蛋白或其配体的方法，包括步骤：
(a)将所述样品与抗PD-1的抗体或抗PD-1配体的抗体进行接触，从而形成可溶性PD-1蛋白-抗体复合物或可溶性PD-1配体-抗体复合物；
(b)检测可溶性PD-1蛋白-抗体复合物或可溶性PD-1配体-抗体复合物，从而确定可溶性PD-1蛋白或其配体的存在与否。
在另一优选例中，在步骤(b)通过夹心法检测可溶性PD-1蛋白-抗体复合物或可溶性PD-1配体-抗体复合物。
在另一优选例中，它包括步骤：
(1)将PD-1或其配体的抗体包被固相载体，得到包被有PD-1或其配体的抗体的固相载体；
(2)在包被有PD-1或其配体的抗体的固相载体上加入液体样品；
(3)加入酶标记的不同种属抗PD-1或其配体抗体；
(4)加入底物进行酶催化反应。
在另一优选例中，所述的PD-1或其配体的抗体为多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的配体是PD-L1。
在另一优选例中，所述的PD-1或其配体为人PD-1或其配体。
在另一优选例中，所述的液体样品包括血清、血浆、滑膜液、尿液或乳汁等。
在本发明的第二方面，提供了一种抗可溶性PD-1蛋白或其配体的抗体的用途，它可用于制备辅助性检测类风湿关节炎的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂是一固相载体，所述的固相载体上固定有抗PD-1或其配体的抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：
固相载体，
PD-1或其配体的抗体，
酶标记的不同种属抗PD-1或其配体抗体，底物。
在另一优选例中，所述的固相载体上包被有PD-1或其配体的抗体。
在另一优选例中，所述的配体为PD-L1。
在另一优选例中，所述的PD-1或其配体为人PD-1或其配体。
在另一优选例中，所述的PD-1或其配体的抗体为多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的不同种属抗人PD-1或其配体抗体为单克隆抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种体外检测液体样品中可溶性PD-1蛋白或其配体的试剂盒，它包括：
固相载体，
PD-1或其配体的抗体，
酶标记的不同种属抗PD-1或其配体抗体，底物。
在另一优选例中，上述试剂盒中所述的固相载体上包被有PD-1或其配体的抗体。
在另一优选例中，上述试剂盒中所述的PD-1或其配体的抗体为多克隆抗体。
在另一优选例中，上述试剂盒中所述的不同种属抗人PD-1或其配体抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，上述试剂盒中所述的PD-1或其配体为人PD-1或其配体。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括包被抗体的缓冲液和底物缓冲液。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括洗涤液，封闭液和终止液。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括说明书。
据此，本发明提供了一种方法，用此方法可以检测到人体内天然的可溶性PD-1及其配体PD-L1，从而可更有效地辅助性检测类风湿关节炎。
附图说明
图1A、B显示了RA患者外周血和滑膜液中单个核细胞协同信号分子的mRNA表达水平；*表示与其它组比较p＜0.05。
HC表示健康人对照，RA表示类风湿关节炎患者，OA表示骨关节炎对照，PB表示外周血，SF表示滑液。
图1C显示了RA患者不同细胞亚群协同信号分子的mRNA表达水平。
*表示与RA患者外周血(PB)组比较p＜0.05，
+表示与RA患者的滑液来源的CD8+T细胞组比较p＜0.05。
图2显示了流式细胞术(FACS)分析协同信号分子在RA患者不同细胞亚群的表达水平。
图3显示了外周血和滑膜液中单个核细胞Fas的mRNA表达水平。
图4显示了细胞因子对协同信号分子的诱导作用。
图5显示了RA患者及对照组滑膜液或血清中可溶性协同信号分子的检测结果。
图6显示了PD-1全长mRNA及不同长度剪切体的表达情况。
图7显示了重组人PD-1-Ig、PD-L1-Ig对T细胞活化增殖的影响。
具体实施方式
本发明人在对RA病理机制进行了深入的研究后发现，可溶性PD-1及其可溶性配体PD-L1在RA患者血清和滑膜液中显著升高，血清中增高的可溶性PD-1和可溶性PD-L1(sPD-1和sPD-L1)与类风湿因子(RF)存在显著相关性，揭示可溶性PD-1等分子对T细胞异常活化具有一定的病理调控作用。
具体而言，发明人原本推测协同刺激分子在RA患者关节局部表达水平升高，而协同抑制分子在滑膜浸润T细胞和巨噬细胞表面可能表达下调，负调控机制的缺乏导致T细胞的持续活化而介导细胞免疫和体液免疫应答，关节损害持续进展。
然而，发明人发现在RA患者滑膜液浸润T细胞中协同抑制分子PD-1、CTLA-4等表达显著增加，它们相应的配体在滑膜液浸润巨噬细胞表面也上调表达，继而发明人发现可溶性协同信号分子拮抗了协同抑制分子的调控作用而对自身反应性T细胞的持续活化发挥病理调控作用。
在上述发现的基础上，本发明人制备了一种试剂盒，运用ELISA方法，首次在人体内证实了可溶性PD-1和可溶性PD-L1的存在，也建立了检测液体样品中可溶性PD-1或可溶性PD-L1的方法。
辅助性检测类风湿关节炎的方法
本发明提供的检测类风湿关节炎的方法是在液体样品中检测可溶性协同信号分子，优选可溶性PD-1和/或其配体，所述的配体优选PD-L1。
所述的液体样品为血清，血浆，滑膜液，尿液，或乳汁，其中优选使用血清或滑膜液。
可以用本领域常规的方法检测液体样品中的可溶性协同信号分子，优选使用抗原抗体结合的免疫学方法，即通过将样品中的可溶性协同信号分子与已知的该信号分子的抗体结合来判断样品中是否存在该可溶性协同信号分子。更佳地选用酶联免疫吸附测定(ELISA)。
本发明的一个优选例中通过以下步骤进行检测：
(a)将人PD-1或人PD-L1抗体包被ELISA板；
(b)加入液体样品使形成可溶性人PD-1与人PD-1抗体复合物或可溶性人PD-L1与人PD-L1抗体复合物I；
(c)加入酶标记的羊/或鼠抗人PD-1抗体或抗人PD-L1抗体使产生带酶标记的双抗体夹心复合物II；
(d)加入底物进行酶催化反应，根据OD值判断、检测。
在本发明的另一优选例中通过以下步骤进行检测：
(a)将人PD-1或人PD-L1抗体包被ELISA板；
(b)加入液体样品使形成可溶性人PD-1与人PD-1抗体复合物或可溶性人PD-L1与人PD-L1抗体复合物I；
(c)加入羊/或鼠抗人PD-1抗体或抗人PD-L1抗体使产生双抗体夹心复合物II；
(d)加入酶标记的鼠抗羊或羊抗鼠抗抗体使产生带酶标记的复合物III；
(e)加入底物进行酶催化反应，根据OD值判断、检测。
在本发明的另一优选例中，在羊/或鼠抗人PD-1抗体或抗人PD-L1抗体上标记生物素，再与酶标记的链霉亲和素结合用于检测。
所述的人PD-1或人PD-L1抗体是本领域常用的，优选多克隆抗体。所述的多克隆抗体可利用本领域技术人员所熟知的方法制得。
所述的羊/或鼠抗人PD-1抗体或抗人PD-L1抗体是本领域常用的，优选单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本发明提供的检测方法可以定性，也可以定量。
辅助性检测类风湿关节炎的试剂
本发明提供了一种体外检测液体样品中可溶性PD-1或其配体的试剂。所述的试剂是一固定有抗PD-1或其配体的抗体的固相载体。
所述的固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应，即通常所称的ELISA板。其材料可以是本领域技术人员所熟悉的，包括(但不限于)聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺，纤维素等。其形状是本领域技术人员所熟悉的，包括(但不限于)微量滴定板、小珠和小试管等。其中优选聚苯乙烯微量滴定板。所述的微量滴定板可以是单孔或多联孔条。
所述的PD-1或PD-L1的抗体用于包被固相载体，优选羊抗人PD-1或羊抗人PD-L1的抗体，它们可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选多克隆抗体，例如R&D Systems公司的产品。
可以用本领域熟知的方法进行抗体包被，优选的方法是将人PD-1或人PD-L1抗体用包被缓冲液制成浓度为1-10μg/ml的溶液，加于固相载体表面，4℃放置18～24小时或37℃保温2小时后用洗涤缓冲液将未吸附在固相载体表面的抗体洗去；然后加入封闭液。所述的包被缓冲液选用(但不限于)：pH9.6的碳酸盐缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液，pH7-8的Tris-HCL缓冲液。所述的洗涤缓冲液选用(但不限于)：含0.05％吐温20的磷酸缓冲液。所述的封闭液选用(但不限于)：胎牛血清，羊血清或兔血清。
辅助性检测类风湿关节炎的试剂盒
本发明提供了一种体外检测液体样品中可溶性PD-1或其配体的试剂盒。所述的试剂盒包括固相载体，PD-1的抗体或PD-L1的抗体，酶标记的不同种属抗PD-1或抗PD-L1抗体，底物。
所述的固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应，即通常所称的ELISA板。其材料可以是本领域技术人员所熟悉的，包括(但不限于)聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺，纤维素等。其形状是本领域技术人员所熟悉的，包括(但不限于)微量滴定板、小珠和小试管等。其中优选聚苯乙烯微量滴定板。所述的微量滴定板可以是单孔或多联孔条。
所述的PD-1或PD-L1的抗体用于包被固相载体，优选羊人PD-1或羊人PD-L1的抗体，它们可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选多克隆抗体，例如R&D Systems公司的产品。
可以用本领域熟知的方法进行抗体包被，优选的方法是将人PD-1或人PD-L1抗体用包被缓冲液制成浓度为1-10μg/ml的溶液，加于固相载体表面，4℃放置18～24小时或37℃保温2小时后用洗涤缓冲液将未吸附在固相载体表面的抗体洗去；然后加入封闭液。所述的包被缓冲液选用(但不限于)：pH9.6的碳酸盐缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液，pH7-8的Tri s-HCL缓冲液。所述的洗涤缓冲液选用(但不限于)：含0.05％吐温20的磷酸缓冲液。所述的封闭液选用(但不限于)：胎牛血清，羊血清或兔血清。
本发明试剂盒可包括鼠/羊抗人PD-1抗体或人PD-L1抗体作为与液体样品反应的抗体。所述的反应用抗体上可带有酶标识构成所述的酶标识的非人种属抗人PD-1或抗人PD-L1抗体。所述的非人种属抗体是单克隆或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
本发明可以将酶标识在羊抗鼠或鼠抗羊的抗体上。本发明还可以在鼠/羊抗人PD-1抗体或人PD-L1抗体上标记生物素，再与酶标记的链霉亲和素结合用于检测。
可以使用本领域所熟知的酶，例如(但不限于)：辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)，碱性磷酸酶(alkaline phosohatase，AP)，葡萄糖氧化酶和β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，其中优选HRP。
本发明试剂盒包含本领域熟知的底物，包括(但不限于)：邻苯二胺(O-phenylenediamine，OPD)、四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)，2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[2，2’-azino-di-(3-ethylbenz iazobine sulfonate-6)，ABTS]，3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid，HPPA]，对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)等，其中优选TMB。
使用的底物缓冲液是本领域熟知的，例如(但不限于)：PH5.0磷酸盐柠檬酸，在本发明的一个优选例中，用该底物缓冲液配制TMB使用液，使用液中含有：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液(PH5.5)10ml，0.75％H2O2 32μl。
在本发明的一个优选例中，试剂盒还包括酶催化的显色反应的终止液，终止液的pH1-6，优选2NH2SO4，或1％十二烷基硫酸钠。
本发明的试剂盒还可以包括阴性对照品和阳性对照品。所述的阴性对照品为不含PD-1或PD-L1的液体，可以是(但不限于)以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似；或正常人血清。所述的阳性对照品以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，在本发明的一个优选例中，所述的阳性对照品为重组人PD-1或PD-L1嵌合体。
本发明提供的试剂盒可用于定性，也可用于定量检测。
用本发明的试剂盒进行检测时，可以按本领域熟知的方法，一种优选的方法包括步骤：
(1)将人PD-1或人PD-L1的多克隆抗体包被ELISA板，37℃过夜，用洗涤缓冲液洗板，加入封闭液后再洗板；
(2)在不同的孔内分别加入正常人血清，样品血清或滑膜液和人PD-1或人PD-L1融合蛋白标准品，37℃孵育2小时，洗板；
(3)加入反应抗体，即鼠抗人PD-1单克隆抗体或鼠抗人PD-L1单克隆抗体，37℃孵育2小时，洗板；
(4)加入HRP标记的羊抗鼠IgG(针对人Ig的抗体已吸收)，37℃孵育2小时，洗板；
(5)加入TMB底物显色后加入终止液终止反应；
(6)在酶标仪上读出OD值。
定量测定时，将人PD-1或人PD-L1融合蛋白标准品梯度稀释的浓度与对应的OD值作图得到标准曲线；根据样品的OD值由标准曲线测得样品的量。
在另一优选例中，上述步骤(3)和(4)变为：
(3’)加入生物素标记的反应抗体，即鼠抗人PD-1单克隆抗体或鼠抗人PD-L1单克隆抗体，37℃孵育2小时，洗板；
(4’)加入HRP标记的链霉亲和素，37℃孵育2小时，洗板。
本发明的主要优点在于：
1、首次建立了在液体样品中检测可溶性PD-1及其配体的方法，并首次证实了人体内存在可溶性PD-1和可溶性PD-L1；
2、本发明提供的方法可作为体外辅助检测类风湿关节炎的有效手段而用于临床检验和实验室研究；
3、本发明提供的检测方法可以利用现有设备(如酶标仪)，成本低廉，适于推广。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
检测可溶性协同信号分子
美国风湿病协会1987年类风湿关节炎诊断标准
1.晨僵至少1小时(≥6周)。
2.3个或3个以上关节肿(≥6周)。
3.对称性关节肿(≥6周)。
4.腕、掌指、近端指关节肿胀(≥6周)。
5.皮下结节。
6.手X线改变(至少有骨质疏松和关节间隙狭窄)。
7.类风湿因子阳性(滴度＞1∶20)。
以上7项中具备4项或四项以上即可诊断。
材料和方法
1材料
淋巴细胞分离液LymphoprepTM(AXIS-SHIELD)；
小鼠抗人单抗anti-CD4-PercP，anti-CD4-FITC，anti-CD8-FITC，anti-CD14-FITC，anti-CTLA-4-APC，anti-PD-1-FITC，anti-CD80-PE，anti-PD-L1-PE-CY7及相应同型对照抗体(BD Bioscience)；
Rneasy Mini Kit(Qiagen)；Sensiscript RT Kit(Qiagen)；人可溶性CTLA-4 ELISA试剂盒(Bender MedSystems)；人可溶性CD80 ELISA试剂盒(Bender MedSystems)；
重组人细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α(R&D Systems)；
CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD14+单核细胞分选试剂盒(Dynal Biotech)；
抗人CD3和CD28单抗(eBioscience)；[3H]-TdR(上海原子核研究所)；人CTLA-4、PD-1、BTLA、CD28、ICOS、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSL、fulllength PD-1(flPD-1)、PD-1 delete exon 3(PD-1Δex3)、PD-1 delete exon 2(PD-1Δex2)、PD-1 delete exon 2，3(PD-1Δex2，3)荧光定量PCR引物(Invitrogen)；ELISA检测抗体及相关试剂；SYBR Green (ABI)等。
2实验仪器
流式细胞仪FACS AriaTM(Becton Dickinson)；低温高速离心机(BECKMAN)；CO2培养箱(Heraus，Germany)；实时定量PCR仪(ABI)；分光光度计(BECKMAN)；DY-A型电泳仪；凝胶扫描成像***(UVP-GDS8000)；酶标仪(Spectra Max250)；多头收集仪(TOMTEC Harvester96)；β液闪仪(Perkin Elmer)；紫外核酸分析仪(BECKMAN)；高速低温离心机(Eppendorf)；倒置显微镜(Nikon)；超净台等。
3病例和样本
本发明包括95例类风湿关节炎(RA)患者，为上海市光华中西医结合医院骨科、内科门诊或住院患者。所有病例均符合1987年美国风湿病协会制定的ACR标准。
患者年龄：54±15岁；性别：男24/女71；病程：15±12年。从其中37例患者获得滑膜液和全血标本，另外58例获取滑膜液和血清标本用于ELISA检测。采用30例OA患者(年龄：64±17岁；性别：男12/女18；病程：9±4年)滑膜液和全血标本作为对照(上海市光华中西医结合医院，上海市第六人民医院)。所有标本均采集自2个月内未服用激素和免疫抑制剂的患者。采用50例健康志愿者外周血标本分离单个核细胞和血清作正常对照组。
滑膜液标本通过滑膜腔穿刺或关节手术无菌获得，肝素抗凝，经350g离心3min，收集上清并保存于-80℃冰箱。外周血或滑膜液单个核细胞通过LymphoprepTM分离获得。
4外周血及关节滑膜液单个核细胞制备
采用淋巴细胞分离液LymphoprepTM密度梯度离心法从抗凝全血和关节滑膜液分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC；synovial fluid mononuclearcell，SFMC)，2％FCS/PBS洗涤2次，备用。
5 T细胞和单核细胞亚群的分离及鉴定
5.1采用Dynabeads阳选分离CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD14+单核细胞。
根据产品说明书操作，过程简述如下：
(1)重悬混匀Dynabeads溶液；
(2)取72μl已接CD4或CD8单抗的Dynabeads(分选CD14+单核细胞则加25μlCD14单抗包被的Dynabeads)并用1ml0.1％BSA/PBS洗涤1次；
(3)加入1ml单个核细胞悬液(1×107/ml)，置于旋转摇床4℃孵育20min；
(4)将Eppendorf管置入MPC-S磁场(Dynal Biotech)孵育3min；
(5)弃上清，用0.1％BSA/PBS洗涤磁珠结合细胞3次，目的细胞结合在磁珠上。
5.2采用Dynabeads(Dynal Biotech)阴选分离CD4+T细胞
步骤如下：
(1)1×107单个核细胞重悬于100μl BufferI(含有2mM EDTA的0.1％BSA/PBS)；
(2)加20μl FCS，20μl anti-CD14，anti-CD16，anti-CD56，anti-CDw123，anti-CD36，anti-CD8，anti-CD19，anti-Glycophorin的抗体混合物，4℃孵育20min；
(3)加入2ml BufferI，混匀，4℃300g离心8min，弃上清；
(4)细胞重悬于900μl BufferI，加100μl预先洗涤的Dynabeads，室温孵育15min；
(5)加入1ml BufferI，混匀，均分为两等份，分别移入新的Eppendorf管中；
(6)将Eppendorf管置入MPC-S磁场(Dynal Biotech)孵育3min；
(7)吸取上清，移至新的无菌Eppendorf管中；
(8)重复步骤(5)-(8)1次，收集上清，其中含有分离得到的CD4+T细胞。
5.3分离细胞的鉴定
取部分阴选CD4+T细胞以及阳选分离得到的CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD14+单核细胞，去除Dynabeads，计数，取2×105细胞分别与FITC标记的CD4单抗、CD8单抗或CD14单抗(BD Bioscience)冰上孵育20min，用2％FCS/PBS洗涤2次，加300μl 1％多聚甲醛固定，FACS检测。结果表明分离得到的各细胞亚群纯度均大于97％。阳选分离得到的CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD14+单核细胞分别用350μl RLT裂解，用于下游RNA抽提，cDNA合成以及荧光定量PCR分析。阴选分离得到的CD4+T细胞用于细胞培养。
6细胞因子对协同信号分子的诱导作用
健康人PBMC以1×106/ml接种在24孔板中，在含有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％FCS的RPMI 1640培养液中培养，试验组分别加入不同浓度的重组人IFN-γ、IL-10或TNF-α(R&D Systems)，设置培养基对照组，37℃，5％CO2培养12h，收集细胞，分选CD4+T细胞或CD14+单核细胞，抽提RNA，用于荧光定量PCR检测各种协同信号分子的mRNA水平，并选择浓度为25ng/ml的各细胞因子刺激组及对照组单个核细胞进行FACS分析。
7T细胞活化后PD-1mRNA不同长度剪切体的表达丰度检测
分离得到的RA、OA患者SFMC、PBMC以及正常人PBMC以2×105/孔密度接种在96孔板中，在含有1μg/ml抗CD3单抗(clone OKT-3，eBioscience)和0.05μg/ml抗CD28单抗(clone CD28.2，eBioscience)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10％FCS的1640培养液中培养48h，设置不加抗体对照组。收集细胞，抽提RNA，用于荧光定量PCR检测全长PD-1(flPD-1)，PD-1 delete exon 3(PD-1Δex3)，PD-1 delete exon2(PD-1Δex2)，PD-1 delete exon 2，3(PD-1Δex2，3)等PD-1分子mRNA不同长度剪切体的表达丰度。
8RNA抽提
使用Qiagen公司Rneasy Mini Kit抽提PBMC、SFMC总RNA，步骤如下：
细胞加入350μl裂解液(RLT)反复吹打裂解
↓
加入等体积350μl 70％乙醇，混匀
↓
吸出700μl样品至Rneasy mini column，放在2ml收集管上≥8000g(≥10000rpm)，15s离心，倒去收集管中液体(如果样品超过700μl，再重复一次)
↓
加入350μl RW1≥8000g(≥10000rpm)，15s离心，倒去收集管中液体
↓
加入80μl DNA酶，室温15min
↓
加入350μl RW1≥8000g(≥10000rpm)，15s离心，弃去收集管
↓
将Rneasy mini column放在新的2ml收集管上，加入500μl RPE(工作浓度)≥8000g(≥10000rpm)，15s离心，倒去收集管中液体
↓
加入500μl RPE(工作浓度)≥8000g(≥10000rpm)，2min离心，弃去收集管
↓
将Rneasy mini column放在新1.5ml收集管上
↓
加入30-50μl Rnase-free水≥8000g(≥10000rpm)，1min离心，收集管中液体，测OD值
↓
紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度
9cDNA合成
使用Qiagen公司的Sensiscript RT Kit，按照说明书操作，简述如下：
| 反应成份 | 体积(μl) |
| 10×逆转录缓冲液 | 2.0 |
| dNTP(5.0mM) | 2.0 |
| 随机引物(0.15μg/ml) | 1.0 |
| RNA酶抑制剂40U/μl | 0.25 |
| 逆转录酶 | 1.0 |
| 无RNA酶的水 | 可变 |
| RNA模板(＜50ng) | 可变 |
| 总体积 | 20 |
37℃孵育60分钟，93℃孵育5分钟，离心，-200℃保存cDNA。
10荧光定量PCR检测
CTLA-4、PD-1、BTLA、CD28、ICOS、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2和ICOSL基因的引物设计使用Applied Biosystems的Prime Express 2.0软件，flPD-1、PD-1Δex3、PD-1Δex2、PD-1Δex2，3引物设计序列如下(Seq.ID.No.1-30)：
基因荧光定量PCR特异性引物序列
| 基因 | Seq.ID.No. | 序列(5’-3’) |
| GAPDH | 12 | 上游引物：GTGAAGGTCGGAGTCAACG下游引物：TGAGGTCAATGAAGGGGTC |
| CTLA-4 | 34 | 上游引物：TGCTTGATTGCGTGGAATTG下游引物：CCACCAGCTGTGGCTTCCT |
| PD-1 | 56 | 上游引物：CAGTGGCATCCCGAAACG下游引物：CACAGCCAGGAGCTCTTCTGA |
| CD28 | 78 | 上游引物：CCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGA下游引物：GGCTTAGAAGGTCCGGGAAA |
| ICOS | 910 | 上游引物：GCACGACCCTAACGGTGAATAC下游引物：TGGGTGCCAGAGTTCCATATTA |
| CD80 | 1112 | 上游引物：GTGTTATCCACGTGACCAAGGA下游引物：TTGCCAGTAGATGCGAGTTTGT |
| CD86 | 1314 | 上游引物：TGCCATGCCAATTTGCAA下游引物：GCCTAAGTATACCTCATTCAGAACCAA |
| PD-L1 | 1516 | 上游引物：CTTCAAGCAGGGATTCTCAACCT下游引物：TAAGTCCCACATTGCCTGCAT |
| PD-L2 | 1718 | 上游引物：GAATTGCAGCTTCACCAGATAGC下游引物：AAGTTGCATTCCAGGGTCACA |
| ICOSL | 1920 | 上游引物：CTGGGCCTTTAGGTGAATGTG下游引物：AATGCCCGGTGATGACAACT |
| flPD-1 | 2122 | 上游引物：CTCAGGGTGACAGAGAGAAG下游引物：GACACCAACCACCAGGGTTT |
| PD-1Δex3 | 2324 | 上游引物：AGG GT GACAG GGACAATAGG下游引物：CCATAGTCCACAGAGAACAC |
| PD-1Δex2 | 2526 | 上游引物：GGTTCTTAGAGAGAAGGGCA下游引物：GACACCAACCACCAGGGTTT |
| PD-1Δex2.3 | 2728 | 上游引物：TGGTTCTTAGGGACAATAGG下游引物：TCTTCTCTCGCCACTGGAAA |
| BTLA | 2930 | 上游引物：AGCCACTCAACAACTCTTTATGTGA下游引物：TTGCCACTTCGTCCTTGGA |
基因表达采用荧光定量PCR方法，内参用GAPDH基因，H2O为阴性对照。反应体系：
| 1∶5稀释的cDNA模板 | 4.85μl |
| 荧光定量PCR引物(上游引物、下游引物各5μM) | 0.15μl |
| 2×SYBR Green PCR缓冲体系(Applied Biosystems) | 5μl |
| 总体积 | 10μl |
加入384孔PCR反应板，反应在ABI 7900Sequence Detection System中进行，反应过程如下：
*测定flPD-1、PD-1Δex3、PD-1Δex2、PD-1Δex2，3mRNA不同长度剪切体循环50次。
目的基因相对表达量＝2-(目的基因CT-GAPDHCT)(CT：循环阈值)。
11流式细胞术(FACS)
5×105-1×106细胞重悬在50μl含有2％FCS/PBS中，加入适量目的分子的荧光标记抗体或同型对照，混匀后室温避光孵育30min，加2％FCS/PBS 2ml，混匀后300g离心8min，弃上清，重复洗1遍。细胞重悬于300μl 2％FCS/PBS中，混匀后上流式细胞仪检测。CTLA-4分子因容易被内吞，需要进行穿膜染色，细胞在4％多聚甲醛中室温固定20min，300g离心8min，弃上清，细胞用500μl 2％FCS/0.5％saponin/PBS重悬，室温孵育10min，离心，去上清，加入50μl 2％FCS/0.5％saponin/PBS以及10μl抗人CTLA-4单抗室温孵育1h，洗1遍，用300μl 1％多聚甲醛重悬细胞。运用FACS-AriaTM上机分析。
12酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和滑膜液中可溶性协同信号分子
可溶性CTLA-4、PD-1和PD-L1(sCTLA-4、sPD-1和sPD-L1)ELISA主要试剂见表1。
其它试剂包括：
PBS：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4×12H2O，KH2PO40.20g；
洗液(Wash Buffer)：0.05％Tween20/PBS；
封闭液(Blocking Buffer)：0.5％BSA/0.05％Tween/PBS；
TMB底物；
终止液：2N H2SO4。
表1可溶性CTLA-4、PD-1和PD-L1ELISA检测主要试剂
| 可溶性蛋白(检测低限) | 包被抗体 | 标准品蛋白 | 检测抗体 | 显色*** |
| 可溶性CTLA-4(0.16ng/ml) | 抗人CTLA-4抗体(2μg/m1)(BenderMedSystemskit) | 可溶性CTLA-4标准品蛋白 | 生物素标记的抗人CTLA-4抗体，1∶1000稀释 | 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，1∶5000稀释 |
| 可溶性PD-1(0.3ng/ml) | 羊抗人PD-1(1.5μg/ml)(R&D Systems) | 重组人PD-1/Fc融合蛋白(R&D Systems) | 小鼠抗人PD-1单克隆抗体(J116，4μg/ml)(eBioscience) | 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠免疫球蛋白(SouthernBiotechnology)(1∶500稀释) |
| 可溶性PD-L1(0.3ng/ml) | 羊抗人PD-L1(1.5μg/ml)(R&D Systems) | 重组人PD-L1/Fc融合蛋白(R&DSystems) | 小鼠抗人PD-L1单克隆抗体(MIH1，1μg/ml)(eBioscience) | 抗体同上(1∶2000稀释) |
具体操作步骤：
(1)包板：加包被抗体100μl/孔，37℃，过夜；
(2)洗板：加300μl洗液/孔，洗板，×2次；
(3)封闭：加250μl封闭液/孔，室温孵育2h；
(4)洗板：加300μl洗液/孔，洗板，×3次；
(5)加样品(1∶2稀释)和梯度稀释的标准品100μl/孔，设置双复孔，37℃，孵育2h；
(6)洗板：加300μl洗液/孔，洗板，×3次；
(7)加入反应抗体100μl/孔，37℃，孵育2h；
(8)洗板：加300μl洗液/孔，洗板，×3次；
(9)加入链霉素-HRP或抗体-HRP，370C，避免光线直射，孵育1h；
(10)洗板：加300μl洗液/孔，洗板，×6次；
(11)加入TMB底物100μl/孔，避光显色；
(12)加入终止液100μl/孔，终止反应；
(13)读数：酶标仪(Bio-Rad Laboratories)上读出OD值(测量波长450nm，参考波长540nm或620nm)。
人可溶性CD80(sCD80)采用human sC80Instant ELISA Kit(Bender Medsystems)检测，步骤简述如下：
(1)加150μl双蒸水到标准品孔中(梯度稀释的标准品已包被于孔中)；
(2)加150μl双蒸水到空白孔中；
(3)加100μl双蒸水到样品孔中(已包被ami-human sCD80mAb，HRP-Conjugate-anti-sCD80mAb以及样品稀释成份，均为干冻粉剂)；
(4)加50μl滑膜液或血清到样品孔中，双复孔，封膜，室温孵育3h；
(5)加400μl洗液/孔，洗板，×3次；
(6)加入TMB底物100μl/孔，避光显色10min；
(7)加入终止液100μl/孔，终止反应；
(8)读数：酶标仪(Bio-Rad Laboratories)上读出OD值(测量波长450nm，参考波长620nm)，该试剂盒检测低限值为0.32ng/ml。
13可溶性PD-1、PD-L1功能试验
健康人外周血CD4+T细胞(4×104/孔)、4000Gry照射的PBMC(2×105/孔，作为APC)接种到抗CD3单抗(1μg/ml)预先包被的96孔板中，在含有10％FCS的RPMI 1640培养液中培养，加或不加梯度浓度的人PD-1-Ig、PD-L1-Ig、control Ig(0μg/ml，0.2μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，25μg/ml)，在37℃，5％CO2孵箱中培养4天，收集细胞前18h时加入1μCi[3H]，收集细胞，β液体闪烁仪检测[3H]的掺入量，分析PD-1-Ig，PD-L1-Ig对CD4+T细胞活化增殖的影响。
14统计分析
各实验组及对照基因表达水平采用Mann-Whitney U检验，两组之间的差别采用Student’st检验，在进行U检验或t检验之前预先采用单因素ANOVA分析。
p＜0.05被认为有统计学意义。
结果
1协同抑制分子在类风湿关节炎患者滑膜液浸润T细胞和巨噬细胞中表达升高
从23例RA患者、10例OA患者外周血和滑膜液以及22份健康人外周血分离单个核细胞，运用荧光定量PCR方法分析包括CTLA-4、PD-1、BTLA、CD28、ICOS、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2以及ICOSL等分子在内的CD28家族协同分子mRNA表达水平。见图1。
结果表明，与健康人及OA对照组相比较，协同抑制分子包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2以及CTLA-4的配体CD80等分子的mRNA在RA患者滑膜液浸润单个核细胞中选择性的表达升高，其中CTLA-4和PD-1mRNA水平较健康人对照分别升高了11.9倍、5.1倍；较OA SFMC分别升高了3.3倍、1.5倍。它们相应的配体CD80和PD-L1mRNA较对照组也显著升高(图1A)，而CD28、ICOS、CD86以及ICOSL等表达无明显变化趋势(图1B)。
CTLA-4和PD-1信号途径在调节T细胞免疫应答，维持机体外周免疫耐受中发挥重要作用，因此发明人进一步研究这些协同信号分子在免疫细胞亚群的表达情况。发明人分选出9例RA患者外周血和滑膜液中的CD4+、CD8+T细胞亚群以及CD14+巨噬细胞，荧光定量PCR分析结果表明，CTLA-4和PD-1mRNA在RA患者滑膜液浸润CD4+和CD8+T细胞表达均升高，并且CTLA-4mRNA高表达于滑膜液浸润CD4+T细胞，而CD80和PD-L1mRNA在滑膜液浸润CD14+巨噬细胞表达显著升高(图1C)。
发明人进一步运用FACS研究分析协同抑制分子在RA患者滑膜液浸润免疫细胞的表达情况(因为CTLA-4分子在细胞膜表面表达后很快被内吞，所以同时还进行了穿膜染色，标识为iCTLA-4，膜表面表达的CTLA-4标识为sCTLA-4)，与荧光定量PCR结果相一致。
结果表明，CTLA-4、PD-1分子在滑膜液浸润CD4+T细胞表达显著升高，而相应配体CD80和PD-L1在滑膜液浸润CD14+巨噬细胞表面表达也增高(图2A，B)。
发明人还运用荧光定量PCR研究了另外一种负性调节分子Fas的表达情况，发现Fas分子mRNA在RA患者外周血和滑膜液浸润单个核细胞表面表达升高(图3A)，而且Fas在RA患者滑膜液浸润CD4+T细胞亚群的表达水平显著高于CD8+T细胞以及外周血T细胞(图3B)。
发明人运用荧光定量PCR和FACS分析，结果表明，协同抑制分子CTLA-4、PD-1、PD-L1等负性调控分子以及CD80在RA患者滑膜液浸润T细胞和巨噬细胞中表达显著增加。这一结果出人意料，表明机体在罹患RA后，体内的免疫调控机制对过强的免疫应答仍然发挥调节作用。
2细胞因子IFN-γ、TNF-α可诱导CD80和PD-L1在单核细胞的表达
发明人运用在RA患者滑膜液中显著升高的细胞因子IFN-γ、TNF-α以及IL-10刺激培养健康人PBMC 12h，分析CTLA-4、PD-1、CD80和PD-L1等分子的表达情况。见图4。
如图4A所示，结果表明，IFN-γ和TNF-α可以剂量依赖方式选择性的诱导CD80和PD-L1 mRNA在CD14+单核细胞中表达，而对CTLA-4和PD-1表达无明显影响。IL-10对协同抑制分子配体和受体的mRNA表达均无影响。
发明人进一步选择25ng/ml浓度IFN-γ、TNF-α和IL-10刺激健康人PBMC培养12h细胞标本进行FACS分析，进一步确认了IFN-γ和TNF-α可以诱导CD80和PD-L1在CD14+单核细胞表面的表达(图4B)。上述细胞因子在细胞活化状态下也不能诱导CTLA-4和PD-1的表达。
3可溶性PD-1在RA患者血清和滑膜液中显著增高且与类风湿因子相关
CTLA-4、PD-1信号途径在免疫应答中发挥负调控作用，但出现了CTLA-4和PD-1在RA患者滑膜液浸润T细胞表达增高，相应的配体CD80和PD-L1在CD14+巨噬细胞表面也增加，而T细胞却处于持续活化状态这一矛盾现象。发明人认为主要有两种可能：一、存在针对这些分子的自身反应性抗体，封闭了抑制性通路；二、存在可溶性协同信号分子如可溶性CTLA-4(soluble CTLA-4，sCTLA-4)、可溶性PD-1(soluble PD-1，sPD-1)、可溶性CD80(soluble CD80，sCD80)或PD-L1(solublePD-L1，sPD-L1)封闭了抑制性通路。
发明人研究了可溶性协同信号分子存在的可能性。发明人测定了95例RA患者血清，37例RA患者滑膜液，以及对照组14例骨关节炎(OA)患者血清，30例OA患者滑膜液，50例健康人血清中sCTLA-4、sPD-1、sCD80以及sPD-L1的表达水平。见图5和表2。
图5A及表2的结果显示，与对照组相比较，sPD-1、sPD-L1在RA患者血清和滑膜液中显著升高，sCD80在RA患者滑膜液和血清中有一定程度升高，未检测到sCTLA-4的升高。血清中增高的sPD-1以及sPD-L1与类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)存在显著相关性，但与C-反应蛋白(C Reactive Protein，CRP)以及红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)无显著相关。sCD80与RF也有相关性(图5B-D)。
表2血清和滑膜液中可溶性协同信号分子的浓度(ng/ml，均值±标准误)
| HC sera | RA sera | RA SF | OA sera | OA SF | |
| sPD-1 | 0.30±0.04 | 3.40±0.45* | 2.65±0.70* | 0.08±0.01 | 0.12±0.03 |
| sCTLA-4 | 0.08±0.01 | 0.10±0.01 | 0.09±0.01 | 0.03±0.004 | 0.04±0.003 |
| sPD-L1 | 0.58±0.07 | 3.52±0.61*# | 1.82±0.47* | 0.47±0.03 | 0.38±0.02 |
| sCD80 | 0.18±0.01 | 0.28±0.02* | 0.52±0.07* | 0.14±0.01 | 0.13±0.01 |
*与HC及OA对照组比较p＜0.05，#与RA SF比较p＜0.05，+与RA sera比较p＜0.05
4RA患者体内编码PD-1mRNA的选择性剪切现象：PD-1Δex3mRNA剪切体选择性增加
PD-1分子全长mRNA包含exon1(编码信号肽)，exon2(编码胞膜外Ig样区)，exon3(编码跨膜区)，exon4和5(编码胞内区)(Genebank accession number：NM_005018)。除了全长mRNA(flPD-1)外，还存在几种不同的剪切体，包括PD-1Δex2，PD-1Δex3，PD-1Δex2，3，PD-1Δex2，3，4。
PD-1Δex2去除了exon2(胞膜外Ig样区)；PD-1Δex3剪切去除了exon3(跨膜区)，但胞膜外Ig样区保存完好；PD-1Δex2，3则去除了编码胞膜外Ig样区和跨膜区的序列。因此可以推断PD-1Δex3编码可溶性PD-1分子。如图6A所示，在读码框未受到影响的三种PD-1mRNA剪切体中，PD-1Δex3在RA患者外周血和滑膜液单个核细胞中选择性表达增高，而其它两种mRNA剪切体因表达丰度太低而检测不到。
发明人进一步检测PD-1Δex3mRNA在RA患者外周血和滑膜液单个核细胞表达增高是否与T细胞活化状态有关。为此，发明人用抗CD3单抗、抗CD28单抗刺激RA患者PBMC、SFMC、OA患者PBMC、SFMC以及健康人PBMC培养48h，收集细胞测定PD-1Δex3mRNA水平。
结果表明单抗刺激活化T细胞后PD-1Δex3mRNA表达水平并不增加，提示PD-1Δex3mRNA表达水平的增高是RA患者特异性的，RA患者体内存在PD-1Δex3mRNA的选择性剪切现象(图6B)。
5可溶性PD-1阻断PD-1通路介导的抑制信号，促进T细胞的活化和增殖
发明人运用人PD-1-Ig、PD-L1-Ig进行功能实验(PD-1-Ig、PD-L1-Ig分别含有PD-1、PD-L1完整的胞膜外区，因此能够很好的模拟可溶性PD-1、可溶性PD-L1的生物学功能：
人PD-1-Ig包含的PD-1分子胞膜外区氨基酸序列(Extracellural domain：Met1-Gln 167)(Seq.ID.No.31)
1 mqipqapwpv vwavlqlgwr pgwfldspdr pwnpptffpa llvvtegdna tftcsfsnts
61 esfvlnwyrm spsnqtdkla afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsv vrarrndsgt
121 ylcgaislap kaqikeslra elrvterrae vptahpspsp rpagqfqtlv vgvvggllgs
181 lvllvwvlav icsraargti garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqw rektpeppvp
241 cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadg prsaqplrpe dghcswpl
人PD-L1-Ig包含的PD-L1分子胞膜外区氨基酸序列(Extracellural domain：Met1-Thr239)(Seq.ID.No.32)
1 mrifagiift acchllraft itapkdlyvv eygsnvtmec rfpvereldl lalvvyweke
61 deqviqfvag eedlkpqhsn frgraslpkd qllkgnaalq itdvklqdag vycciisygg
121 adykritlkv napyrkinqr isvdpatseh elicqaegyp eaeviwtnsd hqpvsgkrsv
181 ttsrtegmll nvtsslrvna tandvfyctf wrsqpgqnht aeliipelpa thppqnrthw
241 vllgsillfl ivvstvllfl rkqvrmldve kcgvedtssk nrndtqfeet
结果表明，PD-1-Ig以及PD-L1-Ig处理组CD4+T细胞增殖均显著高于对照组(图7)，提示可溶性PD-1、可溶性PD-L1可分别有效阻断PD-1信号通路介导的抑制信号，促进T细胞的活化和增殖。
实施例2-4
制备ELISA试剂盒
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| ELISA板(12×8孔) | + | + | + |
| 羊抗人PD-1多克隆抗体(1.5μg/ml)(R&D Systems) | + | + | + |
| HRP-鼠抗人PD-1单克隆抗体(4μg/ml)(eBioscience) | + | ||
| 鼠抗人PD-1单克隆抗体(J116，4μg/ml)(eBioscience) | + | ||
| 生物素-鼠抗人PD-1单克隆抗体(1μg/ml)(eBioscience) | + | ||
| HRP-羊抗鼠IgG(Southern Biotechnology)(1∶500稀释) | + | ||
| HRP-链霉亲和素(合适稀释度)(Sigma公司) | + |
注：1、+表示试剂盒中包括该项
2、鼠抗人PD-1单克隆抗体购自eBioscience公司，再用本领域熟知的方法标记辣根过氧化物酶或生物素
试剂盒中还包括：
磷酸缓冲液(PBS)：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4×12H2O，KH2PO4，0.20g；
洗涤缓冲液：含0.05％Tween 20的上述PBS；
封闭液：含0.5％胎牛血清(BSA)和0.05％Tween的上述PBS；
TMB底物；
酶催化反应终止液：2N H2SO4；
阴性对照品：正常人血清；
阳性对照品：重组人PD-1/Fc嵌合体(R&D Systems)。
实施例5-7
ELISA试剂盒
| 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | |
| ELISA板(12×8孔) | + | + | + |
| 羊抗人PD-L1多克隆抗体(1.5μg/ml)(R&D Systems) | + | + | + |
| HRP-鼠抗人PD-L1单克隆抗体(4μg/ml)(eBioscience) | + | ||
| 鼠抗人PD-L1单克隆抗体(J116，4μg/ml)(eBioscience) | + | ||
| 生物素-鼠抗人PD-L1单克隆抗体(1μg/ml)(eBioscience) | + | ||
| HRP-羊抗鼠IgG(Southern Biotechnology)(1∶500稀释) | + | ||
| HRP-链霉亲和素(合适稀释度)(Sigma公司) | + |
注：1、+表示试剂盒中包括该项
2、鼠抗人PD-1单克隆抗体购自eBioscience公司，再用本领域熟知的方法标记辣根过氧化物酶或生物素
试剂盒中还包括：
磷酸缓冲液(PBS)：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4×12H2O，KH2PO4，0.20g；
洗涤缓冲液：含0.05％Tween 20的上述PBS；
封闭液：含0.5％胎牛血清(BSA)和0.05％Tween的上述PBS；
TMB底物；
酶催化反应终止液：2N H2SO4；
阴性对照品：正常人血清；
阳性对照品：重组人PD-L1/Fc嵌合体(R&D Systems)。
实施例8
试剂盒的使用
标本：
在测试者不知道的情况下(单盲)，采用50例类风湿关节炎(RA)患者血清标本(RA-sera)，32例RA患者滑膜液标本(RA-SF)，22例骨关节炎(OA)患者滑膜液和血清标本(OA-SF和OA-sera)和50例健康志愿者血清(HC-sera)。
用实施例2制得的试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)包板：每孔加入羊抗人PD-1多克隆抗体100μl，37℃，过夜；
(2)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×2次；
(3)封闭：每孔加入250μl封闭液，室温孵育2小时；
(4)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×3次；
(5)以每孔100μl的量将样品(1∶2稀释)和梯度稀释的阳性对照品加入不同的孔内，设置双复孔，37℃，孵育2小时；
(6)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×3次；
(7)每孔加入鼠抗人PD-1单克隆抗体100μl，37℃，孵育2小时；
(8)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×3次；
(9)每孔加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃，避免光线直射，孵育1小时；
(10)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×6次；
(11)每孔加入TMB底物100μl，避光显色；
(12)每孔加入终止液100μl，终止反应；
(13)读数：酶标仪(Bio-Rad Laboratories)上读出OD值(测量波长450nm，参考波长540nm或620nm)。
结果见表3。
表3血清和滑膜液中可溶性PD-1的浓度(ng/ml，均值±标准误)
| HC sera | RA sera | RA SF | OA sera | OA SF | |
| sPD-1 | 0.28±0.03 | 3.65±0.41* | 2.90±0.63* | 0.09±0.01 | 0.15±0.03 |
*与HC及OA对照组比较p＜0.05，
结果显示，实施例2制得的试剂盒可用于检测液体样品中可溶性PD-1。
实施例9-10
试剂盒的使用
用实施例3、4制得的试剂盒重复实施例8，得到类似的结果，表明所制得的试剂盒可用于检测液体样品中可溶性PD-1。
实施例11
试剂盒的使用
标本：
在测试者不知道的情况下(单盲)，采用50例类风湿关节炎(RA)患者血清标本(RA-sera)，32例RA患者滑膜液标本(RA-SF)，22例骨关节炎(OA)患者滑膜液和血清标本(OA-SF和OA-sera)和50例健康志愿者血清(HC-sera)。
用实施例5制得的试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)包板：每孔加入羊抗人PD-L1多克隆抗体100μl，37℃，过夜；
(2)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×2次；
(3)封闭：每孔加入250μl封闭液，室温孵育2小时；
(4)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×3次；
(5)以每孔100μl的量将样品(1∶2稀释)和梯度稀释的阳性对照品加入不同的孔内，设置双复孔，37℃，孵育2小时；
(6)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×3次；
(7)每孔加入鼠抗人PD-L1单克隆抗体100μl，37℃，孵育2小时；
(8)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×3次；
(9)每孔加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃，避免光线直射，孵育1小时；
(10)洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液，洗板，×6次；
(11)每孔加入TMB底物100μl，避光显色；
(12)每孔加入终止液100μl，终止反应；
(13)读数：酶标仪(Bio-Rad Laboratories)上读出OD值(测量波长450nm，参考波长540nm或620nm)。
结果见表4。
表4血清和滑膜液中可溶性PD-L1的浓度(ng/ml，均值±标准误)
| HC sera | RA sera | RA SF | OA sera | OA SF | |
| sPD-L1 | 0.60±0.08 | 3.35±0.54* | 2.76±0.49* | 0.57±0.06 | 0.46±0.02 |
*与HC及OA对照组比较p＜0.05。
结果显示，实施例5制得的试剂盒可用于检测液体样品中可溶性PD-L1。
实施例12-13
试剂盒的使用
用实施例6、7制得的试剂盒重复实施例11，得到类似的结果，表明所制得的试剂盒可用于检测液体样品中可溶性PD-L1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申清的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>可溶性协同信号分子在检测类风湿关节炎中的用途
<130>063942
<160>32
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
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<213>人工序列
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<400>29
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<400>30
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<211>288
<212>PRT
<213>智人
<400>31
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1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210>32
<211>290
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu
1 5 10 15
Arg Ala Phe Thr lle Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp
130 135 140
Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro
145 150 155 160
Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly
165 170 175
Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val
180 185 190
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195 200 205
Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile
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Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp
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Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val
245 250 255
Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys
260 265 270
Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu
275 280 285
Glu Thr
290
Claims (15)
1.一种体外检测液体样品中可溶性PD-1蛋白或其配体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将所述样品与抗PD-1的抗体或抗PD-1配体的抗体进行接触，从而形成可溶性PD-1蛋白-抗体复合物或可溶性PD-1配体-抗体复合物；
(b)检测可溶性PD-1蛋白-抗体复合物或可溶性PD-1配体-抗体复合物，从而确定可溶性PD-1蛋白或其配体的存在与否。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)通过夹心法检测可溶性PD-1蛋白-抗体复合物或可溶性PD-1配体-抗体复合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步骤：
(1)将PD-1或其配体的抗体包被固相载体，得到包被有PD-1或其配体的抗体的固相载体；
(2)在包被有PD-1或其配体的抗体的固相载体上加入液体样品；
(3)加入酶标记的不同种属抗PD-1或其配体抗体；
(4)加入底物进行酶催化反应。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的配体是PD-L1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PD-1或其配体为人PD-1或其配体。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的液体样品包括血清、血浆、滑膜液、尿液或乳汁等。
7.一种抗可溶性PD-1蛋白或其配体的抗体的用途，其特征在于，制备辅助性检测类风湿关节炎的试剂或试剂盒。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂是一固相载体，所述的固相载体上固定有抗PD-1或其配体的抗体。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒包括：
固相载体，
PD-1或其配体的抗体，
酶标记的不同种属抗PD-1或其配体抗体，底物。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的配体为PD-L1。
11.一种体外检测液体样品中可溶性PD-1蛋白或其配体的试剂盒，其特征在于，它包括：
固相载体，
PD-1或其配体的抗体，
酶标记的不同种属抗PD-1或其配体抗体，底物。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体上包被有PD-1或其配体的抗体。
13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的PD-1或其配体的抗体为多克隆抗体。
14.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的不同种属抗人PD-1或其配体抗体为单克隆抗体。
15.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2006100297992A CN101122603A (zh) | 2006-08-08 | 2006-08-08 | 可溶性协同信号分子在检测类风湿关节炎中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101122603A true CN101122603A (zh) | 2008-02-13 |
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ID=39085027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2006100297992A Pending CN101122603A (zh) | 2006-08-08 | 2006-08-08 | 可溶性协同信号分子在检测类风湿关节炎中的用途 |
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|---|---|
| CN (1) | CN101122603A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104198728A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-10 | 广西南宁隆吉维特生物科技有限公司 | 人血清cxcl16酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
| CN104736168A (zh) * | 2012-05-31 | 2015-06-24 | 索伦托治疗有限公司 | 与pd-l1结合的抗原结合蛋白 |
-
2006
- 2006-08-08 CN CNA2006100297992A patent/CN101122603A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN104736168B (zh) * | 2012-05-31 | 2018-09-21 | 索伦托治疗有限公司 | 与pd-l1结合的抗原结合蛋白 |
| CN104198728A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-10 | 广西南宁隆吉维特生物科技有限公司 | 人血清cxcl16酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080213 |