CN101121941B

CN101121941B - 一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法

Info

Publication number: CN101121941B
Application number: CN2007100554619A
Authority: CN
Inventors: 周晓馥; 徐洪伟
Original assignee: Jilin Normal University
Current assignee: Jilin Normal University
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2027-03-26
Also published as: CN101121941A

Abstract

本发明公开了一种利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)遗传转化高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法。通过外植体的制备，发根农杆菌菌液培养，对高山红景天进行遗传转化诱导产生毛状根，经PCR检测，证明毛状根为转化产生，利用发酵罐培养大量生产毛状根，通过添加前体物质和诱导子提高红景天甙含量，用以生产红景天甙，替代濒临枯竭的高山红景天资源。

Description

一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体是一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法。

背景技术

高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)又名库页红景天，为景天科红景天属(Rhodiola L.)多年生双子叶草本植物。是珍稀药用植物之一，中医中具有“固本扶正”之功效，具有“适应原”的作用。还具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能，而且具有延缓肌体衰老、防止老年疾病等功效。由于高山红景天在工业方面的开发，野生植物大量被采挖，资源日趋枯竭。目前，当地政府已严禁采挖。自80年代初期，就开始人工引种栽培的研究，由于高山红景天适应高寒、干燥、高海拔的生长环境，不耐高温、潮湿气候以及易发病等原因，大面积栽培仍没获得成功。高山红景天主要药用成分为红景天甙。明海泉等报道利用其甙元醇进行糖基化反应人工合成红景天甙，但反应过程复杂，收率低。高山红景天细胞培养为红景天甙的生产提供了一条途径，但产量很低，培养细胞中的红景天甙含量至多只能达到野生植株的水平。许建峰等利用细胞培养，用于高山红景天次生代谢物生产研究，通过外界因子、前体物、诱导子以及细胞发酵的动力学研究，可使细胞培养密度最大达到18g DW/L，培养物中的红景天甙产量最大达到1980mg/L。相当于野生高山红景天中红景天甙的含量，况且，由于激素的添加不但增加成本，且影响红景天甙的品质。

由于毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物合成能力。大量培养毛状根替代野生资源，促进中药现代化发展。因此建立高山红景天毛状根培养***大量培养具有重要意义。

自1997年Ackermann首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄今已有100多种植物建立了培养***。并且利用其进行次生代谢物生产。中药有效成分大多在根部。而Ri质粒诱导产生的毛状根具有根的特性，且具有生长速度快、激素自养、分化程度较高，以及遗传性状相对地稳定等优点，因此，较细胞培养更有利于次生代谢物的大量生产。

发明内容

本发明的目的在于通过生物技术手段大量生产高山红景天毛状根，利用毛状根大量培养生产高山红景天甙，用以替代野生资源，填补中药缺口；本发明利用发根农杆菌遗传转化高山红景天获得毛状根，利用发酵罐大量培养毛状根用以生产红景天甙。

本发明是通过以下技术方案实现的：

以高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)为外植体，利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)进行遗传转化诱导产生毛状根(hairy root)，通过培养条件(pH值、温度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮添加)优化提高毛状根诱导率。毛状根经发酵罐培养大量生产毛状根，通过碳源、氮源、光照、温度、pH值、诱导子、前体物质和培养液的优化，提高高山红景天毛状根红景天甙的含量。通过毛状根红景天甙的分离提取过程，生产红景天甙。

该方法的具体步骤如下：

1、外植体的制备：将高山红景天的无菌种子置1/2MS培养基萌发，取3天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置于MS+0.5mg/LNAA+3.0mg/L 6-BA培养基上25℃继代培养。以在MS+1.2mg/L 2，4-D+2.4mg/L 6-BA培养基中暗培养2-4天的叶片、茎段和子叶节为外植体；

2、发根农杆菌培养：将发根农杆菌R1000或LBA9402或R1601或ATCC15834或A4(菌种均由法国园艺中心提供)在YEB固体培养基上活化，挑取单菌落，接种在LB液体培养基中，在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.45～0.60时用于感染外植体。

3、侵染、共培养、毛状根诱导培养、除菌及筛选：将外植体分别侵入发根农杆菌菌液，黑暗中侵染20～30min；将侵染过的外植体置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上(培养基pH值为5.0～6.0)，于18℃～20℃共培养2～5天；移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+50～100m mol/L乙酰丁香酮培养基上，光照培养2～5天，弱光培养诱导毛状根；将诱导产生的毛状根接入抑菌、筛选培养基1/2MS+Cef(500mg/L)+Km(50mg/L)保持弱光培养，每周转接一次，反复转接3～5次后；切下抗Km根系的2～5mm的根尖，接入液体培养基扩大培养。

4、株系筛选及液体扩大培养：选择生长的迅速、分枝较多的毛状根株系，切取长2～4mm根尖部份，置于1/2MS液体培养基，50ml培养液装入150ml三角瓶中弱光或暗培养条件下，于摇床上50～80rpm/min振荡培养，25天继代一次。优化培养基中添加诱导子和前体物质有利于高山红景天次生代谢物积累。诱导子为灵芝或云芝或黑曲霉或毛霉，浓度为50mg/L～100mg/L；前体物质为酪醇或酪氨酸或苯丙氨酸，浓度为0.8～1.8mmol/L。其中诱导子以黑曲霉为好，前体物以酪醇为好。

5、毛状根中红景天甙含量测定：采用高效液相色谱法测定。其结果为：通过发根农杆菌诱导高山红景天得到的毛状根，在25天左右能够增值15～28倍。毛状根干品中红景天甙含量为3.58％，约是野生长白山高山红景天根的5倍，西藏高山红景天的7倍。高山红景天毛状根生长量最大可达到398.21g/L；红景天甙积累量可达到14.26g/L。比野生长白山高山红景天根的0.59％有显著的提高。

6、高山红景天毛状根中红景天甙的分离提取工艺：取高山红景天毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干，干粉以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇提取，或直接用70％酒精浸泡新鲜的毛状根培养物，提取红景天甙。本方法由毛状根培养物中得到的红景天甙的含量为毛状根干重的3.0％～3.50％，总次生代谢物生产率为14.06g/L。

本发明中涉及的缩写术语、培养基：

1.外植体——高山红景天的无菌苗切成的1.0cm²叶片、1cm长茎段及子叶节。

2.发根农杆菌菌种——R1000，R1601，ATCC15834，A₄，LBA9402由法国园艺研究中心(Tepter博士惠赠)。

3.发根农杆菌培养基：LB、YEB

LB液体培养基为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，10g/LNaCl，调pH值至7.2后高压灭菌。LB固体培养基在上述的基础上加15g/L琼脂糖。

YEP培养基为：10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L牛肉浸膏，15g/L琼脂糖，调pH值至7.0后高压灭菌。

4.植物基本培养基：MS(Murashige and Skoog，1962)，50mlMS大量元素(20^*)，5ml MS微量元素(200^*)，5ml Fe盐(200^*)，10ml V维生素(100^*)(V_B11000mg，V_B6100mg，烟酸100mg，甘氨酸200mg，肌醇10g，生物素5mg。定容至1000ml，配成母液)，0.2g酪素，0.2g天冬素，0.5mg氨基苯甲酸，0.25mg核黄素。叶酸50mg用少量NaOH溶解，定容至100ml，每升培养基取1ml(0.5mg/ml)。6.5g/L琼脂，pH 5.8～6.0。

5.抗生素：卡那霉素Km(Kanamycin)、头孢霉素Cef(cephamycin)

6.激素：2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、NAA(Naphthaleneacetic acid)、6-BA(benzyladenine)

7.其他试剂：乙酰丁香酮AS(3，5-mcthoxy-4-hydroxyacetophenone)、脯氨酸Pro(proline)、红景天甙(salidroside)

本发明有益的效果体现在：

l、通过毛状根诱导及培养技术解决高山红景天资源短缺问题，为中药红景天来源开辟出一条有效途径。高山红景天为国家保护植物，具有重要的药用价值，利用毛状根大量培养技术生产红景天甙，可保护有限的野生资源，适合工业化大生产，具有实用性。

2、应用高山红景天毛状根大量培养生产红景天甙与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制，不占用耕地面积，只需占用有限的厂房和培养室。

3、通过人工调控优化培养条件，可提高毛状根的生长和次生代谢物的合成，极大的提高红景天甙的产量。

4、该技术在毛状根液体大量培养过程中不添加任何激素，在暗培养环境中快速生长，因此，可以大大降低成本。

附图说明

图1是高山红景天无菌苗示意图。

图2是发根农杆菌诱导产生的毛状根示意图。

图3是毛状根在固体培养基上快速生长示意图。

图4是毛状根rol基因的PCR检测示意图。

图5是液体培养的高山红景天毛状根示意图。

图6是毛状根液体培养基生长曲线示意图。

具体实施方式

实施例

1无菌苗的获得

取采自长白山海拔1700～2500米的高山红景天种子，用自来水冲洗净，在75％酒精中浸泡1min后，再用15％NaClO消毒12min。然后用无菌水冲洗3～5次，将水空干接种在无激素的1/2MS+Pro700mg/L培养基(琼脂0.6％)上萌发培养10～18天。25℃，光强2000lux，16小时光照，8小时暗培养。待15天无菌苗长出，取3天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置于MS+0.5mg/LNAA+3.0mg/L 6-BA培养基上继代培养如图1所示。

2预培养

取继代培养的无菌苗的子叶节、茎段和叶片，叶片和带叶柄的子叶背腹面用刀轻划，茎段切成1cm长作外植体，接种在MS+1.2mg/L2，4-D+2.4mg/L 6-BA+Pro 700mg/L培养基上预培养2～3天，待边缘略有愈伤现象时用于侵染。

3发根农杆菌培养

将发根农杆菌ATCC15834接种在YEB固体培养基上划线培养，于27℃下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养基。在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.45时用于感染外植体。

4发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选

将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A₆₀₀为0.45的发根农杆菌ATCC15834菌液中，黑暗中侵染24min，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上共培养2天后，移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+60m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于20℃，散射弱光照除菌培养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、茎段和子叶节为对照。15天左右产生毛状根如图2所示。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养如图3所示。

5毛状根优质株系的筛选

挑选除菌彻底、经过PCR检测的毛状根，将分枝多、生长快的毛状根剪下长1～3cm左右，移入1/2MS+Pro 700mg/L培养液中。150ml三角烧瓶中，每瓶装液50ml接入一根毛状根。25天后观察生长情况，挑选生长旺盛的用于继代及大量培养。

6毛状根的检测

基因组DNA微量提取

1)取0.5g～1.0g经过筛选的毛状根在液氮下研磨，装入50ml离心管加入20ml Extraction Buffer(100mM Tris-HCl，PH 8.0；0.35mMSorbitol；5mM EDTA，PH 8.0；1％2-Mercaptoethanol(使用之前加入))并置于冰上。

2)4℃，10000r/min离心10分钟，去上清，用20ml ExtractionBuffer溶解沉淀两次并离心。

3)去上清并用5ml Extraction Buffer悬浮沉淀，加入3.5mlHigh-Salt CTAB Buffer(50mM Tris-HCl，PH 8.0；4M NaCl；1.8％CTAB；25mM EDTA，PH 8.0)和0.3mlSarkosyl(浓度为30％的水溶液)，55℃温育60～90分钟。

4)加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，10000r/min离心10分钟。

5)去上清加入2/3体积预冷的混合有1/10体积乙酸钠的异丙醇。4℃，10000r/min离心20分钟。

6)去上清，用冷的75％的乙醇洗涤沉淀。去乙醇，在空气中干燥DNA，并用200μlTE Buffer(10mM Tris，PH 8.0；1mM EDTA，PH8.0)溶解。

7)加入10μlRnase(1mg/ml)在37℃下温育40分钟，加入等体积的酚氯仿，抽提去除蛋白质。室温下高速离心10分钟(最好13000r/min以上)。

8)取上清加入等体积预冷的100％的氯仿，沉淀去除蛋白质。室温下高速离心10分钟。

9)取上清加入两倍体积的冷的无水乙醇(混合1/10体积的乙酸钠)，沉淀DNA然后将其放于-20℃下30分钟。

10)用最大转速沉淀DNA 15分钟。用75％的冷的乙醇洗涤DNA沉淀，并在空气中干燥。用50～00μl TE Buffer溶解DNA。

毛状根的PCR检测

取经过筛选的毛状根100ng的基因组DNA为模板，以试管苗正常根作为阴性对照，Ri质粒为阳性对照。rolC基因的引物序列(宝生物合成)：

引物I序列5`-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3`

引物II序列5`-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3`

PCR反应总体系为 50ul

Taq Mix(购自宝生物) 25ul

引物I 2(20pmol)ul

引物II 2(20pmol)ul

模板 5(100ng)ul

去离子无菌水 16ul

在PCR仪(UNOII，Biometra)中进行反应，反应程序为94℃，45s；45℃，30s；72℃，45s共30个循环，72℃延长10min，如图4所示。

7毛状根生长曲线的测定：

挑选生长旺盛的毛状根株系，接入1/2MS培养液中。150ml三角烧瓶中，每瓶装液50ml接入毛状根鲜重0.390g(干重0.041g)，共30瓶。每5天测定一次鲜重和干重，以平均重量为指标绘制生长曲线。鲜重系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测定，干重系60℃烘干后测得如图6所示。

8毛状根的液体培养基大量培养：

挑选生长旺盛的毛状根株系，接入150ml三角培养瓶装液50ml的1/2MS+Pro 700mg/L液体培养基中如图5所示。其中碳源为蔗糖或果糖或葡萄糖(30g/L)；NH₄ ⁺和NO₃ ^-为氮源，总氮浓度为80mmol/L；光照为2000xl散射光；温度为18℃～20℃；pH值为6.5～7.2；诱导子为灵芝或云芝或黑曲霉或毛霉，浓度为50mg/L～100mg/L；前体物质为酪醇或酪氨酸或苯丙氨酸，浓度为0.8～1.8mmol/L。其中诱导子以黑曲霉为好，前体物以酪醇为好。

9毛状根红景天甙的分离提取

色谱条件：C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(20∶80)，流速1ml/min，检测波长274nm用于红景天甙的测定。

对照品及供试品溶液的制备：

红景天甙标准品购自中国生物制品检定所。

精密称取红景天甙对照品5.08mg置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得红景天甙对照品贮备液；精密量取此贮备液1ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得红景天甙对照品溶液(50.8μg/ml)。取毛状根样品粗粉约0.4g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇90ml，浸泡振摇60min后超声提取30min，放冷，滤过，用少许甲醇洗涤容器，滤过，滤液并入100ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45Lm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

标准曲线：分别精密吸取红景天甙对照品溶液0.5、1、2、5、10ml，用甲醇稀释成含红景天甙1.56、4.68、7.8、10.92、15.6μg/ml5种溶液，绘制标准曲线，其回归方程为：Y＝34663.4X-2445.1，r＝0.9997(n＝5)。红景天甙在0.20～8.00μg/ml范围内呈良好的线性关系。

经计算分析红景天甙含量为毛状根干重的3.58％，约是野生长白山高山红景天根的5倍，西藏高山红景天的7倍。高山红景天毛状根生长量最大可达到398.21g/L；红景天甙积累量可达到14.26g/L。

10高山红景天毛状根中红景天甙的分离提取工艺

取高山红景天毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干，干粉以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇提取，或直接用70％酒精浸泡新鲜的毛状根培养物，提取红景天甙。本方法由毛状根培养物中得到的红景天甙的含量为毛状根干重的3.0％～3.50％，总次生代谢物生产率为14.06g/L。

下面实施例2、3、4、5中的1、2、5、6、7、8、9、10步骤与实施例1相同省略。

实施例2

3、发根农杆菌培养

将5种发根农杆菌LBA9402，接种在YEB固体培养基上划线培养，于27℃下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养基。在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.55时用于感染外植体。

4、发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选

将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A₆₀₀为0.45～0.60的发根农杆菌LBA9402菌液中，黑暗中侵染25min，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上共培养2.5天后，移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+80m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于20℃，散射弱光照除菌培养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养。

实施例3

3、发根农杆菌培养

将5种发根农杆菌A4接种在YEB固体培养基上划线培养，于27℃下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养基。在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.50时用于感染外植体。

4、发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选

将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A₆₀₀为0.50的发根农杆菌A4菌液中，黑暗中侵染24min，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上共培养2天后，移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+90m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于25℃，散射弱光照除菌培养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养。

实施例4

3、发根农杆菌培养

将5种发根农杆菌R1601接种在YEB固体培养基上划线培养，于27℃下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养基。在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.60时用于感染外植体。

4、发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选

将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A₆₀₀为0.60的发根农杆菌R1601菌液中，黑暗中侵染25min，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上共培养3天后，移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+70mmol/L乙酰丁香酮培养基上，于25℃，散射弱光照除菌培养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养。

实施例5

3、发根农杆菌培养

将5种发根农杆菌R1000，接种在YEB固体培养基上划线培养，于27℃下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养基。在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.45～0.60时用于感染外植体。

4、发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选

将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A₆₀₀为0.55的发根农杆菌R1000菌液中，黑暗中侵染30min，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上共培养3天后，移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+90mmol/L乙酰丁香酮培养基上，于25℃，散射弱光照除菌培养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养。

Claims

1.一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，该方法以高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)为外植体，利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)进行遗传转化诱导产生毛状根(hairy root)，通过培养条件优化提高毛状根诱导率；毛状根经发酵罐培养大量生产毛状根，通过碳源、氮源、光照、温度、pH值、诱导子、前体物质和培养液的优化，提高高山红景天毛状根红景天甙的含量；通过毛状根红景天甙的分离提取过程，生产红景天甙，其特征在于：所述培养液中诱导子为灵芝或云芝或黑曲霉或毛霉中的任意一种，诱导子的添加浓度为50mg/L～100mg/L；前体物质为酪醇或酪氨酸或苯丙氨酸中的任意一种，前体物质的添加浓度为0.8～1.8mmol/L。