CN101100641B - 一种帘状锚固培养生物反应器及利用该反应器进行植物细胞、组织或器官培养的方法 - Google Patents

Abstract

一种帘状锚固培养生物反应器及利用该反应器进行植物细胞组织或器官培养的方法，属于生物技术植物细胞培养工程领域该反应器包括帘式网状双面锚固培养床(A)供养***(B)悬挂装置(C)，帘式网状双面锚固培养床(A)悬挂于悬挂装置(C)上，帘式网状双面锚固培养床(A)具有床体(E)安装在床体(E)顶部的复合流注补料器(F)，床体(E)外套装有一次性无菌封膜(G)。本发明适用于长期连续大规模生产培养，其具有结构简单制造成本低能耗低易于工业化放大无规模限制可连续培养反复收获等优点，可极大地降低生物反应器的制造成本和植物离体培养的规模化生产成本，分散化解规模风险。

Description

一种帘状锚固培养生物反应器及利用该反应器进行植物细胞、组织或器官培养的方法

技术领域

本发明涉及到一种生物反应器和利用该生物反应器进行植物细胞、组织或器官大量培养的方法，适用于微生物、植物、动物的细胞、组织或器官的培养，属于生物技术植物细胞培养工程领域，或根据应用范围归属于生物技术与化学工程与技术的交叉领域——生物工业化生产领域。

背景技术

为了实现植物细胞、组织和器官大量培养工厂化生产有用次生代谢产物，自1956年Routies和Nichell申请第1个利用鼓泡塔反应器培养植物细胞生产有用次生代谢物质的专利以来，全世界研制开发了机械搅拌式STR反应器，包括螺旋搅拌式STR withspiral impeller、提升搅拌式STR with cell lift impeller、膜通气搅拌式、普通搅拌式STR with combined membrane aerator and agitator[黄艳，赵德修，李佐虎.植物学通报，2001，18(6)：665-671]、双螺旋带形搅拌桨反应器Doublehelical-ribbon impeller bioreactor[Jolicoeur M，et al.Biotech.Bioeng.1992，39：511-521]、不锈钢网气体分布器细胞提升式搅拌桨耦合型反应器、微孔金属丝网空气分布器三叶螺旋桨反应器MRP[钟建江，沈林南，王斯靖.植物细胞培养工程的最新进展[J].工业微生物，1995，25(1)：25-29]等；气升式(AL)反应器，包括外环流灌注气升式External boop airlift、内环流气升式Internal boop airlift[刘春朝，王玉春，欧阳藩等.植物学报，1999，41(2)：181-183；Sajc L，Obradovic B，VukovicD，et al.Biotechnol Prog，1995，11：420]、内错流式Alicrof，Air lift internalcross flow[ZL96222807]、导筒气升式Dranght tube airlift[黄艳，赵德修，李佐虎.植物学通报，2001，18(6)：665-671]、不锈钢网导流筒内环流生物反应器、中心聚乙烯泡沫固定气升式、内置多层筛网内环流气升式[刘春朝，王玉春，欧阳藩等.化工冶金，1999，20(3)：329-336]等；鼓泡塔反应器，包括鼓泡式Bubble column、倾斜鼓泡式Slanted bottom bubble column[黄艳，赵德修，李佐虎.植物学通报，2001，18(6)：665-671]等；转鼓式生物反应器；流化床生物反应器，包括鼓泡式循环流化床反应器[Dubuis B，Kut O M，Prenosil J E.Plant Cell Tissue Organ Cult，1995，43：171]；填充床生物反应器[Panda A K，Mishhra S，Bisaria U S，Bhojwani SS.Plant cell reactor，a perspective.Enzyme Microb Technol，1989，11：386-397]；膜生物反应器，包括中空纤维膜、螺线式卷绕反应器[刘春朝，王玉春，欧阳藩等.化工冶金，1999，20(3)：329-336]、复合膜反应器、搅拌膜反应器[Panda A K，MishhraS，Bisaria U S，Bhojwani S S.Plant cell reactor，a perspective.Enzyme MicrobTechnol，1989，11：386-397]、双重中空纤维反应器Dual hollow fibrereactor[Kim.D.J.，Chang，H.N.Biotech.Bioeng.1990，36：460-466]、滴流膜型trickling film反应器[Yokoi，H.et al.J.Ferment.Bioeng.1993，75：48-52]等；胶粒固定反应器[Panda A K，Mishhra S，Bisaria U S，Bhojwani S S.Plant cellreactor，a perspective.Enzyme Microb Technol，1989，11：386-397]；连续灌注式生物反应器[兰文智，余龙江，吴元喜.华中科技大学学报(自然科学版)，2002，30(5)：91-93]；雾化反应器，包括内置筛网喷雾式、内置填充环喷雾式、超声波雾化反应器、喷射雾状流淋反应器等；人造亲水纤维导流式多层塔板生物反应器；矩形生物反应器；钟罩反应器；径向流多层塔板生物反应器；间歇浸没式反应器；雾化器与培养器分离气带式培养***；自旋过滤式反应器[刘春朝，王玉春，欧阳藩等.化工冶金，1999，20(3)：329-336]；滴流床反应器；气体喷射式反应器[Mckelvey SA，etal.Biotechnol Prog，1993，9：315-312][Rama Krishnan D.et al.BiotechnologyTechniques，1994，8(9)：639-644]；液体喷射式环流反应器[Buitelaar RM，etal.Enzy Microb Technol，1991，13：487-494]；离心叶轮反应器centrifugal impellerbioreactor[Wang S J，Zhong J J.Biotechnol Bioeng，1995，51：520]；细胞升式反应器cell-lift bioreactor[钟建江，沈林南，王斯靖.植物细胞培养工程的最新进展[J].工业微生物，1995，25(1)：25-29]；升流式生物反应器lift-streambioreactor[刘志伟，郭勇，张晨.植物细胞培养生物反应器的研究进展[J].现代化工，1999，19(8)：14-16]等，规模由几升到75000升不等，已应用的植物有常春藤、紫松果菊、紫草、人参、黄花蒿、黄连、红豆杉等数十种，日本率先实现了紫草、人参、黄连细胞大规模培养制备紫草宁、人参皂甙和黄连素的工业化生产[Hara Y.Research on the production of useful compounds by plant cell cultures in Japan.In：Di Cosmo F，Misawa M，eds.Plant Cell Culture Secondary Metabolism TowardIndustrial Applicatong.Boca Ratton；CRC Press，1996，187-202]。但大多数技术仍停留在实验室或工业化放大试验阶段。这些研究和技术成果都有一个共同特点，即所采用无论为何种反应器，其沿袭的基本都是微生物发酵的有关理论、方法和原理，培养都在密闭容器中进行，均需梯级放大。由于植物的培养周期要比微生物长得多，因而在长期持续培养过程中均要面临植物细胞、组织和器官优良遗传特性和生理生化特性的持续保持、细胞生长的一致性控制、培养过程的无菌条件和各理化因子的控制、细胞生长和结团所造成的各种不确定性、气液、液固及能量传质特性的持续保持等难以解决的问题，多难以工业化放大。过高的投资成本和因过多、过长的非生产过程所造成过高的运营成本，加上太多控制上的不确定性给工业化大规模生产带来的过高、企业无法承受的商业风险，严重阻碍了其大规模商业化生产的实现。特别是梯级放大，更是将成本风险成倍的放大，到最后，只要一次失败，就可能导致企业破产。植物细胞、组织和器官培养所需时间长，过程中变数太多，仅控制无菌就非常困难。所以，若一次性投入的成本过分集中，其大规模培养工业化生产的商业投资风险就异常巨大，任何企业都无法承受。

此外，目前所报道植物细胞包括组织、器官大量培养生产有用次生代谢产物技术，无论其所采取的方法、途径、手段等如何，最终结果都无一例外的使植物由复杂变得简单植物由有复杂结构的外植体脱分化变为愈伤组织、由高级变得低级或由较为进化到较为原始，即由有各种器官分化的高等植物变为较低等或原始的细胞团，甚至单细胞，由有性繁殖变为无性繁殖、由自养变为异养、由陆生到水生由地生植物变为液体悬浮培养的细胞或细胞团。即现有对植物所实施的细胞、组织、器官大量培养的整个过程，实际可能是一个逆进化驯化培养的过程，人们企图将植物培养驯化得像微生物一样，可以通过发酵的方式来进行生产，结果却忽视了这个过程不仅改变了植物的形态，更有可能改变了植物的生理生化特性和代谢机能。因此，前述植物细胞大量培养工业化生产有用次生代谢产物所遇各种问题，应该与此不无关系。

发明内容

本发明的目的就是针对目前植物细胞培养工程领域所研制的生物反应器存在的上述问题，提供一种帘状锚固培养生物反应器和利用该生物反应器进行植物细胞、组织和器官大量培养的方法，其适用于植物细胞、组织和器官生长和生产培养，尤其适用于长期连续大规模生产培养，对微生物和动物也较适合，具有结构简单、制造成本低、能耗低、非生产过程短而简单、不受培养过程不确定性限制、商业运营风险低、过程控制简单容易、易于工业化放大、无规模限制、一器多用、可连续培养反复收获、易于在线适时实施调控等优点，可极大地降低生物反应器的制造成本和植物离体培养的规模化生产成本，分散化解规模风险。

为达到上述目的，本发明的实施方案为：一种帘状锚固培养生物反应器，包括帘式网状双面锚固培养床、供养***、悬挂装置，帘式网状双面锚固培养床悬挂于悬挂装置上，所述帘式网状双面锚固培养床具有床体、复合流注补料器和一次性无菌封膜，床体具有双层支持网，支持网安装在边框内，两支持网间有空隙形成床内腔，在支持网上附着有绒黏附层，复合流注补料器安装在床体的顶部，具有流注补料槽，流注补料槽连通床体的床内腔和设置在复合流注补料器上的进液管，床体外套装有一次性无菌封膜，一次性无菌封膜上设有排液管和空气连通管；供养***具有输液管和储液罐，帘状锚固培养生物反应器通过进液管和输液管与储液罐连通。

本发明所述的供养***为循环供养***，具有储液罐和下过滤储液罐，储液罐通过输液管与复合流注补料器上的进液管连通，通过空气加压泵可以将储液罐中的培养液注入帘式网状双面锚固培养床，下过滤储液罐通过回液管与一次性无菌封膜下的排液管连通，回流管与下过滤储液罐之间设有瞬时杀菌器，储液罐和下过滤储液罐之间有连通管，通过真空泵可以将下过滤储液罐中的回流培养液打入储液罐中。

所述悬挂装置具有球形滑轨，球形滑轨内设有多个球形悬挂滑吊，多个帘式网状双面锚固培养床可以悬挂在球形悬挂滑吊上。

所述床体的两支撑网之间有间隙调控板，边框上设有限厚框，边框的上边框外配置有承重连接横梁。绒黏附层为具有强亲水性的纤维制成。

所述复合流注补料器具有铆闩和铆孔，通过铆闩和铆孔将复合流注补料器安装于床体的顶部，复合流注补料器的顶部安装有吊环。

所述一次性无菌封膜为耐高温塑料薄膜制成的塑料膜袋，其至少一边具有待粘结带，其余边封闭，下边倾斜设置，排液管设在下边较低边角处。

当在室内进行植物细胞、组织或器官培养时，如果需要光照，本发明还需要照明***，所述照明***可以是阳光收集传输照明***，由阳光收集器、传输光缆和发光末端组成，阳光收集器安装在培养室的房顶上，发光末端安装在帘式网状双面锚固培养床两两之间。

本发明还包括榨式灭菌柜，榨式灭菌柜(H)具有方体柜形框架，内设有活动榨板，框外安装有手轮，通过操作手轮可以移动控制活动榨板。

所述榨式灭菌柜还配有与床体长宽相适应的缓冲隔板和与床内腔长宽相适应的床内腔填充板。缓冲隔板是中间夹有橡胶垫的双层平板。

本发明还提供一种利用上述帘状锚固培养生物反应器进行植物细胞、组织和器官培养的方法，包括以下步骤：

a、给床体注入固化培养基并进行高压蒸汽消毒灭菌；

b、将待培养材料通过固化培养基接种锚固在床体的绒黏附层上；

c、床体接种后，在无菌条件下，各自分别依次无菌安装承重连接横梁、复合流注补料器和一次性无菌封膜组装成帘式网状双面锚固培养床，然后将每个帘式网状双面锚固培养床悬挂在悬挂装置上，推入培养室预定的位置，并将每个帘式网状双面锚固培养床上的进液管和排液管与供养***连通；

d、调节培养室温、湿度到所需的值，根据所需培养一定时间后，启动供养***，开始向床体内补充营养，直至培养体生长达到具有收获价值的生长量，关闭与供养***间的连接阀，无菌拆卸帘式网状双面锚固培养床与供养***之间的连接；

e、将待收获的帘式网状双面锚固培养床移入无菌操作室，撕开套在其上的一次性无菌封膜，沿帘式网状双面锚固培养床的边框无菌平削或平剪下长出边框的培养体，余下部分保留在床面上作为下一周期培养的种子；

f、换一新的一次性无菌封膜重新将培养床套封起来，推回培养室，开始新一轮培养。

步骤a中，所述将固化培养基注入床体及灭菌消毒的方法是将还未安装承重连接横梁的床体***事先装在榨式灭菌柜内的灭菌袋中，在床体两两之间插一缓冲隔板，在两支持网之间的床内腔中再***一块床内腔填充板；转动榨式灭菌柜上的手轮移动活动榨板，将***榨式灭菌柜中的各构件挤紧；将预先配制好未凝固的固化培养基自床体的上边框与绒黏附层之间的缝隙灌注入床体，使培养基充满绒黏附层与***的缓冲隔板之间；将灭菌袋扎紧后将榨式灭菌柜H推入高压蒸汽灭菌室进行灭菌即可。

步骤a中，也可以先将床体进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌操作间内灌注无菌固化培养基。

步骤b中，将待培养材料接种在床体的固化培养基上后，用缓冲隔板平压在床体上，使待培养材料深嵌入固化培养基中直到与绒黏附层充分接触，以使培养材料能通过绒黏附层持续获得其生长所需的养料。

本发明步骤c之前给床体注入固化培养基、高压蒸汽消毒灭菌和接种的方法也可以是，先将床体进行高压蒸汽灭菌，然后将培养基连同培养细胞同时植板锚固于床体的绒黏附层上，植板厚度以使细胞长成愈伤组织后能与绒黏附层充分接触为准。

本发明所提供植物培养生物反应器设计构建原理不同于目前以微生物发酵为参照的植物细胞培养工程的理论和原理，而是对高等植物高度分化结构特征的仿生。高等植物在自然状态下，即有器官分化，又有组织分化，且依照分化有功能上的分工，如其中的微管组织是连接各个细胞、组织和器官，并为其生长、分化和防御等提供物质和信号传导的输导组织。因此，本发明根据高等植物在细胞、组织和器官水平上的高度分工和相互间的有机联系及目标培养体在原植物体中所处解剖学结构的层次，以使植物培养体与培养生物反应器能有机紧密结合、持续稳定生长为目的，而不是将植物体培养驯化到接近微生物的生物学状态后使其像微生物一样在培养生物反应器中生长，生物反应器仅仅只是培养用的器物，二者没有像植物植株中各组成部分那样紧密结合在一起，仿生植物果实中充满维管束、专为胚提供水分和营养的植物胎座设计构建了帘式网状双面锚固培养床，以高亲水性纤维织成的网绒代替植物胎座上的维管束，循环给养***通过该仿生“微管***”将水分和营养连续不断地输送给借助固化培养基像植物“胚”一样附着锚固在该网绒上的植物培养体上，随着培养体的不断生长，二者就像植物的胚与胎座一样紧密结合在一起，直至结合形成为整体，这样只需接种一次，就可反复多次地收获其生物产物，达到连续大规模工厂化生产植物培养体的目的，并使植物细胞、组织和器官大量培养的起始投资成本得到极大降低，分散化解因资本投入过分集中所造成的巨大投资规模风险。

附图说明

图1为本发明帘状锚固培养生物反应器的***组成示意图；

图2为本发明床体、复合流注补料器和一次性无菌封膜组装形成帘式网状双面锚固培养床A后的轴侧示意图；

图3为图2沿I—I方向的剖视图；

图4为本发明床体与复合流注补料器组装后的轴侧示意图；

图5为本发明床体的轴侧示意图；

图6为本发明床体的分层结构轴侧示意图；

图7为本发明复合流注补料器的纵剖结构示意图和正立面示意图；

图8为图7沿II—II方向的剖视图；

图9为本发明一次性无菌封膜的结构示意图；

图10为本发明悬挂装置的结构示意图；

图11为本发明帘状锚固培养生物反应器悬挂安装就位后的轴侧示意图；

图12为本发明已装入床体的榨式灭菌柜的轴侧示意图；

图13为本发明待装入床体和未装入床体的榨式灭菌柜的轴侧示意图。

其中：

A—帘式网状双面锚固培养床 B—供养*** C—悬挂装置 D—阳光收集传输照明*** E—床体 F—复合流注补料器 G一次性无菌封 H—膜榨式灭菌柜

1—承重连接横梁      11—流注补料槽      21—球形悬挂滑吊

2—限厚框            12—槽套            22—球形滑轨

3—边框              13—铆闩            23—储液罐

4—下边框            14—铆孔            24—输液管

5—上边框            15—进液管          25—上空气连通管

6—绒黏附层          16—吊环            26—空气加压泵

7—支持网            17—待粘结带        27—连通管

8—间隙调控板        18—薄膜            28—补料管

9—预留孔            19—空气连通管      29—空压管

10—床内腔           20—排液管          30—上真空管

31—上排液管      47—丝杆          63—真空泵总阀

32—下过滤储液罐  48—手轮          64—蒸汽进气阀

33—过滤网        49—榨底板        65—下真空管阀

34—滤网操作手柄  50—框梁          66—灭菌滤器

35—下空气连通管  51—缓冲隔板      67—补料管阀

36—下真空管      52—万向轮        68—连通管阀

37—真空泵        53—床内腔填充板  69—空气连通管阀

38—下排液管      54—空气连通管阀  70—灭菌滤器

39—瞬时杀菌器    55—灭菌滤器      71—下回液管阀

40—回液管        56—节流阀        72—上排液管阀

41—阳光收集器    57—支管调节阀    73—下排液管阀

42—传输光缆      58—灭菌滤器      74—杀菌器进汽阀

43—发光末端      59—空压管阀      75—杀菌器出汽阀

44—固定前挡板    60—空压支管阀    76—杀菌器排水阀

45—固定后挡板    61—灭菌滤器      77—蒸汽进气管

46—活动榨板      62—上真空管阀    78—回流支管阀

具体实施方式

如图1、图11所示，一种帘状锚固培养生物反应器，包括多个帘式网状双面锚固培养床A、循环供养***B和悬挂装置C，帘式网状双面锚固培养床A悬挂在悬挂装置C上，每个帘式网状双面锚固培养床A均与循环供养***B相连通。

如图1所示，循环供养***B实际为一独立的无菌补料供养***，由上储液罐23和下过滤储液罐32及其附属的输液管24、上空气连通管25、空气加压泵26、连通管27、补料管28、空压管29、上真空管30、上排液管31、过滤网33、过滤网操作手柄34、下空气连通管35、下真空管36、真空泵37、下排液管38、高温瞬时杀菌装置39和回液管40所组成。该***所有与培养基接触部分均为不锈钢制成，***内可以进行洗涤、高温蒸汽消毒、对培养尾液进行高温瞬时杀菌和过滤等工艺操作。所述循环供养***B的储液罐23通过输液管24与各个培养床E的进液管15相连接，输液管24自储液罐23顶部接入并伸至罐底。连通管27一端自上储液罐23顶部侧壁接入，管口伸在上储液罐23近顶部，另一端自下过滤储液罐32的顶部接入，穿过过滤网33直伸到罐底。下过滤储液罐32通过下回液管40与各个培养床上一次性无菌封膜G下方的排液管20相连接，回液管40经高温瞬时杀菌装置39，由下过滤储液罐32顶部接入，管口伸在过滤网33的上方，让回流液经杀菌过滤后回流进下过滤储液罐32。通过空气加压泵26给上储液罐23实施无菌加压来将其中的培养液压送到各培养床，并通过调控其中压力的大小来调控供养量。通过真空泵37使下过滤储液罐32中产生负压，以促使流经床内腔10后未被吸收的培养液回流进下过滤储液罐32。通过真空泵37使上储液罐23中产生负压，以使下过滤储液罐32中的培养液通过连通管27回流进上储液罐23。上储液罐23和下过滤储液罐32分别与空气加压泵26和真空泵37相连接的管道29、30、36均装有气阀和空气过滤灭菌器。两罐顶部分别装有带空气过滤灭菌器和空气阀的上空气连通管25和下空气连通管35，使上储液罐23和下过滤储液罐32必要时能与罐外进行空气交换。连通管27近上储液罐23端用三通接有一补料管28，备给上储液罐23补充培养液用。上储液罐23和下过滤储液罐32的底均为圆锥形，且在锥底部分别装有上排液管31、上排液管阀72和下排液管38、下排液管阀73，供清洗罐体排放污水和高温蒸汽消毒后排放冷凝水之用。下过滤储液罐32的内上部、位于下回液管40的下方有两块分别焊固在下过滤储液罐32侧壁上、向中间倾斜、中间一块可活动、能向下翻转的过滤网33，以对来自下回液管40的残余培养基进行过滤，中间一片滤网能活动，操作过滤网操作手柄34可使其向下翻转，便于清洗滞留在网上的残余物。

如图2—图6所示，帘式网状双面锚固培养床A，具有床体E、复合流注补料器F和一次性无菌封膜G，床体E为一整体厚度约2cm左右的窗式帘状结构，具有两层支持网7，支持网7附着有绒黏附层6，支持网7和绒黏附层6压嵌安装在边框3内，边框3设有限厚框2，两层支持网7正对限厚框2竖直边框之间夹有间隙调控板8。床体E上方二面的2根承重连接横梁1用丝杆和螺母安装在床体E上，是床体E像窗帘一样悬挂时的承重梁，上有供套铆复合流注补料器F的预留孔9，在床体E灌注培养基、高压蒸汽灭菌后才在无菌条件下安装，其大小、厚薄、材料、力学特性及其上预留孔的大小和多少均因床的大小、重量而定。限厚框2、绒黏附层6、支持网7和夹在两支持网间的间隙调控板8各层被用螺丝、螺帽紧密固定在一起，也可以压铆固定在一起，使各层固定在一起时都必须将绒黏附层6和支持网7足够绷紧，保证在间隙调控板8的间隔作用下两支持网7之间保持一定间隔空间。间隙调控板8厚1.2mm~2.3mm，与限厚框2的竖直边框3等宽、长，夹在两支持网7之间，使两支持网间间隔形成一1.2mm~2.3mm的薄层补料通道床内腔10，补料通过此床内腔10流下时穿过支持网7渗进绒黏附层6，通过绒黏附层6的纤毛绒将培养液导流传质给粘附在帘式网状双面锚固培养床A上的植物细胞、组织、器官等培养体。在间隙调控板8的两面各有一与限厚框2竖直边框内表面凹槽相对应的条状突起，且二者能互相嵌合，以嵌压固定绒黏附层6和支持网7，阻止培养液从床的两边渗出。绒黏附层6是利用具有极强亲水性的纤维所制成的纤维网绒，其朝床内的一面为网状，朝床外的一面有约5mm厚的纤毛绒，起粘附固化培养基和导流培养液给培养体传质供给营养的作用，是粘附培养基、植物细胞、组织和器官的关键构件，其上边缘与限厚框2上边框5的上边缘相平齐，自其上边缘向下正对承重连接梁1上铆闩预留孔9处也相应地打有预留孔，以有利复合流注补料器F套装。支持网7是被压固在间隙调控板8二面的一种高强度网，起保护绒黏附层6、防止床内腔10阻塞的作用，其上边缘与绒黏附层6相平齐，在与绒黏附层6上预留孔相对应的位置也打有预留孔。

如图3、图7、图8所示，复合流注补料器F由流注补料槽11和槽套12及其附属的铆闩13、铆孔14、进液管15和吊环16所组成，是专为帘式网状双面锚固培养床A补注分配营养的部件，无菌安装在被灌注固化培养基、高压蒸汽灭菌、无菌安装承重横梁1后的床体E上。其除吊环为不锈钢制成外，其余均为高强度、耐高温工程塑料制成，且制成后经灭菌处理为无菌制品、无菌包装备用，可高温高压蒸汽灭菌、反复使用。所述流注补料槽11其实是槽套12夹在最内层的一横截面形状为一长方形加等腰三角形所组成五边形长槽，五边形的底朝上为槽顶，五边形的顶朝下为槽底，槽顶上装有一进液管15，槽底三角形楔尖部开有1.0mm～1.8mm窄缝，安装时伸入到床体E两支持网7间的床内腔10中，补料培养液由进液管15，经补料槽11底部的缝隙注流入床体E的床内腔10中。槽套12带有悬挂吊环16，悬挂吊环16下有铆闩预留孔14。流注补料槽11与床体E装有承重连接梁1的一端等厚，槽套12内腔与床体E装有承重连接梁1的一端等大，组装时将床体E装有承重连接梁1的一端***槽套12、在铆闩预留孔14中闩上铆闩13即可。帘式网状双面锚固培养床A悬挂到悬挂装置C上时，其全部重量均由槽套12上的悬挂吊环16承载，故复合流注补料器F又是帘式网状双面锚固培养床A悬挂承重的关键构件之一。

如图2、图9所示，一次性无菌封膜G实际就是一个由耐高温塑料薄膜18制成的塑料膜袋，其上有待粘结带17、空气连通管19和排液管20，具有良好的透光性，不透气，起将所述帘式网状双面锚固培养床A与外界有菌环境隔开、保持内部无菌的作用。制成后经消毒灭菌成无菌制品备用，为一次性消耗品，即每当一个培养周期结束、收获培养体时，一次性无菌封膜G便被撕下换成新膜。空气连通管19热压铆固在膜袋正面或背面上部靠边缘处，是床内与床外进行空气交换的通道，其上装有过滤器，可滤掉空气中的有害菌，确保床内空气与床外空气进行安全交换。流经床内腔未被吸收的剩余培养液经排液管20回流进循环供养***B。一次性无菌封膜G的下方倾斜设置，排液管20被热压密封固定在膜袋最下方的顶端部，且向内伸进约3cm，顶部封住，内纳液口开在管顶部的侧面，以防落下的培养体堵塞管口。安装前，膜较长的一侧和膜的下部倾斜边缘为已密封带，剩余两方为待密封带，待密封带边缘为涂有粘胶的待粘结带17，其上有一层保护膜，安装时撕开保护膜即可实施粘结封膜。被灌注培养基、消毒灭菌、接种、无菌安装承重横梁1和复合流注补料器F后的床体E再被套上一次性无菌封膜G封固后即可悬挂就位，打开排液管20与循环给养***B实施无菌对接。

如图5、图12所示，床体E的限厚框2的竖直边框3和下边框4的外边缘较薄约0.3cm～0.5cm，内边缘较厚约0.5cm～0.8cm，相当于所粘附固化培养基的厚度，起限制床面所灌注固化培养基厚度的作用。其平的一面朝床内层，不平的一面朝床外，框外表面较厚侧边框平直而严格在同一平面内，以便于其在榨式灭菌柜H中能与缓冲隔板44间无缝榨紧，使所灌注固化培养基在注入和高压灭菌时不会泄漏。框的上边框5较薄，其他边框较后厚，上边框5与内层的绒黏附层6间有一约3mm～5mm缝隙，在榨式灭菌柜H中给床面灌注固化培养基时便由此缝注入。

如图10所示，悬挂装置C由带吊钩的球形悬挂滑吊21和球形滑轨22所组成，二者均用不锈钢或高强度塑料制成，球形滑轨22被用螺丝、螺帽安装固定在培养室顶的工字钢梁上，其设计强度依帘式网状双面锚固培养床A的大小尺寸和整体重量而定，以足以悬挂任意数量的该培养床且可以滑动自如为准。所述球形悬挂滑吊21为带有吊钩的实心球，球形滑轨22的断面为圆形，球形悬挂滑吊21恰好能嵌合在滑槽内沿球形滑轨22自由滑动。球形滑轨22被安装固定在帘状锚固培养床A转移路径的室内天花顶面的工字钢梁上。球形悬挂滑吊21可沿球形滑轨22做90°直角或其它任意角度的转弯。球形悬挂滑吊21、球形滑轨22直径的大小，完全视帘式网状双面锚固培养床A的大小和重量对材料强度和力学要求而定。

如图1所示，阳光收集传输照明***D由阳光收集器41、传输光缆42和发光末端43所组成，发光末端43可以伸入帘式网状双面锚固培养床A两两之间。阳光收集传输照明***D是一独立光照***，多个巨大的阳光收集器41安装在培养室的房顶上，通过传输光缆42将其所收集的室外自然光传输给夹在已安装就位培养床之间的发光末端43，为床上的植物培养体提供光照。

如图12、图13所示，榨式灭菌柜H是一个独立的床体E专用的辅助消毒设备，实际是一个由固定前挡板44、固定后挡板45、活动榨板46、手轮48、榨底板49和框梁50所组成。活动榨板46上装有1～2根粗丝杆47，丝杆47从固定后挡板45中穿出后再装上带内丝的手轮48，只要转动手轮48，就可带动活动榨板46前后移动，从而将夹在榨框内还未装上承重连接横梁1的床体E挤紧或放松。固定后挡板45中丝杆47穿过处的孔，用孔套加梁进行加固，以满足利用螺旋压榨法将榨框中的各构件榨紧时相关材料所应有的力学性能。榨底板49下装有四个万向轮52，便于整个榨式灭菌柜H能自由移动。榨式灭菌柜H的高宽大小均取决于床体E，且整体可被高温高压蒸汽灭菌。其附属的缓冲隔板51和床内腔填充板53仅在灭菌时使用，前者插在床体E两两之间，后者***床体E的床内腔10中。所述缓冲隔板51是一中间垫有一圈橡胶垫的方正平直的双层不锈钢板，在高压蒸汽灭菌期间，由其与床体E的限厚框2、绒黏附层6及床内腔填充板53临时围合成一前、后、下方及两侧密闭的薄层空间，以供填充固化培养基，其间的橡胶垫起缓冲热胀冷缩、防止高温高压灭菌后冷却收缩时床体E的限厚框2与不锈钢缓冲隔板51之间出现缝隙、导致培养基泄漏的作用。

一种利用上述帘状锚固培养生物反应器进行植物细胞、组织和器官培养的方法，具体步骤是：

1、循环供养***B消毒灭菌。

关闭空压管阀59、真空泵总阀63，打开空气连通管阀54、节流阀56、支管调节阀57、空压支管阀60、上真空管阀62、蒸汽进气阀64、下真空管阀65、补料管阀67、连通管阀68、空气连通管阀69、下回液管阀71、回流支管阀78、上排液管阀72和下排液管阀73，蒸汽从蒸汽进气管77进入，经过下真空管36、上真空管30分别进入储液罐23、下过滤储液罐32后分别从输液管24、上空气连通管25、连通管27、补料管28、空压管29、空压支管阀60、上排液管31、下空气连通管35、下排液管38、下回液管40排出，后按操作规程完成循环供养***B的消毒工序，然后关闭蒸汽进气阀64，蒸汽冷凝水经上排液管31和下排液管38排出后关闭上排液管阀72和下排液管阀73，封好输液管24和下回液管40与帘状锚固培养生物反应器无菌对接的相关接头，后通过补料管28给上储液罐23注入培养液到规定的液位。

2、床体E消毒灭菌、灌注固化培养基。

将还未安装承重连接横梁1的床体E***事先装在榨式灭菌柜H榨框中的耐高温高压蒸汽灭菌袋中，同时在床两两之间插一缓冲隔板51，在床的两支持网7之间再***一块大小、厚薄与该间隙相当的床内腔填充板53，后转动榨式灭菌柜H活动榨板46上固定丝杆47上的手轮48，将***榨式灭菌柜H中的各构件挤紧后，将预先配制好未凝固的固化培养基灌注入床体E的绒黏附层6与***的不锈钢缓冲隔板51之间，使所注入培养基稍高于将要安装的承重连接横梁1的下缘，后将耐高压灭菌袋扎紧，推入高压蒸汽灭菌室进行灭菌。

3、压嵌或植板接种。

将已灭好菌的床体E推入无菌操作间，待固化培养基充分冷却凝固后在无菌条件下将床体E取出平放在无菌操作台上，其下用同时取出的缓冲隔板51垫好，后将待培养材料以合适的密度接种在床体E的固化培养基上，然后用缓冲隔板51平压在床上，使待培养材料深嵌入固化培养基中直到与绒黏附层6充分接触，以使培养材料能通过绒黏附层6持续获得其生长所需的养料，以同样方法给另一面也接上种。也可以先用榨式灭菌柜H或其他方法将床体E进行高压蒸汽灭菌后再在无菌操作间内无菌灌注固化培养基，或用无菌低熔点琼脂培养基将较高密度悬浮培养细胞植板固定于床体E的绒黏附层6上植板厚度在3mm以内，使细胞长成愈伤组织后能与绒黏附层3充分接触，以获得持续生长所需要的营养。

4、组装—封袋—悬挂—对接—培养—收获—再培养

接种后，同样在无菌条件下，依次无菌安装承重连接横梁1、复合流注补料器F和一次性无菌封膜G，然后将已无菌组装完毕、接完种的帘式网状双面锚固培养床A的复合流注补料器F上的吊环16挂入悬挂装置C的球形悬挂滑吊21的吊钩，将床沿球形滑轨22推入培养室预定的位置，将其上的进液管15和排液管20分别与循环供养***B的输液管24、回液管40实施无菌对接。然后将室温调至25℃±5℃、湿度调至80％±5％，待其培养20天左右后，关闭上真空管阀62、空气连通管阀54、补料管阀67、连通管阀68和空压支管阀60，打开节流阀56、支管调节阀57和空压管阀59，启动空气加压泵26，开始向培养床内补充营养，调节空气连通管阀54和支管调节阀57，使储液罐中的压力能维持培养床E的床内腔10的下部有营养液滴间歇流出，开始补料培养，直至培养体长出床面，体积增加3.5倍以上，生长逐渐减缓几近停滞时为一个培养周期(以南方红豆杉愈伤组织为例，该周期约为70~80天)。然后关闭支管调节阀57和回流支管阀78，无菌拆卸掉进液管15、排液管20与循环供养***B的输液管24、回液管40间的连接，将帘式网状双面锚固培养床A沿球形滑轨22自培养室中移出，移入无菌操作室，撕开套在其上的一次性无菌封膜G，用一锋利的无菌长刀，紧靠帘式网状双面锚固培养床A的两竖直边框3平削下长出边框的培养体，余下部分仍保留在床面上，后换一新的一次性无菌封膜G重新将培养床套封起来，再沿球形滑轨22推回培养室，开始新一轮培养。

5、培养液循环

培养过程中自床内腔10下部间歇滴流出的剩余营养液经高温瞬时杀菌器39再杀菌后回流进下过滤储液罐32的过滤网33上，经过滤后被储存在罐内备用。若下过滤储液罐32的位置较高，回流液不能依靠自身重力作用流进下过滤储液罐(32)，则可关闭空气连通管阀69、连通管阀68、上真空管阀62、蒸汽进气阀64，打开下真空管阀65、真空泵总阀63，启动真空泵37，使下过滤储液罐32中产生负压，以促使回流液回流进下过滤储液罐32。

当下过滤储液罐32中的回流液积累到一定量、液面已快接近过滤网的高度时，关闭节流阀56，空气加压泵26停止运转，打开空气连通管阀54，使上储液罐23降压至与空气平衡后再关闭空气连通管阀54、空压管阀59、下真空管阀65、蒸汽进气阀64、空压支管阀60和补料管阀67，打开真空泵总阀63、上真空管阀62、空气连通管阀69、下回液管阀71、连通管阀68，启动真空泵37，使上储液罐23中产生负压，下过滤储液罐32中的回流培养液便会通过连通管27回流进上储液罐23，待下过滤储液罐32中的回流培养液转移完成后便使整个循环供养***B重新回到供养状态，如此反复循环，培养得以周而复始地持续进行。若回流进下过滤储液罐32的回流液中积累了过多的培养体的有害代谢物，则可将回流液自下排液管38排出到有关处理***中除去或萃取出其中的有害代谢物，经净化了的回流培养液又可进入循环供养***B再利用。

本发明具有以下优点和积极效果：

①非生产过程短。以愈伤组织培养为例，由三角瓶种，或培养皿种、塑料袋种一步就到生产接种，免去了繁琐的梯级放大接种。

②可一次接种多批次培养收获。由于采用了粘附锚固、循环补料培养和半保留收获技术，因而接种一次后只要未被污染，便可多批次的培养、多批次的收获，不需每批次接种，使生产过程得以简化而大大缩短。

③设备制造简单，成本低。一单面5M2有效培养面积的培养床，制造***不会超过1000元，但其拥有的培养空间却相当于300L，而现有一个300L任意类型的生物反应器，其造价都在10万元以上。

④操作控制简单，较易实现智能化全自动控制。因本发明中的培养床为一相对独立的无菌体系，且其培养生长的过程是一个全仿生的过程，因此不需要各种复杂的生物传感器采集信息，实施调控，而只需对培养室的温、湿度进行适当调控。整个操作工艺流程只有消毒、接种、组装、就位、培养、收获、再培养7个节点，且不需要反复继代、多级扩培，所以较易实现标准化、智能化全自动控制。

⑤生产风险成本低。由于本发明中所采用帘式悬挂培养床只有两个培养面，且每两个培养面构成一相对独立的培养体系，所以万一某床培养过程中出现问题，其只会造成单床失败，而不会影响其他，所造成的损失极小，相对整个大规模培养而言，其几乎可以忽略不计。

⑥能耗低，运营成本低。由于整个培养过程中培养液采用了循环利用方式，循环动力采用了气压式，所以整个培养过程除培养室的温、湿度维护需要耗能外，其它方面耗能极低。培养所需光照，若考虑阳光收集传输照明***的造价，则可采用玻璃棚自然光照培养。

⑦易于任意规模的工业化放大。由于本发明帘状锚固培养生物反应器是一个个悬挂叠垛在培养室内窗帘样相对独立的培养单元所组成的***，培养室每10cm横切空间便至少可以容纳本发明中的一帘培养床，扩大规模只要增加帘数即可。所以，培养室的规模有多大，培养生产的规模就可以有多大。

⑧可一器多用。由于本发明帘状锚固培养生物反应器的培养单元是一个中空的帘状床，所以其对细胞、组织、器官、植物、动物和微生物应都较适合。

⑨易于在线实施调控。由于本发明实行的是补料连续培养方法，所以可在培养的任意阶段添加特殊的添加剂实施有针对性地调控。

⑩较为独特的仿生学原理。本发明帘状锚固培养生物反应器中的帘式网状双面锚固培养床A，是基于对植物子房中胎座的仿生，培养体粘附锚固在帘式网状双面锚固培养床A的绒黏附层6上进行培养，也是基于植物果实中种子着生于胎座的仿生，将培养体与培养生物反应器视为整体来考虑，是本发明最具价值之所在。

现已用本发明进行了长达1年共6个批次的南方红豆杉Taxus chinensis varmariei愈伤组织实体培养，愈伤组织产量可达392g干重/日·M²，紫杉醇含量最高可达愈伤组织干重的0.0465％，是天然植株中含量的40倍。

Claims (13)

1.一种帘状锚固培养生物反应器，包括帘式网状双面锚固培养床(A)、供养***(B)和悬挂装置(C)，帘式网状双面锚固培养床(A)悬挂于悬挂装置(C)上，所述帘式网状双面锚固培养床(A)具有床体(E)、复合流注补料器(F)和一次性无菌封膜(G)，床体(E)具有双层支持网(7)，支持网(7)安装在边框(3)内，两支持网(7)间有空隙形成床内腔(10)，在支持网上附着有绒黏附层(6)，绒黏附层(6)为具有强亲水性的纤维制成，复合流注补料器(F)安装在床体(E)的顶部，具有流注补料槽(11)，流注补料槽(11)连通床体(E)的床内腔(10)和设置在复合流注补料器(F)上的进液管，床体(E)外套装有一次性无菌封膜(G)，一次性无菌封膜(G)上设有排液管和空气连通管；供养***(B)具有输液管(24)和储液罐(23)，帘状锚固培养生物反应器通过进液管(15)和输液管(24)与储液罐(23)连通。

2.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，所述的供养***(B)为循环供养***，具有储液罐(23)和下过滤储液罐(32)，储液罐(23)通过输液管(24)与复合流注补料器(F)上的进液管(15)连通，通过空气加压泵(26)将储液罐(23)中的培养液注入帘式网状双面锚固培养床(A)，下过滤储液罐(32)通过回液管(40)与一次性无菌封膜(G)下的排液管(20)连通，回流管(40)与下过滤储液罐(32)之间设有瞬时杀菌器，储液罐(23)和下过滤储液罐(32)之间有连通管(27)，通过真空泵(37)可以将下过滤储液罐(32)中的回流培养液打入储液罐(23)中。

3.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，所述悬挂装置(C)具有球形滑轨(22)，球形滑轨(22)内设有多个球形悬挂滑吊(21)，多个帘式网状双面锚固培养床(A)悬挂在球形悬挂滑吊(21)上。

4.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，所述床体(E)的两支撑网(7)之间有间隙调控板(8)，边框(3)上设有限厚框(2)，边框(3)的上边框(5)外配置有承重连接横梁(1)。

5.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，所述复合流注补料器(F)具有铆闩(13)和铆孔(14)、通过铆闩(13)和铆孔(14)将复合流注补料器(F)安装于床体(E)的顶部，复合流注补料器(F)的顶部安装有吊环(16)。

6.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，所述一次性无菌封膜(G)为耐高温塑料薄膜(18)制成的塑料膜袋，其至少一边具有待粘结带(17)，其余边封闭，下边倾斜设置，排液管(20)设在下边较低边角处。

7.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，其还具有照明***，所述照明***是阳光收集传输照明***(D)，由阳光收集器(41)、传输光缆(42)和发光末端(43)组成，阳光收集器(41)安装在培养室的房顶上，发光末端(43)安装在帘式网状双面锚固培养床(A)两两之间。

8.根据权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，其还具有榨式灭菌柜(H)，榨式灭菌柜(H)具有方体柜形框架，内设有活动榨板(46)，框外安装有手轮(48)，通过操作手轮(48)可以移动控制活动榨板(46)。

9.根据权利要求8所述的帘状锚固培养生物反应器，其特征在于，所述榨式灭菌柜(H)配有与床体(E)长宽相适应的缓冲隔板(51)和与床内腔(10)长宽相适应的床内腔填充板(53)，缓冲隔板(51)是中间夹有橡胶垫的双层平板。

10.一种利用权利要求1所述的帘状锚固培养生物反应器进行植物细胞、组织和器官培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、给床体(E)注入固化培养基并进行高压蒸汽消毒灭菌；

b、将待培养材料通过固化培养基接种锚固在床体(E)的绒黏附层(6)上；

c、床体(E)接种后，在无菌条件下，各自分别依次无菌安装承重连接横梁(1)、复合流注补料器(F)和一次性无菌封膜(G)组装成帘式网状双面锚固培养床(A)，然后将每个帘式网状双面锚固培养床(A)悬挂在悬挂装置(C)上，推入培养室预定的位置，并将每个帘式网状双面锚固培养床(A)上的进液管(15)和排液管(20)与供养***(B)连通；

d、调节培养室温、湿度到所需的值，根据所需培养一定时间后，启动供养***(B)，开始向床体(E)内补充营养，直至培养体生长达到具有收获价值的生长量，关闭与供养***(B)间的连接阀，无菌拆卸帘式网状双面锚固培养床(A)与供养***(B)之间的连接；

e、将待收获的帘式网状双面锚固培养床(A)移入无菌操作室，撕开套在其上的一次性无菌封膜(G)，沿帘式网状双面锚固培养床(A)的边框(3)无菌平削或平剪下长出边框的培养体，余下部分保留在床面上作为下一周期培养的种子；

f、换一新的一次性无菌封膜(G)重新将培养床套封起来，推回培养室，开始新一轮培养。

11.根据权利要求10所述的进行植物细胞、组织和器官培养的方法，其特征在于，步骤a中，所述将固化培养基注入床体(E)及灭菌消毒的方法是将还未安装承重连接横梁(1)的床体(E)***事先装在榨式灭菌柜(H)内的灭菌袋中，在床体 (E)两两之间插一缓冲隔板(51)，在两支持网(7)之间的床内腔(10)中再***一块床内腔填充板(53)；转动榨式灭菌柜(H)上的手轮(48)移动活动榨板(46)，将***榨式灭菌柜(H)中的各构件挤紧；将预先配制好未凝固的固化培养基自床体(E)的上边框(5)与绒黏附层(6)之间的缝隙灌注入床体(E)，使培养基充满绒黏附层(6)与***的缓冲隔板(51)之间；将灭菌袋扎紧后将榨式灭菌柜(H)推入高压蒸汽灭菌室进行灭菌即可。

12.根据权利要求10所述的进行植物细胞、组织和器官培养的方法，其特征在于，步骤b中，将待培养材料接种在床体(E)的固化培养基上后，用缓冲隔板(51)平压在床体(E)上，使待培养材料深嵌入固化培养基中直到与绒黏附层(6)充分接触，以使培养材料能通过绒黏附层(6)持续获得其生长所需的养料。

13.根据权利要求10所述的进行植物细胞、组织和器官培养的方法，其特征在于，步骤c之前给床体(E)注入固化培养基、高压蒸汽消毒灭菌和接种的方法是，先将床体(E)进行高压蒸汽灭菌，然后将培养基连同培养细胞同时植板锚固于床体(E)的绒黏附层(6)上，植板厚度以使细胞长成愈伤组织后能与绒黏附层(3)充分接触为准。

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