CN101096705A - 多态性位点基因型预测心脑血管疾病发生及预后的用途、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的多态性位点基因型用于预测个体心脑血管疾病发生及预后的用途，用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型，预测个体心脑血管疾病发生及预后的方法和试剂盒。属于医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的多态性位点基因型用于预测心脑血管疾病发生及预后的用途。本发明还涉及一种通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型，预测心脑血管疾病发生及预后的方法和试剂盒。本发明属于医药领域。
背景技术
脑卒中具有发病率高、复发率高、致残率高及致死率高4大特点，且治疗方法有限，是危害人类健康的最严重疾病之一，所以对各种危险因素的预防越来越重要。脑卒中的危险因素分为可控性和不可控性两部分。可控性危险因素是脑卒中一级预防，主要包括对有高血压、高血脂及高血糖患者进行饮食调节和药物干预，戒烟、忌酒，对心房纤颤和严重颈动脉狭窄患者的治疗等。然而，大量的临床实践证实，有相当一部分动脉粥样硬化所致的脑卒中患者，患病前既无吸烟、酗酒等不良嗜好，也没有高血压、糖尿病、心脏病史。
多数meta分析结果显示，高同型半胱氨酸血症(Hcy，homosysteine)是诱发心脑血管疾病一个重要、独立危险因子。高Hcy血症患者可能较早出现冠状动脉和其他动脉的粥样硬化病变，是缺血性心脑血管疾病的独立危险因素。Boushey等【JAMA，1995，274(8)：10492-10571】对27份研究结果进行资料综合分析发现，tHcy升高与致命和非致命的动脉粥样硬化性血管疾病危险增加有关。这种危险的重要性类似于其它危险因子如高胆固醇血症、高血压、吸烟。他们从分析中还发现Hcy水平和血管危险之间呈一种逐级的线形相关，即剂量依赖关系。这种关系的重要性类似于血浆胆固醇增加0.15mmol/L。此外，欧洲19个中心进行的“高Hcy与心血管疾病”协作计划【JAMA，1997，277(14)：17752-17811】的调查研究也证实，Hcy是缺血性心脑血管疾病的一种独立危险因子，并认为高Hcy血症比任何其它危险因子预示动脉粥样硬化更有价值。
人体内同型半胱氨酸作为蛋氨酸代谢的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。同型半胱氨酸主要通过两条途径进行代谢：再甲基化途径和转硫途径。再甲基化途径：约有50％同型半胱氨酸在蛋氨酸合酶的作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸，参加体内蛋白质的代谢。这一反应中的甲基供体(N-5甲基四氢叶酸)是由N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylene tetrahydrofolate reductase)作用于N-5，10-亚甲基四氢叶酸形成的。另外，约50％的同型半胱氨酸也可通过转硫途径在胱硫醚β合酶(CBS，cystathionine β-synthase)的催化下，与丝氨酸缩合成胱硫酶，后者进一步生成半胱氨酸和α-酮丁酸，此过程需要磷酸吡哆醛(活性维生素B6)作为辅助因子【TIPS，1990，11：411-416】。
高Hcy血症的形成涉及多种因素，包括遗传、营养、药物及其他因素等【Cattaneo M.Hyperhomocysteinemia，atherosclerosis and thrombosis[J].Thromb Haemost，1999，81：165-176】。影响体内血浆同型半胱氨酸水平主要来自遗传因素和营养因素两方面。遗传性Hcy血症主要是由于胱硫醚β合成酶、甲硫氨酸合成酶(MS)及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)活性降低所致。在已经发现的人类MTHFR基因突变中，多数是可以导致酶活性严重下降甚至酶活性缺失的突变，在人群中罕见，而第677位核苷酸的基因突变(C→T)引起该酶的热不稳定性增加，酶活性轻中度降低，使蛋氨酸循环障碍，同型半胱氨酸浓度增高【Circulation，1996，94：3074-3078】。Brattstrom等【Circulation，1998，98(23)：2520-2526】总结了3年中所进行的13项血浆Hcy水平与MTHFR基因型的研究和23项病例对照研究，共涉及5869例心血管病患者和6644例健康对照者，发现TT型血浆Hcy水平显著高于CC型。
高同型半胱氨酸血症与多种疾病以及疾病的并发症相关。高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤和功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，引起血管舒缩因子平衡紊乱，导致妊娠高血压综合征(PIH)。因此，多数研究认为MTHFR基因是PIH的主要候选基因【中国公共卫生，2004，20，6：762-764】。目前广泛认为，除心脑血管病的传统危险因素外，同型半胱氨酸是动脉粥样硬化性血管疾病又一个强有力的预测因子。血液中总的同型半胱氨酸(total homocysteine，tHcy)水平升高可导致冠心病、脑血管病、外周血管病、动静脉血栓栓塞性疾病等。近年来基础与临床研究均显示，tHcy是心脑血管疾病独立的危险因素。高tHcy血症可促发所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周血管疾病等【心血管病学进展，2000，21：29】。大量的事实表明轻度到中度tHcy血症(tHcy浓度≥12μmol/L，但≤100μmol/L)是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的、独立的危险因素。Sutton等【Circulation，1997，96：1745】认为血Hcy水平与单纯收缩期高血压独立相关。有报道认为，Hcy代谢关键酶的基因多态性与单纯收缩期高血压的***密切。MTHFR可能是单纯收缩期高血压的易感基因，tHcy是单纯收缩期高血压的重要中间表型【中华心血管病杂志，2003，31：269-273】。Lim等【Am J Epidemiol，2002，156：1105-1113】认为高水平的Hcy可增加发生高血压的危险性。高同型半胱氨酸血症(HHcy)是高血压病人死亡和左心室射血分数(LVEF)低的独立预测因子【Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005，25：115-121】。高血压病患者中tHcy水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。
一项孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法已于2001年4月2日申请专利，专利申请号为01107305.5，授权公告号为CN1155722C。该发明为孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法。所说的报警基因包括亚甲基四氢叶酸还原酶基因和甲硫氨酸合酶还原酶基因，其突变位点分别为C677T和A66G，并且分别提供了相应的引物序列，可在孕前诊断子代是否发生神经管畸形。
由于心脑血管疾病为严重的危害健康疾病，而脑卒中更是具有发病率高、复发率高、致残率高及致死率高4大特点，且治疗方法有限，是危害人类健康的最严重疾病之一，所以对各种危险因素的预防越来越重要。对于一些已知的公认的危险因素如高血压、高血脂和高血糖的干预和治疗对于心脑血管疾病的预防有了一定的效果，但是仍然有一些患者由于存在其他未知的危险因素而导致不良后果。为了更早地更全面地预防心脑血管疾病尤其是脑卒中的发生，改善其预后，临床迫切地需要及早干预和治疗心脑血管疾病的危险因素，即迫切需要对于心脑血管疾病尤其是脑卒中进行早期预测，本发明即提供一种新的预测心脑血管疾病发生及预后的方法和试剂盒以及用途。
发明内容
本发明涉及MTHFR基因的多态性位点基因型用于预测个体心脑血管疾病的发生及预后的用途。
另外，本发明为个体心脑血管疾病的发生及预后的预测提供一种方法和试剂盒，即通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病的发生及预后的可能性。在多态性位点基因型分析的基础上可以预测个体心脑血管疾病的发生及预后的可能性，因此能够更早地预防心脑血管疾病的发生，改善心脑血管疾病的预后，减少病死率，减轻患者痛苦，降低医疗成本。
在本发明所述的用途、方法和试剂盒中，所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含C677T多态性位点，所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A、A1317G中的多态性位点。在本发明中，所述的MTHFR的多态性位点还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明中，所述的心脑血管疾病包括急性心脑血管事件、急性脑血管疾病、脑梗塞、脑出血、一过性脑缺血发作、脑中风、脑卒中、急性心血管疾病、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克、心源性猝死，优选为脑卒中，预后特别指死亡。个体优选为高血压个体。具体的，当
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测个体发生心脑血管疾病的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测个体发生心脑血管疾病的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
本发明的用途中特别涉及MTHFR多态性位点基因型及血液同型半胱氨酸对于个体心脑血管疾病发生和预后预测的协同作用，特别涉及在适度增高的血液同型半胱氨酸水平时，MTHFR多态性位点基因型对于心脑血管疾病发生及预后的预测作用，以及MTHFR多态性位点基因型和高血压预测心脑血管疾病发生及预后的协同作用，即对于高血压个体，MTHFR多态性位点基因型对于心脑血管疾病发生及预后的预测作用更加显著，具体的，当
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
本发明中的高同型半胱氨酸血症特别指血液同型半胱氨酸水平适度增高，在本发明中为血液同型半胱氨酸水平≤20umol/L，或者血液同型半胱氨酸水平低于人群中血液同型半胱氨酸水平高值的90％。
本发明的又一方面，涉及一种用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸。优选地，所述多态性分型寡核苷酸是：(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测MTHFR基因的多态性位点基因型，或者(2)用于检测MTHFR基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与MTHFR基因上的多态性位点的核酸杂交，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，优选地，寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
本发明中，所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
本发明的再一方面，涉及一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病发生及预后的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，所述方法包括步骤：(1)利用上述的多态性分型寡核苷酸检测来自生物样品中所述MTHFR基因的多态性位点基因型；(2)根据所述MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病发生及预后。
在本发明所述的方法中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明中，所述的心脑血管疾病包括急性心脑血管事件、急性脑血管疾病、脑梗塞、脑出血、一过性脑缺血发作、脑中风、脑卒中、急性心血管疾病、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克、心源性猝死，优选为脑卒中，预后特别指死亡。具体的，当
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测个体发生心脑血管疾病的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测个体发生心脑血管疾病的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
本发明的方法中特别涉及MTHFR多态性位点基因型、血液同型半胱氨酸及血液叶酸水平对于个体心脑血管疾病发生和预后预测的协同作用，特别涉及在适度增高的血液同型半胱氨酸水平时，MTHFR多态性位点基因型对于心脑血管疾病发生及预后的预测作用，以及MTHFR多态性位点基因型和高血压预测心脑血管疾病发生及预后的协同作用，即对于高血压个体，MTHFR多态性位点基因型对于心脑血管疾病发生及预后的预测作用更加显著，具体的，当
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
本发明中的高同型半胱氨酸血症特别指血液同型半胱氨酸水平适度增高，在本发明中血液同型半胱氨酸水平适度增高指血液同型半胱氨酸水平≤20umol/L，或者血液同型半胱氨酸水平低于人群中血液同型半胱氨酸水平高值的90％，即，本发明提供的用途和方法在血液同型半胱氨酸水平适度增高的人群或者个体的情况下，预测效果最好，在血液同型半胱氨酸水平显著升高(血液同型半胱氨酸水平＞20umol/L，或者血液同型半胱氨酸水平高于人群中血液同型半胱氨酸水平高值的90％)的情况下，预测的效果降低(阳性预测值，阴性预测值，敏感性或特异性小于血液同型半胱氨酸水平适度增高范围的人群和个体)。
在本发明所述的方法，可以使用包括选自以下的差异核酸分析技术：聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应一限制性片段长度多态性、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、Taqman生物检测方法。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列测定、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法。生物芯片是指采用广岛原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量或质量。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP、Taqman技术、生物芯片、核酸芯片或者试剂盒。本发明对于多态性位点基因型的检测方法的说明并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测个体心脑血管疾病发生及预后的方法均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点功能型基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测生物样品中个体心脑血管疾病发生及预后的方法。
本发明的另一方面，还涉及一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病发生及预后的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，其中所述的心脑血管疾病包括急性心脑血管事件、急性脑血管疾病、脑梗塞、脑出血、一过性脑缺血发作、脑中风、脑卒中、急性心血管疾病、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克、心源性猝死，优选为脑卒中，预后特别指死亡，所述试剂盒包含至少一种本发明所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。具体的，当
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
另外，当
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
本发明中的高同型半胱氨酸血症特别指血液同型半胱氨酸水平适度增高，在本发明中为血液同型半胱氨酸水平≤20umol/L，或者血液同型半胱氨酸水平低于人群中血液同型半胱氨酸水平高值的90％，，即，本发明提供的试剂盒在血液同型半胱氨酸水平适度增高的人群或者个体的情况下，预测效果最好，在血液同型半胱氨酸水平显著升高(血液同型半胱氨酸水平＞20umol/L，或者血液同型半胱氨酸水平高于人群中血液同型半胱氨酸水平高值的90％)的情况下，预测的效果降低(阳性预测值，阴性预测值，敏感性或特异性小于血液同型半胱氨酸水平适度增高范围的人群和个体)。
本发明提供的试剂盒中MTHFR的多态性位点基因型还可以进一步包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。本发明提到的试剂盒至少包括测定MTHFR的C677T多态性位点，还可以进一步包括测定上述的MTHFR其他多态性位点中的一个或者一个以上位点，也包括上述多态性位点的不同的排列组合。
在本发明所述的方法和试剂盒中所述的生物样品选自：血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液样品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织、组织样分泌物、***物样本等。
所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，或者包含运用芯片、微检测***等方法进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
基于MTHFR基因，针对其不同的多态性位点，可以设计并且获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测个体心脑血管疾病发生及预后。基于本发明的预测方法和用途获得的各种诊断剂和试剂盒也属于本发明范围。
本发明中的“试剂盒”不限于试剂盒的固有形式，可以表现为微芯片、微检测***或者依赖于各种载体的检测***，以及包括前述检测***的统一包装形式，如微孔板***、纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体，塑料载体、硅胶载体、凝胶载体、膜质载体等。
本发明是基于多年的流行病学研究，采用前瞻性巢式病例-对照研究对于参与研究的个体分别检测MTHFR基因的多态性位点基因型、基线血压值、血液同型半胱氨酸水平及一些基础的生理指标，对于MTHFR基因多态性位点、高血压、血液同型半胱氨酸水平等对心脑血管事件及其预后的作用进行分析，基于研究分析结果开发了相应的试剂盒，并且通过试剂盒的检测验证，确立了本发明中的用途和方法。
人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3上，基因包括11个外显子和10个内含子，外显子的长度分别为99-252bp，内含子长度分别为192-981bp，cDNA全长2.2kb，编码一种黄素蛋白，其生化功能是催化从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应【Zhou J，Kang SS，Wong P WK，et al.Purification and characterization ofmethylenetetrahydrofolate reductase from human cadaver liver.Biochem Med Metab Bio，1990，43：234-242.】。5-甲基四氢叶酸是一种甲基供体，参与多种重要的生物过程(如嘌呤、嘧啶的合成)。它还与甲硫氨酸代谢中同型半胱氨酸的复甲基化有关。MTHFR的多态性位点基因型，将改变MTHFR的功能活性。MTHFR酶活性降低，会导致Hcy在体内蓄积，而Hcy不仅与心血管疾病有关，而且具有胚胎毒性，可能是一种致畸性物质。MTHFR缺陷与心血管疾病和先天畸形的发生有关。
高同型半胱氨酸血症可促进所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等。高血压病患者中tHCY水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。
常见的单核苷酸多态性(SNP)位点可以位于基因的外显子部位、内含子部位和非编码区部位包括调节部位，优选为外显子部位，尤其是能改变编码的氨基酸序列的多态性位点。
本发明人研究发现：
MTHFR的常见的多态性位点表现为但不限于以下形式：C677T、A1298C、G1793A、G215A、G482A、A1317G，优选为C677T。MTHFR的多态性位点基因型，尤其是上述位于外显子部位能够影响到相应编码氨基酸序列的多态性位点，常常会影响到MTHFR的酶功能和活性，因此间接或者直接影响到同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的发生，因此能够进一步预测心脑血管疾病的发生及预后。即通过测定MTHFR的多态性位点基因型，可以预测个体心脑血管疾病的发生及预后。特别地，我们的研究有了意想不到的结果，MTHFR多态性位点基因型、高血压、血液同型半胱氨酸水平对于个体心脑血管疾病发生及预后的预测作用有协同作用，即上述二者以上的因素对于个体心脑血管疾病发生及预后的预测作用更强。即MTHFR多态性位点基因型对于个体心脑血管疾病发生及预后有预测作用；当联合高血压时，预测作用增强，即对于高血压个体预测其心脑血管疾病发生及预后的作用更强；当同时联合高血压及血液同型半胱氨酸水平时，预测作用更强，及三者共同对于预测个体心脑血管疾病发生及预后有协同作用。
通过随访3万多例符合研究入选条件的合格的研究对象2～10年，收集到204例对象发生心脑血管疾病(包括死亡)，其中148例具有完整的MTHFR C677T位点基因型数据，根据1∶1匹配性别、年龄及生活地区相似的对照组。校正多个心血管危险因子后，携带MTHFR 677TT基因型的高血压患者较非高血压、无677TT基因型患者的总心脑血管事件发生的风险性高6.4倍(2.3-17.6)；脑卒中事件发生的风险性高8.2倍(2.7-24.7)；心脑血管死亡率发生的风险性高5.3倍(1.7-16.5)。校正血浆同型半胱氨酸水平后，预测风险性略有降低，但是依然显著。由于血浆同型半胱氨酸水平和MTHFR 677TT基因型高度相关，本研究根据基线同型半胱氨酸水平进行了分层分析，1)在去除了各对照组中血浆同型半胱氨酸水平90％分位的研究对象后，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型患者的总心脑血管事件发生的风险性高14.5倍(2.8-75.3)，脑卒中事件发生的风险性高15.5倍(2.8-86.0)，死亡率风险性高26.8倍(3.0-236.3)。2)去除了血浆同型半胱氨酸水平＞20μmol/L的对象后，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型患者的总心脑血管事件发生的风险性高15.0倍(2.9-77.7)，脑卒中事件发生的风险性高16.0倍(2.9-88.6)，死亡率风险性高20.2倍(2.2-187.0)。
本发明还提供了利用功能基因预测个体心脑血管疾病发生及预后的方法及试剂盒，可作为心脑血管疾病发生及预后的可能性的指示***，即通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型用于预测心脑血管疾病的发生及预后。在多态性位点基因型分析的基础上结合血压水平、血液同型半胱氨酸水平等可以进一步更好地预测心脑血管疾病，能够因此更早地预见心脑血管疾病的发生及预后，更好地预防和干预心脑血管疾病的进程，降低医疗成本。
本发明内容中，我们特别设计了用于测定多态性位点基因型位点的引物序列，并且根据该引物序列和靶序列特点确定了扩增效率高、特异性好和省时的检测方法，方便本领域的普通技术人员掌握和使用，有很好的实用价值。
特别是针对MTHFR的C677T多态性位点基因型设计了如下检测所用的PCR扩增引物，与常规的扩增引物相比较，扩增效率高、特异性好和省时，有更好的使用价值。MTHFR的C677T多态性位点基因型的特异性PCR扩增引物如下，扩增得到的片段长度为274bp：
正向引物：5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’
反向引物：5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’
具体实施方式
实施例1：测定MTHFR基因的C677T(Ala222Val，dsSNP ID：rs1801133)多态性位点基因型并预测心脑血管疾病发生及预后
(一)测定MTHFR基因的C677T多态性位点基因型
(1)提取宿主细胞的基因组DNA
(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；
(b)于4℃、2000转/分离心10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40μl、RNA酶50μl，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；
(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟，将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；
(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml离心管中，75％乙醇1ml洗DNA絮状物后，室温干燥；
(e)加DNA水化液1.0ml，置摇床，摇动过夜，备用；
(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFRC677T多态性位点
根据MTHFR C677T基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列：
正向引物：5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’
反向引物：5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’
PCR反应体系：
基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，10×buffer1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，ddH2O补足总体积至10μl。
PCR反应条件：
95℃预变性10min后：94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期：最后68℃延伸7min；得到274 bp的扩增片段。
酶切条件及体系(15μl)：
MTHFR C677T位点PCR产物目的片段长度为245bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10μl，10×NEBuffer#2 1.5μl，HinfI内切酶4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃过夜。
HinfI内切酶识别位点为：
基因型结果判定：
将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下：
酶切片段为274bp，MTHFR基因型为677CC；
酶切片段为274+228+46bp，MTHFR基因型为677CT；
酶切片段为228+46bp，MTHFR基因型为677TT。
(二)心脑血管疾病发生及预后的预测
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
以上方法通过流行病学研究验证，我们采用前瞻性巢式病例一对照研究，通过随访入选的合格研究对象39,165例(平均随访6.2年)，收集到204例对象发生心脑血管疾病(包括死亡)，其中148例具有完整的MTHFR C677T位点基因型数据，根据1∶1匹配性别、年龄及生活地区相似的对照组。
前瞻性巢式病例对照研究中病例可分为总心脑血管疾病、脑卒中和死亡三组，对照组中进行了性别、年龄、生活地区匹配。总心脑血管疾病/对照组共148对、脑卒中/对照组共133对、死亡/对照组共102对具有完整的基因型、血浆同型半胱氨酸水平、血压等中间表型数据。分别测定血压、同型半胱氨酸水平、血糖、血脂及其他如性别、年龄、身高、体重等生理参数，同时获得个体MTHFR C677T多态性位点基因型资料，分析不同的基因型、血压、同型半胱氨酸水平与心脑血管疾病发生及预后之间的关系。三个病例/对照组人群的基线特征包括年龄、性别、身高、体重、体重指数(BMI)、吸烟、饮酒等在不同组别中分布基本相似，无显著差异。
如表1所示，MTHFR 677TT基因型在总心脑血管疾病、脑卒中、死亡组中分布具有逐渐增多趋势，特别在隐性模型指导下差异分布更加明显，经统计学分析结果差别有显著性。分析结果表明，MTHFR C677T多态性位点基因型对于总心脑血管疾病、脑卒中及其死亡有预测作用，即MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性较大，死亡的可能性较大，预后较差；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性较小，死亡的可能性较小，预后较好。
表1.MTHFR C677T多态性位点基因型与心脑血管疾病及预后的关系
| 变量名 | 总心脑血管事件病例对照组 | 脑卒中病例对照组 | 心脑血管事件死亡病例对照组 | |||
| 对照组 | 病例组 | 对照组 | 病例组 | 对照组 | 病例组 | |
| 例数MTHFRC677TCCCTTT隐性模型CC+CTTT | 148N(％)55(37.2)76(51.4)17(11.5)131(88.5)17(11.5) | 148N(％)50(33.8)72(48.6)26(17.6)122(82.4)26(17.6) | 133N(％)49(36.8)68(51.1)16(12.0)117(88.0)16(12.0) | 133N(％)45(33.8)65(48.9)23(17.3)110(82.7)23(17.3) | 102N(％)34(37.8)46(51.1)10(11.1)80(88.9)10(11.1) | 102N(％)29(32.2)43(47.8)18(20.0)72(80.0)18(20.0) |
注：CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；CT，代表MTHFR 677CT杂合型
我们分析同型半胱氨酸水平与心脑血管疾病的关系，如表2所示，在总心脑血管疾病组中，基线血浆同型半胱氨酸水平为18.1±13.0μmol/L，显著性高于对照组(14.9±6.8μmol/L)；常用对数转化后的同型半胱氨酸水平在两组中分布依然有非常显著差异(2.8±0.4 vs 2.6±0.3μmol/L)。同样显著性差异的血浆同型半胱氨酸水平在其它两组中也观察到(脑卒中/对照组：18.2±13.6 vs 15.2±7.0；病死/对照组：19.1±14.2 vs 15.4±7.9)。单因素分析结果提示，同型半胱氨酸是总心脑血管事件、脑卒中事件发生的风险性及其死亡率的重要危险因子。即单独的血液同型半胱氨酸水平能够预测心脑血管疾病发生及预后，心脑血管疾病发生的可能性随着血液同型半胱氨酸水平的升高而增加，而且其预后随着血同型半胱氨酸水平的增加更差，死亡的风险随着血同型半胱氨酸水平增加而增加。
同时，我们的研究结果表明，高血压患病比例在各自病例/对照中分布也有显著差别，结果如表2所示，高血压患者在总心脑血管疾病组和对照组中所占比例分别是79.1％和50.0％，经统计学分析差别有显著性；在脑卒中组和对照组中所占比例为82.0％和48.9％，经统计学分析差别有显著性；在心脑血管疾病死亡组和对照组中所占比例为74.4％和47.8％，经统计学分析差别有显著性，单因素分析结果提示高血压是总心脑血管疾病、脑卒中发生的风险及因心脑血管疾病、脑卒中死亡的重要危险因子，即单独的血压状况和血压水平能够预测心脑血管疾病的发生及预后。
表2.总心血管事件、脑卒中、死亡组及其对照组中人群基本特征
| 变量名 | 总心脑血管疾病 | 脑卒中 | 死 亡 | |||
| 对照组 | 病例组 | 对照组 | 病例组 | 对照组 | 病例组 | |
| 例数血浆tHcyμmol/L对数转化tHcy，mol/L性别男高血压是 | 148Mean±SD14.9±6.82.6±0.3N(％)107(72.3)74(50.0) | 148Mean±SD18.1±13.0**2.8±0.5**N(％)107(72.3)117(79.1)** | 133Mean±SD15.2±7.02.7±0.3N(％)96(72.2)65(48.9) | 133Mean±SD18.2±13.6*2.8±0.5*N(％)96(72.2)109(82.0)** | 102Mean±SD15.4±7.92.7±0.4N(％)67(74.4)43(47.8) | 102Mean±SD19.1±14.2*2.8±0.5**N(％)67(74.4)67(74.4)** |
表注：**P＜0.01，*P＜0.05
分析同型半胱氨酸水平对于心脑血管疾病及脑卒中发病影响及死亡的关系，分析结果表明同型半胱氨酸水平能够预测心脑血管疾病及脑卒中及死亡的发生。结果如表3所示，在全部心脑血管疾病病例组/对照组、全部脑卒中病例组/对照组、心脑血管疾病死亡病例组/对照组和脑卒中死亡病例组/对照组四个样本人群中，每个样本人群中的10≤Hcy＜20μmol/L组和Hcy≥20μmol/L组的发病比例均显著高于Hcy＜10μmol/L组(校正了年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂异常、空腹血糖异常和高血压等因素)，经统计学分析差别有显著性，而且，心脑血管疾病、脑卒中及死亡的发病风险随着Hcy水平的增高而增加。Trend Test分析结果进一步证实，Hcy水平越高心脑血管疾病、脑卒中及死亡的发生的可能性越大，即随着同型半胱氨酸水平的增加，心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性增加，因心脑血管疾病死亡或者脑卒中死亡的可能性增加。
表3.同型半胱氨酸水平对脑卒中发病的影响(采用Logistic回归分析)
| Hcy水平(μmol/L) | 总例数(N) | 病例组N(％) | 校正后* | ||
| OR | 95％CI | P | |||
| 全部心脑血管疾病病例组/对照组样本 | |||||
| Hcy＜1010≤Hcy＜20Hcy≥20Trend Test | 4228254--- | 13(31.0)141(50.0)35(64.8)--- | 1.02.23.71.9 | ---1.0-4.61.4-9.41.2-3.0 | ---0.0390.0060.007 |
| 全部脑卒中病例组/对照组样本 | |||||
| Hcy＜1010≤Hcy＜20Hcy≥20Trend Test | 3524849--- | 12(34.3)122(49.2)32(65.3)--- | 1.01.94.11.8 | ---0.9-4.11.5-10.71.1-2.9 | ---0.0940.0050.030 |
| 心脑血管疾病死亡病例组/对照组样本 | |||||
| Hcy＜1010≤Hcy＜20Hcy≥20Trend Test | 3318847--- | 7(21.2)97(51.6)30(63.8)--- | 1.03.95.72.2 | ---1.5-9.81.9-17.51.3-3.8 | ---0.0040.0020.004 |
| 脑卒中死亡病例组/对照组样本 | |||||
| Hcy＜1010≤Hcy＜20Hcy≥20Trend Test | 2615943--- | 6(23.1)80(50.3)28(65.1)--- | 1.03.35.12.1 | ---1.2-9.21.5-17.21.2-3.7 | ---0.0210.0100.014 |
*校正因素包括，年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖、血压。
进一步分析表明，高血压和高同型半胱氨酸水平对心脑血管事件及其死亡的预测有联合作用。分析结果见表4，对上述四个样本的分析，均显示高血压合并高Hcy组的心脑血管疾病患者比例显著高于正常血压正常Hcy组(校正了年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂和空腹血糖等因素)，OR值大于正常血压高Hcy组和高血压正常Hcy组两者OR值之和，提示高血压和高同型半胱氨酸水平对心脑血管事件的发生具有联合作用。
表4.高血压和高同型半胱氨酸水平对心脑血管事件的联合作用
| 血压 | Hcy水平 | 总例数(N) | 病例组N(％) | 校正后* | ||
| OR | 95％CI | P | ||||
| 全部心脑血管疾病病例组/对照组样本 | ||||||
| 正常正常高血压高血压 | 正常高正常高 | 2111021226 | 3(14.3)38(34.6)10(47.6)138(61.1) | 1.03.34.99.5 | ---0.9-11.91.1-22.02.7-33.7 | ---0.0710.040＜0.001 |
| 全部脑卒中病例组/对照组样本 | ||||||
| 正常正常高血压高血压 | 正常高正常高 | 179818199 | 2(11.8)31(31.6)10(55.6)123(61.8) | 1.03.68.212.1 | ---0.8-16.81.4-48.32.6-55.6 | ---0.1060.0200.001 |
| 心脑血管疾病死亡病例组/对照组样本 | ||||||
| 正常正常高血压高血压 | 正常高正常高 | 198014155 | 3(15.8)29(36.3)4(28.6)98(63.2) | 1.03.21.99.4 | ---0.9-12.10.3-10.62.6-34.4 | ---0.0850.456＜0.001 |
| 脑卒中死亡病例组/对照组样本 | ||||||
| 正常正常高血压高血压 | 正常高正常高 | 157111131 | 2(13.3)24(33.8)4(36.4)84(64.1) | 1.03.53.311.8 | ---0.7，17.00.5，23.12.5，55.4 | ---0.1190.2320.002 |
表注：*校正因素包括，年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂异常和空腹血糖异常；
血压：SBP≥140mmHg或DBP≥90mmHg定义为高血压，反之定义为正常血压；
Hcy水平Hcy＜0μmol/L定义为正常Hcy水平，Hcy≥10μmol/L定义为高Hcy水平。
为了进一步了解多个危险因子对心脑血管事件发生及其死亡率的风险性，表5采用不同多元Logistic回归模型评估了高血压与MTHFR C677T多态性位点基因型间的联合作用。模型I进一步校正年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖等多个危险因子条件，结果表明，携带MTHFR 677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型(即携带有MTHFR 677CC基因型或者携带有MTHFR 677CT基因型)患者的总心脑血管疾病发生的风险性高6.4倍(2.3-17.6)，统计学分析差别有显著性；模型II进一步校正血浆同型半胱氨酸水平后，携带MTHFR 677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型(即携带有MTHFR 677CC基因型或者携带有MTHFR 677CT基因型)患者的总心脑血管事件发生的风险性仍然高(OR＝4.6，1.5-13.8)，统计学分析差别有显著性。在脑卒中风险性评估中发现：采用模型I校正多个危险因子条件下，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型患者的脑卒中事件发生的风险性高8.2倍(2.7-24.7)；模型II进一步校正血浆同型半胱氨酸水平后，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型患者相比，依然具有更高的脑卒中风险性(OR＝7.0，2.1-23.5)，统计学分析差别有显著性。在心脑血管疾病死亡的风险评估中同样发现：采用模型I校正多个危险因子条件下，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型患者的死亡率发生的风险性高5.3倍(1.7-16.5)；模型II进一步校正血浆同型半胱氨酸水平后，携带MTHFR 677TT基因型的高血压患者依然具有较高死亡风险性(OR＝3.4，1.0-11.6)。结果表明，MTHFR C677T多态性位点基因型与高血压对于心脑血管疾病、脑卒中及脑卒中死亡的发生的影响有单独作用与协同作用，二者的共同作用大于单独的作用，即MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性较大，死亡的可能性较大，预后较差；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性较小，死亡的可能性较小，预后较好。
表5.Logistic回归模型评估MTHFR C677T多态性位点
与高血压对总心血管事件、脑卒中及其死亡风险的联合作用
| 血压1 | MTHFRC677T4 | 总例数N | 病例数N | 病例百分比％ | 校正2 | 校正3 | ||||
| OR | 95％CI | P | OR | 95％CI | P | |||||
| 总心脑血管事件病例对照样本 | ||||||||||
| 正常正常高血压高血压 | 677CC或677CT677TT677CC或677CT677TT | 921316130 | 2749522 | 29.330.859.073.3 | 1.00.93.36.4 | 0.3-3.51.8-6.22.3-17.6 | 0.938＜0.001＜0.001 | 1.00.73.14.6 | 0.2-2.91.7-5.91.5-13.8 | 0.622＜0.0010.007 |
| 脑卒中病例对照样本 | ||||||||||
| 正常正常高血压高血压 | 677CC或677CT677TT677CC或677CT677TT | 801214727 | 2138920 | 26.325.060.574.1 | 1.00.84.38.2 | 0.2-3.62.2-8.62.7-24.7 | 0.820＜0.001＜0.001 | 1.00.74.27.0 | 0.2-3.42.1-8.52.1-23.5 | 0.702＜0.0010.002 |
| 心脑血管事件死亡病例对照样本 | ||||||||||
| 正常正常高血压高血压 | 677CC或677CT677TT677CC或677CT677TT | 69810324 | 2236017 | 31.937.558.370.8 | 1.01.12.85.3 | 0.2-5.61.4-5.81.7-16.5 | 0.8890.0050.004 | 1.00.72.63.4 | 0.1-4.21.2-5.31.0-11.6 | 0.7420.0120.055 |
表注：1 血压：SBP≥140mmHg或DBP≥90mmHg定义为高血压，反之定义为正常血压：
2校正因素包括：年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖；
3校正因素包括：年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖和对数转化后tHcy；
4 CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；CT，代表MTHFR677CT杂合型
进一步分层分析，在去除了各对照组中血浆同型半胱氨酸水平90％分位的研究对象后，校正年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖多个危险因子条件下，采用Logistic回归模型评估MTHFR C677T多态性位点与高血压对总心血管疾病、脑卒中及其死亡风险的交互作用。结果如表6所示，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型(即携带有MTHFR 677CC基因型或者携带有MTHFR 677CT基因型)患者的总心脑血管疾病发生的风险性高14.5倍(2.8-75.3)，脑卒中发生的风险性高15.5倍(2.8-86.0)，死亡风险性高26.8倍(3.0-236.3)，经统计学分析有显著性。进一步校正血浆同型半胱氨酸水平后，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型(即携带有MTHFR 677CC基因型或者携带有MTHFR 677CT基因型)患者依然具有更高的总心脑血管事件发生的风险性(OR＝16.3，3.1-86.7)，更高的脑卒中事件发生的风险性(OR＝18.5，3.2-105.3)，和更高的死亡率发生的风险性(OR＝25.6，2.8-234.2)，经统计学分析差别有显著性。
结果如表6所示，去除了血浆同型半胱氨酸水平＞20μmol/L的对象后，校正多个危险因子条件下，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型(即携带有MTHFR 677CC基因型或者携带有MTHFR 677CT基因型)患者的总心脑血管疾病发生的风险性高15.0倍(2.9-77.7)，脑卒中发生的风险性高16.0倍(2.9-88.6)，死亡的风险性高20.2倍(2.2-187.0)，经统计学分析差别有显著性。进一步校正血浆同型半胱氨酸水平后，携带677TT基因型的高血压患者较非高血压、不带有677TT基因型(即携带有MTHFR 677CC基因型或者携带有MTHFR 677CT基因型)患者依然具有更高的总心脑血管事件发生的风险性(OR＝16.7，3.2-88.3)，更高的脑卒中事件发生的风险性(OR＝19.1，3.4-108.9)，和更高的死亡风险性(OR＝20.7，2.2-196.3)，经统计学分析差别有显著性。
本发明中的高同型半胱氨酸血症特别指血液同型半胱氨酸水平适度增高，在本实施例中为血液同型半胱氨酸水平≤20umol/L，或者血液同型半胱氨酸水平低于人群中血液同型半胱氨酸水平高值的90％。结果表明在适度同型半胱氨酸水平下，MTHFR C677T多态性位点与高血压对总心血管疾病、脑卒中及其死亡风险有独立作用和交互作用，即MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测个体心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性较大，死亡的可能性较大，预后较差； MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测个体心脑血管疾病、脑卒中发生的可能性较小，死亡的可能性较小，预后较好；MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，死亡的可能性较大，预后较差；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，死亡的可能性较小，预后较好。
表6.MTHFR C677T多态性位点与高血压
对总心血管疾病、脑卒中及其死亡风险的交互作用
| 血压1 | MTHFRC677T4 | 总例数N | 病例数N | 病例百分比％ | 校正2 | 校正3 | ||||
| OR | 95％CI | P | OR | 95％CI | P | |||||
| 适度同型半胱氨酸水平(低于各对照组tHcy 90％) | ||||||||||
| 总心脑血管事件病例对照样本 | ||||||||||
| 正常 | 677CC或677CT | 86 | 23 | 26.7 | 1.0 | 1.0 | ||||
| 正常 | 677TT | 9 | 2 | 22.2 | 0.8 | 0.1-4.3 | 0.795 | 0.9 | 0.2-5.2 | 0.935 |
| 高血压 | 677CC或677CT | 142 | 80 | 56.3 | 3.3 | 1.7-6.5 | ＜0.001 | 3.5 | 1.8-7.1 | ＜0.001 |
| 高血压 | 677TT | 13 | 11 | 84.6 | 14.5 | 2.8-75.3 | 0.001 | 16.3 | 3.1-86.7 | 0.001 |
| 脑卒中病例对照样本 | ||||||||||
| 正常 | 677CC或677CT | 75 | 18 | 24.0 | 1.0 | 1.0 | ||||
| 正常 | 677TT | 9 | 2 | 22.2 | 0.9 | 0.2-5.1 | 0.928 | 1.2 | 0.2-6.9 | 0.839 |
| 高血压 | 677CC或677CT | 130 | 76 | 58.5 | 4.6 | 2.1-9.7 | ＜0.001 | 5.2 | 2.4-11.4 | ＜0.001 |
| 高血压 | 677TT | 11 | 9 | 81.8 | 15.5 | 2.8-86.0 | 0.002 | 18.5 | 3.2-105.3 | 0.001 |
| 心脑血管事件死亡病例对照样本 | ||||||||||
| 正常 | 677CC或677CT | 65 | 19 | 29.2 | 1.0 | 1.0 | ||||
| 正常 | 677TT | 6 | 2 | 33.3 | 1.2 | 0.2-8.0 | 0.839 | 1.2 | 0.2-7.9 | 0.863 |
| 高血压 | 677CC或677CT | 89 | 49 | 55.1 | 2.8 | 1.3-6.1 | 0.010 | 2.7 | 1.2-6.1 | 0.014 |
| 高血压 | 677TT | 11 | 10 | 90.9 | 26.8 | 3.0-236.3 | 0.003 | 25.6 | 2.8-234.2 | 0.004 |
| 适度同型半胱氨酸水平(≤20umol/L) | ||||||||||
| 总心脑血管事件病例对照样本 | ||||||||||
| 正常 | 677CC或677CT | 87 | 23 | 26.4 | 1.0 | 1.0 | ||||
| 正常 | 677TT | 9 | 2 | 22.2 | 0.8 | 0.2-4.4 | 0.809 | 0.9 | 0.2-5.2 | 0.939 |
| 高血压 | 677CC或677CT | 143 | 81 | 56.6 | 3.5 | 1.8-6.8 | ＜0.001 | 3.7 | 1.9-7.4 | ＜0.001 |
| 高血压 | 677TT | 13 | 11 | 84.6 | 15.0 | 2.9-77.7 | 0.001 | 16.7 | 3.2-88.3 | ＜0.001 |
| 脑卒中病例对照样本 | ||||||||||
| 正常 | 677CC或677CT | 76 | 18 | 23.7 | 1.0 | 1.0 | ||||
| 正常 | 677TT | 9 | 2 | 22.2 | 0.9 | 0.2-5.2 | 0.943 | 1.2 | 0.2-7.1 | 0.817 |
| 高血压 | 677CC或677CT | 130 | 76 | 58.5 | 4.7 | 2.2-10.0 | ＜0.001 | 5.4 | 2.5-11.7 | ＜0.001 |
| 高血压 | 677TT | 11 | 9 | 81.8 | 16.0 | 2.9-88.6 | 0.002 | 19.1 | 3.4-108.9 | ＜0.001 |
| 心脑血管事件死亡病例对照样本 | ||||||||||
| 正常 | 677CC或677CT | 65 | 19 | 29.2 | 1.0 | 1.0 | ||||
| 正常 | 677TT | 6 | 2 | 33.3 | 1.3 | 0.2-8.4 | 0.797 | 1.3 | 0.2-8.8 | 0.785 |
| 高血压 | 677CC或677CT | 87 | 47 | 54.0 | 2.6 | 1.2-5.6 | 0.017 | 2.6 | 1.2-5.8 | 0.019 |
| 高血压 | 677TT | 9 | 8 | 88.9 | 20.2 | 2.2-187.0 | 0.008 | 20.7 | 2.2-196.3 | 0.008 |
表注：1 血压：SBP≥140mmHg或DBP≥90mmHg定义为高血压，反之定义为正常血压；
2校正因素包括：年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖；
3校正因素包括：年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、血脂、血糖和对数转化后tHcy；
4 CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；CT，代表MTHFR677CT杂合型。
我们的前瞻性研究结论性提示，MTHFR C677T位点与高血压之间的联合作用能显著预测总心血管疾病、脑卒中的风险性及其死亡，特别在适度同型半胱氨酸水平条件下，这种联合作用对心脑血管事件及其死亡率的预测异常显著。
实施例2：测定MTHFR C677T多态性位点基因型预测脑血管疾病发生及预后的试剂盒
(一)试剂盒的组成成分：核酸提取试剂，PCR反应试剂，MTHFR C677T多态性位点基因型特异性引物、核酸聚合酶、限制性内切酶、酶切反应混合液和阳性对照模板、阴性对照模板，分别分装后组装成的试剂盒。其中阳性对照模板包括MTHFR C677T纯合野生型、杂合型、纯合突变型阳性对照模板；特异性引物为能够特异性扩增至少含有MTHFR C677T多态性位点的引物。
(二)检测的步骤：
(1)提取宿主细胞的基因组DNA：
(a)取400μl红细胞裂解液加入1.5ml离心管中，加入100μl左右新鲜全血或者抗凝全血。37℃水浴5分钟，15000g离心1分钟；
(b)去上清，加入100μl白细胞裂解液，高速振荡30秒至液体均一，37℃水浴5分钟。加入35μl蛋白沉淀液，高速振荡20秒后15000g离心90秒，离心管底可见褐色沉淀；
(c)将上清液全部移入装有100μl异丙醇的1.5ml离心管中，来回轻柔的摇匀数次至有白色絮状物出现；
(d)弃上清液，注意保留白色沉淀，加入100μl 75％乙醇(以无水乙醇配制)，15000g离心90秒，弃上清，室温干燥沉淀；
(e)加核酸储存液100μl，所得溶液即为全血基因组DNA；
(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFR677CT多态性位点：
根据MTHFR 677CT基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列：
正向引物：5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’
反向引物：5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’
PCR反应体系：
基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，，10×buffer1.0μl，Gold Taq DNA polymerase 3U，ddH2O补足总体积至10μl。
PCR反应条件：
95℃预变性10min后：94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期；最后68℃延伸7min。得到274bp的片段。
酶切条件及体系(15μl)：
MTHFR C677T位点PCR产物目的片段长度为274bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10μl，10×NEBuffer#2 1.5μl，HinfI内切酶4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃过夜。
HinfI内切酶识别位点为：
(三)基因型测定的结果判定：
将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下：
酶切片段为274bp，MTHFR基因型为677CC纯合野生型；
酶切片段为274+228+46bp，MTHFR基因型为677CT杂合型：
酶切片段为228+46bp，MTHFR基因型为677TT纯合突变型。
(四)对于脑血管疾病发生及预后的预测：
根据上述步骤(三)的基因型结果，参照与实施例1的步骤(二)相同的预测方法，对于脑血管疾病及预后进行预测。
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型或高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
Claims (21)
1.MTHFR基因的多态性位点基因型用于预测个体心脑血管疾病发生及预后的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述MTHFR基因的多态性位点基因型至少包含C677T多态性位点。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述MTHFR基因的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述的心脑血管疾病包括急性心脑血管事件、急性脑血管疾病、脑梗塞、脑出血、一过性脑缺血发作、脑中风、脑卒中、急性心血管疾病、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克、心源性猝死，优选为脑卒中。
5.如权利要求1所述的用途，其中个体尤指高血压个体。
6.如权利要求1所述的用途，其中
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测个体发生心脑血管疾病的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测个体发生心脑血管疾病的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
7.如权利要求6所述的用途，其中
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
8.一种用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是：(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测MTHFR基因的多态性位点基因型，或者(2)用于检测MTHFR基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与MTHFR基因上的多态性位点的核酸杂交，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，优选地，寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
9.如权利要求8所述的多态性分型寡核苷酸，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
10.一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病发生及预后的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含C677T多态性位点，所述方法包括步骤：(1)利用权利要求8或9所述的多态性分型寡核苷酸检测来自生物样品中所述MTHFR基因的多态性位点基因型；(2)根据所述MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病的发生及预后。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含C677T多态性位点，还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述的心脑血管疾病包括急性心脑血管事件、急性脑血管疾病、脑梗塞、脑出血、一过性脑缺血发作、脑中风、脑卒中、急性心血管疾病、冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、心源性休克、心源性猝死，优选为脑卒中。
13.如权利要求10所述的方法，其中个体尤指高血压个体。
14.如权利要求10所述的方法，其中
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
15.如权利要求14所述的方法，其中
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
16.如权利要求11所述的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术：聚合酶链反应、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、和Taqman生物检测方法。
17.一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测个体心脑血管疾病发生及预后的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，其中所述的心脑血管疾病包括急性心脑血管事件、急性脑血管疾病、脑梗塞、脑出血、一过性脑缺血发作、脑中风、脑卒中、急性心血管疾病、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心源性休克、心源性猝死，优选为脑卒中，所述试剂盒包含至少一种如权利要求8或9中任一项所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
19.如权利要求17所述的试剂盒，其中
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型时，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
20.如权利要求17所述的试剂盒，其中
(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好；
(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较大，预后较差；
(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型或677CT杂合型，伴发高同型半胱氨酸血症，预测高血压个体心脑血管疾病发生的可能性较小，预后较好。
21.如权利要求10所述的方法或权利要求17所述的试剂盒，其中所述的生物样品选自血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述生物样品为血液样品。
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2006
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Open date: 20080102 |