CN101085797B - 一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法 - Google Patents
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Abstract
用超大孔连续床晶胶吸附层析技术(Supermacroporous CryogelChromatography，简称晶胶层析)迅速高效地分离ATP的方法。。所述方法是首先将微生物发酵液的pH值调为酸性，用阴离子交换型超大孔连续床晶胶介质床柱进行吸附，然后用冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的发酵液和杂质，用洗脱液分步洗脱，得到高纯度的ATP。本发明提供的方法将现有ATP分离工艺过程中的菌体过滤、沉淀、活性炭吸附、阴离子交换层析等多个步骤简化为通过晶胶吸附层析一步实现，工艺简单，料液在柱内停留时间短，分离迅速，处理流速高，分离过程成本低，得到的ATP纯度高，规模化生产分离十分方便。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法，尤其是一种利用超大孔连续床晶胶吸附层析技术从发酵液中分离三磷酸腺苷(ATP)的方法。
(二)背景技术
ATP是生物细胞内的高能物质，是机体能量利用和储存的中心，参与体内脂肪、蛋白质、糖类和核酸等的代谢，其二钠盐在临床上广泛用于心肌疾病、脑溢血、肌肉萎缩、肝炎等疾病的辅助治疗。
ATP可通过叶绿体光合磷酸化法转化、酵母或产氨短菌等微生物发酵、酶转化以及从动物组织提取等方式进行制备。微生物发酵法是目前工业上生产ATP的主要方法。其主要工艺过程包括培养发酵、菌体过滤、杂蛋白沉淀、活性炭吸附、阴离子交换层析、去热原、结晶精制、干燥等多个步骤，工艺过程复杂，成本高。特别是，ATP吸附层析分离过程常用阴离子交换树脂，而常规粒状阴离子交换树脂介质的孔隙尺寸在纳米或亚微米范围，ATP的吸附主要通过扩散传质，达到吸附平衡需要的时间长。因而，料液在工业吸附层析柱内停留的时间常常长达数天至十多天，增大了过程成本。另外，环境温度较高时(如高于25～30℃的夏季)，料液很容易变质，导致生产操作无法顺利进行，严重影响了生产效率和ATP产品的质量。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种用超大孔连续床晶胶吸附层析技术(Supermacroporous Cryogel Chromatography，简称晶胶层析)迅速高效地分离ATP的新方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下：(1)将含有三磷酸腺苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。
阴离子交换超大孔晶胶介质的制备可通过结晶致孔、聚合反应和孔内接枝方法实现。首先，将聚合物单体、交联剂、催化剂的水溶液装入层析柱(如常规层析玻璃柱)，在冷冻条件下进行结晶致孔，得到超大孔晶胶基质。然后，将带有阴离子交换功能基团的接枝单体溶液注入晶胶基质，在催化剂作用下进行孔内接枝聚合反应，得到阴离子交换超大孔连续床晶胶介质。晶胶基质的制备方法可参照文献中介绍的方法(Yao et al.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基质孔内接枝聚合反应也可参照文献(Savina et al.，J.Chromatogr.A 1092，199-205，2005)。具体过程见后面的实例。
所述阴离子交换晶胶介质优选为叔胺或季胺型阴离子交换晶胶介质。
所述胺基或其衍生基团优选为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2。
所述步骤(2)中冲洗液流速0.1～20cm/min。
所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下：先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷。
所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
所述碱金属盐优选为NaCl或KCl。
所述步骤(1)中含有三磷酸腺苷的混合液为啤酒酵母发酵液。
具体的，所述方法如下：
(1)将含有三磷酸腺苷的啤酒酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一：
①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；
(2)用冲洗液以2～10cm/min流速冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；所述冲洗液为下列之一：①去离子水、②pH2～4的盐酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的柠檬酸溶液；
(3)用洗脱液以2～10cm/min流速进行梯度洗脱：先用含NaCl或KCl 0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含NaCl或KCl 0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
与现有ATP分离技术相比，本发明提供的方法的特色是利用晶胶层析实现了ATP的直接分离。晶胶层析方法是2002年出现的新型生物分离技术，可在高流速下从含有微生物细胞的复杂料液***中直接分离目标物。晶胶介质为整体状介质，与常规粒状介质不同。晶胶介质内有很多尺寸在数十至数百微米的超大孔隙，可允许发酵液中的微生物细胞顺利通过，而料液中的目标物则吸附在孔隙内表面，进而实现层析分离。其吸附主要利用对流传递，传质阻力小，吸附和层析分离十分迅速。该方法将离心、过滤、浓缩和层析分离等几个步骤集成为一步实现，可减化传统分离步骤，缩短处理时间，降低过程成本。本方法将现有ATP分离过程中的菌体过滤、沉淀、活性碳吸附、阴离子交换层析等多个步骤简化为通过晶胶吸附层析一步实现，处理流速高，料液在柱内停留时间短。
本发明方法的有益效果主要体现在：工艺简单，分离迅速，处理量大，得到的ATP纯度高，分离过程成本低。另外，本发明提供的ATP分离方法中，操作压力低(优选操作条件下柱内压降梯度在0.001～0.02atm/cm左右)，规模化生产十分容易；而且，晶胶介质可方便地进行再生，重复使用，进一步降低了成本。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
用0.05M的盐酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液(以腺苷一磷酸、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸铵等为底物，用啤酒酵母发酵所得，菌体浓度约10g/L，湿重，下同)的pH调为1，作为待分离用的料液，其OD600值为0.32，ATP含量12mg/mL。料液溶质中，ATP占总溶质的46％(重量百分比)，腺苷二磷酸(ADP)占28％(重量百分比)，腺苷一磷酸(AMP)占16％(重量百分比)，其它可溶性杂质占10％(重量百分比)，下同。选择内径26mm、高150mm的阴离子交换晶胶层析柱(孔径5～80μm，孔隙率50％，功能基团-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)。晶胶介质的制备如下：将9g丙烯酰胺、2g甲双叉丙烯酰胺、0.5g过硫酸铵、0.3g四甲基乙二胺溶于75mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-20℃)进行结晶致孔和聚合反应(48h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将50mL 0.5M的接枝单体CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶胶基质，于63℃下反应24h，得到阴离子交换晶胶介质。
用盐酸溶液(pH 1)平衡晶胶床柱，将410mL料液以5cm/min流速上入晶胶床柱，用流动式紫外检测器监测层析过程(UV 254nm)。在5cm/min流速下用400mL去离子水冲洗床柱，冲出柱内的发酵液和未吸附的杂质。然后，用1000mL含有0.001M NaCl的盐酸溶液(pH 1)进行洗脱，以除去吸附在晶胶介质中的杂质，洗脱流速2cm/min；以150mL含有0.5M NaCl的盐酸溶液(pH 1)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速2cm/min。
用高效液相色谱(HPLC，5μm、4.6mm×250mm的WatersSymmetryShield RP C18分析柱，柱温25℃，流动相为50mM的磷酸钾缓冲液，pH 6.5，流速1mL/min，紫外检测波长259nm，进样量20μL，外标法定量)对收集的ATP进行分析，ATP收率91％，纯度95.5％。
实施例2：
用0.1M的柠檬酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液的pH调为3，作为待分离用的料液(OD600为0.21，ATP含量8mg/mL)。用柠檬酸溶液(pH3)，对内径55mm、高100mm的晶胶床柱(孔径20～150μm，孔隙率74％，功能基团-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)进行平衡。晶胶介质的制备如下：将10g丙烯酰胺、0.5g甲双叉丙烯酰胺、1.2g过硫酸铵、1g四甲基乙二胺溶于230mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-30℃)进行结晶致孔和聚合反应(60h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将200mL 0.2M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶胶基质，于53℃下反应12h，得到阴离子交换晶胶介质。
将280mL料液以2cm/min流速上入晶胶床柱。于2cm/min流速下用600mL柠檬酸溶液(pH 3)冲洗床柱后，依次用2L含0.02M KCl的柠檬酸溶液(pH 3)、300mL含3M KCl的乙酸溶液(pH 3)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速2cm/min。ATP收率92％，纯度94.1％。
实施例3：
用0.01M的盐酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液的pH调为5，作为待分离用的料液(OD600为0.26，ATP含量9.7mg/mL)。用盐酸溶液(pH5)，对内径100mm、高200mm的晶胶柱(孔径80～400μm，孔隙率98％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)进行平衡。晶胶介质的制备如下：将40g丙烯酰胺、10g甲双叉丙烯酰胺、6g过硫酸铵、10g四甲基乙二胺溶于1.5L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-55℃)进行结晶致孔和聚合反应(64h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将2L 0.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于52℃下反应7h，得到阴离子交换晶胶介质。
将2L料液以6cm/min流速上入晶胶床柱，在8cm/min流速下用4L去离子水冲洗后，依次用6L含0.01M NaCl的盐酸溶液(pH 5)、2.5L含0.5MNaCl的盐酸溶液(pH 5)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速6cm/min。ATP收率84％，纯度89.2％。
实施例4：
用0.01M的盐酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液的pH调为2，作为待分离用的料液(OD600为0.18，ATP含量7.2mg/mL)。用盐酸溶液(pH2)，对内径150mm、高500mm的晶胶柱(孔径20～150μm，孔隙率83％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)进行平衡。晶胶介质的制备如下：将380g丙烯酰胺、40g甲双叉丙烯酰胺、30g过硫酸铵、70g四甲基乙二胺溶于8L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-48℃)进行结晶致孔和聚合反应(72h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将9L 1M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于57℃下反应12h，得到阴离子交换晶胶介质。
将15L料液以10cm/min流速上入晶胶床柱，在10cm/min流速下用25L去离子水冲洗后，依次用40L含0.01M NaCl的盐酸溶液(pH 2)、15L含2M NaCl的盐酸溶液(pH 2)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速10cm/min。ATP收率90％，纯度98.2％。
实施例5：
用0.01M的盐酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液的pH调为3，作为待分离用的料液(OD600为0.12，ATP含量5.9mg/mL)。用盐酸溶液(pH3)对内径150mm、高300mm的晶胶床柱(孔径50～250μm，孔隙率87％，功能基团-N(C2H5)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)进行平衡。晶胶介质的制备如下：将200g丙烯酰胺、32g甲双叉丙烯酰胺、17g过硫酸铵、22g四甲基乙二胺溶于5L水，装入层析柱，在冷冻条件下(-53℃)进行结晶致孔和聚合反应(36h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将5L 1.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(C2H5)2，注入晶胶基质，于65℃下反应12h，得到阴离子交换晶胶介质。
将10L料液以7cm/min流速上入晶胶床柱，在3cm/min流速下用15L盐酸溶液(pH 3)冲洗床柱，依次用20L含0.04M NaCl的盐酸溶液(pH3)、8L含0.1M NaCl的盐酸溶液(pH 3)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速4cm/min。ATP收率93％，纯度97.5％。
实施例6：
用0.02M的硫酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液的pH调为4，作为待分离用的料液(OD600为0.45，ATP含量18mg/mL)。用稀硫酸溶液(pH4)，对晶胶床柱(内径16mm、高60mm，孔径30～300μm，孔隙率91％，功能基团-N(CH3)2，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)进行平衡。晶胶介质的制备如下：将0.55g丙烯酰胺、0.09g甲双叉丙烯酰胺、0.089g过硫酸铵、0.064g四甲基乙二胺溶于11mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-25℃)进行结晶致孔和聚合反应(24h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将15mL 0.2M的接枝单体CH2＝CHCO2(CH2)2N(CH3)2注入晶胶基质，于62℃下反应4h，得到阴离子交换晶胶介质。
将15mL料液以30cm/min流速上入晶胶床柱，在30cm/min流速下用90mL稀硫酸溶液(pH 4)冲洗后，依次用200mL含0.06M KCl的硫酸溶液(pH 4)、20mL含0.8M KCl的硫酸溶液(pH 4)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速20cm/min。ATP收率71％，纯度86.0％。
实施例7：
用0.01M的乙酸，将含有ATP的啤酒酵母发酵液的pH调为6，作为待分离用的料液(OD600为0.1，ATP含量4.6mg/mL)。用乙酸溶液(pH 6)，对内径10mm、高100mm的晶胶床柱(内径10mm、高100mm，孔径10～90μm，孔隙率83％，功能基团-N+(CH3)3，聚丙烯酰胺基晶胶骨架，自制)进行平衡。晶胶介质的制备如下：将0.8g丙烯酰胺、0.1g甲双叉丙烯酰胺、0.07g过硫酸铵、0.06g四甲基乙二胺溶于10mL水，装入层析柱，在冷冻条件下(-15℃)进行结晶致孔和聚合反应(72h)，得到超大孔晶胶基质。然后，将10mL 0.5M的接枝单体CH2＝C(CH3)CO2CH2CH2N(CH3)3Cl，注入晶胶基质，于58℃下反应15h，得到阴离子交换晶胶介质。
将20mL料液以0.1cm/min流速上入晶胶床柱，于0.1cm/min流速下用120mL去离子水冲洗床柱。然后，依次用280mL含0.03M KCl的乙酸溶液(pH 6)、20mL含0.1M KCl的乙酸溶液(pH 6)进行洗脱，收集ATP洗脱峰，洗脱流速0.1cm/min。ATP收率81％，纯度88.0％。
Claims (6)
1.一种三磷酸腺苷的晶胶吸附层析分离方法，所述方法如下：(1)将含有三磷酸腺苷的混合液调pH为酸性，以0.1～30cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为胺基或其衍生基团；所述胺基或其衍生基团为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；(2)以去离子水或pH值1～6的稀酸溶液为冲洗液冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；(3)用洗脱液进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷，所述的洗脱液为含有0.001～3M碱金属盐的稀酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱液流速0.1～20cm/min，步骤如下：先用含碱金属盐0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含碱金属盐0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述碱金属盐为NaCl或KCl。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中含有三磷酸腺苷的混合液为啤酒酵母发酵液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)将含有三磷酸腺苷的啤酒酵母发酵液调pH为2～3，以2～10cm/min流速上超大孔连续床晶胶介质床柱，进行吸附；所述晶胶介质为阴离子交换晶胶介质，所述阴离子交换晶胶介质的孔径为5～400μm、孔隙率为50～98％、功能基团为下列之一：①-N+(CH3)3、②-N(CH3)2、③-N(C2H5)2；
(2)用冲洗液以2～10cm/min流速冲洗床柱，除去晶胶介质内残留的混合液；所述冲洗液为下列之一：①去离子水、②pH2～4的盐酸溶液、③pH2～4的硫酸溶液、④pH2～4的乙酸溶液、⑤pH2～4的柠檬酸溶液；
(3)用洗脱液以2～10cm/min流速进行梯度洗脱：先用含NaCl或KCl0.001～0.06M、pH 1～6的稀酸溶液I进行洗脱，再用含NaCl或KCl 0.1～3M、pH 1～6的稀酸溶液II进行洗脱，收集含三磷酸腺苷的洗脱峰，得到所述的三磷酸腺苷；所述稀酸溶液I、稀酸溶液II各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③乙酸溶液、④柠檬酸溶液。
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