CN101077426A - 自体脂肪干细胞构建的组织工程化软骨 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种软骨移植物，所述的移植物包括：(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)脂肪干细胞；并且具有与需修复的软骨缺损部位相匹配的形状。本发明的自体脂肪干细胞构建的组织工程化软骨可有效地治疗软骨病损。本发明还提供了该组织工程化软骨的制备方法和用途。

Description

自体脂肪干细胞构建的组织工程化软骨

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及组织工程化软骨及其制备方法和用途。

背景技术

先天畸形、外伤、感染、肿瘤或骨软骨炎等疾病均可以导致软骨的缺损或损伤。由于软骨组织损伤后自我修复能力很低，因此，软骨缺损或损伤的治疗一直是修复重建外科面临的巨大挑战。目前临床上常用的治疗手段包括：自体软骨的游离或带蒂移植(主要取自体肋软骨)、异体软骨的游离移植、自体或异体软骨细胞注射移植、骨膜或软骨膜移植及应用人工假体等。但这些方法均存在明显的缺点，如：自体软骨移植供体来源少、创伤大、移植后易吸收缩小，还可能出现各供区并发症。异体和异种软骨移植物不但具有免疫原性，而且存在传播艾滋病、肝炎等病原体的危险。虽然人工合成的软骨组织代用品具有制作简单，使用方便等优点，但是替代材料只具备充填、支持及维持美观的作用，缺少软骨生物学功能，不是真正意义上的结构与功能重建，而且可能发生移植部位疼痛、人工代用品外露等问题，无法满足患者的治疗要求。

组织工程技术的兴起为软骨缺损的完美修复带来了新的希望。其基本原理是将有特定功能的细胞与一定形状的可降解生物材料结合，通过体外培养构建出有相应功能的活体组织用于组织缺损的修复，或直接将细胞-材料复合物植入体内组织缺损部位进行修复。

软骨是最早应用组织工程技术构建成功的组织，目前应用软骨细胞为种子细胞在体内外已经能够成功地构建出精确形状的成熟软骨组织。但获取软骨细胞同样会面临软骨移植时存在的供区创伤大、供体来源不足及同种异体免疫排斥反应等问题，而且软骨细胞体外大量扩增极易发生老化与去分化，常规培养传代3～4次后即丧失软骨形成能力。

干细胞(stem cells)包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的软骨分化潜能已被许多研究充分证实，但骨髓穿刺给病人带来很大的痛苦，胚胎干细胞应用又存在伦理问题。

成体干细胞的应用大大拓展了种子细胞的来源，但目前只有将自体成体干细胞用于小动物的软骨组织的缺损修复，对于将其用于大型哺乳动物，目前还未获成功。

因此，本领域迫切需要提供一种将自体成体干细胞作为种子细胞的软骨移植物，并且是可用于大型哺乳动物的软骨移植物。

发明内容

本发明旨在提供一种可用于大型哺乳动物的软骨移植物。

本发明的另一个目的是提供所述软骨移植物的制法和用途。

在本发明的第一方面，提供了一种软骨移植物，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；

(b)脂肪干细胞；

并且具有与需修复的软骨缺损部位相匹配的形状。

在另一优选例中，所述的软骨移植物的形状与大型哺乳动物软骨组织缺损部位相匹配。

在另一优选例中，所述的软骨移植物的形状与关节部位相匹配。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞为自体脂肪干细胞。

在另一优选例中，脂肪干细胞的含量为1×10⁷个细胞/ml移植物-1×10⁹个细胞/ml移植物。

在另一优选例中，还含有由脂肪干细胞诱导分化形成的软骨样细胞。

在另一优选例中，由脂肪干细胞诱导分化形成的软骨样细胞的含量为1×10⁷个细胞/ml移植物-9×10⁸个细胞/ml移植物。

在另一优选例中，所述的软骨移植物中还含有转移生长因子-β₃、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、软骨形态发生蛋白(CDMP)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、胰岛素、***(IGF)-1和2、碱性脂肪干细胞生长因子(bFGF)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)和肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)中的一种或多种。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：可降解性合成高分子材料、天然可降解材料、可注射性材料，及其混合物。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚α-羟基酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环酮，及其混合物。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB，及其混合物。

在本发明的第二方面，提供了一种软骨移植物的制备方法，它包括步骤：

(1)将脂肪干细胞接种于三维的药学上可接受的生物可降解材料上，形成脂防干细胞-支架复合物，所述的复合物具有与需修复的软骨缺损部位相匹配的形状；

(2)将脂肪干细胞-支架复合物在诱导液中培养2-4周，使得脂肪干细胞诱导分化形成软骨样细胞，从而形成含软骨细胞的移植物。

在另一优选例中，所述的诱导液含有：转移生长因子-β₁10±5ng/ml，***100±50ng/ml，***40±20ng/ml。

在另一优选例中，步骤(1)中脂肪干细胞的接种密度为1×10⁷个细胞/ml移植物-1×10⁹个细胞/ml移植物。

在另一优选例中，步骤(2)中将脂肪干细胞诱导分化形成的软骨样细胞含量为1×10⁷个细胞/ml移植物-9×10⁸个细胞/ml移植物。

在另一优选例中，步骤(2)的培养温度为37±2℃。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞为自体脂肪干细胞。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞为原代-第十五代脂肪干细胞。

在另一优选例中，所述的脂肪干细胞为第二代脂肪干细胞。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：可降解性合成高分子材料、天然可降解材料、可注射性材料，及其混合物。

在另一优选例中，步骤(1)中所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚α-羟基酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环酮，及其混合物。更佳地，是聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB，及其混合物。

在本发明的第三方面，提供了一种上述的软骨移植物的用途，所述的软骨移植物可用于制备修复软骨组织缺损的试剂盒或用于制备人工软骨关节。

由此，本发明提供了一种将自体成体干细胞作为种子细胞的软骨移植物，并且可用于大型哺乳动物的软骨缺损修复。

附图说明

图1显示了新生软骨的大体观察情况，其中

A为实验组，即术后3个月新生软骨(ADSCs复合PLGA)的大体观；

B为实验组，即术后3个月新生软骨(ADSCs复合PLGA)的剖面观；

C为对照组，是单纯的支架(PLGA)。

图2显示了新生软骨的组织学、免疫组化及特殊染色检测情况，其中，

A为实验组，即术后3个月新生软骨(ADSCs复合PLGA)的HE染色；

B为实验组，即术后3个月新生软骨(ADSCs复合PLGA)的II型胶原染色；

C为实验组，即术后3个月新生软骨(ADSCs复合PLGA)的藏红花染色。

图3显示了生物支架复合聚乳酸/聚羟基乙酸。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现将自体脂肪干细胞作为种子细胞接种于支架材料上，经过特定的软骨诱导液培养数周后，可构建成用于修复大型哺乳动物的软骨移植物。这样，就可以使用来源丰富的脂肪干细胞作为种子细胞制备用于修复缺损的软骨组织的软骨移植物。

本文所用的术语“ADSCs(Adipose-derived stem cells，脂肪干细胞)”是指从脂肪组织中得到的具有增殖分化能力的干细胞。

本文所用术语“BMSCs(Bone Marrow Stem Cells，骨髓基质干细胞)”是从骨髓中得到的具有增殖分化能力的干细胞。

本文所用术语“成软骨诱导”是指体外培养的ADSCs在成软骨诱导条件下，表达成软骨细胞表型。

本发明所用术语“成软骨细胞”和“软骨细胞”可互换使用。

本发明所称的软骨移植物的形状与需修复的软骨缺损部位相匹配，是指移植物的形状与需修复的软骨缺损部位的形状一致或基本一致，尤其是指移植物的形状与需修复的哺乳动物软骨缺损部位的形状一致或基本一致，所述移植物的体积是哺乳动物软骨体积的1-120％。

种子细胞

可用于本发明软骨移植物的种子细胞选自：脂肪干细胞、软骨细胞或骨髓基质细胞，其中优选脂肪干细胞。

本发明用于软骨移植物的是脂肪干细胞，或脂肪干细胞与其他细胞(如软骨细胞和/或骨髓基质细胞等)的混合物。在脂肪干细胞与其他的混合物中，脂肪干细胞与软骨细胞和/或骨髓基质细胞的数量之比为100-10000∶1，较佳地为50-10000∶1，更佳地为10-10000∶1。

本发明的脂肪干细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的脂肪干细胞，通常，本发明的脂肪干细胞是自体的(如真皮、皮下组织以及其他组织中的脂肪干细胞)、或同种异体的脂肪干细胞(如人胎儿来源的脂肪干细胞)。脂肪干细胞还可以是衍生自骨髓基质干细胞、或其他干细胞的脂肪干细胞。优选自体脂肪干细胞。

可用于本发明的脂肪干细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是哺乳动物。

尽管自体的脂肪干细胞是优选的，但异体的脂肪干细胞的来源也可使用。

分离和获得脂肪干细胞的方法是本领域中已知的。常用的分离方案包括：

(a)胶原酶消化、分离法。无菌条件下获取脂肪组织，充分剪碎后移入离心管，加入等体积的0.075％的I型胶原酶消化，37℃、40min，加入含血清培养液终上消化，离心1390r/min，10min，弃去上清，用150目细胞滤器过滤，再离心1390r/min，5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液混匀细胞，以5×10⁴/cm²接种于100mm²培养皿中培养。24小时后，可见梭型细胞贴壁，待细胞生长达培养皿底部近80％-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，传代，继续培养。

(b)组织块培养法。在全麻无菌条件下取皮下脂肪组织或关节脂肪垫组织，切成1×1×1mm³大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗2遍。将组织块在培养皿表面均匀摆置，将培养皿放置于培养箱中放置2-4小时，轻轻加入培养液，让液体缓慢覆盖组织小块，等待细胞游出。

脂肪干细胞的培养方法和培养液是本领域中熟知的。一种优选的方法是将脂肪干细胞在饱和湿度、5％CO₂、37℃培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)低糖DMEM培养基(购自Gibco公司)+10％胎牛血清；2)低糖DMEM培养基+20％小牛血清；3)低糖DMEM培养基+10-20％自体(异体)动物血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进脂肪干细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。

适用于本发明的脂肪干细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的脂肪干细胞是体外培养的原代至第十五代细胞，且免疫组织化学染色证明I型胶原表达，原位杂交检测证明I型胶原mRNA表达脂肪干细胞。

此外，本发明的软骨移植物还可添加或含有一些其他细胞，如软骨细胞、和/或骨髓基质细胞。

分离和获得软骨细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是在全麻无菌条件，手术显微镜下，解剖分离软骨层组织，放入4℃的PBS中清洗。(1)将软骨层组织剪成1mm³大小组织块，置离心管中，加入0.2％II型胶原酶(体积/容积比为1∶5)，37℃恒温振荡器内消化4h以上，直至软骨组织块基本消失、溶液变浑浊为止；或采用分阶段消化法，即每消化1h就过滤，离心1次，将分离后的软骨细胞立即放入培养液中保存起来，这样反复进行，直至所有软骨组织块消化完全。然后收集细胞悬液，以1500r/min速度离心10min，弃去上清液；PBS反复冲洗3次，离心，弃去上清液；加入含10％FBS的F-12培养液10ml，软骨细胞接种于培养皿后，放入5％CO₂、37℃、饱和湿度培养箱中进行细胞培养，隔日换液，开始原代细胞培养。

软骨细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在饱和湿度、5％CO₂培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)F12培养基+10％胎牛血清；2)F12培养基+20％小牛血清；3)F12培养基+10-20％自体(异体)动物血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进软骨细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。所述的软骨细胞也可以是脂肪干细胞诱导产生的。

可用于本发明的骨髓基质细胞(BMSCs)的来源没有特别限制，一种优选的来源是来自自体的骨髓。分离获得骨髓基质干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，***5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，GlandIsland，NY，USA)条件培养液)，制成细胞悬液，以约1×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液，加入条件培养液继续培养隔日换液。待细胞生长近融合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种进行细胞传代。

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。

一种优选的材料为聚乳酸PLA和聚羟基乙酸PLGA的复合材料(PLA/PGA，PLGA)。

组织工程化软骨

体外培养扩增的脂肪干细胞接种到生物相容性良好并可被机体吸收的可降解生物材料上形成种子细胞—生物材料复合物，将这一“种子细胞—生物材料”复合物植入到缺损部位，随着生物材料的逐渐降解吸收，种子细胞继续增殖并分泌基质，最终替代生物材料而形成相应的软骨组织。

本发明的组织工程化软骨的制备方法简便，将一定数量的种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合。

本发明的组织工程化软骨移植物的形状没有特别限制。通常，移植物的形状与哺乳动物软骨缺损的形状相同或基本相同。以类似于关节软骨形状的移植物为例，其体积为0.02-6cm³。

当本发明的生物可降解材料为可注射性材料时，以该液体材料调整软骨细胞浓度；当本发明的生物可降解材料为固体性材料时，以培养液调整种子细胞悬液浓度，然后与可降解材料混合，混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的细胞悬液最大量为宜，接种密度是按ml细胞悬液。本发明组织工程化软骨中的种子细胞浓度通常约为1×10⁷至5×10⁹/ml或更高，较佳地为1×10⁷至1×10⁸/ml，更佳地为1×10⁷至1×10⁸/ml。

本发明的组织工程化软骨的制备方法简便，将一定数量的种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合即可。一种优选的方法是将脂肪干细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料上，37℃培养4h后加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，共同培养3天；第四天更换成软骨诱导液，体外培养2周-4周。

软骨的培养方法和培养液是本领域中熟知的。合适的培养液包括(但并不限于)：转移生长因子-β₁10±5ng/ml，***100±50ng/ml，***40±20ng/ml。

此外，在本发明的组织工程化软骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而促进脂肪干细胞分化为软骨细胞，以及保持软骨细胞的表型和/或促进软骨细胞生长。代表性的物质包括(但并不限于)：转移生长因子-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-7、CDMP、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、胰岛素、***(IGF)-1和2、碱性脂肪干细胞生长因子(bFGF)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)和肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)。

用本发明方法形成的组织工程化软骨，分为两类，一类是软骨细胞与可注射性生物材料构成的复合物，该复合物可直接注射到皮下、软骨缺损处等体内各部位。另一类是软骨细胞与非可注射性复合物，该复合物可直接植入体内皮下、软骨缺损处等体内各部位。

用途

本发明提供的软骨移植物，可用于制备修复软骨组织的缺损的试剂盒。试剂盒包括(但不限于)：脂肪干细胞，药学上接受的生物可降解材料，软骨诱导液，说明书等。所述的诱导液含有(但并不限于)：转移生长因子-β₁10±5ng/ml，***100±50ng/ml，***40±20ng/ml。

本发明提供的软骨移植物，还可用于制备人工软骨关节。可以使用本领域熟知的方法将人工软骨关节植入体内。一种优选的方法是使用关节镜。

本发明的主要优点在于：

1、利用来源充足的脂肪干细胞作为种子细胞；

2、首次制备了可用于大型哺乳动物的软骨移植物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

实施例1

脂肪干细胞的分离培养

无菌条件下获取猪颈背部脂肪组织，充分剪碎后移入离心管，加入等体积的0.075％的I型胶原酶消化，37℃、40min，加入含血清培养液终止消化，离心1390r/min，10min，弃去上清，用150目细胞滤器过滤，再离心1390r/min，5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液混匀细胞，以5×10⁴/cm²接种于100mm²培养皿中培养。24小时后，可见梭型细胞贴壁，待细胞生长达培养皿底部近80％-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，传代，继续培养，收集第二代细胞用于接种材料。

实施例2

生物支架复合聚乳酸/聚羟基乙酸(polylacticacid/polyglicolicacid，PLA/PGA，PLGA)的制备

方法：取无纺PGA纤维约40mg均匀地嵌入预制的圆柱状(直径9mm，高5mm)硅胶模具内，加入1％的PLA二氯乙烷溶液约0.3ml，待其自然干燥后取出真空保存备用。见图3。

实施例3

脂肪干细胞-PLGA复合物制备

收集第二代脂肪干细胞，调节细胞浓度为50×10⁶/ml，接种于圆柱形PLGA(直径9mm，高5mm)上，37℃培养4h后加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，共同培养3天；第四天更换成软骨诱导液，体外培养2周。

软骨诱导液的组成：高糖DMEM培养基，L-谷氨酰胺0.3g/L、抗坏血酸0.05g/L、碳酸氢钠3.7g/L、青霉素10万单位/L、硫酸链霉素0.1g/L加入1％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)为基础培养液。另加TGF-β₁10ng/ml，IGF-1 100ng/ml，***(Dexamethasone)40ng/ml制备条件培养液。

实施例4

软骨移植物回植

实验猪麻醉前禁食12小时，禁水4小时。***10mg/kg肌注，进行诱导麻醉，速眠新0.1ml/kg肌注麻醉，整个过程中动物保持侧卧位。常规消毒铺巾，膝关节侧面纵向切口，制造人工的髌骨脱位，暴露膝关节面，使用8mm直径角膜环钻制造一个8mm的圆柱形全层软骨缺损，彻底止血。一侧植入实施例3制备的自体脂肪干细胞-PLGA材料复合物为实验组，另一侧植入单纯PLGA材料为对照组。

结果

术后新生软骨评价：术后3个月取材，观察膝关节愈合情况。实验组标本中部及边缘分别取材，脱钙后石蜡包埋，组织学切片行HE染色、免疫组织化学染色、特殊染色观察。

1.大体观察：见图1。

结果表明：

实验组，术后3个月时有明显的新生软骨组织形成，色泽与周围软骨组织相近，质实、表面光滑程度欠佳、有一定的弹性，缺损区基本被修复。新生软骨区软骨厚度略大于周围关节软骨厚度，新生组织深层大部分已骨化，与周围松质骨间界限无法区分。

对照组未被修复，而且，缺损出现扩大现象。

2.组织学检测：见图2。

结果表明：

HE染色显示在3个月时修复组织与正常软骨组织形态相近，有成熟的软骨陷窝形成，但细胞密度较正常软骨组织高，核大位于陷窝中央。正常组织与新生组织交界处连接良好，但组织学上极易区分。图2A。

实验组术后3个月，II型胶原免疫组化染色显示修复区细胞外基质有II型胶原表达，但染色比正常软骨组织稍淡，图2B。

实验组术后3个月，藏红花染色显示修复区软骨组织有集合蛋白聚糖的表达，同样，部分区域染色稍淡。图2C。

讨论

关节软骨缺损的修复目前有软骨下骨钻孔术、自体软骨移植、骨软骨膜移植等，但是，这些方法都因各自的缺点而未能广泛使用。

聚羟基乙酸(Polyglycolic acid，PGA)是一种人工合成的高分子材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以被制作成优良的三维细胞支架。本发明人先后成功的应用软骨细胞、骨髓基质干细胞复合PLGA材料形成细胞材料复合物，成功地修复了猪关节软骨缺损。这表明了PLGA作为软骨缺损修复的支架材料是可行的，但并没有成功转化的实例。

本发明应用自体脂肪干细胞复合PLGA材料修复猪关节软骨缺损。组织学、免疫组织化学及特殊染色均表明了自体脂肪干细胞修复了猪关节软骨的缺损，而对照组则未被修复，缺损还出现进一步扩大的现象。本发明显示，自体脂肪干细胞在关节软骨缺损的修复中发挥作用。术后3个月组织学上未发现材料残留，表明材料的降解速度与组织形成相匹配，是组织工程软骨构建的良好材料。

当然，可以理解的是：上述内容仅是举例说明本发明的应用原则。本领域的普通技术人员可做出很多改变和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，后面的权利要求即包括了这些改变和修饰。因此，尽管本发明参照本发明之优选实施例方案进行描述，但本领域的普通技术人员可以显而易见地做出很多改变，包括但不限于面积大小、材料、形状、操作方法、使用等，但都不偏离本发明的原则和范围。

Claims (10)

1.一种软骨移植物，其特征在于，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；

(b)脂肪干细胞；

并且具有与需修复的软骨缺损部位相匹配的形状。

2.如权利要求1所述的软骨移植物，其特征在于，所述的脂肪干细胞为自体脂肪干细胞。

3.如权利要求1所述的软骨移植物，其特征在于，脂肪干细胞的含量为1×10⁷个细胞/ml移植物-1×10⁹个细胞/ml移植物。

4.如权利要求1所述的软骨移植物，其特征在于，还含有由脂肪干细胞诱导分化形成的软骨样细胞。

5.如权利要求1所述的软骨移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：可降解性合成高分子材料、天然可降解材料、可注射性材料，及其混合物。

6.一种软骨移植物的制备方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)将脂肪干细胞接种于三维的药学上可接受的生物可降解材料上，形成脂肪干细胞-支架复合物，所述的复合物具有与需修复的软骨缺损部位相匹配的形状；

(2)将脂肪干细胞-支架复合物在诱导液中培养2-4周，使得脂肪干细胞诱导分化形成软骨样细胞，从而形成含软骨细胞的移植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的诱导液含有：转移生长因子-β₁10±5ng/ml，***100±50ng/ml，***40±20ng/ml。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中脂肪干细胞的接种密度为1×10⁷个细胞/ml移植物-1×10⁹个细胞/ml移植物。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的脂肪干细胞为自体脂肪干细胞。

10.一种如权利要求1所述的软骨移植物的用途，其特征在于，所述的软骨移植物可用于制备修复软骨组织缺损的试剂盒或用于制备人工软骨关节。

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