CN101072580B

CN101072580B - 抗体制备方法

Info

Publication number: CN101072580B
Application number: CN2005800387634A
Authority: CN
Inventors: 泰匡官; 威廉·约翰·彭黑尔; 皮特·迈克尔·吉尔林
Original assignee: Agri Biotech Pty Ltd
Current assignee: Agri Biotech Pty Ltd
Priority date: 2004-10-06
Filing date: 2005-10-06
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2025-10-06
Also published as: EP1799252A1; WO2006037182A1; CN101072580A; EP1799252A4; NZ554142A; US20080069853A1; CA2583061A1; JP2008515813A; CA2583061C; US7862799B2

Abstract

一种诱导奶抗体持续释放的方法，包括步骤：a)至少在一个乳上淋巴腺附近，或紧靠该乳上淋巴腺的位置，或在该乳上淋巴腺里面植入至少一个抗原释放物，该抗原释放物在使用时将抗原释放到乳上淋巴腺周围的组织区域中，所述乳上淋巴腺刺激抗体分泌到乳腺中。

Description

抗体制备方法

技术领域

本发明涉及一种诱导持续产生抗体或免疫球蛋白的方法，尤其涉及一种诱导持续产生哺乳动物奶抗体的方法。

背景技术

与传统的从血液中获得抗体相比，生产奶抗体的优势在于通过每天使用奶能获得抗体奶的持续供给。血产品收获以后，要留出一段时间让供血动物恢复身体(例如，一个月)。因此，由于能获得的血液量有限，抗体的产量是有限的(每个月约3～30mg)。相反，奶场的动物每天产奶会显著提高抗体的产量(如2mg/天乘30天，每个月将产出150mg)。

以前，习惯于通过直接给哺乳动物***进行注射或灌输来刺激奶抗体的产生[J.L Smith，J.S Hogan&K.L Smith(1999)″Efficacy of intramammaryimmunization with an Escherichia coliJS bacteria.″Journal of DairyScience，82：2582-2588；J.S Hogan，K.L.Smith，P.Schoenberger，S.Romig&L Thompson(1997)″Response of antibody titres to intramammaryimmunization with Escherichia coli JS bacteria.″Journal of Dairy Science，80：2398-2402；F.J Bourne，T.J Newby&J.W Chidlow(1975)″The influenceof route of vaccination on the systemic and local immune response in thepig.″Research in Veteri nary Science，18：244-248.]。这种注射非常耗时，因为必须重复注射以反复刺激抗体产生。而且，频繁地直接对哺乳动物***进行注射会导致感染，例如乳腺炎。

***内免疫技术由于很可能患***感染，通常还没有被作为在野外条件下进行接种疫苗的首选方法(R.F.Sheldrake(1987)Australian Journal of DairyTechnology，42：30-32)，该技术经常要求技术非常熟练的专业人员来实施。

需要指出，许多关于乳腺分泌物中的免疫球蛋白产品的公开文献都关注动物及其后代的疾病预防。几乎没有公开文献在关注富含免疫球蛋白的奶产品，以获得自身的免疫球蛋白。

发明概要

在本发明的一个方面，提供了一种诱导奶抗体持续释放的方法，包括步骤：至少在一个乳上淋巴腺旁或里面植入至少一个抗原释放物，该抗原释放物在使用时将抗原释放到乳上淋巴腺周围的组织区域，所述乳上淋巴腺刺激抗体分泌到乳腺中。

在本发明的另一方面，提供了由本发明任何一种方法产生的抗体。

在本发明的第三方面，涉及一种生产含抗体奶的方法，该方法包括：按上述方法诱导抗体产生，再收集含有抗体的哺乳动物奶。用通常的挤奶程序就可以实现奶的收集。

本发明的目的、特征及有益效果将从下面的优选实施例进行具体描述。

附图说明

图1是本发明染成蓝色的乳上淋巴腺示意图，图中显示动物接受腹股沟部位接种后出现了蓝色的迁移(该图感谢墨道什大学(Murdoch University)解剖系Martin CAKE博士的帮助)；

图2是本发明对山羊鼻内免疫的示意图；

图3是本发明在绵羊腹股沟部位植入抗原释放物的示意图；

图4是图3中绵羊植入抗原释放物的位置示意图；

图5是本发明用于植入抗原释放物的装置的示意图；

图6是本发明抗原释放物中的脂肪酶蛋白扩散到奶琼脂平板中的示意图，当脂肪酶从管的小孔中扩散出来，该酶就水解奶琼脂中的脂质，如图中杆状周围的黑色区域所示，脂肪酶蛋白被用作是本发明发展的典型抗原；

图7是本发明中用不同实验方案进行免疫的山羊产生的奶中含抗脂肪酶抗体水平的曲线图，在28天中，对每个方案的2只动物的平均吸光值在图上标示，最高抗体水平是采用抗原释放物并配上肌肉注射的方法获得；

图8是本发明中对两只都植入抗原释放物并接受肌肉注射的动物，分别测试其各产生的抗脂肪酶抗体的吸光值的曲线图，对于两只都植入抗原释放物并接受肌肉注射的动物，其各产生的抗脂肪酶抗体水平如图中所示，这两条曲线的结果表明免疫实验步骤具有可重复性；

图9是本发明用不同实验方案免疫的山羊的血清中含抗脂肪酶抗体水平的曲线图，在28天中，对每个方案的2只动物的平均吸光值如图上标示；

图10是本发明用植入抗原释放物并接受肌肉注射的方法免疫的山羊产生的奶(◆)和血清(■)中分别含抗脂肪酶抗体的平均值比较图；

图11是本发明仅植入抗原释放物的山羊所产生的奶(◆)和血清(■)中分别含抗脂肪酶抗体的曲线图，奶中含抗脂肪酶抗体、血清中缺乏抗脂肪酶抗体的结果表明植入腹股沟部位的抗原释放物中的抗原扩散至乳上淋巴腺；

图12是本发明为说明抗脂肪酶抗体抑制脂肪酶水解活性而在奶琼脂玻片上进行扩散检验的示意图，第一奶玻片：孔中加入PBS或盐溶液，第二奶玻片：5mg/ml荧光假单胞菌脂肪酶，第三奶玻片：5mg/ml脂肪酶和不含抗体的血清(1：1稀释)，第四奶玻片：5mg/ml脂肪酶和含有抗脂肪酶抗体的血清(1：1稀释)；

图13是本发明的接种荧光假单胞菌脂肪酶的山羊的奶中IgG、IgA和IgM含量的柱状图，两组动物在0、10和19天，在不同的部位进行接种(第一组(G1)接种在腹部，第二组(G2)接种在靠近乳上淋巴腺的位置)，IgG、IgA和IgM的相对水平通过ELISA实验确定，在第二组动物奶中的三类免疫球蛋白水平都比第二组动物高。

发明内容

概要

本技术领域的技术人员要知道本发明可被变化和修改，而不只是明确描述的内容，本发明应被理解为包括所有这样的变化和修改。本发明也包括所有单独、或全部在说明书中提到的步骤、特征、成分及混合物，还包括这些步骤或特征的任何两个或更多或所有的组合。

在此引用的每篇文献、参考书、专利申请或专利的所有出版物都是为读者理解提供的参考。在此引用的文献、参考书、专利申请或专利在本文中不重复只是为了简明。

本发明范围并不限于描述的特定实施例，该实施例只是为了给出范例。功能相当的产品、组分和方法无疑都将落在本发明的范围之内。

整个说明书中，除非内容需要，术语“包括”将被理解为包含一规定的整数或包含一组整数，但并不排除任何其他整数或整数群。

在说明书中，缩写词CRD和ARD可交替使用。该两个词都指本发明描述、公开和权利主张的“抗原释放物”。

在本发明的详细描述中可发现所用的选择术语的其他定义，且这些定义贯穿始终。除非有别的解释，本发明所使用的其他科学和技术术语与本发明所属技术领域内常规技术具有相同的意思。

发明的详细内容

本发明基于一次意外发现：在一个乳上淋巴腺旁，或紧密靠近该乳上淋巴腺的位置，或在该乳上淋巴腺里面植入一个植入性抗原释放物，该抗原释放物在很长一段时间内释放抗原，以刺激乳上淋巴腺，从而使奶中的抗体持续释放。刺激乳上淋巴腺的优点在于该乳上淋巴腺的节点在乳腺附近。由乳上淋巴腺产生的抗体分泌到乳腺中，并因此进入哺乳动物的奶中。本发明方法通过抗原释放物缓慢释放抗原能长期维持抗体生产的刺激。本方法刺激不同亚类和同种型的免疫球蛋白，如IgA、IgG和IgM。

因此，在本发明的一个方面，提供了一种诱导奶抗体持续释放的方法，包括步骤：至少在一个乳上淋巴腺旁，或紧密靠近该乳上淋巴腺，或在该乳上淋巴腺里面植入至少一个抗原释放物，该抗原释放物在使用时将抗原释放到乳上淋巴腺周围的组织区域，所述乳上淋巴腺刺激抗体分泌到乳腺中。

在本发明中，植入物与乳上淋巴腺的距离应当足够接近，从而使抗原释放物释放的抗原能引起哺乳动物(被植入抗原释放物)的抗体反应，且该抗体反应能维持一个促进奶中抗体生产的水平，所述奶中抗体能达到适于治疗或抗菌的标准。例如，ARD可以植入在***内。做为选择，抗原释放物适宜于植入在离至少一个乳上淋巴腺不超过100毫米的位置，在该位置，使用中的抗原释放物将抗原释放到乳上淋巴腺周围的组织区域，所述乳上淋巴腺刺激抗体分泌到乳腺中。较佳地，抗原释放物植入在接近或距离乳上淋巴腺约1～100mm的位置。最佳地，所述距离约为50～100mm。

本发明被认为可用于刺激动物体内许多腺体产生抗体。在这方面，已有文献表明，对一种腺体的免疫会引起其他乳腺分泌物中的抗体活性(例如，参阅F.JBourne et al(1975)Research in Veterinary Science18：244-248)。

本发明方法在哺乳动物上进行实验。较佳地，用于本发明方法的哺乳动物为啮齿动物或反刍动物。最佳地，所述哺乳动物为山羊、绵羊或牛。所述哺乳动物尤其最好是奶牛品种，不过奶山羊或奶绵羊品种也可以使用。

在本发明中，术语“奶”指由哺乳动物产生的乳和初乳，也指全脂奶的任何液体或固体派生产品，如脱脂乳或乳清。

在本发明中，术语“抗原”指任何能够引起哺乳动物抗原反应的物质。可以根据抗体的最终效用选择抗原。也就是说，如果抗体被用于产生被动免疫，该被动免疫所寻求对抗的抗原应当被使用，该抗原可以来自细菌、病毒、酵母、支原体、蛋白、半抗原、肽、动物组织提取液、植物组织提取液、真菌、花粉、灰尘、完整哺乳动物细胞的化学抗原(包括***)以及细胞碎片。在半抗原或肽被用作抗原的地方，应当运用所属技术领域技术人员熟知的化学原理使该些抗原首先必须与运输物质如蛋白结合(Hanly et al；Review of Polyclonal AntibodyProduction Procedures，ILAR Journal(1995)，37：3，93-118)。在本发明的一个实施例中，任何细菌抗原可被用于本发明。较佳地，所述细菌抗原优选来自于(但不限于)以下细菌种属：埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄状球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及幽门螺杆菌属(Helicobacter)。尤其优选的细菌种属为：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)以及荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。最佳地，所述抗原为来源于荧光假单胞菌的脂蛋白脂酶。

在至少一个乳上淋巴腺旁或里面植入抗原释放物，会使该抗原释放物内含有的抗原被释放到乳上淋巴腺节点内及周围的组织(图1)。这样依次刺激节点针对抗原产生抗体。所述抗体被分泌到乳腺中，从而进入哺乳动物的奶中。

抗原释放物的大小、特性及选择依赖于目的抗原的大小和特征。适宜的抗原释放物能以一定的速度将其含有的抗原释放出来，所述速度使体内被植入该抗原释放物的哺乳动物作出的抗体反应维持在一个合适水平。

美国专利US3,279,996中描述了缓慢释放成分的物质，同时在澳大利亚专利AU740133中描述了持续释放抗原的免疫增效物质。

在德国专利DE69917625D中描述了一种充满有益物质的多孔渗水硅植入物。美国专利US6,716,208描述了一种用于分子传输的可植入物。其他合适的持续释放物的制备实例还包括：由含蛋白的固体疏水聚合物制成的半透性基质，所述基质形成一定形状的物体，如薄膜或压缩成传输载体的微囊体。缓释基质包括聚酯、水凝胶，如：聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯[Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)and Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982)]或聚乙烯醇[poly(vinylalcohol)]，聚交酯(美国专利US3,773,919、欧洲专利EP58,481)，L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯(gamma ethyl-L-glutamate)的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers22：547-556[1983])，不可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物(Langer et al.，supra)，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，以及聚D-3-羟基丁酸(欧洲专利EP133,988)。其他文献有B.Baras，M.A.Benoit&J.Gillard(2000)″Parameters influencing the antigen release from spraydried poly(DL-lactide)microparticles.″International Journal ofPharmaceutics，200：133-145。

如乙烯-醋酸乙烯共聚物、乳酸-乙醇酸共聚物这类聚合物能释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白持续更短时间。当装入胶囊的抗原长久存在于体内时，这些抗原可能会因为暴露于37℃且潮湿的环境而产生变性或聚集，从而导致生物活性丧失，甚至可能造成免疫原的改变。基于有关机制为抗体稳定性设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制是由于巯基-二硫化物的相互交换而形成了分子间SS或二硫键，稳定性将可以通过修饰硫氢基、冻干酸溶液、控制水含量、使用适当的添加剂、开发特效的聚合物基质成分的方法获得。

缓释碎片成分也包括包封于脂质体内的残存碎片。现有许多制备含有抗体脂质体的方法[德国专利DE3,218,121；Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688-3692(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030-4034(1980)；欧洲专利EP52,322、EP36,676、EP88,046、EP143,949、EP142,641；日本专利83-118008；美国专利US4,485,045和US4,544,545；以及欧洲专利EP102,324]。通常，脂质体为小单层脂质体，脂质含量超过约为30％的胆固醇，该脂质和胆固醇的比例可根据最佳的抗体治疗作适当调整。本发明还包括其它能将抗原缓释到乳上淋巴腺周围组织的方案。

抗原用于治疗的有效量由目的、药物传输通路、抗原类型和/或佐剂、以及动物的自身条件来决定。因此，为了获得理想效果，临床医学家有必要算出有效剂量的值，并改善药物使用模式。典型的例如，医务工作者要施用抗原直到剂量达到理想效果。该治疗的过程通过常规化验就能被方便地监测。

在本发明的另一方面，提供了一种诱导奶抗体持续释放的方法，还包括如下步骤：在***内、腹膜内、肌肉内或鼻内的给药途径中使用引物成分。引物添加可在植入抗原释放物前或后进行，也可在植入抗原释放物时添加引物。较佳地，引物成分被传送到粘膜表面，因为这样粘膜表面(乳腺是其中之一)的抗体产生才被优先刺激。

引物成分可一次性施用，也可在几天或几周内间隔分数次施用。引物成分施用的间隔时间通常基于当时的免疫手册(例如，每隔2周)。为避免局部疼痛和充血，通常在同一位置施加引物成分的频率不要超出每两周一次。最初施用引物的步骤将刺激低水平的抗体生产，随着抗原释放物释放抗原，原先低水平的抗体生产会得到提高并维持在高水平。

本发明方法还可包括另外的步骤，即在哺乳动物体内植入抗原释放物后，通过***内、腹膜内、肌肉内和/或鼻内的给药途径给该动物施用含抗原的增强成分。较佳地，所述增强成分被传送到粘膜表面，因为这样粘膜表面(乳腺是其中之一)的抗体产生才被优先刺激。所述增强成分可一次施用，也可在几天或几周内间隔分多次施用。为了操作者的方便，通常间隔施用增强成分。为避免局部疼痛和充血，通常在同一位置施加增强成分的频率不要超出每周一次。

在一个优选方法中，每一步所使用的抗原是相同的。因此，所述相同抗原可被应用于抗原释放物、引物成分和/或增强成分。

在抗原释放物内、引物和增强成分内都要使用合适的佐剂。佐剂既能作为缓慢释放免疫原的组织载体，又能作为一种可非专一性地增强免疫反应的淋巴***催化剂[Hood et al.，in Immunology，p.384，Second Ed.，Benjamin/Cummings，Menlo Park，California(1984)]。适用于本发明抗原的佐剂包括(但不限于)：弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund’sincomplete adjuvant，FIC)、TiterMax Gold^TM，adjuvant65，霍乱毒素B亚单位免疫佐剂(cholera toxin B subunit)，针对白细胞介素-1B的163-171片断合成的佐剂(IL1-B Fragment163-171synthetic human adjuvant)、alhydrogel水凝胶；或百日咳博德特氏菌(bordetella pertussis)、胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)、细胞因子(cytokines)、皂角苷(saponin)、Adju-Phos、AlgalGlucau、Algammuliu、Alhydrogel、Antigen Formulation、Avridine、Bay R1005、calcitrial、磷酸钙(calcium phosphate)、凝胶体(Gel)、CRL1005、cholera Holotoxin霍乱全毒素(CT)、DDA、DHEA、DMPC，DMPG、DOC/明钒聚合体(Alum Complex)、γ菊粉(Gamma Inulin)、Gerbu Ad juvant、GMDP、Imiquimod、Imuither、γ-干扰素(Interferon-gamma)、ISCOM(s)、lscoprop7.0.3、Loxoribine、LT-OA或LT口服佐剂(Oral adjuvant)、MF59、MONTANIDE ISA51和ISA720、MPL、MTP-PE、MTP PE Liposomas、murameti de、murapalmitive、NAGO、非离子表面活性剂囊泡(Nonionic surfactant vesides)、Pleuram、PLGA、PGA和PLA、聚醚L121(Pluronic L121)、PMMA、PODDS、PolyRa、Polyru Polyphophazene、聚三梨醇酯80(Polysorbate80)、螺旋形蛋白(Protein Cochleates)、QS-21、Quil A、Rehydrogel HPA、Rehydrogel LV、S-28465、SAF-1、Sclavo、肽、Seudai Protediposomes、sendai-contaiminglipid matrices、Span85、specal、鲨烯(squalene)，十八烷酪氨酸(stearylTyrosine)、Theramide、Threonyl-MDP、Ty Particles、皂角苷Q521(saponinQ521)、MF59和明矾(Alum)。

在本发明的另一方面，该方法还包括一个预选步骤。所述预选步骤中，对动物的产抗体能力进行测试与挑选。因为在动物之间，产抗体能力差异很大。预选步骤通过挑选出表现最佳抗体测定反应的动物，有助于减少动物差异因素。该预选步骤同样可用于建立特别适于抗体生产的动物组。

关于施用引物成分或增强成分的步骤，最好按照已知手册将抗原物质悬浮于液体介质后进行灌输或注射。任何本领域已知的合适载体、稀释液、缓冲液和佐剂都可使用。合适的悬浮液体包括盐溶液、水、生理缓冲液。

如果引物成分或增强成分通过注射施用，在注射前适宜用实验室的匀浆器将抗原乳化进合适的载体中。在本方法的一个实施例中，水溶性抗原与3倍体积的佐剂混合，并乳化形成稳定的油包水乳状液。可用本领域公知的检测方法证明稳定乳状液的出现。

依照本发明的第二方面，本发明也提供了由本发明任何一种方法产生的抗体及该些抗体的片断。所述抗体可以是不同亚类或同种型的免疫球蛋白中的任何一种，如IgA、IgG和IgM，或任何其他亚类。

按照本发明的这一方面，可准备的典型抗体分子和片断包括：完整的免疫球蛋白分子，大部分完整的免疫球蛋白分子，以及含有补位(抗体分子上与抗原表位互补的结合部位)的免疫球蛋白分子片断。这些含有补位的抗体片断包括本领域公知的片断，如Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)。该些抗体片断可以按已知的方法，分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本完整的抗体进行蛋白水解反应而制得。如参阅美国专利U.S.4,342,566。众所周知的Fab’抗体片断是通过巯基乙醇对F(ab’)2片断进行还原反应，减少F(ab’)2片断两重链之间的二硫键，再将所得的硫醇蛋白用碘乙酰胺试剂烷基化而制得。较佳地，抗体为完整的抗体分子，在这作以解释说明。

依照第三方面，本发明涉及一种哺乳动物含抗体奶的生产方法，该方法包括依据上述方法诱导抗体产生，并收集哺乳动物的抗体奶。可用常规的挤奶方式实现奶的收集。

直接从哺乳动物身上获得的奶是可用的，但如果必要可进行处理。处理步骤包括：热处理、紫外线辐射、浓缩、补充食品添加剂、烘干成浓缩品、奶粉或乳清粉等。

在本发明方法的进一步步骤中，抗体可以从奶中分离。所述分离可通过本领域公知的分离技术实现。例如，从以下物质中分离出富含免疫球蛋白的成分：乳清(Nielson，K.(1986)Can.J.Vet.Res50：227-231；欧洲专利EP0320152；世界知识产权组织专利WO97/27757；英国专利GB2179947)、奶(Kanamara etal(1993)Milchwissenschaft48：247-251；美国专利U.S.4,229,342)、初乳(Kanamaru et al(1982)Agric.Biol.Chem46：1531-1537；法国专利FR2520235；新西兰专利239466；美国专利U.S.4,582,580)、奶和初乳的混合物(美国专利U.S.4,644,056)。

分离的抗体如果需要可进行纯化。所述纯化可按照已知技术如沉淀、离子交换层析进行操作。合适的技术已在上述期刊和专利文献中公开。依据附加处理步骤产生的分离和纯化抗体也是本发明的组成部分。在瑞士专利号为1,573,995的专利文献中，公开了大规模生产含抗体的蛋白浓缩品的方法。以下简要叙述该方法，包括步骤：收集超免疫的产奶雌性动物的奶、将乳脂和杂质分开、凝结纯化和脱脂乳、分离酪蛋白、对乳清蛋白进行过滤、超过滤、灭菌处理、在维持抗体不变性和无菌的条件下蒸发和干燥产物。

实施例

在下面非限制性的实施例中，将更加详细地描述本发明的特征。但是，该详细描述只是为了举例说明本发明，不应将其理解为是对上述发明内容的限制。

实施例1

不含佐剂的抗原释放物的制备

材料

(i)0.15g D-甘露醇(Sigma-Aldrich)

(ii)0.15g柠檬酸钠(Proanalys)

(iii)11.25mg来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)

(iv)0.75ml部分A硅橡胶(Dow Coming Q7-4850)

(v)0.75ml部分B硅橡胶(Dow Coming Q7-4850)

(vi)2x2.5ml一次性注射器(Terumo)

(vii)2x1ml注射器(Terumo)

(viii)2x12G x4英寸不锈钢皮下注射器针头

(ix)37℃保温箱

(x)无菌皮氏培养皿

(xi)无菌解剖刀

(xii)无菌spachella

(xiii)32ml McCartney玻璃瓶

方法

(i)拔出所有注射器的活塞

(ii)用抹刀把部分A硅橡胶放入1ml注射器中，活塞重新放入注射器并将0.75ml分配到一个2.5ml注射器中。对于部分B硅橡胶采取同样的操作。

(iii)将脂肪酶、甘露醇和柠檬酸钠混合并混入一个小型McCartney玻璃瓶，再将该混合物放入含有部分A硅橡胶的2.5ml注射器中。然后，把部分B硅橡胶从注射器中用力排出，并注入所述含部分A硅橡胶的2.5ml注射器中，以形成在部分A和部分B硅橡胶之间夹有脂肪酶、甘露醇和柠檬酸钠混合物的“三明治”结构。把活塞放回该注射器，同时从空的注射器中移出活塞。第一个注射器中的内容物被挤入第二个注射器内，然后放回第二个注射器的活塞。该操作重复20次，使反应物有效混合。反应物最后挤入两个12G的针头，并37℃保存三天。从针头内取出硬化的硅橡胶，并将其截成3cm长度放入打开的皮氏培养皿中，再在紫外线下放置24小时后，放入10ml无菌离心管于-20℃保存。每个3cm ARD在250μl总硅橡胶中含1mg脂肪酶、13mg甘露醇、13mg柠檬酸钠。

实施例2

包含佐剂的抗原释放物的制备

材料

(i)0.3g D-甘露醇(Sigma-Aldrich)

(ii)0.3g柠檬酸钠(Proanalys)

(iii)22.50mg来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)

(iv)1.2mg人工合成的白细胞介素1-B(IL1-B)163-171片断

(v)1.5ml部分A硅橡胶(Dow Coming Q7-4850)

(vi)1.5ml部分B硅橡胶(Dow Coming Q7-4850)

(vii)2x2.5ml一次性注射器(Terumo)

(viii)2x1ml注射器(Terumo)

(ix)2x12G x4英寸不锈钢皮下注射器针头

(x)37℃保温箱

(xi)无菌皮氏培养皿

(xii)无菌解剖刀

(xiii)无菌spachella

(xiv)32ml McCartney玻璃瓶

方法

(i)拔出所有注射器的活塞

(ii)用抹刀把部分A硅橡胶放入1ml注射器中，活塞重新放入注射器并挤压将0.75ml分配到一个2.5ml注射器中。对于部分B硅橡胶采取同样的操作。将脂肪酶、甘露醇和柠檬酸钠在一个小型McCartney玻璃瓶中混合，再将该混合物放入含有部分A硅橡胶的2.5ml注射器中。然后，把部分B硅橡胶从注射器中用力排出，并注入所述含部分A硅橡胶的2.5ml注射器中，以形成在部分A和部分B硅橡胶之间夹有脂肪酶、甘露醇和柠檬酸钠混合物的“三明治”结构。把活塞放回该注射器，同时从空的注射器中移出活塞。第一个注射器中的内容物被挤入第二个注射器内，然后放回第二个注射器的活塞，并把第二个注射器中的内容物再挤入第一个注射器内。该操作重复20次，使反应物有效混合。反应物最后挤入两个12G的针头，并在37℃保存三天。从针头内取出硬化的硅橡胶，并将其截成3cm长度放入打开的皮氏培养皿中，再在紫外线下放置24小时后，放入10ml无菌离心管于-20℃保存。每个3cm ARD在250μl总硅橡胶中含1mg脂肪酶、13mg甘露醇、13mg柠檬酸钠和50μg IL1-B。

实施例3

ARD的传送

构建一个需要使用的装置，包括：10ml一次性luer螺旋锁口注射器、10G x4英寸不锈钢皮下注射器针头、以及90mm x10G不锈钢焊条(见图5)。所述装置还装配有设在注射器活塞上、并能穿过针头的活塞杆。活塞抽回约3cm，能在针尖附近留出一块空间，该空间内可***抗原释放物。因此，当活塞挤压时，活塞杆能把抗原释放物排出针头(见图5)。

将动物仰躺在地板上，并让动物操作员限制住该动物。用碘酒擦洗邻近动物***右侧约3cm x10cm的面积，在该部位用26G皮下注射器针头使2ml2％利诺卡因渗入皮肤组织，以进行局部麻醉。提供ARD的10G注射器针头在所述面积靠后的部位***，并向前面的皮下推进。活塞压下的同时，拔开针头。***针头的点用碘酒擦拭。多数情况下，能在原位置触摸到抗原释放物。

实施例4

脂肪酶鼻接种体的制备

材料

(i)15.5mg来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)

(ii)38.75ml0.85％盐(Excel实验室)

(iii)1mg霍乱毒素B亚单位(US Biological)

(iv)2.5ml注射器

(v)50ml无菌管(Falcon)

(vi)来自翼状输液器的8-10cm长、约20G的塑料管(Terumo)

方法

(i)在第一次施用的当天把所有成分放入50ml管中混合。

(ii)剩余物在4℃保存直至使用。

实施例5

鼻接种体的传输

用取自输液器的20G的塑料管将2.5ml的接种体(含1mg脂肪酶、64.5μg霍乱毒素B亚单位)吸引入注射器。把60-80％的管长放入动物的右鼻孔，缓慢施加，同时把管子从鼻孔中撤出(见图2)。

实施例6

脂肪酶肌肉注射接种体的制备

材料

(i)36.5mg来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma)

(ii)9.1ml0.85％盐(Excel实验室)

(iii)TiterMax Gold^TM佐剂

(iv)McCartney玻璃瓶

(v)3ml塑料注射器(Teruma)

(vi)不锈钢双轴

(vii)23Gx1英寸皮下注射器针头

方法

(i)脂肪酶和盐在McCartney玻璃瓶中混合，并在第一次施用的当天采用4mg/ml的浓度。剩余物在4℃保存直至使用。

实施例7

肌肉接种体的传输

按照厂商说明书，将含有4mg/ml脂肪酶的0.5ml盐溶液吸入注射器，并用0.5mlTiterMax Gold^TM佐剂进行乳化。用带有23G x1英寸针头的注射器将接种体注射在左后腿附近的肌肉中。动物在第7天、第14天、第21天都要接受肌肉注射接种体。

实施例8

免疫实验方案1

在动物的后肢上部(臀部)进行肌肉注射。

五只动物用四种不同的抗原免疫。两只动物接受同一种类型的抗原，剩下三只动物各自接受一种不同的抗原。表1是对初次接种时间、后续的两次接种时间、抗原浓度(Ag)、TiterMax佐剂的体积(T/max)概述的列表。

表1 对山羊接种多种抗原所作的免疫原成分和接种时间列表。

初次接种

第二次接种

第三次接种

实施例9

免疫实验方案2

对动物接种抗原释放物(ARD)和/或注射剂。

表2描述了关于6只动物和一种抗原的接种体的列表

一只动物在腹股沟部位接受皮下注射抗原，之后的第30天该动物接受肌肉注射抗原。一只动物只接受一次皮下注射抗原。一只动物在腹股沟部位接受一个具有抗原的植入体。一只动物在腹股沟部位接受一个具有抗原的植入体，之后的第30天该动物在臀部接受一次肌肉注射抗原。一只动物在腹股沟部位接受一个具有抗原的植入体，之后的第15天该动物接受一次肌肉注射抗原。一只动物在腹股沟部位接受一个具有抗原的植入体，之后的第15天该动物接受一次鼻接种体。

表2 抗原释放物的预实验方案

通过抗原的CRD和S/C注射实验来评价***的抗体分泌

实施例10

免疫实验方案3

在该实验方案中，共用12只山羊，每组用2只动物。

对每2只动物分别使用6种不同的实验方案进行评价，以确定一个持续产生抗体奶的最佳方法，参阅表4和表5。

表4用于刺激奶中抗体产生的免疫实验方案

组描述佐剂	接种方案Day1 Day7 Day14 Day21	采样频率奶收集采血
			仅肌肉注射1 Intramuscular(IM) YESInjection2 ARD only YES仅鼻内喷射3 YESIntranasal(IN)sprayIncramuscular{IM}YES注射-ARD4 Intranasl(IN)喷射+5 YESARD6 ARD only NO	IM注射 IM增强 IM注射植入 ARDIN接种 IN增强 IN增强植入ARDIM注射 IM增强 IM注射植入ARD	每日 3-4天间隔每日 3-4天间隔每日 3-4天间隔每日 3-4天间隔每日 3-4天间隔每日 3-4天间隔

表5 用于刺激奶中抗体产生的免疫实验方案

总共研究12只山羊，对6组中的每组山羊施用一种不同的接种状况。抗脂肪酶抗体的存在用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行评价。图6显示了平均吸光值小于日常羊奶样品的空白对照值的情况。该结果在动物之间具有可重复性(见图7)。

所有6种接种状况都能成功的产生抗体。但是，每组抗体的相对浓度不同。由第4组动物记录得到的平均吸光值最高，这说明产生的抗体浓度最高。第4组动物在接受抗原释放物植入体后的第7、14、21天在山羊的后腹部位置连续进行注射。

第4组的平均吸光值大于第1组山羊产生的值，第1组山羊仅在第7、14、21天接受肌肉注射。

第1组和第4组动物都直到约14天的时候才显示出一些反应。在第15天，抗脂肪酶抗体的水平明显提升，可能是第二次免疫反应的结果。在研究期间，抗体始终保持较高水平直到第28天。

如图8、9、10所示，对接种动物血清中的抗脂肪酶抗体水平也进行了测试。图8是对两只都植入抗原释放物并接受肌肉注射的动物，分别测试其各产生的抗脂肪酶抗体的吸光值的结果曲线图。图9显示了用不同实验方案免疫的山羊的血清中含抗脂肪酶抗体水平。图10显示了用植入抗原释放物并接受肌肉注射的方法免疫的山羊产生的奶和血清中分别含抗脂肪酶抗体的平均值比较。图11显示了仅植入抗原释放物的山羊所产生的奶和血清中分别含抗脂肪酶抗体的情况，奶中含抗脂肪酶抗体、血清中缺乏抗脂肪酶抗体的结果表明植入腹股沟部位的抗原释放物中的抗原扩散至乳上淋巴腺。

实施例11

免疫实验方案4

在该实验中，每组用两只正处泌乳期的山羊(Capra hircvs)，总共用4只。所用抗原为来自荧光假单胞菌的脂肪酶。

免疫实验的准备

1.将30mg脂肪酶在15ml0.85％盐溶液中乳化。

2.Titermax Gold乳化依照厂商提供的操作说明书。含脂肪酶的盐溶液与等体积的Titremax Gold混合(1：1)。

3.用2.5ml注射器吸1ml混合液，以备施用(每1ml中含1mg脂肪酶)。

4.两组动物在0、10和19天接种。

5.第一组在左侧腹部接种，第二组在接近乳上淋巴腺的位置接种。

6.收集奶和血清。

为酶联免疫吸附实验(ELISA)涂平板

1.预先制备含2.5μg/ml抗原的涂板缓冲液。

2.在96孔ELISA板的每个孔中加入100μl混合液。

3.该ELISA板盖上盖子后，在4℃下静置过夜。

酶联免疫吸附步骤

1.使用前，将铺好的板用PBS Tween洗3遍。

2.一种血清稀释液，即含1％人血清的PBS Tween。

3.在每个孔中加100μl血清稀释液。

4.向每个孔中加入1μl目的样品。

5.将平板在37℃孵育2小时。

6.用PBS Tween洗平板3次。

7.将小鼠抗羊IgG、小鼠抗羊IgA和小鼠抗羊IgM用1％血清稀释液按1/1000配比进行稀释，以制备抗体稀释液。

8.把100μl抗体稀释液分别加入各孔中。

9.将平板在37℃放置2小时。

10.用PBS Tween洗平板3次。

11.将兔抗鼠IgG(H+L)用1％血清稀释液按1/2500配比进行稀释，以制备抗体稀释液。

12.每孔加100μl。

13.37℃孵育2小时。

14.用PBS Tween洗平板3次。

15.将含250mg/ml硝苯基磷酸的二乙醇胺缓冲液(DiethanolamineBuffer)稀释100倍。

16.每孔加100μl。

17.室温孵育约20至30分钟。

18.用50μl3.75M NaOH终止反应。

19.ELISA板在405nm读值。

结果

收集的奶通过ELISA实验分析IgG、IgA和IgM水平。第一组(腹部肌肉注射-指定为G1)和第二组(刺激乳上淋巴腺-G2动物)的结果如图13所示，该图表明：与第一组动物相比，第二组动物的奶中含有更高水平的三类免疫球蛋白。

实施例12

奶样品的收集和储存

材料

(i)Beckman Acuspin冷冻离心机

(ii)来自毛霉菌(Mucor meihei)的II型凝乳酵素(Sigma)用Hp水配成2mg/ml的浓度

(iii)5ml无菌离心管

(iv)P1000吸液

(v)1ml一次性移液管

(vi)5ml塑料储存管

(vii)37℃保温箱

方法

通过手挤奶将奶收集到没有任何化学和机械刺激的32ml McCartney玻璃瓶中。通常在早晨没有与自己的小山羊分开的时候收集奶。收集的奶样品储存于冰上，并尽快转移到操作地方。奶被转移到10ml无菌离心管，在4℃2000rpm离心15分钟。用一次性移液管吸出固体脂肪层下的奶，并放入10ml新管。用移液管吸奶的时候，将移液管小心伸入脂肪层下面的奶层。2mg/ml的凝乳酵素溶液以0.4ml凝乳酵素对5ml奶的比例加入奶中，摇动管子后37℃保温1～2小时。管子在4℃5000rpm离心15分钟，用移液管吸出上清液，并将该上清液-20℃保存。

用酶联免疫吸附实验(ELISA)对奶中的抗体进行定量。就指示抗脂肪酶抗体相对浓度的吸光值而言，血清吸光值比奶的吸光值低。因此，奶中的抗脂肪酶抗体水平比血清中的抗体水平高。

实施例13

收集和储存血样品

材料

(i)9ml真空采血***Vacutainers^TM(Bectco Djckinson)能收集7ml血清

(ii)20Gx1.5英寸真空采血***Vacutai ners^TM(Bectco Dickinson)的针头和针托

方法

用Vacutainer^TM真空采血***的收集管、针托和针头从颈静脉采集血样品。采样管在4℃保存。血样品在4℃4000rpm离心15分钟。上层血清用移液管吸出后放-20℃保存。

实施例14

酶联免疫吸附实验(ELISA)

材料

(i)10x磷酸缓冲液(PBS)：1L双蒸水，1.91g KH2PO4(BDH Chemicals AustPty Ltd)，6.1g Na2HPO4(ASAX Chemicals)，2g KCl(BDH Chemicals Aust PtyLtd)，

(ii)80g NaCl，1.95g NaN3(Sigma Aldrich)，调pH至7.4

(iii)200ml碳酸盐涂层缓冲液(pH9.6)，含有：200ml双蒸水，3.18g Na2CO3(BDH)，5.88g NaHCO3(BDH)，0.39g NaN3(Sigma)，

(iv)0.85％盐溶液(Excel Laboratories)

(v)含0.25mg/ml荧光假单胞菌脂肪酶(Sigma Aldrich)的碳酸盐涂层缓冲液

(vi)PBS-TW20洗板液(BDH)：200ml10x PBS(如上述)，1800ml蒸馏水，1ml土温-20(Labchem)

(vii)血清稀释液：200ml甘油(BDH)，29g NaCl(BDH)，0.2g KH2PO4(BDH)，0.61g Na2HPO4(BDH)，0.2g KCl(BDH)，1.95g NaN3(Sigma)，补充蒸馏水至1L体积，再加1.5ml土温-20(Labchem)，调pH至7.4，4℃保存。使用前，加入干燥的BSA(CSL)，使其占总溶液浓度的1％。

(viii)0.85％盐溶液(Excel Laboratori es)

(ix)驴抗山羊IgG-马辣根过氧化物酶(HRP)(Promega)

(x)1MH2SO4(AJAX Finechem)

(xi)TMBS EIA溶液(BioRad)A&B部分

(xii)P200移液枪和枪头

(xiii)P20移液枪和枪头

(xiv)nunc^TM polsorb96孔ELISA板

(xv)BioRad^TM96孔板的450型分光光度计

方法

在ELISA板的孔中加入100μl含脂肪酶的碳酸盐缓冲液，并在4℃贮存过夜。用PBS-TW洗板3次。为分析血清可在孔中加入100μl血清稀释液，为进行奶分析可在孔中加入90μl血清稀释液。1μl血清样品和10μl奶样品加到血清稀释液中。通过轻拍ELISA板将上述溶液成分混合。板子在4℃过夜。用PBS-TW洗板3次。在每个孔中加入100μl用0.85％盐溶液以1/2500比例稀释驴抗山羊IgG-HRP的溶液。把孔板室温孵育1小时。用PBS-TW洗板3次。将TMBS的9份A和1份B在Schott玻璃瓶中混合，并在每个孔中加入100μl该混合的TMBS。把孔板室温孵育10分钟。在每个孔中加入100μl lM H2SO4后，在分光光度计的450nm波长下读取数值。同时，打印输出吸光率的结果值。从所有动物收集的每份奶样品和血样品的吸光值都进行测试。为单个动物、以及每组动物的平均吸光值在以时间(天)为X轴、吸光值为Y轴的坐标中绘制出曲线图(包括两个测试主题)。

实施例15

在奶琼脂面中的脂肪酶扩散

(i)配制含1％(1g/100ml)琼脂(Oxoid Cat No L13，Basingstoke，Hampshire，England)的磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)

(ii)在5ml1％琼脂中加入100μl全脂奶(Masters，Perth，Australia)

(iii)为了制成琼脂片，把2.5ml奶琼脂倾倒在玻片上，并放置10分钟(在1％琼脂中含2％的奶)

(iv)用琼脂打孔机在奶琼脂胶中挖出5个1.5mm直径的孔，孔中的琼脂用抽真空去除。

(v)琼脂胶用荧光假单胞菌脂肪酶(Aldrich，Milwaukee，Wl，USA)孵育过夜，用0.85％盐溶液配制含5mg/ml脂肪酶的溶液。

(vi)将(a)盐溶液、(b)脂肪酶+无脂肪酶抗体血清和(c)脂肪酶+含抗脂肪酶抗体血清各自产生的扩散圈进行比较，所述扩散圈能指示脂肪酶降解脂肪。

结果如图12所示。在每一块奶片上，5个孔都充满了盐溶液(slide1)、脂肪酶(slide2)、脂肪酶和不含抗体的血清(slide3)、脂肪酶和含有抗脂肪酶抗体的血清(slide4)。在第二个奶片(slide2)中，由于脂肪酶水解了奶胶片中的脂质，水解圈很明显。阴性对照(slide1)证明水解圈由脂肪酶引起。如第四奶片(slide4)所证实，脂肪酶的水解活性能被抗脂肪酶抗体抑制。第三奶片(Slide3)证明是抗体而不是血清中的其他成分抑制脂肪酶。

尽管本发明列出了涉及的优选实施例，但是应当被理解为在本发明的主要原则范围内还可以作许多变化和修改。因此，优选实施例和所有这些变化及修改都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.一种诱导奶抗体持续释放的方法，包括步骤：

a)将包含抗原的引物施用到粘膜表面；

b)在距离至少一个乳上淋巴腺不超过100毫米的位置或在该乳上淋巴腺里面通过注射植入至少一个抗原释放物；

c)在抗原释放物被植入后，将包含抗原的增强成分传送到粘膜表面

其中，所述抗原释放物在使用时将抗原释放到乳上淋巴腺周围的组织区域中，所述乳上淋巴腺刺激抗体分泌到乳腺中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述注射物位于距离乳上淋巴腺不超过100毫米的位置，或在该乳上淋巴腺里面，以使抗原释放物在使用过程中，其抗原释放能引起奶抗体的产生。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原释放物通过注射被植入在离至少一个乳上淋巴腺1～100毫米的位置。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原释放物通过注射被植入在离至少一个乳上淋巴腺50～100毫米的位置。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原释放物通过注射植入哺乳动物体内，该哺乳动物包括：啮齿动物和反刍动物。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原释放物通过注射植入哺乳动物体内，该哺乳动物可选自：山羊、绵羊和牛。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗原释放物通过注射植入到奶牛、奶山羊或奶绵羊动物品种体内。

8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原为细菌抗原。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细菌抗原可来源于以下细菌种属：埃希氏菌属、葡萄状球菌属、链球菌属、沙门氏菌属以及幽门螺杆菌属。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细菌抗原可来源于以下细菌种属：大肠埃希氏菌、艰难梭菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌以及荧光假单胞菌。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细菌抗原为来源于荧光假单胞菌的脂蛋白脂肪酶。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物在通过注射植入抗原释放物之前施加。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物在通过注射植入抗原释放物的过程中施加。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物成分可一次性施加。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增强成分可一次性施加。

16.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述使用的抗原在每个步骤都相同。

17.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原释放物、引物成分和增强成分都包含佐剂。

18.一种权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括步骤：在通过注射植入抗原释放物前预选动物，表现最高抗体测定反应的动物被用于权利要求1至4中任一项所述的方法中。

19.一种含抗体的非人哺乳动物奶的生产方法，其特征在于，包括步骤：

a)按权利要求1至18中任一项所述的方法诱导抗体产生；并

b)从非人哺乳动物收集含抗体的奶。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述奶直接从哺乳动物获得即可使用。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述奶在使用之前可经过处理。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述处理的方法包括：热处理、紫外线辐射、浓缩、补充食品添加剂、烘干成浓缩品或奶粉。

23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，还包括从奶中分离抗体的步骤。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述抗体分离后进行纯化。

25.权利要求23或24所述方法分离的抗体。

26.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，所述分离的抗体包括：完整的免疫球蛋白分子，大部分完整的免疫球蛋白分子，以及含有补位的免疫球蛋白分子片断。

27.如权利要求26所述的抗体，其特征在于，所述免疫球蛋白分子片断包括：Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)片断。

28.一种生产含抗体的蛋白浓缩物的方法，其特征在于，包括步骤：

a)收集产奶期非人雌性动物的奶，该雌性动物被按照权利要求1至18中任一项所述的方法通过注射植入了抗原释放物；

b)将乳脂和杂质分开；

c)凝结纯化的脱脂乳；

d)分开干酪素；

e)对乳清蛋白进行过滤、超过滤、灭菌处理；

f)在保持抗体不变性和无菌的条件下蒸发和干燥蛋白。