CN101056648B - [d-meala]3-[etval]4环孢菌素用于丙型肝炎感染治疗的应用以及包含所述[d-meala]3-[etval]4-环孢菌素的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有增加的亲环蛋白结合活性以及基本上缺少免疫抑制活性的环孢菌素作为单一活性剂或与其他活性剂联合，在HCV感染治疗中的应用。

Description

[D-MEALA]3-[ETVAL]4环孢菌素用于丙型肝炎感染治疗的应用以及包含所述[D-MEALA]3-[ETVAL]4-环孢菌素的药物组合物
本发明涉及环孢菌素用于丙型肝炎病毒(HCV)感染治疗的应用以及包含所述环孢菌素的药物组合物。 
约15年前，Choo和同事克隆并鉴定了HCV(参见Science244，(1989)，359-362)。HCV属于黄病毒科，包含包膜的核壳体和单链正链RNA基因组(参见Bartenschlager等，Antiviral Res.60，(2003)，91-102)。HCV主要通过血液、血液制品传播，亦在怀孕期间垂直传播。用于筛选血液制品的诊断试验的导入显著减少了新感染的比率。 
尽管如此，HCV仍然是严重的医学问题。目前，约有1.7亿人感染HCV。最初的感染过程通常是缓和的。然而，免疫***常常无法清除病毒，持续感染的人群处于肝硬化和肝细胞癌的高风险中(参见Poynard等，Lancet349，(1997)，825-832)。 
尚没有有效的疫苗，且治疗选择非常有限(参见Manns等，Indian J.Gastroenterol.20(Suppl.1)，(2001)，C47-51；Tan等，Nat.Rev.Drug Discov.1，(2002)，867-881)。 
当前的治疗是基于干扰素α和利巴韦林联用。在85-90％的基因型2和3感染患者中，该治疗产生持续的抗病毒反应，但不幸的是，仅约45％的流行的基因型1感染患者产生持续的抗病毒反应。此外，副作用相当大，包括肌痛、关节痛、头痛、发热、严重抑郁、白细胞减少和溶血性贫血。
显然，HCV感染治疗需要具有更高抗病毒活性和更好安全性分布图的额外治疗，特别是如在预防HCV复发情况下。为建立安全性分布图，对于HCV感染临床治疗来说，诸如低细胞毒性和细胞抑制效应以及高选择性指数的标准是特别相关的。 
最近，通过临床观察资料描述了一种新的使用环孢菌素治疗HCV感染的方法(参见Teraoka等，Transplant Proc，1988，20(3 suppl 3)，868-876，和lnoue等J Gastroenterol，2003，38，567-572)。近来，显示环孢菌素A(CsA)以临床上能达到的药物浓度抑制HCV亚基因组复制子在体外细胞内的复制(参见Watashi等，Hepatology 38，2003，1282-1288，和Nakagawa等，BBRC 313，2004，42-47)。这两项研究都认为CsA的抗HCV作用与基于分别使用抑制免疫的大环内酯，即已知名称为FK 506的化合物和非免疫抑制的环孢菌素A衍生物即已知名称为NIM 811或[MeIle]4-CsA的化合物所得到的观察资料的免疫抑制活性无关。Nakagawa等认为由于CsA众所周知的免疫抑制性，其扩展应用可能在实际上有困难，建议克服该困难的解决方案应考虑使用非免疫抑制的环孢菌素类似物。 
在过去15年中，已进行了许多目的在于鉴定这样的非免疫抑制的环孢菌素类似物的药物化学研究，化合物NIM 811是具有该特性的最具代表性的化合物之一。 
Ko等的专利申请EP 0484281中报道了NIM 811和其他9种环孢菌素A衍生物的非免疫抑制性，认为在HIV感染治疗和AIDS预防中可能有用。那些衍生物的设计包括环孢菌素A的4-和/或5-位氨基酸上的修饰。 
通过修饰环孢菌素A的2-和/或6-位氨基酸，Sigal等合成了总计61种的环孢菌素类似物，并观察到这样的化学修饰诱导了免疫抑制活性的减少(参见Sigal等，J.Exp.Med.，173，1991，619-628)。 
为了获得非免疫抑制的化合物，Barriere等在WO98/28328、WO98/28329和WO98/28330中详细描述了修饰环孢菌素A的3-位氨基酸的进一步尝试。 
Wenger等已设计了一系列在位置3上不同于环孢菌素A的化合物，在该位置上它们含有不同于甘氨酸的N-甲基化的、体积不大的疏水或中性氨基酸，在位置4上它们含有不同于亮氨酸的N-甲基化的或N-乙基化的疏水或中性氨基酸，他们报道了那些化合物具有高效抑制HIV-1复制的能力，并且基本上没有免疫抑制活性(参见国际专利申请WO00/01715和Tetrahedron Lett.，41，(2000)，7193-6)。 
本发明的目的是在于提供给临床医生一种新的HCV感染治疗方法，尤其是如在预防HCV复发的情况下。与业已批准的治疗或新提议的治疗相比，该治疗应提供更高的抗病毒活性和更好的安全性分布图。 
本发明人令人惊奇地发现给予感染HCV的患者一种十分特别的化合物，即[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA，符合了上述的要求。他们观察到，除了其非免疫抑制性之外，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对亲环蛋白具有显著增加的亲和力，所增加的亲和力与提高的抑制HCV复制的功效相关。 
因此，本发明的一个主题涉及[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在制备供治疗患者HCV感染之用的药物中的应用。 
Wenger等在WO00/01715中已报道了[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA，其已分配了CAS登记号254435-95-5。其是一种下列分子式所描述的环状十一氨基酸多肽： 
-MeBmt-aAbu-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- 
  1      2      3      4     5    6     7    8     9     10     11
其中MeBmt是N-甲基-(4R)-4-丁-2E-烯-1-基-4-甲基-(L)苏氨酸，αAbu是L-α-氨基丁酸，D-MeAla是N-甲基-D-丙氨酸，EtVal是N-乙基-L-缬氨酸，Val是L-缬氨酸，MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸，Ala是L-丙氨酸，(D)Ala是D-丙氨酸，以及MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。通常在环孢菌素A参考文献中所使用的氨基酸位置的常规编号示于该分子式之下。通过使用包含表示不同于环孢菌素A中的那些的残基本身并提供它们位置的第一部分，以及表示所有其他残基与环孢菌素A中的那些相同的标记“CsA”的第二部分的组合命名获得其名称。例如，[MeIle]4-CsA是一种除第4位的MeLeu为MeIle(N-甲基-L-异亮氨酸)所取代之外与环孢菌素A相同的环孢菌素。 
本发明将以下列实验和附图来进行进一步的解释，其中： 
-图.1是在感染的Huh-7-Lunet细胞中通过荧光素酶测定法所测得的剂量反应直方图； 
-图.2是在感染的Huh-7.5细胞中通过荧光素酶测定法所测得的剂量反应直方图； 
-图.3是感染的Huh-9-13细胞的清除率反应曲线； 
-图.4是联用IFN/[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA剂量反应的3D图示。 
目前，环孢菌素A的医学应用涉及该化合物通过阻止某些自分泌T-细胞生长因子包括白介素2(IL-2)从活化的T细胞产生和释放，以抑制细胞介导的免疫应答的能力(参见Borel(1989)Transplant.Proceed.21，810-815；Kronke等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，5214-5218；Faulds等(1993)Drugs45,953-1040)。一旦进入细胞，环孢菌素A就以高亲和力结合亲环蛋白(参见Handschumacher等(1984)Science226,544-547)。在 不同的生物学功能中，它们具有可在体外测定的肽基-脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性(参见Fischer等(1989)Nature337,476-478；Takahashi等(1989)Nature337,473-475)。对于环孢菌素A的免疫抑制效应，关键在于亲环蛋白-环孢菌素A复合物和依赖钙及钙调蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2B(钙依赖磷酸酶)之间的相互作用(参见Hauske(1993)DN&P6,705-711，Friedman等(1991)Cell66,799-806；Liu等(1991)Cell66,807-815)。该三元复合物的形成，导致钙依赖磷酸酶的磷酸酶活性受到抑制(参见Jain等(1993)Nature365,352-355；Rao等(1997)Annu.Rev.Immunol.15,707-747Crabtree(1999)Cell96，611-614)。钙依赖磷酸酶促进NF-AT选择性脱磷酸，然后移位至细胞核，在此其与激活蛋白1结合并反式激活靶基因，包括IL-2基因。 
人们相信，由于3和4位上的氨基酸，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA具有显著减少的与钙依赖磷酸酶相互作用的能力，如转录和免疫测定所示，以及明显增加的对亲环蛋白的亲和力，如肽基-脯氨酰顺反异构酶活性的抑制测定所示。 
使用修改自Kofron等(参见Biochemistry30，6127-6134(1991)；J.Am.Chem.Soc.114，2670-2675(1992))的方法测定亲环蛋白的肽基-脯氨酰顺反异构酶(PPI ase)活性。N-琥珀酰化Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，Bachem，Bubendorf，Switzerland)用作为底物。该测定是基于四肽Ala-Ala-Pro-Phe-pNA中反式异构重整(trans isoform)的Phe-pNA键被糜蛋白酶优先切割。该切割释放了可在390nm处检测和定量(ε＝11,814M-1cm-1)的对硝基苯胺部分。Schutkowski等(1995)Biochemistry34，13016-13026。通过亲环蛋白(PPIase，EC5.2.1.8)催化了顺反式异构化作用。在将CsA或另外的环孢菌素(10-9-2x10-5M终浓度，制备自1000倍浓缩 的乙醇储液)与0.1μg亲环蛋白(Sigma)于1.5ml总体积的40mM Hepes，pH7.9中混合并在冰上温育50分钟后，将反应混合物转移到Varian分光光度计(Varian)中保持在10℃的比色杯中。在添加3.75mg糜蛋白酶(70μl糜蛋白酶10mM HCl溶液)之后，通过添加10μl3.2mM Suc-AAPF-pNA到0.5M LiCl/三氟乙醇溶液启动反应。监测反应3分钟，由所获得的数据确定初速常数。作为对照，也测定不存在亲环蛋白的平行反应的初速常数。确定环孢菌素A和其他环孢菌素的浓度反应曲线，以及将不同的环孢菌素的IC50(50％抑制浓度)值表示为相对于环孢菌素A(1.0)的值。小于1的值意味着与CsA相比该化合物具有更高的亲环蛋白亲和力。 
最初，NF-AT-依赖的报道基因测定法被用于测定环孢菌素的免疫抑制活性。Baumann等(1992)Transplant.Proc.24，43-48。由G.Zenke，Novartis Pharma AG，Basel，Switzerland获得用含有在IL-2基因的启动子控制下的细菌β-半乳糖苷酶基因的报道基因构建体稳定转染的Jurkat T细胞。细胞在补充有10％热失活的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、50μM2-巯基乙醇和100u/ml潮霉素B的RPMI1640培养基中生长。在存在或不存在环孢菌素A或另外的环孢菌素(10-9-2x10-5M终浓度，制备自1000倍浓缩的乙醇储液)情况下，通过添加2.4μM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酯和75μg/ml植物血球凝集素刺激细胞。在37℃培养20小时后，收获细胞并在50mM Na2HPO4(pH9.0)、10mM KCl、1mM MgSO4、1％Triton X-100、0.5mM4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(Sigma，Buchs，Switzerland)中裂解。在室温下于黑暗中使β-半乳糖苷酶反应进行1小时。在上清液中使用荧光测定法测定发荧光的4-甲基-伞形酮(激发：355nm；发射：460nm)。确定环孢菌素A和其他环孢菌素的浓度反应曲线，计算相对于环孢菌素A(1.0)不同的环孢菌素的IC50值。高于1 的值意味着与CsA相比该化合物免疫抑制力较低。实例结果示于下表1中。 
表1：CsA和其他环孢菌素的亲环蛋白结合(PPIase)和免疫抑制(IL-2)活性 
  
化合物 PPIase IL-2
CsA 1.0 1.0
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 0.3 7161
[MeIle]4-CsA 0.5 2250
表1所示数据揭示了在位置4上的某些取代(即Val，Ile)显著地减少了免疫抑制活性(通过IL-2表达抑制所测定的)，以及可检测地增加了亲环蛋白结合亲和力(通过亲环蛋白PPIase活性抑制所测定的)。位置3上的取代导致进一步显著增加的亲环蛋白结合活性(增加2倍或更多；参见[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA)。与从文献中所能得到的最好的标准化合物[MeIle]4-CsA相比，其具有更高的亲环蛋白结合活性和较低的残留免疫抑制活性。[MeIle]4-CsA也被称为NIM811。 
[D-MeAla] 3 -[EtVal] 4 -CsA的非免疫抑制活性
在确证分析中，使用混合淋巴细胞反应测定CsA、[MeIle]4-CsA和[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的免疫抑制活性。在该测定中，将环孢菌素溶解在乙醇中(10mg/ml)。在通过辐射失活其中一群细胞(刺激细胞；S)之后，混合来自两个健康供体的新鲜分离的CD4+PBMCs。在存在或不存在环孢菌素(1μg/ml)下共培养5天后，通过[3H]-胸苷掺入测定非失活细胞群(应答细胞；R)的增殖反应。
该测定使用两种细胞群相互进行，每种依次失活和刺激。应答细胞的刺激(％)通过公式计算： 
刺激百分数＝100x(存在环孢菌素的样品-背景)/(不存在环孢菌素的样品-背景) 
样品指刺激细胞和应答细胞的混合物。背景代表其中仅有刺激细胞被混合的对照。结果示于表2。它们被解释为指[MeIle]4-CsA和[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA都基本上无免疫抑制活性。 
表2：在存在/不存在环孢菌素下CD4+PBMCs的增殖反应 
  
共培养 化合物 N ％刺激(相对) 标准偏差
R1xS2 无 8 100 30
R1xS2 CsA 4 29 3
R1xS2 [MeIle]4-CsA 4 84 13
RlxS2 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 4 75 11
R2xS1 无 8 100 9
     R2xS1    CsA  4  9  2
R2xS1 [MeIle]4-CsA 4 75 9
R2xS1 [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 4 65 7
S1xS2 无 4 0 0.6
R1xS2指共培养来自供体1的应答细胞和来自供体2的刺激细胞。N是测定次数
[D-MeAla] 3 -[EtVal] 4 -CsA的高抗-HCV活性和低细胞毒性/抑制细胞效应
如前所述，丙型肝炎病毒(HCV)感染是严重的健康问题，因为持续感染的患者处于发展的慢性肝病包括肝硬化和肝细胞癌的高风险中。当前可利用的治疗对于大部分后一种疾病人群并不适宜，且伴随着明显的副作用。直到最近，由于缺少适当的在人临床试验前能用于筛选潜在活性化合物的体外HCV复制模型，仍就阻碍了更有效治疗的开发。通过开发在培养的肝细胞瘤细胞中高水平自主扩增的基因修饰的HCV微基因组(复制子)克服了该障碍(Lohmann等Science285，(1999)，110-113)。该HCV复制子***已迅速地成为用于研究HCV复制、发病机理和持续性(persistence)的标准工具(Bartenschlager等Antiviral Res.60，(2003)，91-102)。HCV基因组由单链RNA组成，该单链RNA含有编码约3000个氨基酸的多蛋白的单一可读框。该多蛋白的翻译在位于RNA5′末端的内部核糖体进入位点(IRES)处启动。HCV多蛋白被切割为至少十种蛋白。它们包括衣壳蛋白C、包膜蛋白E1和E2、可能的病毒膜孔蛋白p7、具有丝氨酸蛋白酶以及腺苷三磷酸酶/解螺旋酶活性的非结构蛋白NS2和NS3、NS4A、膜网-诱导蛋白NS4B、NS5A和依赖于RNA的RNA聚合酶NS5B。第一个成功的复制子是在5′至3′方向上含有HCV IRES、新霉素磷酸转移酶编码序列、来自脑心肌炎病毒的IRES以及HCV蛋白NS3到NS5编码序列的双顺反子RNA。在导入Huh-7细胞和使用G418(遗传霉素)选择之后，该复制子应显示高水平的复制自主性(1,000-5,000拷贝/细胞)(Lohmann等，1999)。对该***的鉴定揭示了复制效率取决于宿主细胞的许可以及更重要的是HCV蛋白编码序列对细胞培养物选择的适应性突变。发现复制对干扰素α敏感，提供了证明该***用于筛选具有体内功效药物的相关性证据。还构建了其中新霉素磷酸转移酶编码序列被取代的变异的复制子，如为荧光素酶编码序列或编码荧光素酶-遍在蛋白-新霉素磷酸转移酶融合蛋白的序 列所取代。可通过常规荧光素酶测定法测定后一种变异的复制子的复制，而前一种复制子的复制需要测定RNA拷贝数。 
Watashi等(2003)通过RNA印迹和定量RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)证实了HCV RNA在含有HCV复制子的MH-14细胞中的积聚为CsA所抑制，但不为免疫抑制的大环内酯FK506和非免疫抑制的CsA衍生物PSC833所抑制。他们包括将细胞暴露于活性剂7天的测定揭示了在1 
μg/ml环孢菌素A存在下，HCV RNA滴度减少约200倍。他们进一步发现非免疫抑制环孢菌素[MeIle]4-CsA也抑制HCV复制。结果表明在减少HCV RNA滴度上，[MeIle]4-CsA与CsA效果几乎相同。 
为测定本发明的环孢菌素是否具有抗HCV活性，以及其应当具有这样的活性，与CsA和[MeIle]4-CsA的活性相比该活性是多少，在HCV复制子***中进行比较CsA、[MeIle]4-CsA和[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA抑制效果的试验。 
测定使用了含有编码萤火虫荧光素酶-泛蛋白-新霉素磷酸转移酶融合蛋白和HCV蛋白NS3-5的双顺反子RNA的Huh5-2细胞。病毒序列来源于基因型1b的HCV病毒。细胞在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Life Technologies)、1x非必需氨基酸(Life Technologies)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和250μg/ml G418(Geneticin，Life Technologies)的RPMI1640培养基(Gibco)中于37℃和5％CO2下培养。对于抗病毒(复制)测定，在除G418外的相同的培养基中，细胞以7000细胞/孔密度接种在96-孔View PlatesTM(Packard)中。24小时培养后，除去培养基，添加在培养基中连续稀释的测试混合物，并再培养细胞72小时。 
通过荧光素酶测定法或定量RT-PCR测定抗病毒效果。为进行荧光素酶测定法，除去培养基，并用PBS洗涤细胞。在50μl Glo裂解缓冲液 (Promega)中裂解15分钟后，将50μl替代Glo的荧光素酶测定试剂(Promega)添加到细胞裂解液中。使用发光计测定荧光素酶活性，并将来自每个测试孔的信号表示为在没有暴露于测试化合物的培养物的信号的百分数。 
使用MTT测定法(CellTiter96R AQueous非放射性细胞增殖测定法，Promega)，测定普通的96-孔平板(Beckton-Dickinson)相同的培养物中细胞密度和抑制细胞效应。在该测定法中，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)被生物还原为甲臜(formazan)，其在平板阅读仪498nm处定量。甲臜产量与活细胞数量直接相关。 
使用ABI PRISM7700测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)，通过RT-PCR分析定量复制子的新霉素区。所使用的正向和反向引物分别是5′-CCGGCTACCTGCCCATTC-3′和5′-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3′。荧光探针是5′-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3′。作为内标(internal control)，使用含有新霉素磷酸转移酶基因序列一部分的质粒。 
来自这些试验的结果可以计算不同环孢菌素的EC50，其是抑制50％HCV复制子复制所需的有效浓度，和CC50，其是抑制50％指数生长细胞增殖所需的浓度，以及选择性指数SI，其是CC50和EC50的比值。 
表3显示了使用用于测定复制效率的荧光素酶活性测定法以及用于校准荧光素酶测定法和用于测定化合物的抑制细胞效应的MTT测定法，获得自Huh5-2细胞的值。与上述讨论的Watashi等(2003)的观察结果一致，CsA和[MeIle]4-CsA具有相似的抗HCV(复制)活性。
令人惊奇的是，与CsA和[MeIle]4-CsA相比，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA明显更有效。也注意到[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的50％抑制细胞生长浓度(CC50)显著高于对CsA和[MeIle]4-CsA测定的值。因此，与其他两种环孢菌素相比，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA有相当高的选择性指数。进行类似的试验，其中EC50值来自使用定量RT-PCR测定的RNA滴度，获得了相似的结果。对于CsA、[MeIle]4-CsA和[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA分别获得了45*、73和625*的SI值。星号表示当前两次独立测定值中较低的。 
表3：由HCV RNA复制的荧光素酶测定法和包含含有荧光素酶的HCV小复制子的Huh5-2细胞中细胞毒性的MTT测定法测定的EC50、CC50和SI值 
  
化合物 EC50(μg/ml)+/-Std.Dev  CC50(μg/ml)+/-Std.Dev  选择性指数
CsA 0.28+/-0.13 11.6+/-5.6 41
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 0.03+/-0.04 >27 >900
[MeIle]4-CsA 0.22 14 64
在用重组HCV感染的靶细胞中测定的[D-MeAla] 3 -[EtVal] 4 -CsA的抗病毒活性
在接近体内情况的培养***中进一步测定与CsA相比的[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的抗HCV活性。该方法使用了已用感染性全长嵌合HCV构建体或被修饰以携带荧光素酶报道基因的相同病毒感染的肝细胞瘤细胞。在用本发明的环孢菌素或CsA处理感染的细胞后，测定与抑制病毒复制直接相关的荧光素酶活性。
HCV毒株J6和JFH1(Jcl)全长嵌合基因组的感染性HCV病毒被用于给测定法中的肝细胞瘤细胞接种。还对Jcl病毒的构建体进行修饰以获得携带荧光素酶报道基因(Jcl-Luc)的双顺反子基因组。在基因组RNA转录物通过电穿孔转染Huh-7.5细胞24和96小时后，收集细胞培养物上清液。过滤上清液(0.45μM)并通过根据Lindenbach等(Science，309，(2005)，623-626)的有限稀释法测定每毫升的细胞培养物感染剂量50(CCID50)。对于Jcl，CCID50是1.3x105，而对于Jcl-Luc是4.2x103。 
测定使用Huh-7-Lunet或Huh-7.5细胞(Lohmann等，Science285(5424)，(1999)，110-113)。细胞培养在补充有10％热失活的胎牛血清(FCS)(Integro)、1x非必需氨基酸(Gibco)、100IU/ml青霉素(Gibco)、100μg/ml链霉素(Gibco)或25μg/ml潮霉素(Gibco)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM；Gibco)中，于37℃和5％CO2下生长。对于抗病毒(复制)测定，将Huh-7-Lunet和Huh-7.5细胞以2x104或4x104细胞/孔的密度接种在12-孔平板上。24小时后，用0.5ml的Jcl-Luc病毒储液(12-孔平板)或0.25ml的Jcl病毒储液(12-孔平板)替换培养基。4小时后，用含有不同浓度的CsA或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的培养基替换病毒接种物，并进一步培养额外的72小时。 
通过荧光素酶测定法测定病毒复制的抑制。为进行荧光素酶测定法，收获细胞，用PBS洗涤并在荧光素酶裂解缓冲液(1％Triton X-100、25mM双甘氨肽、15mM MgSO4、4mM EGTA和1mM DTT)中裂解。根据Krieger等(J Virol，75(10)，(2001)，4614-4624)测定萤火虫荧光素酶活性。简言之，在一次冻/融循环后，重悬细胞并将100μl细胞裂解液与360μl测定缓冲液(25mM双甘氨肽、15mM MgSO4、1mM DTT、2mM ATP、15mM磷酸钾缓冲液，pH7.8)和200μl底物溶液(200mM荧光素、25mM双甘氨 肽)混合。最后，通过使用Lumat LB9507发光计(Berthold)对20个样品测定发光。 
在这些例子中(图1和2)，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(白条)和CsA(黑条)产生剂量依赖性抗病毒活性，籍此再次证明[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA较CsA优异，因此确证了使用亚基因组复制子所获得的数据。要产生与本发明的环孢菌素相同的复制抑制效果，需要10倍更高浓度的CsA。 
本发明的环孢菌素对亲环蛋白的高亲和力
在上述讨论的Watashi等(2003)和Nagakawa等(2003)的观察结果中，抗HCV效果与环孢菌素对亲环蛋白的结合容量相关测定CsA、[MeIle]4-CsA和[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA对亲环蛋白PPIase活性的效果，以确定更有效的亲环蛋白如亲环蛋白A的PPIase活性的抑制剂，以及因此更有效的HCV复制的抑制剂。 
在该测定中使用商用人重组亲环蛋白A(Sigma)。根据Garcia-Echverria等(BBRC，191，(1993)，70-75)使用糜蛋白酶-偶联的分光光度测定法测定亲环蛋白的PPIase活性。该方法是基于糜蛋白酶对N-琥珀酰-ala-ala-pro-phe-对硝基苯胺类型的肽的高反式选择性。该肽切割释放了可被检测并可在390nm处定量的对硝基苯胺部分。顺式水解受限于亲环蛋白A顺反异构化的速率。该肽在溶于470mM2，2，2-三氟乙醇的25nMLiCl溶液中制备，以提高顺式构象异构体肽总数。该测定在分光束分光光度计上进行并将水浴设定在5℃。将20nM亲环蛋白A(7500pmol/mg总酶浓度；Sigma)溶解在缓冲液(35mM HEPES和0.26mg/ml糜蛋白酶(比活度50单位/毫克)，用KOH调到pH7.8)中并在室温下温育6分钟，然后在水浴中温育54分钟。在这些温育液中适当添加浓度范围在2-50nM的CsA、[MeIle]4-CsA或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。然后，将3.5ml温育 的亲环蛋白添加到样品比色杯中。参比比色杯含有已完成的反应以平衡参比光束。添加25μM肽以启动反应，并以每秒10个数据点监测吸光度改变。作为对照，还测定不存在亲环蛋白的平行反应的速率。将存在亲环蛋白A下的速率减去这些肽水解的空白速率(即不存在亲环蛋白下)。 
通过一阶回归分析法分析获得自PPIase测定的初速，该一阶回归分析法使用了在390nm处吸光度改变的时程迹(traces)的一阶变换。在紧密结合的抑制剂多蛋白平衡中，使用软件FigSyS(2003，Biosoft)通过拟合由回归分析获得数据，计算总酶浓度(Et)、抑制剂解离常数(Ki)和限速反应的速度常数。 
该紧密结合的抑制剂多蛋白平衡具有下列公式： 
v＝k*Et*P-k*(-b-sqrt(b*b-4*c))/2 
在此b定义为b＝-(Et*P+I+Ki)以及c是c＝Et*P*I。 
一旦通过计算机对给定数据组计算了Et、Ki和k，对图示数据作图并对假定为抑制剂紧密结合单一蛋白的点进行线性拟合，定义为下列等式： 
v＝K*Et*P-K(B-sqrt(B*B-4*C))/2 
在此B＝Et*P+I+Ki和C＝Et*P*I。 
表4：PPlase活性测定法测定的亲环蛋白A对CsA、[MeIle]4-CsA和[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的Et、Ki和k值 
  
化合物 Et(pmol/mg) Ki(nM) k(s-1)
CsA 7500 9.79±1.37 0.17±0.0069
[MeIle]4-CsA 7500 2.11±0.32 0.17±0.0068
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 7500 0.34±0.12 0.16±0.0074
[0072] 与CsA和[MeIle]4-CsA相比，对本发明的环孢菌素所观察到的亲环蛋白A最低的Ki确证了高效的抗病毒活性、特异性和选择性指数(如上所述)。令人惊奇的是，与其他非免疫抑制的环孢菌素[MeIle]4-CsA相比，非免疫抑制的[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA显示了几乎6倍高的对亲环蛋白实例的亲和力。 
上述试验证实了与任何其他测试的环孢菌素相比，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA是更有效的HCV复制的抑制剂。该增加的抗-HCV活性与增加的[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的亲环蛋白结合活性相关。 
HCV复制子清除和回弹(rebound)
HCV感染复发是主要的疾病问题，特别是甚至在使用可能的治疗如环孢菌素和/或干扰素时。基于在存在选择重组产生的复制子的药物G418下进行体外细胞测定以研究与CsA相比本发明的环孢菌素是否具有更有效的抗HCV活性，其反映在化合物是否具有更有效地去除产生HCV复制子的细胞的能力。 
测定使用Huh-9-13细胞、人肝细胞瘤细胞(Huh-7)(Lohmann等，Science285(5424)，(1999)，110-113)。细胞在常用的不含有G418压力的完全培养基DMEM中生长。细胞在CsA或[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA(都为0.5或1μg/ml)存在下培养或不经过任何处理，连续传代7次。进行对照试验以保证在不存在G418选择压力下，传代几次过程中不应影响HCV复制子含量。为证实已用[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理7天的Huh-9-13细胞确实清除了其复制子，重新启动G418选择(1000μg/ml)传代多2次。在回弹期，只有那些仍然携带HCV复制子的细胞才能在这些条件下增殖，而不存在复制子的细胞则在G418存在下死亡。
在不同的传代时间点，使用RT-PCR在提取的病毒RNA样品。使用的正向和反向引物分别是5′-CCGGCTACCTGCCCATTC-3′和5′-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3′。荧光探针是5′-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-3′。作为内标，使用含有新霉素磷酸转移酶基因序列一部分的质粒。分析结果并将其表示为每1’000个细胞的复制子RNA量(ng)，用于作图。 
来自这些试验的结果(图3)显示，在该标准的体外细胞测定中，与CsA相比[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA具有优异的抗病毒效应。令人惊奇的是，本发明的环孢菌素显示的是杀病毒效应，而不仅仅是其他免疫抑制的CsA的抑制病毒效应。事实上，当[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA处理的Huh-9-13细胞(图3中的圆环和正方形)再次在G418存在下培养时(回弹期)，与CsA处理的细胞(菱形和三角形)相比，培养物还是死亡的。两种已用CsA处理连续传代7次的培养物都能在G418存在下增殖。这证实了[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA能去除Huh-9-13细胞中的HCV复制子。 
联合用药
干扰素(IFN)是当前HCV感染治疗的一部分。使用Prichard和Shipman(Antiviral Res，1990，14，181-205)的方法评估[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA/IFN-α2a联合用药的效应。简言之，由单个化合物的剂量反应曲线计算理论加性效应，表示为方程式： 
Z＝X+Y(1-X)， 
在此X代表[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA单独产生的抑制，Y代表IFN-α 
2a单独产生的抑制。Z代表[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA和IFN-α2a联合用药产生的效应。当联合用药是加性时，真实试验表面(surface)减去理论加性 表面，获得等于零平面的水平表面，位于零平面之上的表面表明联合用药的协同效应，而在零平面之下的表面则表明拮抗作用。除以棋盘(checkerboard)方式添加化合物之外，基本上如上对Huh5-2细胞的所述进行抗病毒测定。对于每种化合物，使用三个重复的平板测量每种化合物的剂量反应曲线。从所有三个平板获得的数据被用于计算理论加性表面。对每对化合物的组合研究也重复进行三次。通过ANOVA检验分析数据方差。 
在使用最高浓度的IFN-α2a时，注意到有微小的协同活性，但总的来说[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA和IFN-α2a联合用药的抗HCV活性可视为是加性的(图4)。 
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的研究结果可总结如下： 
-与CsA相比，[D-MeAla]3-[EtVal]4-GsA具有更有效的抗HCV活性，以及较少的细胞毒性，如HCV亚基因组复制子***所示。 
-这已在用全长感染性HCV毒株J6和JFH1嵌合基因组感染的肝细胞瘤细胞培养物中得到证实。 
-与CsA相比，[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA能更有效地去除细胞中的HCV复制子。 
-这些效应与更显著的亲环蛋白结合亲和力相关。 
-[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA/IFN-α2a联合用药的抗HCV活性是加性的。 
[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA可用于治疗感染HCV的患者。该活性化合物可通过任何常规途径给药。其可亲本地(parentally)给药，如以可注射溶液或悬浮液形式，或以可注射的沉淀物配方的形式。优选地，可以供饮用的溶液或悬浮液、片剂或胶囊的形式口服给药。包含本发明的环孢菌素的供口服给药的药物组合物描述于实施例中。如实施例所证实的，这样的药物组合物通常包含本发明的环孢菌素以及一种或多种药学上可接受的载体物质。典型地，这些组合物是浓缩的，且在给药前需要与适当的稀释剂如水结合。供肠胃外给药的药物组合物通常还包括一种或多种赋形剂。可选择的赋形剂包括等渗剂、缓冲液或另外的pH调节剂，以及防腐剂。可添加这些赋形剂用于维持组合物并达到优选的pH范围(约6.5-7.5)和重量克分子渗透压浓度(约300mosm/L)。 
供口服给药的环孢菌素配方的额外实施例可见U.S.专利号5,525,590和5,639,724，以及U.S.专利申请2003/0104992。通过口服途径，对于每日一次到每周一次的给药，本发明的环孢菌素的指示剂量可为约1mg/kg至约100mg/kg，优选为约1mg/kg至约20mg/kg。通过静脉途径，所指示的相应剂量可为约1mg/kg至约50mg/kg，优选为约1mg/kg至约25mg/kg。本发明的环孢菌素的有效量应理解为这样一种量，即当在治疗方案过程中重复给予需要治疗HCV感染的患者时，在患者中产生客观的临床反应如统计学上显著减少的血清HCV滴度或显著减少的血清ALT活性的量。 
进行I期临床研究以评估口服剂量的[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA的安全性，并确定药品的药物代谢分布图和安全性分布图。研究显示水性微乳剂中50-1600mg的剂量能良好耐受。观察到轻微且短暂的副作用，包括恶心、呕吐、腹痛、轻微头痛。这些副作用与剂量无关。 
当确定用于测试包含本发明的环孢菌素的药物组合物抗HCV感染功效的试验剂量时，临床医师需要考虑许多因素。其中主要考虑的因素是所 选择的本发明的环孢菌素的毒性和半衰期。额外的因素包括患者体重、患者年龄、患者的一般状况(包括显著的全身性或主要疾病，包括代谢失调的肝病、重度原始骨髓损害和其他病毒感染)、如通过血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平指示的HCV感染期(急性对慢性)、特定的HCV基因型、HCV感染的在先治疗、患者中其他药物的存在等等。一个疗程需要重复给予本发明的药物组合物。典型地，每周应给予足够的药物剂量3-7次，治疗可持续约4周到6个月，优选约4周到12个月。治疗后可测定血清中HCV和ALT水平。治疗终点是这样一种病毒学反应，即在治疗过程结束时、治疗开始几个月后或治疗完成几个月后，不存在HCV。血清中的HCV可以通过诸如定量RT-PCR或RNA印迹的方法测定的RNA水平、或通过酶免疫测定法或病毒蛋白的增强化学发光免疫测定法在蛋白质水平上来计量。该终点还可包括正常范围内的血清ALT水平的测定。 
除本发明的环孢菌素之外，本发明的药物组合物可包含一种或多种其他抗HCV感染的活性成分，例如不同的抗病毒药品如利巴韦林或干扰素α。本发明的环孢菌素和上述其他活性成分可作为同一种药物组合物的一部分共同给药或分别给药，作为用来获得所述联合治疗益处的适当的给药方案的一部分。所述适当的给药方案、每种剂量给药量以及每种活性剂剂量之间的特定间隔时间都取决于所使用的活性剂的特定组合、正被治疗的患者的情况以及其他在上文中讨论的因素。上述额外的活性成分应通常以小于或等于它们有效的作为单一治疗剂的剂量的量给予。对于这样的活性剂，已经获FDA批准用于对人给药的FDA所批准的剂量是公众可得到的。 
所有在此引用的专利、专利申请和出版物都应视为其全文已并入作为参考。 
本发明进一步通过下列实施例详细描述。对于本领域技术人员，提供实施例是为了举例说明，而非意在限制如权利要求所述的本发明的范围。因此，本发明不应视为被限制在所提供的实施例，而应视为包含由在此所提供的教导而明显获得的所有和全部的变化。 
实施例1：合成[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA 
(翻译自Jean Francois Guichou标题为“De nouveaux analogues deCyclosporin A comme agent anti-VIH-1”，Faculte des Sciences，University ofLausanne，CH-1015Lausanne，Switzerland(2001)的博士论文). 
合成H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe： 
将4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(41.5mmoles；5.8g)添加到溶于100ml醋酸酐的环孢菌素A(CsA)(8.3mmoles；10g)溶液中。在室温下搅拌该溶液18小时。然后用600ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用水洗涤两次，再用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤四次。在无水Na2SO4上干燥有机相，过滤并减压蒸发溶剂。在硅胶上层析分离获得的黄色残留物(洗脱液：98:2二氯甲烷/甲醇)并在***中重结晶。回收9.5g的MeBmt(OAc)-CsA，一种白色粉末，产率92％。 
将三甲基氧鎓四氟硼酸盐(22.5mmoles；3.3g)添加到溶于60ml二氯甲烷的MeBmt(OAc)-Cs(7.5mmoles；9.4g)溶液中。在室温下16小时后，添加溶于甲醇中的35ml0.26M甲醇钠。1小时后，添加35ml甲醇和35ml2N硫酸，并再搅拌反应混合物15分钟，用饱和KHCO3(28ml)中和至pH6.0并用乙酸乙酯抽提两次。用饱和NaCl洗涤有机相2次，在无水Na2SO4上干燥并过滤。然后，减压蒸发溶剂。在硅胶上层析分离残留物(洗 脱液：5:1乙酸乙酯/甲醇)。获得7.3g的H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe(产率：76％)。 
HPLC tr＝268.23mn(98％) 
ES/MS：m/z：1277.5[M+H+]，639.2[M+2H+] 
合成H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe： 
将DMAP(2.3mmoles；334mg)和异硫氰酸苯酯(6.9mmoles；0.75ml)添加到溶于48ml四氢呋喃的 
H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(4.6mmoles；7g)溶液中。2小时后，蒸发溶剂，并在硅胶上层析分离粗制品(洗脱液：9:1叔丁基甲基醚(MTBE)/乙酸乙酯(1)；9:1MTBE/甲醇(2))。获得5.8g的Ph-NH-C(S)-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(90％产率)。 
将13.8ml三氟乙酸添加到溶于290ml二氯甲烷的后一种化合物的溶液中(4mmoles；5.6g)。反应1小时后，使用KHCO3中和混合物并用500ml二氯甲烷稀释。用饱和NaCI洗涤有机相2次，在无水Na2SO4上干燥并过滤。然后，减压蒸发溶剂。在硅胶上层析分离残留物(洗脱液：9:1MTBE/乙酸乙酯(1)；3:1MTBE/甲醇(2))。获得2.8g的H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(61％产率)。 
HPLC tr＝25.80mn(99％)
ES/MS：m/z：1050.5[M+H+]，547.7[M+2H+] 
合成Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH： 
在惰性气氛下，将氟代-N，N，N’，-四甲基脲六氟磷酸酯(TFFH)(0.96mmoles；0.25g)添加到溶于15ml二氯甲烷的H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe(0.87mmoles；1.00g)、DIPEA(2.78mmoles；0.48ml)和Boc-D-MeAla-EtVal-OH(0.96mmoles；0.32g)溶液中。15分钟后，蒸发二氯甲烷，并用乙酸乙酯吸收残留物。接连用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸溶液和饱和NaCI溶液洗涤有机相，然后在无水Na2SO4上干燥并浓缩。在硅胶上层析分离(在98:2乙酸乙酯/甲醇中)，获得1.14g(90％)的Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe。 
用45ml无水甲醇吸收后一种产物(0.64mmoles；0.93g)，在3小时30分钟的时间内，硼氢化钠(25.5mmoles；0.96g)分成小份以15分钟的间隔添加。在4小时，将反应混合物冷却到0℃，通过添加10％柠檬酸水解并浓缩。用乙酸乙酯吸收残留物。用10％柠檬酸溶液和饱和NaCI溶液洗涤有机相，然后在无水Na2SO4上干燥并浓缩。在硅胶上层析分离(在95:5乙酸乙酯/甲醇中)后，获得0.63g(81％)的 
Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH。 
ES/MS：m/z：1434.9[M+H+］，717.9[M+2H+] 
合成H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH：
将甲磺酸(3.18mmoles；2.060ml)添加到溶于42.5ml甲醇的Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-AbU-NMe-CH2-CH2-OH(0.425mmoles；610mg)溶液中，并将混合物加热并保持在50℃。通过HPLC和质谱法监测反应进程。在80小时后，将混合物冷却到0℃，并通过添加1M NaHCO3水解。除去甲醇，并用乙酸乙酯吸收残留物。用1M NaHCO3和饱和NaCI溶液依次洗涤有机相，在无水Na2SO4上干燥并浓缩。产物(557mg)H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-O-CH2-CH2-NHMe用于下一步反应，无需纯化。 
在惰性气氛下，将产物(0.42mmoles；557mg)溶解在20ml甲醇中并与溶于1.26ml甲醇的甲醇钠(1.26mmoles)溶液混合。在室温18小时后，将反应混合物冷却到0℃，并逐滴添加溶于5ml水中的氢氧化钠(4.2mmoles；168mg)。在室温21小时后，将反应混合物再冷却到0℃并用1M KHSO4中和。除去甲醇，并将残留物溶解在乙酸乙酯中。用半饱和NaCI溶液洗涤有机相，在无水Na2SO4上干燥并浓缩。产物(335mg；64％)H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH用于下一步反应，无需纯化。 
HPLC tr＝26.27mn(86％) 
ES/MS：m/z：1235.5[M+H+]，618.2[M+2H+] 
合成[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA： 
在惰性气氛下，将溶于50ml二氯甲烷的H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH(0.162mmoles；200mg)和均三甲基吡啶(sym.collidine)(1.78mmoles；0.24ml)溶逐滴添加到溶于3.2升二氯甲烷的(7-氮杂苯并***-1-基羟基)三吡咯烷鏻六氟代磷酸酯(PyAOP，0.486mmoles；254mg)溶液中。72小时后，通过添加10％Na2CO3溶液水解反应混合物。蒸发二氯甲烷，并用乙 酸乙酯吸收残留物。有机相依次用0.1N HCI溶液和NaCI饱和溶液洗涤，在无水Na2SO4上干燥并浓缩。在硅胶上纯化粗制品，获得110mg(59％)[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA。 
HPLC tr＝30.54mn(100％) 
ES/MS：m/z：1217.6[M+H+]，609.3[M+2H+] 
实施例2：本发明环孢菌素的口服配方 
数量表示为％w/w. 
  
实例A：  
本发明的环孢菌素 10
Glycofurol75 35.95
Miglycol812 18
Cremophor RH40 35.95
α-生育酚 0.1
  
实例B：  
本发明的环孢菌素 10
四甘醇 2
Captex800 2
Nikkol HCO-40 85.9
丁基羟甲苯(BHT) 0.1
   
实例C：  
本发明的环孢菌素 10
Glycofurol75 39.95
Miglycol812 14
Cremophor RH40 36
丁基羟基茴香醚(BHA) 0.05-0.1
  
实例D：  
本发明的环孢菌素 10
四甘醇 10
Myritol 5
Cremophor RH40 74.9
α-生育酚 0.1
  
实例E：  
本发明的环孢菌素 10
乙醇 9
丙二醇 8
Cremophor RH40 41
甘油单亚油酸酯(Glycerol monolinoleate) 32
配方A-D的个别成分和制备方法参见英国专利申请第2,222,770号。

Claims (4)

1.[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA在制备供治疗患者HCV感染或预防HCV复发之用的药物中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于同时给予或分别给予所述[D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA和至少另一种抗HCV的抗病毒药品活性成分，所述抗HCV的抗病毒药品活性成分选自利巴韦林或干扰素α。
3.根据权利要求1的应用，其中所述治疗患者HCV感染或预防HCV复发之用的药物进一步包含至少一种抗HCV的抗病毒药品活性成分，所述抗HCV的抗病毒药品活性成分选自利巴韦林或干扰素α。
4.根据权利要求1-3之一的应用，其中所述治疗患者HCV感染或预防HCV复发之用的药物进一步包含药学上可接受的载体和任选的稀释剂。
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