CN101056647A - 肠血管活性多肽药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了涉及肠血管活性多肽的药物组合物和治疗包括糖尿病、胰岛素抵抗、代谢性酸中毒和肥胖症在内的代谢紊乱的方法。也公开了使用肠血管活性多肽组合物的方法。

Description

肠血管活性多肽药物
发明领域
本发明涉及多肽类似物及其合成和用途。更具体而言，本发明涉及与肠血管活性多肽有关的合成多肽类似物，及其药物组合物。
背景技术
当消化道中存在食物时，肠中的细胞分泌激素信号(“ 肠降血糖素”)，使胰腺对葡萄糖的存在敏感，并且导致增强的葡萄糖依赖性胰岛素分泌反应。对于肠降血糖素信号、胰高血糖素样肽1(GLP1)和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)，见到这种提供葡萄糖依赖性胰岛素释放的协同反应(Kieffer TJ和Habener，JR(1999)Endocr.Rev.20，876-913)。这些肠降血糖素信号一般在体内表现为短作用时间，GLP1表现大约1-2分钟的t1/2(Knudsen，LB 2004，J.Med.Chem.47，4128-34)。GLP1和GIP被氨肽酶、二肽酰肽酶IV(DPPIV)切割，因此在医药制剂中通常不使用自然存在的天然激素。在毒蜥(GilaMonster)唾液中发现的一种肽(毒蜥外泌肽4(exendin 4)，Exenatide；Amylin Pharmaceuticals，San Diego，California)显示与GLP1受体结合，并且表现出强激动活性，从而引起期望的葡萄糖依赖性胰岛素分泌反应(Nielsen LL，Young，AA，Parkes，DG(2004)Regul.Peptides，117，77-88)。曾经给需要治疗的2型糖尿病患者施用了Exenatide和GLP1的类似物。
垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是一种神经调节肽，它刺激PAC1、VPAC1和VPAC2受体，是从胰腺中的神经末梢上释放的。该普通类别的受体存在于包括胰腺在内的体内多种组织内。在胰腺中，VPAC2受体的刺激显示响应血糖水平升高提供增强的葡萄糖依赖性胰岛素释放，这类似于GLP1或exenatide(Tsutsumi，M.等人(2002)Diabetes 51，1453-60)。因此，这种刺激(来自于PACAP或VPAC激动类似物)可以在刺激葡萄糖依赖性胰岛素释放中与肠降血糖素样信号协同或作为其替代，因为第二类受体的激活导致增强的胰岛素分泌的类似的分布。这种作用将有利于包括2型糖尿病(T2DM)、代谢性酸中毒、胰岛素抵抗和肥胖症在内的代谢紊乱的治疗。然而，自然存在的PACAP及其类似物的天然序列在体内的存在期一般也较短。
合成毒蜥外泌肽-4是作用期较短的肽，因此医学上需要能够调节葡萄糖依赖性胰岛素分泌的长效的肽。
发明概述
本发明提供PACAP和肠血管活性多肽(VIP)的合成多肽类似物及其盐，其中C末端包含形成两亲性α螺旋的氨基酸残基，所述残基选自亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)，排列顺序为：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa
其中n＝1-5。在一个实施方案中，n＝1或2。
在本发明的PACAP和VIP多肽类似物中引入的修饰有利于延长激活PACAP和VIP家族受体，优选VPAC2受体的治疗剂的作用持续时间。不局限于任何特定理论，认为作用持续时间的延长可能是由于C末端区域中的两亲性螺旋与体内细胞膜的磷脂相互作用的能力，从而具有“贮库(depoting)”作用。因此，本发明的肽类似物与细胞膜结合，然后缓慢再释放到细胞质中，在远处发挥其作用。相反，如果细胞质中不含诸如PACAP、VIP或GLP1的肽，则它被蛋白酶快速作用或通过肾小球过滤而被清除。
因此，本发明的一个方面提供PACAP、VIP的类似物和其生理学活性的截短类似物和同系物，或其盐，其中C末端包含形成两亲性α-螺旋的氨基酸残基，所述残基的序列选自具有稳定所述α-螺旋的能力的天然氨基酸或选择的非天然氨基酸。
还提供了用于递送有效葡萄糖依赖性胰岛素释放量的PACAP、VIP的多肽类似物和其生理学活性的截短类似物和同系物或其盐的药物组合物，其中C末端包含形成两亲性α-螺旋的氨基酸残基，所述残基选自排列顺序如下的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa；
其中n＝1-5。
本发明进一步提供治疗以高血糖为特征的哺乳动物疾病的方法，该方法包括给需要的哺乳动物施用有效葡萄糖依赖性胰岛素释放量的PACAP、VIP的多肽类似物和其生理学活性的截短类似物和同系物，或其盐，其中C末端包含形成两亲性α-螺旋的氨基酸，所述残基选自排列顺序如下的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa；
其中n＝1-5。
本发明也包括用于固相合成PACAP、VIP的多肽类似物和其生理学活性的截短类似物和同系物或其盐的方法，其中C末端包含形成两亲性α-螺旋的氨基酸残基，所述残基选自排列顺序如下的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa；
其中n＝1-5。
此处所述用于制备多肽类似物的方法包括将受到保护的氨基酸连续偶联到适当的树脂支持物上，除去侧链和Nα保护基，并且从树脂上切下多肽。
本发明还提供用于重组合成PACAP、VIP的多肽类似物和其生理学活性的截短类似物和同系物或其盐的DNA序列、载体和质粒，其中C末端包含形成两亲性α-螺旋的氨基酸残基，所述残基选自排列顺序如下的亲水性氨基酸(Haa)和亲脂性氨基酸(Laa)：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa；
其中n＝1-5。
另外，本发明还提供用于预防和治疗包括糖尿病、胰岛素抵抗、高血糖症、代谢性酸中毒和肥胖症在内的表现为血糖水平升高的多种代谢紊乱的药物组合物和方法，包括有效量的本发明的多肽，或其盐，和药学可接受的载体。在本发明的其它方面，治疗有效量的代谢紊乱化合物，包括胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽，毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂，可以与本发明的多肽联合施用。
附图简述
图1A、1B和1C是本发明的示例性多肽类似物的列表。使用氨基酸单字母缩写的标准命名。字母“X”是指具有C10-C3000链的聚乙二醇链。术语“酰基”是指C2-C16酰基链。字母“Z”是指在ε位具有长酰基链的赖氨酸。术语“hex”是指己酰基。术语“pen”是指戊酰基。术语“lau”是指月桂酰基。术语“myr”是指肉豆蔻酰基。术语“ste”是指硬脂酰基。术语“pr”是指丙酰基。
图2列出了其他多肽和多肽类似物。
发明详述
缩写和定义
各种常用核苷酸碱基和氨基酸的单字母和三字母缩写按照PureAppl.Chem.31，639-645(1972)和40，277-290(1974)的建议，并符合37CFR.sctn.1.822(55 FR 18245，May 1，1990)。除非另外指出为D-或DL，缩写表示L-氨基酸。某些天然和非天然的氨基酸是无手性的，例如，甘氨酸。所有肽序列都以左侧为N末端氨基酸，右侧为C末端氨基酸的形式表示。
“亲水性氨基酸(Haa)”是指除了肽键形成所需的官能团外还具有至少一个亲水性官能团的氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸及其同系物。
“亲脂性氨基酸(Laa)”是指不带电荷的、脂族的或芳族的氨基酸，如异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其同系物。
在本发明中，丙氨酸被归类为“两亲性氨基酸”，即能够作为亲水性或亲脂性氨基酸起作用。
“PACAP或VIP的同系物”是指在基本类似于PACAP或VIP天然序列的序列中含有氨基酸的多肽，如具有至少50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的氨基酸序列同一性。这里所述的同系物相对于PACAP或VIP的天然序列可包括氨基酸置换、缺失和/或***。同系物的例子包括与PACAP或VIP的天然序列相同或基本类似的至少5、10、15、20、25、30或35个连续氨基酸。
“PACAP或VIP的类似物”是指一种多肽，其含有：(i)PACAP、VIP和/或PACAP或VIP的同系物；和(ii)至少一个在自然存在的天然PACAP和/或VIP中不存在的官能团。例如，类似物可以任选地包含氨基酸侧链内的或多肽的氨基端或羧基端处的官能团。官能团的例子包括烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤代-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-，硼酸盐(borate)、硼化物(boronate)、磷酸基、膦酰基、杂环、烯酮(enone)、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等，或它们的任意组合。其它可以引入的示例性的官能团包括但不限于含有可光敏化交联剂的氨基酸、自旋标记的(spin-labeled)氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光束缚的(photocaged)和/或可光致异构化的氨基酸、含有生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸如糖取代的丝氨酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、含酮氨基酸、含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可切割的和/或光可切割的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的侧链的氨基酸(例如具有聚醚或长链烃，例如多于大约5个或多于大约10个碳)、碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸、和含有一个或多个毒性部分的氨基酸。
此处提供的类似物可以包括基于天然氨基酸的非天然氨基酸，如酪氨酸类似物，包括对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中取代的酪氨酸含有乙酰基、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基等。谷氨酰胺类似物包括但不限于α-羟基衍生物、β-取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸类似物的例子包括但不限于间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包括羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、乙酰基等。具体例子包括但不限于O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc-β-丝氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷丝氨酸、膦丝氨酸、膦酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、和异丙基-L-苯丙氨酸，等等。
通常，任选地设计或选择类似物，以改变多肽的生物学性质，如调节毒性、生物分布、溶解性、稳定性，例如热、水解、氧化、对酶降解的抗性等，纯化和处理的容易程度、结构特性、分光性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其他分子反应(例如共价或非共价反应)的能力，等。
“PACAP或VIP的生理学活性的截短同系物或类似物”是指其序列包含少于PACAP或VIP中所见氨基酸的全部互补序列，但是引发类似的生理学反应的多肽。这里提供的代表性的截短同系物和/或类似物至少包括在PACAP或VIP的天然序列中所见的5、10、15、20、25、30或35个连续氨基酸。截短的PACAP或VIP不需要与PACAP或VIP完全同源就能引发类似的生理学反应。PACAP或VIP是优选的，但不是排他性的，是该类的代表。
“PEG”是指聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。在一个实施方案中，PEG包含C10-C3000链。在另一个实施方案中，PEG的分子量大于40kD。PEG在本领域中众所周知，例如在美国专利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337中描述。
“ 两亲性α-螺旋”是指某些多肽呈现的二级结构，其中氨基酸采取α-螺旋构型，具有沿螺旋的长轴定向的相对的极性面和非极性面。通过构建适当斜度的″Schiffer-Edmundson轮″(M.Schiffer和A.B.Edmundson，Biophys.J.7，121(1967)，在此引用作为参考)，并且注意限定螺旋的圆柱形相对面上亲水性和亲脂性残基的隔离，一定程度地研究了目标多肽中α-螺旋结构的可能性。可选择地，可以获得实验证据，如圆二色性或x-射线衍射数据，表明特定多肽中α-螺旋区的存在。一种理想的α-螺旋每圈具有3.6个氨基酸残基，其相邻的侧链分开100°弧度。
多肽
在实施方案中，此处提供的多肽包含PACAP和/或VIP的截短的部分，其具有PACAP或VIP的天然序列的至少5、10、15、20、25、30或35个连续氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽与PACAP或VIP的天然序列具有至少50、60、70、80、85、90、95或99％的氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含PACAP和/或VIP的至少5、10、15、20、25、30或35个连续氨基酸，与PACAP或VIP的天然序列具有至少50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的氨基酸序列同一性。
这里提供的多肽任选地包含调节VPAC2选择性的修饰、官能团和/或氨基酸置换。示例性的修饰、官能化和/或置换包括但不限于Gourlet等人(Peptides 18，403-8；Xia M等人(1997)和J.Pharmacol.Exp.Ther.281：629-33(1997)报道的C-末端阳离子延伸和/或突变；这两篇文献的内容在此引用作为参考)。
任选地可以向本发明的多肽中引入在氨基端或羧基端的修饰。例如，本发明的多肽，如VIP类似物，可以用长链脂肪酸在N末端酰化，生成表现低效力、部分激动剂和拮抗剂活性的多肽(Gourlet等人，Eur.J.Pharmacol.354：105-111(1998)，其内容在此引用作为参考)。本发明多肽，如VIP类似物的其他示例性的修饰包括使用己酸酰化，生成显现出对VPAC2选择性提高的多肽(Langer等人，Peptides 25：275-8(2004)，其内容在此引用作为参考)。因此，该酰化的长度和定位可以改变效力，并且能够导致效力的丧失(拮抗)或激动类似物。与这种不可预测性相反，设计和检测这里提供的多肽获得期望的效力和活性。
任选地可以在本发明多肽的至少一个氨基酸的侧链内引入修饰，以提高作用持续时间和/或效力。例如，本发明的多肽任选地可以在侧链中包含至少一个酰化为官能性的氨基酸(即R基团)。代表性的修饰包括反应性侧链(如Lys)在多肽内各个位点的脂肪酸酰化。Kurtzhals等人已经报道了类似的修饰，其中胰岛素在LysB29的酰化产生地特胰岛素(insulin detemir)(Kurtzhals等人.，Biochem J.312，725-31(1995)，Kurtzhals，P.，Int.J.Obesity 28：Suppl 2，S23-8(2004))。类似地，使用长链脂肪酸通过连接体分子酰化产生有效且长效的GLP1类似物(Knudsen LB等人(2000).J.Med.Chem.43，1664-69)，但是这种酰化可能导致活性的丧失或强激动剂，这取决于酰基链的长度和定位。与引入长链脂肪酸的不可预测的效果相反，这里所述的多肽已经设计为引入最佳数目、长度和定位的酰基链，以获得期望的活性。
任选地可以引入本发明多肽中(例如多肽链内或N或C末端)来延长作用时间的另一种类型的修饰是PEG化或引入长链聚乙二醇聚合物(PEG)。PEG或长链PEG聚合物的引入提高了本发明多肽的有效分子量，从而阻止了向尿中的快速过滤。引入PEG或长链PEG聚合物的方法在本领域中众所周知，例如在Greenwald等人，Adv.Drug Del.Rev.55：217-250(2003)中描述，其内容在此引入作为参考。
最近报道的一种通过加入非天然氨基酸引入PEG或PEG聚合物的替代方法可以用本发明的多肽进行。该方法采用设计的tRNA/tRNA合成酶对，在表达质粒中由琥珀抑制密码子编码(Deiters，A等人.(2004).Bio-org.Med.Chem.Lett.14，5743-5)。例如，对-叠氮基苯丙氨酸可以加入本发明的多肽中，然后在存在还原剂和铜离子的条件下与具有乙炔部分的PEG聚合物反应，以促进被称为“Huisgen[3+2]环加成作用”的有机反应。
两亲性螺旋
本发明的多肽包含对应于以下通式的两亲性α-螺旋：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa
其中n、Haa和Laa如以上定义，Haa选自亲水性氨基酸，Laa选自亲脂性氨基酸。不被任何特定理论所限制，认为C末端区域中的两亲性螺旋通过与体内细胞膜的磷脂相互作用而使本发明多肽的作用持续时间延长，从而具有“贮库”作用。本发明的多肽包含是两亲性α螺旋，而不仅仅是优化的α螺旋的肽区。不希望被任何特定理论所限制，认为两亲性α螺旋有利于提高与细胞膜的相互作用，并且帮助C末端脂肪酰基链修饰对于膜相互作用的正确放置。
Eisenberg等人的研究将疏水性等级与螺旋轮组合，以量化两亲性螺旋的概念(Nature 299：371-374(1982)和Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81：140-144(1984)；其公开内容在此引用作为参考)。平均疏水性力矩(hydrophobic moment)被定义为构成螺旋的成分氨基酸的疏水性的矢量和。以下氨基酸的疏水性是Eisenberg等人报道为“一致”等级的那些：Ile 0.73；Phe 0.61；Val 0.54；Leu 0.53；Trp 0.37；Met 0.26 Ala 0.25；Gly 0.16；Cys 0.04；Tyr 0.02；Pro-0.07；Tlir-0.18；Ser-0.26；His-0.40；Glu-0.62；Asn-0.64；Gln-0.69；Asp-0.72；Lys-1.10；Arg-1.76。
每圈有3.6个残基(或侧链之间100°弧度(＝36073.6))的理想α-螺旋的疏水性力矩，μH，可以由以下公式计算：
μH＝[(∑HNsineδ(N-1)2+(∑HNcosδ(N-1))2]1/2
其中HN是第N个氨基酸的疏水性值，对周期性为δ＝100°的序列中的N个氨基酸求和。疏水性力矩可以表示为每个残基的平均疏水性力矩，将μH除以N，得到<μH>。在100°±20°时<μH>的值为大约0.20或更高提示两亲性螺旋形成。
Cornett等人的研究通过引入“两亲性指数”作为两亲性的预测手段进一步扩展了对两亲性α-螺旋的研究(J.Mol.Biol.，195：659-685(1987)；其公开内容在此引用作为参考)。他们的结论是所有已知的α-螺旋中有大约一半是两亲性的，优势频率(dominant frequency)为97.5°，而不是100°。每圈的残基数更接近3.7，而不是3.6。Eisenberg等人的基本方法足以将给定的序列归类为两亲性的，特别是当从头开始设计形成两亲性α-螺旋的序列时。
取代的两亲性α-螺旋氨基酸序列可能缺乏与天然存在的多肽的特定片段序列的同源性，但是在生理环境中产生类似的二级结构，即具有相对的极性和非极性面的α-螺旋。将天然存在的氨基酸序列置换为可替代的序列可能有利地影响改变的亲本多肽的生理学活性、稳定性或其它性质。描述这些序列的设计和选择的报道的例子在J.L.Krstenansky等人，FEBS Letters 242：2，409-413(1989)，和J.P.Segrest等人Proteins：Structure，Function，and Genetics 8：103-117(1990)中提供。
本发明的多肽包含对应于以下通式的两亲性α-螺旋：
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa
其中如上定义的，Haa选自亲水性氨基酸，Laa选自亲脂性氨基酸。在采取理想的α-螺旋的一个实施方案中，n＝2，残基1、4、5、8和9在彼此大约140°弧度内沿螺旋的一个面(A)分布，而残基2、3、6、7和10占据螺旋另一个面(B)的相对的140°弧度。在一个实施方案中，一个面上的所有残基为相同极性，而另一面上的所有残基为相反的极性，即如果A面全为亲水性的，则B面全为亲脂性的，反之亦然。本领域技术人员应当知道尽管本发明的螺旋被描述为
Haa(Laa Laa Haa Haa)n Laa，
但是相反的序列
Laa(Haa Haa Laa Laa)n Haa
也将满足残基分布标准，并且是本发明的螺旋的等同描述。
丙氨酸可以替代亲水性或亲脂性氨基酸，因为Ala可以容易地位于两亲性α-螺旋的任一面上，尽管Ala-10不形成两亲性α-螺旋。通常不使用脯氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；但是可以容忍它们在序列中的存在和其它随机错误，例如亲脂性面上的亲水性残基，只要该片段中的其余氨基酸基本符合亲水性面—亲脂性面分区。用于确定一个序列的两亲性是否足以成为本发明的序列的一种方便的方法是计算如上定义的平均疏水性力矩。如果在100°±20°时每个残基的峰平均力矩超过大约0.20，则该序列将形成两亲性螺旋，并且是本发明的序列。
在将该概念应用于PACAP和VIP时，假定任一个区或两个区(N-末端或C-末端)，优选C-末端，可以呈现α-螺旋二级结构，并且能够被具有类似结构趋势的非同源序列替代，而不丧失生物活性或免疫反应的诱导。
药物制剂
本发明的多肽可以以导致有益疗效的任意量施用。在一个优选实施方案中，本发明的化合物在治疗血糖水平升高、高血糖症、包括2型糖尿病在内的糖尿病、胰岛素抵抗、代谢性酸中毒和肥胖症中有用。在一个实施方案中，此处所述的化合物在胰岛素和/或葡萄糖水平的调节上具有有益的活性。在一个实施方案中，本发明的多肽以高于或低于调节胰岛素和/或葡萄糖分泌的其他治疗形式的浓度给患者施用。在另一个实施方案中，本发明的多肽与其他化合物一起施用，产生协同疗效，例如，本发明的多肽可以与毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物一起施用。
实施例
实施例1：合成类似物
图1中示出的一些示例性的合成多肽类似物来源于VPAC2 selUldB(见图1)。图1中示出的其他示例性合成多肽类似物是VIP的截短的同系物(见图1)。
在一个方面，本发明的多肽是VIP的生理活性截短同系物的类似物，如图1所示的TP 1至TP 6。类似物TP 1至TP 6具有含有C12-C24，优选C16-C24的长酰基残基。图1所示的类似物TP 7至TP 12在N末端上具有含有C2-C16，优选C6的酰基残基。图2所示的类似物SQNM 10-12(对应于SEQ ID NO：40-42)在C或N末端不含酰基化。
这里提供的其他代表性多肽类似物具有对应于通式(I)的氨基酸序列：
酰基-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-长酰基)-X
                        通式(I)
其中：
n＝1-3；
Haa是亲水性氨基酸；
Laa是亲脂性氨基酸；
酰基是C2-16酰基链；
长酰基是C12-24酰基链；
X是OH或NHR1，其中R1是H或低级烷基、卤代烷基或PEG；
aa1是Gly或Ala；
aa2是Val、Ile或Leu；
aa3是Asp或Arg；
aa4是Ser或Asn；
aa5是Ser或Thr；
aa6是Leu或Tyr；
aa7是Met、Leu或Val；
aa8是Ala或Val；
aa9是Asn、Gln或Ala；
aa10是Trp、Ala或Ser；
aa11是Ile或Val；
aa12是Leu或Lys；
aa13是Lys、Arg、Asn或Gly；
aa14是Ala或Gly；
aa15是Lys或Arg；且
aa16是Lys或Arg。
在一个优选实施方案中，酰基是C2-8酰基链，长酰基是C12-24酰基链。
这里提供的其他代表性多肽类似物具有对应于通式(II)的氨基酸序列：
酰基-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-aa17-Pro-Pro-Pro-Lys(ε-长酰基)-X
                            通式(II)
其中：
n＝1-3；
Haa是亲水性氨基酸；
Laa是亲脂性氨基酸；
酰基是C2-16酰基链；
长酰基是C12-24酰基链；
X是OH或NHR1，其中R1是H或低级烷基、卤代烷基或PEG；
aa1是Gly或Ala；
aa2是Val、Ile或Leu；
aa3是Asp或Arg；
aa4是Ser或Asn；
aa5是Ser或Thr；
aa6是Leu或Tyr；
aa7是Met、Leu或Val；
aa8是Ala或Val；
aa9是Asn、Gln或Ala；
aa10是Trp、Ala或Ser；
aa11是Ile或Val；
aa12是Leu或Lys；
aa13是Lys、Arg、Asn或Gly；
aa14是Ala或Gly；
aa15是Lys或Arg；
aa16是Lys或Arg；且
aa17不存在或是Gln。
在一个优选实施方案中，酰基是C2-8酰基链，长酰基是C12-24酰基链。
这里提供的其他代表性多肽类似物具有对应于通式(III)的氨基酸序列：
酰基-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-长酰基)-PEG
                                通式(III)
其中：
n＝1-3；
Haa是亲水性氨基酸；
Laa是亲脂性氨基酸；
酰基是C2-16酰基链；
长酰基是C12-24酰基链；
aa1是Gly或Ala；
aa2是Val、Ile或Leu；
aa3是Asp或Arg；
aa4是Ser或Asn；
aa5是Ser或Thr；
aa6是Leu或Tyr；
aa7是Met、Leu或Val；
aa8是Ala或Val；
aa9是Asn、Gln或Ala；
aa10是Trp、Ala或Ser；
aa11是Ile或Val；
aa12是Leu或Lys；
aa13是Lys、Arg、Asn或Gly；
aa14是Ala或Gly；
aa15是Lys或Arg；且
aa16是Lys或Arg。
在一个优选实施方案中，酰基是C2-8酰基链，长酰基是C12-24酰基链。
本领域技术人员应当知道，可以合成多肽类似物的大量变换形式，假如在100°±20°时每个残基具有大于约0.20的平均疏水性力矩的氨基酸序列被***C末端区的位置中，它们将具有此处所述多肽类似物的期望的特征。
实施例2：合成多肽的常用方法
本发明的多肽可以用如下所述的方法合成，J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，I11.(1984)和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，Vol.2，Academic Press，New York，(1973)的固相合成，和E.Schroder和K.Lubke，The Peptides，Vol.1，Academic Press，New York，(1965)的溶液合成，和Houben-Weyl，Synthesis of Peptides and Peptidomimetics.4th ed.Vol E22；M.Goodman，A.Felix，L.Moroder，C.Toniolo，Eds.，Thieme：New York，2004的通用合成技术。上述论文的内容在此引用作为参考。
通常，这些方法涉及向延长的肽链上连续加入受保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基和任何反应性侧链基团受到保护。这种受到保护的氨基酸然后连接到惰性固体支持物上，或者在溶液中使用，并且在适合形成酰胺键的条件下加入也适当地受到保护的序列中的下一个氨基酸。在所有需要的氨基酸已经以正确顺序连接后，除去保护基和任何固体支持物，得到粗多肽。将多肽脱盐并纯化，优选层析，产生终产物。
一种制备含有不到约40个氨基酸的生理活性截短多肽的类似物的优选方法包括固相肽合成。在该方法中，α-氨基(Nα)官能团和任何反应性侧链被酸或碱敏感的基团保护。保护基应当对肽键形成条件稳定，并且易于除去，而不影响已有的多肽链。合适的α-氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、邻-氯代苄氧羰基、联苯基异丙氧羰基、叔-戊氧羰基(Amoc)、异冰片基氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基-羰基、邻-硝基苯硫基、2-氰-叔-丁氧羰基、9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)等，优选叔丁氧羰基(Boc)。合适的侧链保护基包括但不限于：乙酰基、苄基(Bzl)、苄氧基甲基(Bom)、邻-溴苄氧羰基、叔丁基、叔丁基二甲基硅烷基、2-氯苄基(Cl-z)、2，6-二氯苄基、环己基、环戊基、异丙基、特戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、三甲基硅烷基和三苯甲基。
在固相合成中，C末端氨基酸首先连接到合适的树脂支持物上。合适的树脂支持物是对于分步缩合和脱保护反应的试剂和反应条件而言为惰性，并且在使用的介质中不可溶的那些材料。商业上可购到的树脂的例子包括用反应基修饰的苯乙烯/二乙烯基苯树脂，例如氯代甲基化共聚-(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟基甲基化共聚-(苯乙烯-二乙烯基苯)等。优选苄基化的、羟基甲基化的苯乙酰胺甲基(PAM)树脂。当化合物的C末端是酰胺时，一种优选的树脂是对甲基二苯甲基氨基-共-聚-(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂。
向PAM树脂上连接可以如下实现：通过在升高的温度下，例如约40°至60℃，优选约50℃下，使乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的Na保护的氨基酸，优选Boc-氨基酸，例如其铵、铯、三乙铵、1，5-二氮二环-[5.4.0]十一碳-5-烯、四甲基铵或类似的盐，优选在DMF中的铯盐，与树脂反应约12-72小时，优选约48小时。
可以通过，例如，在约10°到50℃，优选25℃的温度下，在诸如二氯甲烷或二甲基甲酰胺，优选二氯甲烷的溶剂中，N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基苯并***(HOBt)介导地偶联约2小时到约24小时，优选约2小时，将Nα-Boc-氨基酸连接到二苯甲基胺树脂上。
受保护的氨基酸的连续偶联可以用本领域众所周知的方法进行，典型地使用自动肽合成仪。用三乙胺或类似的碱中和后，优选加入约1.5-2.5倍摩尔过量的每种受保护的氨基酸，在诸如二氯甲烷、DMF或其混合物的惰性非水极性溶剂中，优选在二氯甲烷中，在室温下进行偶联。代表性偶联剂是N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基-碳二亚胺(DIC)或其他碳二亚胺，其单独或在存在1-羟基苯并***(HOBt)、O-酰基脲、苯并***-1-基-氧代三(吡咯基)磷六氟磷酸盐(PyBop)、N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基亚胺或肟的条件下使用。可选择地，可以使用受保护的氨基酸活性酯(例如对硝基苯酯、五氟苯酯等)或对称酐。
在固相合成结束时，从树脂上除去完全保护的肽。当与树脂支持物的连接是苄酯类型时，可以如下实现切割：对于具有烷基胺C末端的肽通过使用烷基胺或氟烷基胺的氨解作用，或者对于具有未取代的酰胺C末端的肽通过使用例如氨/甲醇或氨/乙醇的氨解作用，反应温度为约-10°至50℃，优选约25℃，反应时间为约12-24小时，优选约18小时。具有羟基C-末端的肽可以用HF或其他强酸性脱保护方案或通过皂化切下。可选择地，可以通过转酯作用，例如使用甲醇，然后氨解或皂化，从树脂上除去肽。受保护的肽可以通过硅胶层析纯化。
侧链保护基可以通过以下方法从肽上除去：在存在茴香醚或其他碳鎓离子清除剂的条件下，例如用无水液体氟化氢处理氨解产物，用氟化氢/吡啶复合物处理，用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸处理，用氢和碳载钯或聚乙烯吡咯烷酮还原，或用液氨中的钠还原，优选用液态氟化氢和茴香醚，反应温度为约-10°至+10℃，优选约0℃，反应时间为约15分钟至2小时，优选约1.5小时。
对于二苯甲胺树脂上的肽，树脂切割和脱保护步骤可以使用如上所述的液态氟化氢和茴香醚组合为一步。
溶液可以脱盐(例如使用BioRad AG-3.RTM阴离子交换树脂)，通过使用任意或全部以下类型的一系列层析步骤纯化肽：以乙酸盐形式在弱碱性树脂上离子交换；在未衍生化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，例如Amberlite.RTM.XAD上疏水性吸附层析；硅胶吸附层析；在羧甲基纤维素上离子交换层析；分配层析，例如在Sephadex.RTM.G-25上；逆流分配；或高效液相层析(HPLC)，特别是在辛基-或十八烷基硅烷基硅(ODS)键合相柱填充物上反相HPLC。
因此，本发明的另一方面涉及制备多肽及其药学可接受的盐的方法，该方法包括在适合的树脂支持物上连续缩合受保护的氨基酸，除去保护基和树脂支持物，并纯化产物，获得PACAP和VIP(优选如上定义的其中C末端氨基酸形成两亲性α-螺旋肽序列的PACAP和VIP)的生理活性截短同系物和类似物的类似物。
实施例3：代表性多肽类似物的示例性合成和纯化方案
使用以下所述的合成和纯化方法制备对应于SEQ ID NO：1的代表性多肽类似物。
戊酰基-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Val-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Trp-Ile-Lys-Lys-Ala-Lys-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys(ε硬脂酰基)-NH2(SEQ IDNO：1)
通常，利用Fmoc化学方法在Fmoc-Rink-酰胺-PEG树脂上合成肽。用于氨基酸侧链官能团的保护基是：用于Glu、Tyr、Thr、Asp和Ser的叔丁基；用于Lys和Trp的Boc基团；用于Arg团的Pbf基团；用于Asn和His的Trt基团。N-αFmoc保护的氨基酸购自EMD Biosciences(SanDiego，CA)。用于偶联和切割的试剂购自Aldrich(St.Louis，MO)。溶剂购自Fisher Scientific(Fairlawn，NJ)。
通常，合成方案涉及通过重复除去Fmoc保护基和偶联被保护的氨基酸在树脂上装配肽链。为了合成，首先将Dde-Lys(Fmoc)-OH偶联到Rink酰胺树脂上。然后用20％哌啶的DMF溶液除去Fmoc保护基。使用HBTU、HOBt和NMM将硬脂酸偶联到Lys的侧链上。用2％肼的DMF溶液除去Dde基团，然后偶联Fmoc保护的氨基酸。使用HBTU和HOBt作为偶联试剂，使用NMM作为碱。除去最后一个Fmoc保护基后，用DIC(4当量)和HOBt(4当量)将戊酸(4当量)偶联到氨基端上。用混合物1处理肽树脂，用于切割和除去侧链保护基。从冷醚中沉淀粗肽，并通过过滤收集。
使用来自Waters(Milford，MA)的20mm×250mm柱通过RP-HPLC进行粗肽的纯化。使用TFA缓冲液纯化肽。使用在60分钟里从35％至55％乙腈的线性梯度。将合并的级分冻干。通过质谱分析和氨基酸分析证实肽的身份。肽的纯度通过分析HPLC柱(C18柱，4.6×250mm，Supelco(St.Louis，MO)生产)层析测定。
上述程序可以总结为以下的分步方案：
步骤1.树脂溶胀：Fmoc-Rink-酰胺-PEG树脂在DCM中溶胀30分钟(10ml/g树脂)
步骤2.脱保护：
a.将20％哌啶/DMF溶液(10ml/g树脂)加入树脂中；
b.将溶液搅拌30分钟(当所有树脂在反应容器中自由飘浮时开始计时)；和
c.排出溶液。
步骤3.洗涤：用DMF(10ml/g树脂)洗涤树脂5次。进行茚三酮试验，显示阳性。
步骤4.偶联：
a.称取Fmoc-AA-OH(3当量，相对于树脂载量计算)和HOBt(3当量，相对于树脂载量)加入塑料瓶中。
b.用DMF(5ml/g树脂)溶解固体。
c.将HBTU(3当量，相对于树脂)加入混合物中，然后加入NMM(6当量，相对于树脂)。
d.将混合物加入树脂中。
e.将混合物轻轻鼓泡(或搅拌)10-60分钟，直到用小样品树脂获得阴性茚三酮试验。
步骤5.洗涤：用DMF洗涤树脂3次。
步骤6.重复步骤2-5，直到肽装配。
步骤7.N-末端Fmoc脱保护：重复步骤2。
步骤8.洗涤和干燥：
a.在最后一次偶联后，用DMF洗涤树脂3次，用MeOH洗一次，用DCM洗三次，用MeOH洗三次。
b.树脂在真空下(例如吸水泵)干燥2小时，在高真空(油泵)下干燥最少12小时。
步骤9.切割：
a.将干燥树脂置于塑料瓶中，加入切割混合物。在室温下振荡混合物2.5小时。
b.通过减压过滤除去树脂。树脂用TFA洗两次。合并过滤物，加入8-10倍体积的冷醚，获得沉淀物。
c.通过过滤分离粗肽，然后用冷醚洗涤两次。
在上述合成方案中使用如下化学试剂和溶剂：NMM(N-甲基吗啉)；HBTU(2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯)；HOBt(1-羟基苯并***)；DMF(二甲基甲酰胺)；DCM(二氯甲烷)；甲醇；二***；哌啶；Tis(三异丙基硅烷)；茴香硫醚；苯酚；EDT(1，2-乙二硫醇)；三氟乙酸混合物1：TFA/茴香硫醚/苯酚/H2O/EDT(87.5/5/2.5/2.5/2.5v/v/)；TFA缓冲液：A(0.1％TFA水溶液)；和TFA缓冲液B(0.1％TFA的乙腈溶液)。
其他代表性多肽类似物用类似于以上的方法制备。以下表1中列出了本发明的示例性多肽类似物的化学性质。
表1.示例性多肽类似物的性质
  类似物的名称  氨基酸序列   基于RP-HPLC色谱图的纯度     基于电喷射质谱分析的分子量
  TP-103  SEQ ID NO：2   96.9％     5267.2a.m.u
  TP-104  SEQ ID NO：3   95.5％     4756.7a.m.u
  TP-105  SEQ ID NO：4   96.1％     5183.3a.m.u
  TP-106  SEQ ID NO：5   95.2％     4784.8a.m.u
  TP-107  SEQ ID NO：6   99.6％     4955.1a.m.u
  TP-108  SEQ ID NO：7   91.5％     5172.4a.m.u
实施例4：多肽的重组合成
可选择地，可以通过克隆和表达编码所需多肽的基因制备本发明的多肽。在该方法中，制备含有所需要的DNA序列的质粒，并将其***适当的宿主微生物中，典型地是细菌，如大肠杆菌，或酵母，如酿酒酵母，包括宿主微生物，以生产多个拷贝的质粒，以及编码本发明的多肽类似物的cDNA。
首先，设计编码选择的PACAP或VIP类似物的合成基因，使其具有适宜的限制酶切位点，以利于随后的改变。可以利用Mullis在美国专利Nos.4,683,195和4,683,202中教导的聚合酶链反应(PCR)来扩增序列，在此引用作为参考。
可以分离扩增的合成基因，并连接到合适的质粒如Trp LE质粒中，可以向该质粒中串联***4个拷贝的基因。Trp LE质粒的制备在美国专利No.4,738,921和欧洲专利公开No.0212532中描述，在此引用作为参考。Trp LE质粒通常比Trp E质粒产生多8-10倍的蛋白质。然后可以在诸如大肠杆菌或酿酒酵母等合适的宿主中表达多拷贝基因。
在本发明中可以使用Trp LE 18 Prot(He3，Pro5)作为表达载体。TrpLE 18Prot(He3，Pro5)含有以下元件：含有氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起点的pBR322片段(EcoRI-BamHI)；含有trp启动子和trpE基因的EcoRI-SacII片段；HIV蛋白酶(He3，Pro5)基因片段(SacII-HindIII)；bGRF基因片段(HindIII-BamHI)；和来自大肠杆菌rpoc基因的转录终止子。HIV蛋白酶和bGRF基因片段不是关键性的，如果需要可以替换为其他编码序列。
表达的多聚体融合蛋白然后在细胞内积累为稳定的包涵体，可以通过离心与其余的细胞蛋白质分离。分离的融合蛋白转化为单体PACAP或VIP类似物，并且可以通过阳离子交换和/或反相HPLC进行纯化。
克隆、扩增、表达和纯化的替代方法对于本领域技术人员是显而易见的。代表性的方法在Maniatis等人，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中公开，在此引用作为参考。
实施例5：使用胰岛细胞静置培养的体外生物测定
进行如下的示例性体外生物测定来评价代表性多肽类似物调节胰岛素分泌的能力。
胰岛分离。从体重约为250g并且通过腹膜内注射戊巴比妥钠(35mg/230g大鼠)麻醉的雄性Fisher大鼠中分离大鼠胰岛(Sweet IR等人(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.314，976-983)。通常通过向局部切开的胰脏的胰管内注射胶原酶(10mL的0.23mg/mL Liberase，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)并将其手术切除来制备胰岛。所有操作都经过华盛顿大学动物实验管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at the University ofWashington)的批准。
将胰置于含有5mL的0.23mg/mL Liberase的15mL锥形管中，在37℃孵育30分钟。然后将消化物通过400-微米不锈钢筛网过滤，用Hanks缓冲盐溶液漂洗，在Optiprep梯度溶液(Nycomed，Oslo，Norway)中纯化。胰岛在进行测定之前在补加了10％(v/v)热灭活胎牛血清(FBS)、抗生素-抗真菌剂(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B)、2mM谷氨酰胺(均来自Gibco-BRL，Grand Island，NY)和1mMβ巯基乙醇的RPMI 1640培养基中培养18-24小时。
生物测定。在显微镜下挑取胰岛，置于10ml 3mM Krebs Ringer缓冲液(KRB)中洗涤。将胰岛在3mM葡萄糖KRB中孵育60分钟，然后以每孔10个胰岛置于96孔板的200μl培养基中。将胰岛在对照或处理条件下孵育120分钟，收集上清液。典型的一组条件检测3mM葡萄糖(安静对照)，16mM葡萄糖(检测对照)，16mM葡萄糖+10nmGLP1，16mM葡萄糖+10nM毒蜥外泌肽-4，16mM葡萄糖+50nM测试肽。缓冲液条件是含有0.1％BSA，20mM HEPES的KRB，一式四份进行测定。使用商品胰岛素酶联免疫吸附(ELISA)测定根据厂商使用说明评价上清液的胰岛素含量。
生物测定的结果。表2列出了在上述测定中获得的类似物TP-106的胰岛素分泌，在该测定中TP-106在200nM的浓度时表现出最大活性。为了比较，在该测定中检测了毒蜥外泌肽4，其在10nM时显示最大活性。TP-106是高度疏水性的类似物，设计为在皮下注射部位贮存(depot)，因此TP-106的有效浓度预期大大低于标称浓度(200nM)。
表2.使用TP-106的胰岛细胞静置培养生物测定的结果
    分泌的胰岛素(ng/100个胰岛/min) 标准差
  3mM葡萄糖16mM葡萄糖毒蜥外泌肽4+16mM葡萄糖50nM TP-106+16mM葡萄糖200nM TP-106+16mM葡萄糖16mM葡萄糖+16mM葡萄糖     0.011.384.822.725.201.58     0.000.170.200.600.500.05
对其他示例性多肽类似物进行上述胰岛细胞静置培养测定。浓度为100nM的TP-107在该测定中表现出最大活性。作为对比，在该测定中检测了毒蜥外泌肽4，其在10nM时表现出最大活性。所示的肽设计为与血清白蛋白结合，因此，预期赋予胰岛素活性的游离肽的浓度相当低，因此该类似物比该体外测定中所示的更有效。
表3.使用TP-107和TP-108的胰岛细胞静置培养生物测定的结果
    分泌的平均胰岛素(ng/100个胰岛/min) 标准差
  3mM葡萄糖16mM葡萄糖10nM毒蜥外泌肽4+16mM葡萄糖10nM PACAP+16mM葡萄糖10nM TP-107+16mM葡萄糖100nM TP-107+16mM葡萄糖1μM TP-107+16mM葡萄糖100nM TP-108+16mM葡萄糖1μM TP-108+16mM葡萄糖     0.143.656.756.072.896.106.074.105.65     0.000.801.151.670.211.550.901.210.13
实施例6：体内生物测定
进行以下的示例性体内测定以评价代表性多肽类似物调节胰岛素分泌的能力。
检测的研究组。初次接受试验的8周大的雌性db/db小鼠适应一周，在此期间定期处理这些动物，使它们适应实验程序。研究组每组包括6只小鼠，通过腹膜内注射施用以下成分之一：
(1)载体对照；
(2)阳性对照(毒蜥外泌肽-4或其他标准治疗)；
(3)高剂量的多肽类似物；或
(4)低剂量的多肽类似物。
从尾尖部的切口取少量血液进行血液采样。用商品手持式葡萄糖计测定血糖水平。在第1天的早晨，给动物注射多肽类似物和对照物。在注射前以及注射后2、4、8、14、24小时采集血样并立即分析。在整个试验过程中随意喂养动物(Tsutsumi等人，Diabetes 51：1453-60(2002))。
表4列出了上述体内测定获得的数据的代表性采样。如下所示，高剂量的TP-106在注射后2小时表现出统计学显著性的活性(例如，血浆葡萄糖降低)，在给药后4小时保持活性。
表4.使用TP-103和TP-106的体内测定的结果
    平均血糖水平(mmol/L)
 0小时 2小时  4小时 8小时 14小时  24小时
    载体  23.9s.d.*＝1.33 21.9s.d.＝1.22  18.3s.d.＝1.01 27.3s.d.＝1.52 22.5s.d.＝1.25  23.5s.d.＝1.31
    TP-103低剂量  22.9s.d.＝1.27 20.5s.d.＝1.14  17.6s.d.＝0.98 26.4s.d.＝1.47 24.6s.d.＝1.37  21.4s.d.＝1.19
    TP-103高剂量  20.7s.d.＝1.15 17.3s.d.＝0.96  16.9s.d.＝0.94 23.4s.d.＝1.30 23.7s.d.＝1.31  25.0s.d.＝1.39
    TP-106低剂量  23.9s.d.＝1.33 20.5s.d.＝1.14  16.1s.d.＝0.89 24.0s.d.＝1.33 28.2s.d.＝1.57  23.2s.d.＝1.29
    TP-106高剂量  21.8s.d.＝1.21 13.4s.d.＝0.75  14.7s.d.＝0.82 25.1s.d.＝1.39 26.3s.d.＝1.46  21.2s.d.＝1.18
*s.d.＝标准差
实施例7：本发明的应用
本发明的多肽可用于预防和治疗多种代谢紊乱。具体而言，本发明的化合物用于预防和治疗血糖水平升高、高血糖症、包括2型糖尿病在内的糖尿病、胰岛素抵抗、代谢性酸中毒和肥胖症。
通常，本发明的多肽或其盐以每天约0.01至1μg/kg体重，优选每天约0.07至约0.2μg/kg体重的量施用。对于50kg的人类女性受试者，活性成分的每日剂量为约0.5至约50μg，优选约3.5至约10μg。对于其他哺乳动物，如马、狗和牛，可能需要较高的剂量。该剂量在常规药物组合物中可以根据需要通过一次施用、通过多次应用或通过控制释放来递送，以达到最有效的结果，优选每天注射一次或多次。
在另一个实施方案中，本发明的多肽可以与在治疗代谢紊乱中有用的其他化合物联合施用，例如，本发明的多肽可以与一种或多种在代谢紊乱的治疗中使用的如下化合物一起施用，这些化合物包括但不限于胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR，包括作用于PPAR受体α、β或γ亚型的试剂和/或作用于PPAR受体多种亚型的试剂)激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂，它们可以与本发明的多肽联合给药。
准确剂量和组合物和最合适的给药方式的选择尤其受到所选择的多肽的药理学性质、所治疗疾病的性质和严重程度、接受者的身体状态和精神敏度的影响。
代表性的给药方式包括口服、肠胃外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、直肠、口腔(包括舌下)、透皮和鼻内。
药学可接受的盐保留亲本多肽的需要的生物活性，而没有毒副作用。这些盐的实例包括：(a)由例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等无机酸形成的酸加成盐；和由例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、扑酸(pamoic acid)、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等有机酸形成的盐；(b)由诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等多价金属阳离子形成的碱加成盐；或由N，N ′-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如鞣酸锌盐等。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其含有本发明的多肽或其药学可接受的盐作为活性成分，与药学可接受的无毒性载体混合。如上所述，这种组合物可以制备用于肠胃外(皮下、肌肉内或静脉内)给药，特别是液体溶液或悬浮液的形式；用于口服或口腔给药，特别是片剂或胶囊的形式；用于鼻内给药，特别是粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式；用于直肠或透皮给药。
该组合物可以方便地以单位剂量形式给药，并且可以用药学领域众所周知的任何方法制备，例如，如Remington′s PharmaceuticalSciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，(1985)所述，其在此引用作为参考。用于肠胃外给药的制剂可以含有无菌水或盐水、烷撑二醇如丙二醇、聚烷撑二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等作为赋形剂。用于口服给药的制剂可以通过加入胆汁酸盐或酰基肉毒碱而增强。用于经鼻给药的制剂可以是固体，并且可以含有赋形剂，例如乳糖或葡聚糖，或者可以是以滴鼻剂或计量喷剂形式使用的水性或油性溶液。对于口腔给药，典型的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等。
当配制用于经鼻给药时，可以用表面活性酸增强通过鼻粘膜的吸收，所述酸例如甘氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、ethocholic acid、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、环糊精等，含量为约0.2至15重量％，优选约0.5至4重量％，最优选约2重量％。表现出较高效力而刺激性降低的另一类吸收增强剂是烷基麦芽苷类，如十四烷基麦芽苷(Arnold，JJ等人(2004).J Pharm.Sci.93，2205-13，和此处的参考文献，均引用作为参考)。
在延长的时间期限内，例如在一周到一年的期限内给受试者施用本发明的化合物，可以通过单次施用含有对于期望的释放期而言足够活性成分的控制释放***来实现。各种控制释放***，如整块(monolithic)或储库(reservoir)型微胶囊、储库型(Depot)植入物、渗透泵、囊泡、微团、脂质体、透皮帖剂、离子电渗装置和可替代的注射剂型，可以用于该目的。在期望递送活性成分的部位局部化是某些控制释放装置的另一个特征，这可以证明在某些疾病的治疗中是有益的。
控制释放制剂的一种形式含有在诸如共聚(乳/乙醇)酸等缓慢降解的无毒性非抗原性聚合物中分散或包封的多肽或其盐，如Kent，Lewis，Sanders和Tice在美国专利No.4,675,189中的先驱性工作所述，该专利在此引用作为参考。化合物或优选其相对不溶性盐，也可以配制在胆固醇或其他脂质基质沉淀物或硅塑料基质植入物中。其他的缓释、储库型植入物或注射制剂对于本领域技术人员是显而易见的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978，和R.W.Baker，Controlled Release of Biologically Active Agents，John Wiley & Sons，New York，1987，在此引用作为参考。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都在此引用作为参考，如同每一独立的出版物和专利申请具体且单独地引用作为参考。
尽管上面给出的实施例和讨论旨在说明本发明的代表性化合物的合成和检测，但是应当理解，它能够进一步修饰，并且不应理解为限制所附权利要求书的范围。
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Claims (19)

1.一种肠血管活性多肽，选自：
(a)对应于通式(I)的多肽：
酰基-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-长酰基)-X
                          通式(I)
其中：
n＝1-3；
Haa是亲水性氨基酸；
Laa是亲脂性氨基酸；
酰基是C2-16酰基链；
长酰基是C12-24酰基链；
X是OH或NHR1，其中R1是H或低级烷基、卤代烷基或PEG；
aa1是Gly或Ala；
aa2是Val、Ile或Leu；
aa3是Asp或Arg；
aa4是Ser或Asn；
aa5是Ser或Thr；
aa6是Leu或Tyr；
aa7是Met、Leu或Val；
aa8是Ala或Val；
aa9是Asn、Gln或Ala；
aa10是Trp、Ala或Ser；
aa11是Ile或Val；
aa12是Leu或Lys；
aa13是Lys、Arg、Asn或Gly；
aa14是Ala或Gly；
aa15是Lys或Arg；且
aa16是Lys或Arg；
(b)对应于通式(II)的多肽：
酰基-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-aa17-Pro-Pro-Pro-Lys(ε-长酰基)-X
                          通式(II)
其中：
n＝1-3；
Haa是亲水性氨基酸；
Laa是亲脂性氨基酸；
酰基是C2-16酰基链；
长酰基是C12-24酰基链；
X是OH或NHR1，其中R1是H或低级烷基、卤代烷基或PEG；
aa1是Gly或Ala；
aa2是Val、Ile或Leu；
aa3是Asp或Arg；
aa4是Ser或Asn；
aa5是Ser或Thr；
aa6是Leu或Tyr；
aa7是Met、Leu或Val；
aa8是Ala或Val；
aa9是Ash、Gln或Ala；
aa10是Trp、Ala或Ser；
aa11是Ile或Val；
aa12是Leu或Lys；
aa13是Lys、Arg、Asn或Gly；
aa14是Ala或Gly；
aa15是Lys或Arg；
aa16是Lys或Arg；且
aa17不存在或是Gln；
(c)对应于通式(III)的多肽：
酰基-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-长酰基)-PEG
                      通式(III)
其中：
n＝1-3；
Haa是亲水性氨基酸；
Laa是亲脂性氨基酸；
酰基是C2-16酰基链；
长酰基是C12-24酰基链；
aa1是Gly或Ala；
aa2是Val、Ile或Leu；
aa3是Asp或Arg；
aa4是Ser或Asn；
aa5是Ser或Thr；
aa6是Leu或Tyr；
aa7是Met、Leu或Val；
aa8是Ala或Val；
aa9是Asn、Gln或Ala；
aa10是Trp、Ala或Ser；
aa11是Ile或Val；
aa12是Leu或Lys；
aa13是Lys、Arg、Asn或Gly；
aa14是Ala或Gly；
aa15是Lys或Arg；且
aa16是Lys或Arg；和
(d)选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：38的多肽。
2.权利要求1的多肽，其中酰基是C4-C8酰基链；长酰基是C6-C14酰基链；PEG是C2-C20链的聚乙二醇链。
3.一种制备权利要求1的多肽的方法，所述方法包括通过向肽链上连续添加受保护的氨基酸而合成多肽，除去保护基，脱盐并纯化该多肽。
4.一种制备权利要求1的多肽的方法，所述方法包括表达编码所述多肽的基因，并纯化表达的多肽。
5.编码权利要求1的多肽的表达载体。
6.用权利要求5的表达载体转化的宿主细胞。
7.一种药物组合物，其含有有效量的权利要求1的多肽或其可接受的盐，和至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
8.权利要求7的药物组合物，进一步包含有效量的至少一种化合物，该化合物选自：胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂。
9.一种治疗血糖水平升高的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1的多肽。
10.权利要求9的方法，进一步包括施用治疗有效量的至少一种化合物，该化合物选自：胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、PPAR激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂。
11.一种治疗糖尿病的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1的多肽。
12.权利要求11的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
13.权利要求11的方法，进一步包括施用治疗有效量的至少一种化合物，该化合物选自：胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、PPAR激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂。
14.一种治疗胰岛素抵抗的方法，该方法包括施用治疗有效量的权利要求1的多肽。
15.权利要求14的方法，进一步包括施用治疗有效量的至少一种化合物，该化合物选自：胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、PPAR激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂。
16.一种预防代谢性酸中毒的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1的多肽。
17.权利要求16的方法，进一步包括施用治疗有效量的至少一种化合物，该化合物选自：胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、PPAR激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂。
18.一种治疗肥胖症的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1的多肽。
19.权利要求18的方法，进一步包括施用治疗有效量的至少一种化合物，该化合物选自：胰岛素、胰岛素类似物、肠降血糖素、肠降血糖素类似物、胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽类似物、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、磺酰脲类、双缩胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、PPAR激动剂、PPAR拮抗剂和PPAR部分激动剂。
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