CN101045939A - 一种hbv dna基因分型的检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HBV DNA基因分型的检测方法及其试剂盒。根据HBV基因型特征位点设计特异性探针及配套的引物，或设计特异性引物及配套的反向引物和病毒特异性检测探针，对HBV基因型进行检测，可以单独使用检测型，也可以分别在数个PCR管中通过相同的PCR程序对同一样本进行实时荧光检测，同时检测B、C或通用型。根据型反应管和通用型反应管检测Ct值的差值，对临床样本中HBV病毒中型病毒的比例含量进行判断。本发明的试剂盒性能稳定、操作简便、检测快速，能很好地判断HBV DNA的型别，帮助HBV的针对性抗病毒治疗和预后的分析。

Description

一种HBV DNA基因分型的检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种病毒的检测。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估计全球有20亿人感染，其中慢性感染者3.5亿，我国约占半数，全球每年约有100万人死于HBV感染。此种感染最终可发展为肝硬化、肝癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。

乙型肝炎病毒主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害，机体细胞识别病毒抗原并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受包括宿主与病毒的多个因素影响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，可能也从中扮演了重要的角色。不同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱。从目前的研究来看，HBV C基因型与较重的肝脏病变相关，B型则与较轻的病变相关；A型与慢性肝炎相关，D型与急性自限型肝炎相关：其它基因型与疾病谱的关系还有待发现。

Kao发现C型与重症如肝硬化和肝细胞癌有关，B型多存在于年轻的非肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型患者在HBV的免疫清除阶段血清转化比B型延迟，同时C型比B型有更高的C基因启动子突变率。在抗病毒治疗中，B型比C型对拉米夫定敏感，不过两型产生药抗性的几率是一样的。Lindh等对东亚地区的43名基因型为C的HBV慢性感染者的基因型及CP变异的研究表明，T1762变异更易出现在C基因型，感染C型后更易出现较重的肝脏炎症。

对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入细致的研究，现有研究表明不同亚型的HBV感染的临床病程和对治疗的反应都存在着一定的差异。病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一，乙型肝炎病毒变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可发生于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中利用RNA中间体，病毒聚合酶和逆转录酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校对酶活性，发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。不同的病人机体和不同的药物与不同的变异毒株长期相互作用表现出不同的基因型。虽然没有确切数据表明HBV的变异比例，但病毒变异是高频并永恒的，现在已经由最初的A～D四型发展到了A～H八型，病毒与机体的继续斗争将会出现更多的变异热点和基因型。尽管HBV分型、变异与临床表征有着一定关联度，但是目前仍然没有完全阐明清楚。大规模的***流行病学分子特征普查将更有助人们认识HBV与机体以及药物的辨证关系，这就依赖于简便快速的HBV分型方法。

对HBV进行基因分型以及变异热点的检测，在选择合适的药物或制订治疗方案等方面都有重要指导。目前临床检测市场迫切需要有相关成熟的技术方案尤其是针对病毒分子特征以及机理的方法，来进一步指导乙肝的临床治疗。虽然有很多实验室都在研究HBV分型及变异的检测方法，但国内外市场上还没有检测HBV基因型的临床诊断用产品。

国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对是以生物***发生学中的基因同源性为基础的，它主要是通过HBV全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)。片段基因序列比对是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术类型有片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以作临床常规使用，目前只作为实验室研究使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断：应用SSP法进行PCR扩增需要多个扩增管，使用常规的PCR后产物电泳的方法也容易污染，其灵敏性比特异性探针低；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，最具有实用价值。基因芯片技术也能建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法，但费用较高，检测时需要昂贵的芯片扫描仪，且探针固定技术，检测灵敏度等关键技术还未取得重大突破，目前尚未见有基因芯片进行HBV基因分型的产品上市。

实时荧光PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5’端报告荧光基团的激发光被3’端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5’->3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是同时增多。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。HBV的变异是不断产生的，目前的分型方法均只能基于现在已经取得的研究成果，分型依据和分型办法均在不断发展中。

发明内容

本发明需要解决的技术问题的是提供一种HBV DNA分型的检测方法及其试剂盒，以克服现有技术对HBV DNA分型检测比较烦琐复杂的缺陷。

技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案之一是一种HBV DNA基因分型的检测方法，即在聚合酶链式反应中，使用以下结构的多聚核苷酸序列作为检测探针：

序列B 5’AAATC TCCAG 3’；

序列C 5’AGCAC CCACG 3’；

序列D 5’ACTAC CGTGT 3’；

本领域的普通技术人员无需特别的试验即可以理解，采用包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列，只要包含了上述分型特异性序列B、C和/或D，即可同样达到本发明的技术效果；同样，与上述的序列B、C、D和包含B、C、D的同源性大于75％的序列，事实上也可以达到HBV基因分型的目的，但本发明需要指出的是，其替代效果不一定比上述明确指出的序列更好；同理，不管上述序列B、C、D还是包含B、C、D的序列还是同源性大于75％的序列，其碱基互补序列只是碱基形式上的变化，并未改变本发明的技术方案实质；

上述的各种序列还可以经添加互补臂形成分子信标探针，以利用分子荧光进行HBV分型检测，这种分子信标探针是上述各种序列所构成的发明方案的一种合理延伸，也是上述序列的一种理所当然的可能利用方式；

在实际应用中，还有一种可能是使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合，来达到检测HBV某一型或者一型以上的目的，如使用包含序列B的延长序列和与序列C同源的序列和含序列D的分子信标探针进行HBV分型等等。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的一种优选方案为，以所说的探针之一或一条以上作为引物参与聚合酶链式反应。其原理是，以上各种探针是特异地与目标序列严格互补的，所以同时也可以作为引物使用。这种可以省略引物的使用的技术方案，也是本领域的普通技术人员常用手段之一。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的另一种优选方案为，可以采用标记探针技术来标记所说的检测探针。本领域的普通技术人员无需特别的试验即可以理解，用来标记的荧光发光基团可以为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一种或一种以上的组合；同样，荧光淬灭基团可以为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。荧光发光基团和荧光淬灭基团的不同选择，将影响到检测的灵敏度和使用的成本，但不影响本发明提供的检测方案的实质。

本发明还提供上述探针在PCR反应过程中的使用方法，即采用单管PCR反应检测HBV的某个型；或者，用另一种使用方法为，分两管，在同一时间运行同一PCR扩增程序，分别检测两个型或者一个型与通用型；或者，用另一种使用方法为，分三管，在同一时间运行同一PCR扩增程序，分别检测两个型和通用型。具体说明如下：

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的一种实现方式是，由两个反应管在同一时间运行同一扩增程序进行实时荧光聚合酶链式反应检测，两管分别使用序列B、序列C、序列D中的任意1条。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的另一种实现方式是，由三个反应管在同一时间运行同一扩增程序进行实时荧光聚合酶链式反应检测，三管分别使用序列B、序列C、序列D。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的两种实现方式的优选方案为，在上述反应管之外增加一个总HBV反应管，与型检测反应管在同一时间运行同一PCR扩增程序进行实时荧光检测，并且使用如下检测探针：

探针U 5’ATAAA ACGCC GCAGA CAC 3’

或者包含有探针U序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于75％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的聚合酶链式反应运行程序如下：反应管先在45-55℃反应1-3分钟，然后93-98℃保温3-6分钟，再按93-97℃ 15-30秒和55-65℃ 15-40秒循环35-45次。最优选如下运行程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃30秒循环40次。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法的结果处理可以采取如下方案：根据序列B管与序列U管检测的Ct值的差值、序列C管与序列U管检测的Ct值的差值、序列D管与序列U管检测的Ct值的差值分别判断样本中HBV DNA中B型病毒、C型病毒、D型病毒与总病毒的病毒相对量。其中，Ct值的“C”代表Cycle，“t”代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

进一步理解上述结果处理方案，可以解释为：当采用两管或两管以上进行PCR反应并且采用荧光PCR方法时，其结果数据处理方案为，根据型反应管检测Ct值与通用反应管检测的Ct值的差值来判断样本中型病毒和总病毒的比例关系。如B和U的两管法，计算ΔCt_B-U＝Ct-B-Ct-U，即B型反应管检测Ct值(Ct-B)与通用U反应管检测的Ct值(Ct-U)的差值，由此判断样本里HBV病毒中B型病毒DNA与总HBV病毒的相对量，以解决复合感染多型病毒患者的型别诊断问题。

上述的HBV DNA基因分型的检测方法另一种检测形式上的优选方案为，使用序列B、序列C和序列D中的任意一条或一条以上的组合，固定在膜载体或其它固相载体上，与包含特异性互补序列的DNA进行杂交。

本发明提供的技术方案之二是HBV DNA基因分型检测的试剂盒，所述的试剂盒组成包括：核酸提取试剂、反应液、荧光标记探针、耐热DNA聚合酶和对照品，其特征在于，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；荧光标记探针序列为5’端用FAM标记、3’端用TAMRA标记的序列B和/或序列C；

其中，引物1为5’AGACT CGTGG TGGAC TTC 3’；

引物2为5’AGGCA TAGCA GCAGG ATG 3’。

上述试剂盒的具体组成可以按照具体用途进行调节，但均基于上述的方法和探针或引物选择。比如：一种HBV DNA分型检测试剂盒1，其组成包括：

核酸提取试剂

核酸扩增试剂，其组成包括：

    反应液

    荧光探针

    耐热DNA聚合酶

    对照品

其中，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；

荧光探针序列为探针1，其5`端用FAM标记，其3`端用TAMRA标记。

PCR运行程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃30秒循环40次。

又比如：一种HBV DNA分型检测试剂盒2，其组成包括：

核酸提取试剂

核酸扩增试剂，其组成包括：

    反应液

    荧光探针B

    荧光探针C

    耐热DNA聚合酶

    对照品

其中，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；

荧光探针B序列为探针1，其5`端用FAM标记，其3`端用TAMRA标记；

荧光探针C序列为探针2，其5`端用FAM标记，其3`端用TAMRA标记；

PCR运行程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃30秒循环40次。

有益效果

本发明与现有HBV DNA分型检测方法相比，具有以下有益的技术效果：

本发明的HBV DNA分型检测方法是利用了HBV基因组的型别特征位点，并且证明这个位点是可以应用于实际检测的。应用特殊探针和配套PCR方法，解决了背景技术中所说的片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等方法的缺陷，比DNA序列测定更简便和快速。同时，采用荧光PCR方法，可以避免PCR产物进一步处理中产生的模板污染，简化实验室设置和防护要求，减少实验失败的可能，提高生物安全性和检测的稳定性。

如本文所用，术语“分子信标探针”即molecular beacon，是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构，荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。

如本文所用，术语“互补臂”是指探针中呈发夹形的茎环结构中的两条茎之间相互形成寡核苷酸分子内的互补结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

设计和制备引物、探针序列。(针对HBV DNA基因相关序列设计，GeneBank序列号为B型AB033555，C型AB014377，D型AB104709)

引物1(上游引物)5’AGACT CGTGG TGGAC TTC 3’、

引物2(下游引物)5’AGGCA TAGCA GCAGG ATG 3’、

序列B 5’AAATC TCCAG 3’；

序列C 5’AGCAC CCACG 3’；

序列D 5’ACTAC CGTGT 3’；

探针1(B基因型探针)5’AGT CCC  AAA TCT CCA GTC AC 3’(包含序列B)、

探针2(C基因型探针)5’GG A GCA CCC ACG TGT CCT GG 3’(包含序列C)、

探针3(D基因型探针)5’GA A CTA CCG TGT GTC TTG GC 3’(包含序列D)

探针1、2、3的荧光标记为：荧光发光基团FAM；荧光淬灭基团为TAMRA。

实施例2

制备乙型肝炎病毒(HBV)分型荧光PCR检测试剂盒。

组成为：

组成成分(10人份/盒)                    体积

提取液A                                500μL×1管

提取液B                                500μL×1管

反应液                                 560μL×1管

荧光探针B                              60μL×1管

荧光探针C                              60μL×1管

MgCl₂溶液                             160μL×1管

Taq酶(含0.67U/μLTaq酶和0.02U/LUNG酶)  90μL×1管

阳性对照品                             20μL×1管

阴性对照品                             50μL×1管

试剂盒中三种反应液配方：

原材料	B反应管	C反应管
			10×Buffer	1×	1×
MgCl2	4mM	4mM
			d(AGC)TP	200μM	200μM
d(UTP)	300μM	300μM
			引物1，2	200nM	200nM
探针1	300nM
			探针2		300nM
Taq酶	2U	2U
			UNG酶	0.06U	0.06U
摸板(检测时另加)	5μL	5μL
			终体积	50μL	50μL

核酸提取试剂配方为：

提取液A：8％聚乙二醇、1mol/LNaCl

提取液B：10mmol/L NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20

阳性对照品为人工合成的HBV C型和B型DNA片段等浓度混合液。

实施例3

HBV DNA的分型检测方法，同时也是检测试剂盒的使用方法。

1、HBV DNA提取

取待测血清样本50μL，加入50μL核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μL，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

2、荧光PCR检测

按样本数[样本数＝标本数+对照品]n分别配制两管反应液：

<B管>：取反应液n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针B n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀

<C管>：取反应液n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针C n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀

两种反应液均按45μL/管分装到反应管中，取待测样本DNA抽提产物及对照品各5μL依次加入上述两种反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置全自动荧光检测仪上运行如下PCR程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃30秒循环40次。

实施例4

HBV DNA的分型定量检测方法，同时也是检测试剂盒的使用方法。

1、HBV DNA提取

取待测血清样本50μL，加入50μL核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μL，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

2、荧光PCR检测

按样本数[样本数＝标本数+对照品]n分别配制两管反应液：

<B管>：取反应液n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针B n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀

<U管>：取反应液n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针U n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀

两种反应液均按45μL/管分装到反应管中，取待测样本DNA抽提产物、B型HBV DNA定量模板1-3号(浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴copy/ml)各5μL依次加入上述两种反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置全自动荧光检测仪上运行如下PCR程序：反应管先在45℃反应3分钟，然后93℃保温6分钟，再按93℃ 30秒和55℃ 40秒循环45次。

根据定量模板1-3号的Ct值和已知浓度可以模拟出定量标准曲线，并按此曲线，根据某样本的B管Ct值和U管Ct值计算出B型DNA和总HBV DNA的量值，并相除得出B型DNA占总HBV DNA的含量。

实施例5

HBV DNA的相对分型定量检测方法，同时也是检测试剂盒的使用方法。

1、HBV DNA提取

取待测血清样本50μL，加入50μL核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μL，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

2、荧光PCR检测

按样本数[样本数＝标本数+对照品]n分别配制两管反应液：

<C管>：取反应液n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针C n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀

<U管>：取反应液n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针U n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀

两种反应液均按45μL/管分装到反应管中，取待测样本DNA抽提产物各5μL依次加入上述两种反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置全自动荧光检测仪上运行如下PCR程序：反应管先在55℃反应1分钟，然后98℃保温3分钟，再按97℃15秒和65℃15秒循环35次。

根据经验公式，Ct值与原始模板浓度存在线性关系，Ct值越大则原始模板数量越少，每3.3个Ct值的变化代表约10倍的原始模板数量的变化。某样本的C管的Ct-c大于U管的Ct-u，差值为ΔCt＝Ct-c-Ct-u，则该样本中C型HBV占总HBV DNA的比例约为10的(-ΔCt/3.3)次幂。

实施例6

HBV DNA的相对分型定量检测方法，同时也是检测试剂盒的使用方法。

1、HBV DNA提取

取待测血清样本50μL，加入50μL核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μL，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

2、PCR扩增

按样本数[样本数＝标本数+对照品]n配制D管反应液：取反应液(引物1的5’端被生物素标记)n×28μL、MgCl₂ n×8μL、荧光探针D n×6μL、Taq酶n×3μL混于一离心管中混匀，按45μL/管分装到反应管中，取待测样本DNA抽提产物各5μL加入反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置PCR扩增仪上运行如下PCR程序：93℃20秒→55℃30秒→72℃60秒循环40次。

3、探针杂交

取PCR扩增产物10μL进行热变性后，加入杂交液至100μL。将探针3点在杂交膜上，吸干后用紫外交联方法进行固定化。将带有探针的膜条浸入杂交液，在42℃环境中进行杂交反应约15分钟。取出膜条，转移到100μL链霉亲和素-碱性磷酸酶液中，室温反应10分钟。取出膜条，转移到100μL碱性磷酸酶底物液中，室温反应10分钟。取出膜条，观察探针包被点。如在探针点产生蓝紫色斑点，则表明存在D型HBV DNA。

Claims (10)

1、一种HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，在聚合酶链式反应中使用以下结构的多聚核苷酸序列作为检测探针：

序列B 5’AAATC TCCAG 3’；

序列C 5’AGCAC CCACG 3’；

序列D 5’ACTAC CGTGT 3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于75％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

2、根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，以所说的探针之一或一条以上作为引物参与聚合酶链式反应。

3、根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，标记探针的荧光发光基团为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一种或一种以上的组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。

4、根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，由两个反应管在同一时间运行同一扩增程序进行实时荧光聚合酶链式反应检测，两管分别使用序列B、序列C、序列D中的任意1条。

5、根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，由三个反应管在同一时间运行同一扩增程序进行实时荧光聚合酶链式反应检测，三管分别使用序列B、序列C、序列D。

6、根据权利要求4或5所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，增加一个总HBV反应管，与型检测反应管在同一时间运行同一PCR扩增程序进行实时荧光检测，并且使用如下检测探针：

探针U  5’ATAAA ACGCC GCAGA CAC 3’

或者包含有探针U序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于75％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针。

7、根据权利要求1-6所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，聚合酶链式反应运行程序如下：反应管先在45-55℃反应1-3分钟，然后93-98℃保温3-6分钟，再按93-97℃ 15-30秒和55-65℃ 15-40秒循环35-45次。

8、根据权利要求7所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于根据序列B管与序列U管检测的Ct值的差值、序列C管与序列U管检测的Ct值的差值、序列D管与序列U管检测的Ct值的差值分别判断样本中HBV DNA中B型病毒、C型病毒、D型病毒与总病毒的病毒相对量。

9、根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于使用序列B、序列C和序列D中的任意一条或一条以上的组合，固定在膜载体或其它固相载体上，与包含特异性互补序列的DNA进行杂交。

10、一种HBV DNA基因分型检测试剂盒，所述的试剂盒组成包括：核酸提取试剂、反应液、荧光标记探针、耐热DNA聚合酶和对照品，其特征在于，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；荧光标记探针序列为5’端用FAM标记、3’端用TAMRA标记的序列B和/或序列C；

其中，引物1为  5’AGACT CGTGG TGGAC TTC 3’；

引物2为        5’AGGCA TAGCA GCAGG ATG 3’。