CN101045932A

CN101045932A - 编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因及其用途

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Publication number: CN101045932A
Application number: CNA2007100858065A
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2007-10-03
Also published as: AU2007223600A1; EP1994050A1; CA2638791A1; JP2009528024A; US20090041891A1; WO2007102355A1

Abstract

本发明涉及编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因及其用途，特别是涉及麦芽糖发酵性优异的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子MalRp的基因MALR，特别是通过提高啤酒酵母中特征性的nonScMALR基因的表达量而提高使麦芽糖发酵的能力的酵母及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。

Description

编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因及其用途

技术领域

本发明涉及编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因及其用途，特别是涉及麦芽糖发酵性优异的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及编码酿造酵母的麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子MalRp的基因MALR，特别是通过提高啤酒酵母中特征性的nonScMALR基因的表达量而提高使麦芽糖发酵的能力的酵母及使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

背景技术

啤酒制造中，使浸出物浓度为11％左右的原麦芽汁发酵，得到酒精浓度为4.5～5％左右的啤酒，为提高啤酒的生产性，有时采用高浓度酿造法。高浓度酿造法(high gravity brewing)是指使浸出物浓度比通常麦芽汁高的麦芽汁发酵后，用水稀释，制造所需酒精浓度的啤酒的方法。其具体的方式为(1)采用比通常的发酵温度高的温度，(2)增加向麦芽汁的通气量，(3)增加酵母的添加量以及这些方式的组合。在制造通常的啤酒时，这些方法中原麦芽汁浸出物浓度为15％左右的高浓度酿造可以说是达到了的极限。

进行原麦芽汁浸出物浓度15％以上的高浓度酿造时，所产生的问题中最大的问题首先是从发酵中期到后期，发酵速度显著降低。麦芽汁中所含有的糖质主要是麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖、果糖、蔗糖。酵母先发酵葡萄糖、果糖、蔗糖，之后发酵麦芽糖、麦芽三糖。因此，从发酵中期到发酵后期，醪液中的可发酵性糖只有麦芽糖、麦芽三糖。且其存在比为3∶1，麦芽糖占绝对多数。

麦芽糖通过酵母的麦芽糖转运蛋白摄入细胞内后，通过麦芽糖酶水解成2个葡萄糖，再经过糖酵解(Embden-Meyerhof)途径转化为二氧化碳和乙醇。该2种酶在基因的转录水平、在麦芽糖的存在下被诱导，在葡萄糖的存在下被抑制。已知在麦芽糖的存在下这些酶的转录诱导与转录因子MalR有关，并已知MalR的转录自身也在葡萄糖的存在下受到抑制(Mol Cell Biol.7：2477-2483，1987、Curr Genet.28：258-266，1995)。

麦芽汁中，因葡萄糖约占可发酵性糖的17％，酵母的麦芽糖代谢体系基因在发酵初期阶段受葡萄糖抑制，麦芽糖的发酵大幅度延迟。此现象在高浓度酿造时更为显著，不仅麦芽糖发酵延迟，发酵结束时作为残糖的大量的麦芽糖也未被发酵而残留下来。由于这些问题，高浓度酿造，例如使通常浓度的2倍浓度的麦芽汁发酵，以往的技术是不充分的。

日本特开平1-153082号公报中公开了为了改善通过面包酵母而使生面团(dough)发酵，使用导入含有不受葡萄糖抑制的乙醇脱氢酶基因的启动子和麦芽糖酶基因及麦芽糖转运蛋白基因的质粒的面包酵母。另外，也有文献报道，使Saccharomyces cerevisiae的麦芽糖转运蛋白基因MAL6T在酿造用酵母中高表达，从而实现高浓度酿造的例子(日本特开平06-245750号公报)。

发明内容

根据上述现状，希望有既不影响发酵速度和产品质量，又可实现高浓度酿造的酵母。

本发明人等为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定、分离了编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因。且制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了可促进麦芽糖发酵，从而完成了本发明。

即本发明涉及编码啤酒酵母中存在的麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因、该基因编码的蛋白质、调节了该基因表达的转化酵母、通过使用调节了该基因表达的酵母的酒精饮料的制造方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。

(1)多核苷酸，其选自由下述(a)～(f)所组成的群组：

(a)多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸；

(b)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；

(e)多核苷酸，其含有与序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(f)多核苷酸，其含有与编码序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸。

(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其选自由下述(g)～(i)所组成的群组：

(g)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列或序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1～10个氨基酸的氨基酸序列组成且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；

(h)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(i)多核苷酸，其含有与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸或序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。

(6)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。

(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(7a)上述(7)中所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其连接在该启动子的有义或反义方向；以及

(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化并在酵母中起作用的信号。

(7b)上述(7)中所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其连接在该启动子的有义方向；以及

(8)酵母，其中导入了上述(7)～(7b)中任一项所述的载体。

(9)上述(8)中所述的酵母，其通过导入上述(7)～(7b)中任一项所述的载体，提高了使麦芽糖发酵的能力。

(10)上述(9)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述的蛋白质的表达量增加，提高了使麦芽糖发酵的能力。

(11)酒精饮料的制造方法，其使用上述(8)～(10)中任一项所述的酵母。

(12)上述(11)中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

(13)酒精饮料，其由上述(11)或(12)中所述的方法制造。

(14)评价被检酵母的麦芽糖发酵能力的方法，其使用根据具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的麦芽糖发酵能力进行评价。

(14a)根据上述(14)中所述的方法，筛选麦芽糖发酵能力强的酵母的方法。

(14b)酒精饮料使用根据上述(14a)中所述的方法筛选的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(15)评价被检酵母的麦芽糖发酵能力的方法，其通过培养被检酵母、测定具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量，对被检酵母的麦芽糖发酵能力进行评价。

(15a)筛选麦芽糖发酵能力强的酵母的方法，其根据上述(15)中所述方法，评价被检酵母，筛选编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量高的酵母。

(15b)酒精饮料使用根据上述(15a)中所述方法筛选的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(16)酵母的选择方法，其通过培养被检酵母，对上述(6)中所述的蛋白质进行定量或测定具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量，选择与目标麦芽糖发酵能力相应的上述蛋白质的生成量或上述基因的表达量的被检酵母。

(17)上述(16)中所述的酵母的选择方法，其通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因在各酵母中的表达量，选择该基因比在标准酵母中高表达的被检酵母。

(18)上述(16)中所述的酵母的选择方法，其通过培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中上述(6)所述的蛋白质进行定量，选择该蛋白质的量比在标准酵母中多的被检酵母。

(19)酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用上述(8)～(10)中所述的酵母及通过上述(16)～(18)中所述方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵，调节发酵速度。

根据使用本发明的转化酵母的酒精饮料的制造方法，即使葡萄糖存在麦芽糖的发酵也不受抑制，此结果，因不等葡萄糖消失麦芽糖也会进行降解发酵，发酵速度提高，所以可通过高浓度麦芽汁酿造啤酒。

附图说明

图1是表示啤酒酿造试验中酵母增殖量经时变化的图形。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。

图2是表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量经时变化的图形。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图3是表示啤酒酿造试验中酵母的nonScMALR基因的表达行为的图形。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号强度。

具体实施方式

本发明人认为通过增大酵母的麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性，可使麦芽糖更高效地发酵。基于此设想不断研究的结果，以用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离、鉴定了啤酒酵母中特有的编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的non-ScMALR基因。该碱基序列示于序列号：1。由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号：2。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；以及(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，不只限于上述的来自啤酒酵母的编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具同等功能的蛋白质的其他的多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可举例为(c)具有由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质。

此种蛋白质，可为由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基的氨基酸序列组成且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、***及/或付加的数量，一般优选较小的数量。另外，此种蛋白质可举例为(d)具有与序列号：2的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的氨基酸序列且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质。上述同一性的数值一般越大越好。

麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性，可根据对这些基因的转录量(mRNA)进行定量来测定。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1994-2003)。

另外，本发明也包含(e)多核苷酸，其含有与序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸。

此处的“在严谨条件下杂交的多核苷酸”，是指以序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸或编码序列号：2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如可利用MolecularCloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997等中所述的方法。

本说明书中所述的“严谨条件”可为低严谨条件、中严谨条件、高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严谨性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，可实现同样的严谨条件。

另外，在杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos DirectLabelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明书，与标记探针进行过夜培养后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤后，可检测出杂交后的多核苷酸(例如DNA)。

此外可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数(default parameter)计算时，可为与编码序列号：2的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。

另外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来决定。已开发了基于BLAST算法的称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、word length＝12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、word length＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

2.本发明的蛋白质

本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质。

此种蛋白质，可举例为由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加上述数量的氨基酸残基的氨基酸序列组成且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质。此外，此种蛋白质，可举例为具有与序列号：2的氨基酸序列具有如上所述的同源性的氨基酸序列，且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质。

此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版(モレキュラ一クロ一ニング第3版)、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中任意的且1个或多个氨基酸序列的位置上，缺失、取代、***及/或添加1个或多个氨基酸残基，其中，缺失、取代、***及添加中的2种以上也可同时发生。

以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法[芴甲氧羰基法(fluorenylmethoxycarbonyl)]、tBoc法[叔丁氧羰基法(t-Butyl Oxy Carbonyl)]等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instruments公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所(島津製作所社)等制造的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母

其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)。本发明的载体通常如下构成，其含有包括以(x)在酵母细胞内可转录的启动子、(y)连接在该启动子的有义或反义方向的上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)、以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化的在酵母中起作用的信号作为构成因子的表达盒。

导入酵母时使用的载体，可利用多复制型(YEp型)、单复制型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型载体的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已为人所知，且易获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，只要能在酿造用酵母中起作用，同时又不受醪液中糖和氨基酸等成分浓度的影响，则可任意组合。例如可利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中已有详细记载，可通过已知方法很容易地获得。

因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418^r、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别选自，猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain etal.，gene，101，149，1991)(それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。

如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母为可用于酿造的任意的酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可举例为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。还可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如协会葡萄酒用1号、3号、4号等；清酒酵母，例如协会酵母清酒用7号、9号等，但并不限于此。本发明中，啤酒酵母，例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。

酵母的转化方法，可利用通常使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法实施，但不限于此。

更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基[例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等]中培养，使OD600nm值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃条件下静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件下静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃、静置约30分钟后，将此细胞在约42℃条件、加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30℃、静置约60分钟。之后，移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基中，获得转化体。其他有关一般性的克隆技术可参照[《分子克隆》第3版(モレキュラ一クロ一ニング第3版)]、“Methods in Yeast Genetics、A laboratorymanual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒精饮料制造方法及根据该制造方法获得的酒精饮料

将上述本发明的载体导入适合酿造所需制造酒精饮料的酵母中，并可通过使用该酵母、使用高浓度麦芽汁在短时间内制造酒精饮料。而且通过根据下述本发明的酵母的评价方法进行的选择，也可获得使麦芽糖发酵能力提高的酵母。作为制造对象的酒精饮料并不限于此，例如可举例为啤酒、发泡酒等的啤酒味饮料。

制造这些酒精饮料时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往完全相同，不会因制造缩短了发酵时间的酒精饮料而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设备、不增加成本的情况下，制造麦芽糖发酵能力等优异的酒精饮料。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用根据具有序列号：1的碱基序列、且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的麦芽糖发酵能力进行评价的方法。使用引物或探针的评价方法的一般方法为公知的方法，例如，如WO 01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中的记载。以下，对该评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用根据编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在该基因或该基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的方法进行。

基因或特异性序列的检测可使用公知的方法进行。例如，将含有特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有与该碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为一个引物，将含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有与该碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间的碱基数，通常为300～2000bp较适当。

PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃、退火温度：40～60℃、延伸温度：60～75℃、循环数：10次以上等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，可测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否是包含特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价其酵母的麦芽糖发酵能力。另外，可通过分析扩增物的碱基序列，更进一步正确地预测、评价上述性能。

本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量，评价被检酵母的麦芽糖发酵能力。另外，编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量的测定，可通过培养被检酵母，对编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的转录产物mRNA或蛋白质进行定量来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR法，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1994-2003)。而且，也可通过测定培养被检酵母时所得到的发酵液中的麦芽糖浓度，预测该被检酵母中的上述基因的表达量。

而且，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量，选择与目标麦芽糖发酵能力相应的上述基因表达量的酵母，来选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。另外，也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中上述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的上述基因的表达量，来选择所需的酵母。具体地说，例如可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1的碱基序列且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因在各酵母中的表达量，选择该基因比在标准酵母中高表达的菌株，来选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。

或者可通过培养被检酵母，选择麦芽糖发酵能力强的酵母，来选择适合酿造所需酒精饮料的被检酵母。

此时，被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲磺酸乙酯(EMS：Ethylmethanesulfonate)、N-甲基N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大嵨泰治编著，生物化学实验法39，酵母分子遗传学实验法，p67-75，学会出版中心等)(大嵨泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一など)。

另外，可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可举例为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可举例为酵母属(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)、Saccharomyces cerevisiae、及Saccharomyces carlsbergensis)，本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且还可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如协会葡萄酒用1号、3号、4号等；清酒酵母，例如协会酵母清酒用7号、9号等，但不限于此。本发明中，啤酒酵母，例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母群中以任意组合选择。

以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因(nonScMALR)的克隆

使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库进行检索的结果，发现了啤酒酵母中特有的编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因nonScMALR(序列号：1)。以所得到的碱基序列信息为基础，分别设计用于扩增全长基因的引物nonScMALR_F(序列号：3)/nonScMALR_R(序列号：4)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan34/70株(有时可简写为“W34/70株”)的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有nonScMALR全长基因的DNA片段。

将如上所述获得的nonScMALR基因片段通过TA克隆***到pCR2.1-TOPO载体(invitrogen公司制造)。将nonScMALR基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例2：啤酒酿造试验中的nonScMALR基因表达的分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒酿造试验，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列进行检测。

麦芽汁浸出物浓度 12.69％

麦芽汁容量 70L

麦芽汁溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母投入量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图1)、表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其与日本特开2004-283169中所述的啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用基因芯片操作***(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0AFFYMETRIX公司制)进行。nonScMALR基因的表达模式如图3所示。由此结果可确认，nonScMALR基因在通常的啤酒发酵中进行了表达。

实施例3：nonScMALR高表达株的制备

将实施例1中所述的nonScMALR/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI进行酶切，制备包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot连接，构建了nonScMALR高表达载体nonScMALR/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418^r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用由上述方法制备的高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus UPMT3株。UPMT3株是将日本特开平06-245750号公报中所述的麦芽糖转运蛋白基因MAL6T用日本特开2000-316559号公报中所述的YIp型高表达质粒pUP3GLP导入到Saccharomyces pastorianus BH84株的染色体的菌株。用含有氨基糖苷类抗生素300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体。

实施例4：使用高浓度麦芽汁的啤酒酿造试验

使用亲株及用实施例3获得的nonScMALR高表达株用以下条件进行发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度 16.9％(12％麦芽汁中添加5％葡萄糖)

麦芽汁容量 20ml

发酵温度 28℃一定

调整酵母投入量，使发酵开始时的OD660为1.1。

将从发酵开始44.5小时后的醪液的浸出物浓度及醪液的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的浓度用液相色谱法测定。

如表1所示，与亲株相比，nonScMALR高表达株在44.5小时后的浸出物浓度比亲株低，发酵度增加4.2％。

且发酵结束时醪液的糖分析的结果，如表2所示，nonScMALR高表达株与亲株相比，麦芽糖、麦芽三糖的发酵被促进了。

表1

菌株	醪液浸出物浓度(％)	发酵度(％)
菌株	醪液浸出物浓度(％)	发酵度(％)	亲株(UPMT 3)	3.04	82.0
NonScMALR高表达株	2.34	86.2	亲株(UPMT 3)	3.04	82.0

表2

菌株	葡萄糖(％)	麦芽糖(％)	麦芽三糖(％)
菌株	葡萄糖(％)	麦芽糖(％)	麦芽三糖(％)	亲株(UPMT 3)	0.03	0.5	0.92
NonScMALR高表达株	0.03	0.22	0.6	亲株(UPMT 3)	0.03	0.5	0.92

工业实用性

根据本发明的酒精饮料制造方法，因酵母的麦芽糖发酵能力增大，所以即使在高浓度酿造中也能提高发酵速度，可在短时间内制造酒精饮料。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子基因及其用途

(Gene encoding maltase and a maltose transporter transcription factor，and use thereof)

<130>G06-0105CN

<150>JP2006-055542

<151>2006-03-01

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1434

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>1

atgagtttcg ttaagcaagc atgcgactgt tgtcgcgttc gccgaataaa gtgtgacggt 60

aaaggaccgt gtagtcgctg ccttcagcat gatttgaagt gtacatacct taaacagtta 120

aagaaaagag gtccaaagtc catcagggct cgaagcttga aaaaaatagc cgatgtacag 180

aaagctagta atggtggcac tacgatagct actgcggaag aatccacgaa ggttccaaag 240

aggctaatcg accaatgcct aaggctttac cacaataatc tgtacgttat atggcctctg 300

ctctgttacg aagatcttca caggcttctg gaagaaaggt atgatgactg ttatgtgtac 360

tggtttctgg tagctctctc ggcagccact cttagtgact tgcaaactga aatagaatct 420

aaggagggag cttccttgac tggaaaacag ctatgtgacc tttgtatgtc attacaccac 480

cgttttgatg acctcagggg tagcgatgtt tttagaataa tgacgtatta ttatttgcat 540

cgttgttttg ctcaatcttc tgatacaaga acttcgtaca gactctcttg tgaagccatt 600

agcctcatca agatcgccgg atttcatcgc gaggaaacgt atgagcgtat ctcgttcaat 660

gagcagcagc ttagacggaa ggtgtattat ttgcttcttt tgactgaaag atattattcc 720

gtgtatattt actgcgcaac aagcctggat gccacgatat caccaccgca acctgaagtt 780

gtaactgacc ctcgactttc cttggatagt ttcctcgaga tgatcagagt atttactgta 840

gcaggaaaat gtttttttga ttcattagct gccaactccg taaacgtttc ttgtactgaa 900

gactccctca aaaaaatatg gagggaactt catacaacgt cacttgaaat agagccatgg 960

tcgtacggat acatagacat ttcattttcc cggcattgga tcagaacact ggcttggaag 1020

ctagcgcctc taacaaaagg tatacgaacc ggtttccttt caaacactaa taatgcgctc 1080

ataccagtca aaattgccaa agacatgttg gttgatacat ttttaacccc aaaaagcttc 1140

tatgaagttc acggccccgg aataccaaca aaggcgctag aagtagcgaa tgcgttggta 1200

gacgttgtta tgaatcagtt agaccagaat atgaaattgg aggctttgaa cgttttgcac 1260

gatatatcca aatttgtttt ttctttagaa cactgtgata gtcggctgat caagatattt 1320

accgctaaat gtcaaactgc ccttatttct atacctattt ctagaccact agaattaagc 1380

gatgattctg aagaagacac taataaaatt cttgaagaac atactgataa gtga 1434

<210>2

<211>477

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>2

Met Ser Phe Val Lys Gln Ala Cys Asp Cys Cys Arg Val Arg Arg Ile

1 5 10 15

Lys Cys Asp Gly Lys Gly Pro Cys Ser Arg Cys Leu Gln His Asp Leu

20 25 30

Lys Cys Thr Tyr Leu Lys Gln Leu Lys Lys Arg Gly Pro Lys Ser Ile

35 40 45

Arg Ala Arg Ser Leu Lys Lys Ile Ala Asp Val Gln Lys Ala Ser Asn

50 55 60

Gly Gly Thr Thr Ile Ala Thr Ala Glu Glu Ser Thr Lys Val Pro Lys

65 70 75 80

Arg Leu Ile Asp Gln Cys Leu Arg Leu Tyr His Asn Asn Leu Tyr Val

85 90 95

Ile Trp Pro Leu Leu Cys Tyr Glu Asp Leu His Arg Leu Leu Glu Glu

100 105 110

Arg Tyr Asp Asp Cys Tyr Val Tyr Trp Phe Leu Val Ala Leu Ser Ala

115 120 125

Ala Thr Leu Ser Asp Leu Gln Thr Glu Ile Glu Ser Lys Glu Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Thr Gly Lys Gln Leu Cys Asp Leu Cys Met Ser Leu His His

145 150 155 160

Arg Phe Asp Asp Leu Arg Gly Ser Asp Val Phe Arg Ile Met Thr Tyr

165 170 175

Tyr Tyr Leu His Arg Cys Phe Ala Gln Ser Ser Asp Thr Arg Thr Ser

180 185 190

Tyr Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ile Ser Leu Ile Lys Ile Ala Gly Phe

195 200 205

His Arg Glu Glu Thr Tyr Glu Arg Ile Ser Phe Asn Glu Gln Gln Leu

210 215 220

Arg Arg Lys Val Tyr Tyr Leu Leu Leu Leu Thr Glu Arg Tyr Tyr Ser

225 230 235 240

Val Tyr Ile Tyr Cys Ala Thr Ser Leu Asp Ala Thr Ile Ser Pro Pro

245 250 255

Gln Pro Glu Val Val Thr Asp Pro Arg Leu Ser Leu Asp Ser Phe Leu

260 265 270

Glu Met Ile Arg Val Phe Thr Val Ala Gly Lys Cys Phe Phe Asp Ser

275 280 285

Leu Ala Ala Asn Ser Val Asn Val Ser Cys Thr Glu Asp Ser Leu Lys

290 295 300

Lys Ile Trp Arg Glu Leu His Thr Thr Ser Leu Glu Ile Glu Pro Trp

305 310 315 320

Ser Tyr Gly Tyr Ile Asp Ile Ser Phe Ser Arg His Trp Ile Arg Thr

325 330 335

Leu Ala Trp Lys Leu Ala Pro Leu Thr Lys Gly Ile Arg Thr Gly Phe

340 345 350

Leu Ser Asn Thr Asn Asn Ala Leu Ile Pro Val Lys Ile Ala Lys Asp

355 360 365

Met Leu Val Asp Thr Phe Leu Thr Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Val His

370 375 380

Gly Pro Gly Ile Pro Thr Lys Ala Leu Glu Val Ala Asn Ala Leu Val

385 390 395 400

Asp Val Val Met Asn Gln Leu Asp Gln Asn Met Lys Leu Glu Ala Leu

405 410 415

Asn Val Leu His Asp Ile Ser Lys Phe Val Phe Ser Leu Glu His Cys

420 425 430

Asp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Phe Thr Ala Lys Cys Gln Thr Ala Leu

435 440 445

Ile Ser Ile Pro Ile Ser Arg Pro Leu Glu Leu Ser Asp Asp Ser Glu

450 455 460

Glu Asp Thr Asn Lys Ile Leu Glu Glu His Thr Asp Lys

465 470 475

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>3

gagctcatag cggccatgag tttcgttaag caagcatgcg 40

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>4

ggatcctatg cggccgcagc aaccaaaaag cttaaaaaac tt 42

Claims

1. 多核苷酸，其选自由下述(a)～(f)所组成的群组：

(c)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列、且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；

(e)多核苷酸，其含有与序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸。

2.如权利要求1中所述的多核苷酸，其选自由下述(g)～(i)所组成的群组：

(g)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列或序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、***及/或添加1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；

(h)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(i)多核苷酸，其含有与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸、或序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白活性的转录诱导活性的蛋白质的多核苷酸。

3.如权利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

4.如权利要求1中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

5.如权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。

6.蛋白质，其由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码。

7.载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。

8.酵母，其中导入了权利要求7中所述的载体。

9.如权利要求8中所述的酵母，其通过导入权利要求7中所述的载体，提高了使麦芽糖发酵的能力。

10.如权利要求9中所述的酵母，其通过使权利要求6中所述的蛋白质的表达量增加，提高了使麦芽糖发酵的能力。

11.酒精饮料的制造方法，其使用权利要求8～10中任一项所述的酵母。

12.如权利要求11中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

13.酒精饮料，其由权利要求11或12中所述的方法制造。

14.评价被检酵母的麦芽糖发酵能力的方法，其使用根据具有序列号：1的碱基序列、且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的麦芽糖发酵能力进行评价。

15.评价被检酵母的麦芽糖发酵能力的方法，其通过培养被检酵母，测定具有序列号：1的碱基序列、且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量，对被检酵母的麦芽糖发酵能力进行评价。

16.酵母的选择方法，其通过培养被检酵母，对权利要求6中所述的蛋白质进行定量或测定具有序列号：1的碱基序列、且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因的表达量，选择与目标麦芽糖发酵能力相应的上述蛋白质的生成量或上述基因的表达量的被检酵母。

17.如权利要求16中所述的酵母的选择方法，其通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1的碱基序列、且编码麦芽糖酶及麦芽糖转运蛋白基因的转录诱导因子的基因在各酵母中的表达量，选择该基因比在标准酵母中高表达的被检酵母。

18.如权利要求16中所述的酵母的选择方法，其通过培养标准酵母及被检酵母，对各酵母中权利要求6所述的蛋白质进行定量，选择该蛋白质的量比在标准酵母中多的被检酵母。

19.酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用权利要求8～10中所述的酵母及通过权利要求16～18中所述方法选择的酵母中的任一种酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵，调节发酵速度。