CN101045751A

CN101045751A - 人源抗a型肉毒神经毒素基因工程抗体及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN101045751A
Application number: CNA2007100642291A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 荫俊; 史晶; 侯晓军; 包士中; 王忠泽; 蔡昆
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2007-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2007-10-03
Anticipated expiration: 2027-03-07
Also published as: CN100575363C

Abstract

本发明公开了人源抗A型肉毒神经毒素单克隆抗体，该抗体具有序列表中序列35所示的氨基酸序列，本发明还公开了上述抗体的改构体，其重链的氨基酸序列如序列表中序列36所示，轻链的氨基酸序列如序列表中序列37所示。上述抗体通过以下方法制备：首先通过分子生物学或其它方法制备具有特异中和活性、高亲和力的HuAb－BNa基因，在原核细胞如大肠杆菌等、真核细胞如酵母菌等、哺乳动物细胞如CHO中表达，经过纯化获得均质的HuAb－BNa蛋白。本发明制备的HuAb－BNa，具有特异中和活性强、亲和力高、无毒副作用的特点，适用于A型肉毒神经毒素中毒的急救治疗，同时适用于A型肉毒神经毒素的检测，具有良好的应用前景。

Description

人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种基因工程抗体，具体涉及一种人源抗肉毒神经毒素的基因工程抗体，还涉及该抗体的制备方法与用途。

背景技术

肉毒神经毒素(Clostridium Botulinum Neurotoxins，BN，简称肉毒毒素)是一组已知毒力最强的蛋白质(包括A-G型)。当肉毒毒素从污染食品或经感染进入人体循环后，通过阻断神经递质乙酰胆碱(兴奋性突触递质)在神经肌肉接头的释放，引起严重的神经失调和进行性神经肌肉***肉毒中毒症状，造成骨骼肌无力和延髓麻痹，严重的最终出现呼吸衰竭、心跳停止而导致死亡。引起人类中毒的主要是A、B、E型，A型肉毒毒素比其它血清型可引起更严重的病症和导致更高的死亡率。

应用抗毒素提供被动免疫在毒素中毒的预防和治疗中能起到有效的保护作用。目前，临床特异性治疗肉毒中毒主要是使用肉毒多价抗毒素—马血清。马血清来源的多克隆抗毒素(HIG)已用于80％以上肉毒中毒病人的治疗。多克隆抗毒素可识别大量的不同表位，可以保证一小部分保护性抗体的存在。1984年Tacket CO报道马抗的应用，在暴露于肉毒毒素前和暴露后24小时内使用马抗体也是有效的。但是，使用马抗有明显的副作用，Black RE报道临床治疗中约有9％病例出现血清病和过敏性反应(Black RE，Gunn RA.Hypersensitivity reactions associated with botulinal antitoxin.Am J Med 1980；69：567-570)。这种异源性产生的强免疫排斥反应和血清病等严重限制了马血清抗毒素的临床应用。为了避免和克服这些副作用，人们从志愿免疫献血者的血清中制备人免疫球蛋白(human BIG)(Gelzleichter TR，Myers MA，MentonRG，et al.Protection against botulinum toxins provided by passive immunizationwith botulinum human immune globulin J Appl Toxicol.1999 Dec；19 Suppl1：S35-8)，主要用于婴儿肉毒中毒的治疗。然而人免疫球蛋白的应用仍存在很多问题，主要包括潜在血源感染疾病的传播、制品有效性和特异性差异，以及制品的献血者来源不足等，这些问题制约了它的应用。而人们常常忽视的潜在问题是，为满足生产人免疫球蛋白的需要而进行肉毒类毒素免疫的志愿者，将会失去用肉毒毒素治疗多种神经调节障碍疾病的机会和权利。因此，目前的研究重点转向了新型抗毒素的制备。Hc是肉毒毒素的受体结合区，含中和表位，该位点在不同血清型毒素中是高度特异的。因此成为抗体研究针对靶标。

鼠源单克隆抗体是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，其制备包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化以及单克隆抗体的大量生产。2001年Pless DD等制备了针对A型肉毒毒素Hc片段的鼠单克隆抗体，SPR分析抗体解离常数范围为0.06-0.9nM，表位绘图分析显示，这些鼠源单抗结合到Hc片段的至少两个不同区域。2004年Yang GH等用不含毒性成分的B型肉毒毒素类毒素免疫制备获得了一株针对Hc片段的具有毒素中和活性的鼠单抗BTBH-N1，报道称10μg可以有效中和20LD₅₀的B型毒素；Bavari；Sina等制备了针对A型肉毒毒素的鼠单克隆抗体，可用于毒素的检测及治疗，并对其申请了专利(United StatesPatent Application No.20060177881)；Marks，James D等通过噬菌体文库筛选获得了针对A型肉毒毒素的鼠源中和抗体，并对其申请了专利(United StatesPatent Application No.20040175385)。但是，鼠源性单抗用于人类疾病的预防和治疗时会产生异种蛋白***反应，大大限制了其临床应用价值。而且，机体对异源抗体蛋白的清除作用使得鼠源性抗体在人体内半衰期缩短，生物活性降低。因此，人们一直致力于人源性抗体的研究，如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；鼠单抗的人源化改造，将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生CDR移植的人源化抗体，或者采用基因敲除技术将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，然后用抗原免疫小鼠，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体等等，但都遇到一些技术困难和条件限制。

近年来分子生物学的发展，特别是文库技术的成熟大大推动了抗体基因工程的发展，并对抗体的人源化过程发挥着重要作用。从特异性免疫的抗体库中可以比较容易的得到高亲和力抗体。免疫库的抗体基因来自免疫后个体的免疫球蛋白mRNA，因此，在免疫库中，针对某种抗原的抗体基因可能是富集的或经亲和力成熟的，容易得到高亲和力特异抗体克隆。2002年Peter等从噬菌体天然抗体文库和BoNT/A噬菌体免疫文库中筛选抗BoNT/A-Hc的人源ScFv，结果显示免疫文库获得的抗体可识别并结合两个不同的表位I和II，结合I的ScFv具有毒素中和活性(Amersdorfer P，Wong C，Smith T，et al，Genetic and immunological comparison of anti-botulinum type A antibodies fromimmune and non-immune human phage libraries.Vaccine.2002 Feb 22；20(11-12)：1640-8.)。然而基因工程抗体的表达量低是阻碍抗体开发和应用的瓶颈。国内外很多实验室都开展这方面的研究工作，应用了不同的表达载体、宿主菌和不同的表达***。Park JT等利用大肠杆菌表达***对抗肉毒毒素抗体Fab片段进行了表达，并对表达条件进行了优化(Park JT，Bradbury L，Kragl FJ，et al.Biotechnol Prog.2006 Jan-Feb；22(1)：233-40)。Mah DC等在酵母表达***中实现了抗A型肉毒毒素ScFv的表达(Mah DC，Hu WG，Pon JK，etal.Hybrid Hybridomics.2003 Oct；22(5)：277-83)；Almquist KC等在转基因土豆中实现了抗A型肉毒毒素ScFv的表达；2004年Mowry MC等在CHO DG44细胞中实现了针对A型肉毒毒素的一株嵌合抗体的表达，但还未达到高水平表达。

S.Bavari研究确定了产生保护性免疫的序列片段，并且制备了相应的多肽(BoNTaHc1157-1181，Pa；BoNTaHc1230-1253，Pb)，它不但可以识别和结合肉毒毒素中和抗毒素血清，而且可以免疫诱导小鼠产生特异的抗BoNTa中和抗体(S.Bavari，Dorothy D.Pless，Edna R.Torres，et al.Identifying thePrinciple protective antigenic determinants of type A botulinumneurotoxin.vaccine，1998，16(19)：1850-1856)，因此可以应用于抗体免疫文库的构建和抗毒素基因的筛选。

发明内容

针对现有肉毒毒素中毒治疗用抗毒素制品的缺陷，本发明提供了人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体，该抗体具有如序列表中序列35所示的氨基酸序列，其编码基因具有如序列表中序列34所示的核苷酸序列。

针对单链抗体通常都存在的稳定性差的问题，本发明还提供了一种人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体的小分子稳定性改构体(dsFv)，即二硫键稳定性Fvs。该改构体是在上述人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体基础上改构而成，在抗体可变区VH和VL之间，通过定点突变引入二硫键形成位点VH46Cys和VL99Cys，以添加二硫键的方式连接VH和VL构建二硫键稳定性抗体。其中重链的氨基酸序列如序列表中序列36所示，轻链的氨基酸序列如序列表中序列37所示。改构的dsFv抗体结构的抗原结合特异性没有发生改变，不同条件下的稳定性获得了明显改善，实时SPR技术测定抗体亲和力也获得了提高，更加适合于应用。

本发明的人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体具有特异中和活性强、亲和力高、无毒副作用的特点，适用于A型肉毒神经毒素中毒的急救治疗。本发明获得的HuAb-BNa产品，不仅可以完全消除抗肉毒神经毒素马血清(ETIG)易引起的过敏反应，而且可以克服人抗肉毒神经毒素免疫球蛋白(HTIG)生产的血源不足和潜在病毒污染的问题，具有良好的应用前景。

本发明同时提供了人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体(HuAb-BNa)的制备方法。首先是制备人源抗A型肉毒神经毒素编码基因，可以采用化学合成或基因工程例如PCR方法，然后将该基因克隆入原核或真核表达载体，制备重组表达载体，其中原核表达载体可以为pCANTAB-5E、pET等、真核表达载体可以为pPCI9K等。然后将制备的重组表达载体分别转入原核细胞如大肠杆菌等、真核细胞如酵母菌等或哺乳动物细胞如CHO等中进行表达，其中大肠杆菌可以为HB2151、BL21(DE3)等、酵母为GS115等。

本发明的HuAb-BNa基因是通过以下方法进行筛选的。首先合成制备免疫肽Pa(如序列表中序列1所示)和Pb(如序列表中序列2所示)，制备铝佐剂肽疫苗，经志愿者免疫诱导，从外周血淋巴细胞中分离、克隆抗体重、轻链可变区基因(VH和VK)，构建人源噬菌体抗体免疫文库，比较容易地用毒素靶抗原，采用酶联板固相抗原捕获法，筛选HuAb-BNa噬菌体阳性克隆，进而获得具有特异中和活性、高亲和力的HuAb-BNa基因，在实施该发明中，该基因可以通过本领域已知的技术进行化学合成或通过PCR等生物学方法进行制备。可以在原核细胞如大肠杆菌等、真核细胞如酵母菌等、哺乳动物细胞如CHO中获得表达，经过纯化获得均质的HuAb-BNa蛋白，从而制备重组人源基因工程抗毒素，这种直接获得人源抗毒素中和性克隆其基因的方法具有明显的技术优势，获得的基因工程抗毒素是完全人源性的，不需复杂的人源化制备过程，产品几乎没有免疫原性和毒副作用，不需过敏实验就可以直接使用。

本发明同时提供了人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体在肉毒毒素中毒急救治疗中的应用。可以提供更为安全、有效和作用机理明确的人源抗毒素。基因工程技术制备的人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体，可以有效中和A型肉毒毒素，延迟A型肉毒毒素中毒症状的发生，保护小鼠逃避致死量A型肉毒毒素的攻击，起到急救治疗的作用。本发明同时还公开了人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体在A型肉毒毒素检测中的用途。

本发明针对目前抗毒素产品存在的缺陷，为满足研制新一代人源(化)抗毒素的需求，提供了人源抗A型肉毒神经毒素编码基因以及特异针对A型肉毒毒素的高亲和力的人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗毒素，而且提供了其制备方法，该抗毒素作为免疫球蛋白的替换品，有很多优点：其有效成分明确，为抗A型肉毒毒素中和性单克隆抗体；特异性高，针对肉毒毒素的受体(中和)表位；无或低免疫原性，完全人源性蛋白结构；能够不限量的生产，可基因工程化制备放大。

附图说明

图1为提取人脾淋巴细胞总RNA产物的琼脂糖电泳图谱。

图2为人抗体VH和VL基因扩增图谱：A图为VH1-6基因扩增产物的琼脂糖电泳；B图为VL1-6基因扩增产物的琼脂糖电泳。其中M为DNA分子量标准DL2000；1-6泳道为VH1a-6a或VK1a-6a基因的PCR产物。

图3为组装的人单链抗体(ScFv)基因库，重链与轻链基因拼接产物的琼脂糖电泳图谱，其中M为DNA分子量标准DL2000；1-6泳道为组装ScFv的PCR产物。

图4为人源抗A型肉毒毒素抗体(HuAb-BNa)的重组构建与表达鉴定图谱，

其中

A.ScFv的扩增：M.DL2000；1.ScFv基因；

B.ScFv表达的SDS-PAGE与WB鉴定：M.蛋白分子标准；1.表达株蛋白；2.空载体菌蛋白；3.表达株蛋白免疫印记

C.dsFv表达的SDS-PAGE：M.低分子量蛋白标准；1.纯化前复性的dsFv蛋白；2.pET22b/BL21裂解液

D.dsFv表达的NATIVE-PAGE：M.低分子量蛋白标准；1.纯化前复性的dsFv蛋白；2.初纯化的dsFv蛋白

图5为HuAb-BNa的纯化制备，其中

A.纯化ScFv的NATIVE-PAGE：M.低分子量蛋白标准；1-2.纯化的ScFv蛋白

B.纯化dsFv的NATIVE-PAGE：M.低分子量蛋白标准；1.纯化的dsFv蛋白。

图6为HuAb-BNa的抗原结合曲线，其中

A.HuAb-BNa梯度剂量ScFv的抗原结合曲线；

B.HuAb-BNa梯度剂量dsFv的抗原结合曲线。

图7为HuAb-BNa的抗原动力学结合Fit曲线(Biacore SPR技术)，其中

A.ScFv与A型肉毒毒素抗原动力学结合Fit曲线；

B.dsFv与A型肉毒毒素抗原动力学结合Fit曲线。

具体实施方式

实施例1 人源抗A型肉毒毒素噬菌体免疫文库的构建与筛选

一、材料：

1.菌株：辅助噬菌体M13K07购自Biolab公司；宿主菌E.coli TG1为Pharmacia公司产品。

2.试剂：NotI、SfiI等限制性内切酶均为Promega公司产品；FicollPlus Pague和anti M13-HRP为Pharmacia产品；总RNA提取试剂盒、RT逆转录试剂盒、PCR扩增试剂为TAKARA公司产品；BSA(牛血清白蛋白组分V)为GIBCO公司产品；DEPC、羧苄青霉素、四环素和硫酸卡那霉素购自SIGMA公司。

3.载体：噬菌体载体pCANTAB-5E为Pharmacia公司产品。

二、方法结果：

1.A型肉毒毒素表位肽疫苗与志愿者免疫

1.1 A型肉毒毒素表位肽合成

Peptide A(BoNTaHc1157-1181，Pa)：如序列表中序列1所示。(25-mer)

Peptide B(BoNTaHc1230-1253，Pb)：如序列表中序列2所示。(25-mer)

免疫多肽Pa和Pb由军事医学科学院生物工程所合成。

1.2表位肽疫苗的志愿者免疫

先用多肽Pa和Pb对三名志愿者进行基础免疫，然后每隔2周用合成多肽加强免疫两次，免疫时辅以氢氧化铝佐剂。

2.人源抗A型肉毒毒素噬菌体免疫文库的构建

2.1人源噬菌体免疫文库构建的引物设计：设计的系列引物由上海博亚公司合成，如下：

IgG，IgM cDNA的合成引物：

GCHIFOR：如序列表中序列3所示；MCHIFOR：如序列表中序列4所示；

LFOR：如序列表中序列5所示

人源重链可变区(VH)的扩增引物：

HuVh1a-up：如序列表中序列6所示；HuVh2a-up：如序列表中序列7所示；HuVh3a-up：如序列表中序列8所示；HuVh4a-up：如序列表中序列9所示；HuVh5a-up：如序列表中序列10所示；HuVh6a-up：如序列表中序列11所示；HuVh-down：如序列表中序列12或13所示

人源轻链可变区(VK)的扩增引物：

HuVκ1a-up：如序列表中序列14所示；HuVκ2a-up：如序列表中序列15所示；HuVκ3a-up：如序列表中序列16所示；HuVκ4a-up：如序列表中序列17所示；HuVκ5a-up：如序列表中序列18所示；HuVκ6a-up：如序列表中序列19所示；HuVκ-down：如序列表中序列20所示

人源ScFv组装用Linkers：

Vκ1-6/Vh1：如序列表中序列21所示；Vκ1-6/Vh2：如序列表中序列22所示；Vκ1-6/Vh3：如序列表中序列23所示；Vκ1-6/Vh4：如序列表中序列24所示；Vκ1-6/Vh5：如序列表中序列25所示；Vκ1-6/Vh6：如序列表中序列26所示；

含限制性酶切位点Sfi I/Not I的ScFv克隆扩增引物：

HuVκ-up(Sfi I)：如序列表中序列27所示；Up-p2：如序列表中序列28所示；Up-P3：如序列表中序列29所示；Up-p4：如序列表中序列30所示；Up-p5：如序列表中序列31所示；Up-p6：如序列表中序列32所示；

HuVh-down(Not I)：如序列表中序列33所示。

2.2淋巴细胞的分离和细胞总RNA的提取

收取抗凝血40ml，以20ml Ficoll离心分离乳白色淋巴细胞层，用PBS洗3次，2000rpm，5min，7.8×10⁷细胞悬浮至终体积为1ml。参见试剂盒操作说明(Modified RNAgents Total RNA Isolation protocols)提取细胞总RNA 20μg，结果见附图1。

2.3 cDNA的合成

参见TAKARA试剂盒(BcaBEST^TM RNA PCR KIT Ver1.1)操作说明。以纯化的总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，RT反应条件为：30℃ 10分钟、42℃ 30分钟、99℃ 5分钟、5℃ 5分钟。

2.4 PCR扩增抗体可变区VH和Vκ基因

以2μl cDNA为模板，PCR反应***中添加1.6mmol/L MgCl₂，1mmol/L dNTP，加入2.5U的Tag酶，热启动，减少非特异性反应。PCR条件为：94℃ 30秒、57℃ 50秒、72℃ 60秒行25个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增目的产物Vh1-6和Vκ1-6进行纯化，大小为300-400bp，结果见附图2。

2.5 ScFv单链抗体基因的组装(splicing overlap extension，SOE)

分别测定VH链、Vκ链及Linker DNA相对的量，进行等摩尔混合，通过PCR进行组装。首先无引物拼接，94℃ 5分钟后，加入0.5μl(2.5U)Tag聚合酶，进行20个循环反应，94℃ 1分钟，54℃ 2分钟，72℃ 3分钟，最后72℃延伸10分钟。然后进行有引物扩增，在ScFv的5’和3’端引入限制性内切酶位点Sfi I/Not I，进行30轮PCR循环：94℃ 1分钟，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟。最后72℃延伸10分钟。PCR产物大小约为750bp，结果见附图3。

2.6重组噬菌体单链ScFv抗体文库的构建

2.6.1 ScFv克隆入噬菌体载体

pCANTAB-5E是Pharmacia公司商业化载体，按常规方法从带有质粒DNA的TG1菌中提取和纯化载体DNA。用Sfi I和Not I双酶切消化ScFv的PCR产物和载体pCANTAB-5E并分别纯化。然后将ScFv单链基因通过连接反应克隆入pCANTAB-5E载体。

2.6.2重组噬菌体单链ScFv抗体文库的构建

将连接产物电转化200μl事先制备的TG1电转致敏菌，电转设置为：2500V，电击30秒。电转后加入5-10ml 2×YT-G(含2％葡萄糖)，37℃振荡培养1小时。将重组转化菌10μl涂含2％葡萄糖的2×YT-氨苄平皿，30℃培养过夜。通过计算菌落检测库容量为1.8×10⁸。

3.人源抗A型肉毒毒素噬菌体阳性克隆的筛选

3.1单链噬菌体抗体库的富集筛选

噬菌体文库经过M13K07超感染后，产生的重组噬菌粒可释放于细菌培养上清中，用于噬菌体阳性克隆的筛选。噬菌体单链抗体库的富集筛选选择微量孔板筛选方法，将抗原BoNTa包被96孔板，然后进行吸附-洗脱-富集的三轮筛选过程，第三轮的阳性克隆率为64.9％，结合活性(OD₄₅₀)从第一轮的0.242-0.358，增加到第三轮的0.402-1.462。

3.2噬菌体阳性克隆的序列分析

对挑选的噬菌体阳性克隆HuAb-BNa的ScFv进行测序，获得其编码基因的核苷酸序列。与Kabat数据库中已知基因序列比较，确定家族定位；推导获得抗体基因编码的氨基酸序列，如序列表中序列35所示。结果显示，抗A型肉毒毒素抗体克隆HuAb-BNa的ScFv全长744bp，编码248氨基酸，HuAb-BNa的核苷酸序列(ScFv，744bp；VH，369bp；VL，330bp)如序列表中序列34所示，其中TCTGGTGGCGGCGGTTCTGGCGGTGGCGGTTTTGGTGGCGGTGGT为linker序列；HuAb-BNa的氨基酸序列(ScFv，248Aa)如序列表中序列35所示。HuAb-BNa的VH基因长369bp，编码123个氨基酸，属于VH4免疫球蛋白家族；Vκ基因长330bp，编码110个氨基酸，属于K chain IV家族。Vκ基因与VH基因之间由编码(SerGly₄)₃的DNA Linker正确连接构成ScFv结构。抗体的VH与Vκ通过不同方式进行结构组合和重构，可构建获得一系列功能抗体变构体，如单链抗体(ScFv)、二硫键稳定型抗体(dsFv)、单链二硫键稳定型抗体(ScdsFv)、Fab抗体片段、多结构域抗体或是全分子抗体等等。

实施例2 人源抗A型肉毒毒素基因工程抗体的重组制备

一、材料：

1.菌株：宿主菌E.coli HB2151为Pharmacia公司产品；E.coli BL21(DE3)为Novagen公司产品。

2.试剂：E-tag亲和层析纯化介质和Ni-NTA亲和纯化用Histrap HP预装柱购自Amersham Pharmacia公司；PCR扩增试剂为TAKARA公司产品；羧苄青霉素购自SIGMA公司；咪唑购自Amresco公司。

3.载体：噬菌体重组表达载体pCANTAB-5E为Pharmacia公司产品；表达载体pET22b为Novagen公司产品。

二、方法结果：

1.ScFv的重组制备

1.1 ScFv在大肠杆菌中的可溶表达

将筛选获得的阳性克隆的重组表达质粒pCan-ScFv及空载体分别转化大肠杆菌HB2151，PCR鉴定挑选重组工程菌株，结果见附图4-A。进行诱导表达：工程菌在LB-Amp培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.5，加0.3mmol/L IPTG诱导4小时可达到表达水平的平台期，SDS-PAGE分析ScFv的表达产物分子量约为26KDa，附图4-B显示与预期结果一致。薄层扫描分析显示，重组表达水平为15％。表达蛋白定位分析表明，表达蛋白以可溶形式存在于胞内。

SDS-PAGE分析：取1ml诱导后的菌液，12000rpm离心2min，弃上清，菌体加入100μl上样缓冲液(10％蔗糖，2％SDS，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10％巯基乙醇，0.002％溴酚蓝)悬起沉淀，沸水中煮5分钟，12000rpm离心，取上清10μl电泳。对比空载体和重组质粒转化工程菌的蛋白条带，观察有无外源基因表达。

1.2 ScFv的纯化

利用表达产物C末端的E-tag，进行E-tag亲和层析纯化(纯化介质购自Amersham Pharmacia公司)，将收集的洗脱蛋白进行NATIVE-PAGE分析，见附图5-A，并进行蛋白定量。

2.稳定型改构体dsFv的重组构建与制备

2.1 dsFv的重组构建

以ScFv基因为模板，采用长引物设计，通过连续三步PCR扩增，在ScFv中引入两个突变氨基酸，即VH46Gly/Cys，VK99Gly/Cys。突变体基因分析表明，成功的在ScFv中定点引入了突变：46GGG→TGC，99GGG→TGC，其它基因序列保持不变，突变基因可以正确编码成两个氨基酸Cys，dsFv的氨基酸序列如下：VHm46G/C( 为突变位点)如序列表中序列36所示，VKm99G/C(

为突变位点)如序列表中序列37所示。

2.2 dsFv的重组制备

2.2.1 dsFv的重组表达

构建的pET-VHm46G/C和pET-VKm99G/C重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，实现高水平表达，表达蛋白占菌体蛋白的30％以上，以包含体形式存在。

2.2.2包含体的制备与溶解

4000rpm、离心10分钟，收集诱导表达后的菌体。加入相当于原菌液1/10的蒸馏水，悬起沉淀，超声破碎细胞，10,000rpm、离心10分钟收集包含体沉淀。依次用2.5mol/L NaCl，0.05％Triton-X-100，4mol/L尿素洗涤沉淀得到包含体。将包含体溶解于变性液(pH8.0 0.50mmol/L Tris，6mol/LUrea，0.1mol/L DTT)中，4℃搅拌过夜。

2.3 dsFv的稀释法复性与亲和纯化

将处理好的变性蛋白VHm和VKm等比例混合装入透析袋，在含不同浓度(6M，4M，2M，0M)尿素的PBS中梯度稀释复性。逐渐除去变性蛋白中的尿素，使蛋白在此缓慢过程中，重新进行蛋白折叠，复性为与天然抗体蛋白结构相同或相似的可溶蛋白。复性蛋白进行了SDS-PAGE和NATIVE-PAGE分析：在还原蛋白电泳中，复性产物因为再变性，二硫键打开，蛋白带在13KDa，显示的是抗体可变区产物；而在非还原蛋白电泳中，抗体可变区间可以保持了已形成的二硫键，复性产物蛋白带在26KDa，见附图4-C、D所示。

上样buffer A(20mmol/L Na₃PO₄，0.5mol/L NaCl，40mmol/L imidazole，PH 7.4)平衡Ni-NTA纯化柱，复性蛋白直接上样，buffer B(20mmol/L Na₃PO₄，0.5mol/L NaCl，400mmol/L imidazole，PH 7.4)为洗脱液，收集洗脱峰，纯化的蛋白用NATIVE-PAGE检测，见附图5-B所示。

实施例3 人源抗A型肉毒毒素基因工程抗体的生物学活性分析

一、材料：

1.试剂：anti His-HRP为Pierce公司产品；BSA(牛血清白蛋白组分V)为GIBCO公司产品；硫氰酸氨购自北京生化试剂公司；抗肉毒马血清购自中国药品生物制品鉴定所；亲和力测定用试剂如HBS溶液、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、N羟基琥珀亚胺(NHS)、乙醇胺均为Pharmacia公司产品。

2.材料：CM5芯片为Pharmacia公司产品；Balb/C小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。

3.仪器：Biacore3000为GE公司产品。

二、方法结果：

1.人源抗A型肉毒毒素基因工程抗体的抗原结合活性(ELISA)

1.1 抗原结合活性

用ELISA检测验证了HuAb-BNa重组抗体只与A型毒素抗原特异结合，而与B型毒素抗原不结合。附图6-A、B显示梯度剂量的ScFv或dsFv蛋白质与A型肉毒毒素抗原的结合曲线。随抗体蛋白浓度升高，结合曲线接***台，抗原抗体的结合渐趋饱和。利用高亲和力HuAb-BNa的敏感性结合特点可以应用于A型肉毒毒素的型特异性检测。

1.2 dsFv与ScFv的相对亲和力比较

抗体蛋白与抗原结合过程中加入不同浓度的硫氰酸氨，当结合量纵轴数值下降为1/2时，即ELISA检测的OD₄₅₀下降为不加硫氰酸氨时的50％时，相应的硫氰酸氨浓度表示为相对亲和力。结果显示，dsFv的相对亲和力指数是1.5，而ScFv是1.1，说明重组制备的dsFv对抗原的亲和力高于原ScFv母本抗体，其结合力更强，具有更好的应用性质。

1.3 Biacore检测抗毒素的结合亲和力

Biacore(Biomolecular Interaction Analysis)的工作原理是基于表面等离子共振传感(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术来实时追踪生物分子间的相互作用。实验时先将抗原固定在传感器芯片表面，再将待分析的抗体蛋白注射到传感器芯片表面，可检测抗体与抗原结合和解离的全过程，图7-A、B就分别显示了ScFv和dsFv的动态结合曲线或Fit曲线，测定的亲和力反应抗体的结合强度，是评价抗体应用性的重要指标。分析结果显示，ScFv的亲和力为9.69×10^-8，而dsFv的亲和力为1.13×10^-8，提高了7.5倍，属于高亲和力抗体。

1.4 ELISA检测ScFv的竞争抑制结合活性

ELISA：抗原包被96孔，用3％BSA-PBS(含0.02％NaN₃)封闭，加入ScFv抗体蛋白，37℃温育2小时，0.05％Tween20-PBS(PBST)和PBS分别洗板三次，加入抗A型肉毒毒素马血清，37℃温育1小时，0.05％Tween20-PBS(PBST)和PBS分别洗板三次，加HRP标记的抗马抗体，37℃温育1h后，对TMB底物显色(5mg TMB，0.05mol/L NaHCO₃，0.5mmol/L MgCl₂)，酶标仪上读取A₄₅₀。

结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争抗肉毒马血清与肉毒毒素的结合，见表1。

表1 ELISA检测重组ScFv的竞争抑制活性(D₄₅₀)

抗原	rScFv+抗肉毒毒素马血清	BSA+抗肉毒毒素马血清	rScFv+抗破伤风毒素马血清	BSA+抗破伤风毒素马血清
抗原	rScFv+抗肉毒毒素马血清	BSA+抗肉毒毒素马血清	rScFv+抗破伤风毒素马血清	BSA+抗破伤风毒素马血清	A型肉毒类毒素破伤风类毒素对照	0.543-0.045	0.969-0.045	-0.7980.045	-0.8040.045

2.人源抗A型肉毒毒素基因工程抗体的中和活性(动物保护实验)

攻毒组10只，以最小致死剂量(MLD)A型肉毒毒素注射的小鼠，48小时内全部死亡；治疗组10只，以MLD A型肉毒毒素与100ug dsFv抗体4℃温育过夜，腹腔注射动物，48小时内小鼠存活5只，96小时内存活2只，小鼠平均死亡时间长于攻毒组动物3倍多，可以有效中和肉毒毒素，明显延迟毒素毒性的发生，对小鼠起到保护作用；对照组抗肉毒马血清可以完全中和毒素活性，小鼠全部存活；药物对照组5只，每只注射100ug dsFv抗体，动物一切正常，没有死亡，说明注射剂量重组抗体蛋白无毒性，结果见附表2。

表2.dsFv对BoNTa的体内中和活性

组别	48h内存活数	96h内存活数	存活率	平均死亡时间(h)
组别	48h内存活数	96h内存活数	存活率	平均死亡时间(h)	MLD BoNTa+Horseserum(anti-BoNTa)MLD BoNTa+dsFvMLD BoNTa controldsFv control	10/105/100/105/5	10/102/100/105/5	100％20％0％100％	78.8±6.521.3±2.3

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体及其制备方法与用途

<130>

<160>37

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>25

<212>PRT

<213>

<400>1

Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr

20 25

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>

<400>2

Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn

1 5 10 15

Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln

20 25

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>

<400>3

gtccaccttg gtgttgctgg gctt 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>

<400>4

tggaagaggc acgttctttt cttt 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>

<400>5

agactctccc ctgttgaagc tctt 24

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>6

caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>7

caggtcaact taagggagtc tgg 23

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>8

gaggtgcagc tggtggagtc tgg 23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>9

caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>10

gaggtgcagc tgttgcagtc tgg 23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>11

caggtacagc tgcagcagtc agg 23

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>12

cttggtggag gctgaggaga cggtgaccag 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>13

cttggtggaa gctgaagaga cggtgaccag 30

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>14

gacatccaga tgacccagtc tcc 23

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>15

gatgttgtga tgactcagtc tcc 23

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>16

gaaattgtgt tgacgcagtc tcc 23

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>17

gacatcgtga tgacccagtc tcc 23

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>18

gaaacgacac tcacgcagtc tcc 23

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>19

gaaattgtgc tgactcagtc tcc 23

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>20

ggtgcagcca cagtacgtta gatctcca 28

<210>21

<211>94

<212>DNA

<213>

<400>21

tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60

gtggcggtgg tcaggtgcag ctggtgcagt ctgg 94

<210>22

<211>94

<212>DNA

<213>

<400>22

tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60

gtggcggtgg tcaggtcaac ttaagggagt ctgg 94

<210>23

<211>94

<212>DNA

<213>

<400>23

tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60

gtggcggtgg tgaggtgcag ctggtggagt ctgg 94

<210>24

<211>94

<212>DNA

<213>

<400>24

tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60

gtggcggtgg tcaggtgcag ctgcaggagt cggg 94

<210>25

<211>94

<212>DNA

<213>

<400>25

tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60

gtggcggtgg tgaggtgcag ctgttgcagt ctgg 94

<210>26

<211>94

<212>DNA

<213>

<400>26

tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60

gtggcggtgg tcaggtacag ctgcagcagt cagg 94

<210>27

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>27

gtcctcgcaa ctgcggceca gccggccatg gccgacatcc agatgaccca gtctcc 56

<210>28

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>28

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgatgttg tgatgactca gtctcc 56

<210>29

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>29

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaaattg tgttgacgca gtctcc 56

<210>30

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>30

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgacatcg tgatgaccca gtctcc 56

<210>31

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>31

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaaacga cactcacgca gtctcc 56

<210>32

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>32

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaaattg tgctgactca gtctcc 56

<210>33

<211>56

<212>DNA

<213>

<400>33

gagtcattct cgacttgcgg ccgccttggt ggagagctga gagagacggt gaccag 56

<210>34

<211>744

<212>DNA

<213>

<400>34

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtagtt actactgggg ctggatccgc 120

cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgatgc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgagacaa 300

ggtagtagtg gttattacca gaactggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360

gtctcctcat ctggtggcgg cggttctggc ggtggcggtt ttggtggcgg tggtgatgtt 420

gtgatgactc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 480

tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcagc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 540

caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 600

ttcagtggca gcgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagacc ggagcctgaa 660

gattttgcag tgtactactg tcagcaaccg gggttcactt tcggccctgg gaccaaagtg 720

gagatcaaac gtactgtggc tgca 744

<210>35

<211>248

<212>PRT

<213>

<400>35

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gln Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Gln Asn Trp Phe Asp Pro

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Val Val Met Thr Gln

130 135 140

Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser

180 185 190

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Pro Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Gly Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

245

<210>36

<211>123

<212>PRT

<213>

<400>36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Cys Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gln Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Gln Asn Trp Phe Asp Pro

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>37

<211>110

<212>PRT

<213>

<400>37

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Pro Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Gly Phe Thr Phe

85 90 95

Gly Pro Cys Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Claims

1.人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体，其特征在于具有如序列表中序列35所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体，其特征在于其编码基因具有如序列表中序列34所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体的改构体，其特征在于其中重链的氨基酸序列如序列表中序列36所示，轻链的氨基酸序列如序列表中序列37所示。

4.权利要求1、2或3所述人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体或其改构体的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备人源抗A型肉毒神经毒素编码基因；

(2)将该基因克隆入原核或真核表达载体，制备重组表达载体；

(3)将制备的重组表达载体分别转入原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞中进行表达。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中制备人源抗A型肉毒神经毒素编码基因采用化学合成或基因工程方法。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其中原核表达载体为pCANTAB-5E、pET、真核表达载体为pPCI9K。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其中原核细胞为大肠杆菌HB2151、BL21(DE3)、真核细胞为酵母GS115、哺乳动物细胞为CHO。

8.权利要求1、2或3所述人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体或改构体在制备肉毒毒素中毒急救治疗药剂中的用途。

9.权利要求1、2或3所述人源抗A型肉毒神经毒素基因工程抗体或改构体在制备A型肉毒神经毒素检测试剂中的用途。