CN101027047A

CN101027047A - 鉴定用于治疗癫痫发作、神经疾病、内分泌病和激素疾病的药剂的方法

Info

Publication number: CN101027047A
Application number: CN 200380109459
Authority: CN
Inventors: B·林奇; K·诺卡; B·福克斯
Original assignee: UCB SA
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2003-12-02
Publication date: 2007-08-29

Abstract

本发明涉及表征SV2蛋白的性质和功能的方法。本发明还包括鉴定调节SV2蛋白活性的化合物或药剂的方法。包含在这些方法中的有调节左乙拉西坦与SV2蛋白包括SV2A的结合的化合物或药剂的鉴定。另外，本发明还提供了作为工具筛选化学文库和表征SV2蛋白的生物素化配体。此外，本发明还提供了溶解和纯化功能活性的膜结合蛋白如SV2的方法。

Description

鉴定用于治疗癫痫发作、神经疾病、内分泌病和激素疾病的药剂的方法

相关申请

本申请要求于2003年9月30日递交的美国临时申请60/506,764以及于2002年12月3日递交的美国临时申请60/430,372的权益，特此将其全文并入作为参考。

发明领域

本发明一般地涉及神经疾病、内分泌病和激素疾病的药物发现领域。

发明背景

神经疾病折磨着大量的个体，并对卫生保健***提出了渐增的经济学挑战，这是因为对于其致因知之甚少，其诊断经常是主观性的并且多数缺乏有效的治疗。一般而言，脑活动根本上是由神经元在突触联系通讯的能力决定的。特定的神经递质化学物质在突触前神经元中被包装到与突触前膜融合的突触囊泡中，以释放定量的神经递质化学物质，其穿越突触间隙活化驻留在突触后膜中的相应受体类型。在这些受体类型中有神经元谷氨酸盐受体(GluR′s)、γ-氨基丁酸受体(GABAR′s)、烟碱性乙酰胆碱受体、5-羟色胺受体、多巴胺受体等。许多神经疾病是由电流在各脑组织中通过突触的不适当传导引起的。在癫痫中，推测与突触的不正常功能有关的错误电流导致各种水平的癫痫发作。同样地，在几种精神疾病、运动疾病和神经变性疾病中，电流传导变得异常、混乱或降低，由此导致疾病状态。从而，突触囊泡功能缺陷一般将对神经传递特别是对神经递质释放的控制具有不利影响。

癫痫发作，包括癫痫性癫痫发作在内，是由皮层功能局灶性或泛化失调引起的，这可能是归因于各种大脑或全身疾病，包括例如脑水肿、脑缺氧、脑创伤、中枢神经***(CNS)感染、先天或发育性脑缺陷、扩张的脑病变、高烧、代谢障碍以及惊厥或毒性药物的使用。只有当癫痫发作以散发的间隔和持续数年(或无限期地)复发的时候，癫痫症才得以诊断。

癫痫症在病因学上被分为具有归属于三大类的癫痫发作表现的症状性癫痫或特发性癫痫：1)全面强直-阵挛，2)失神或小发作，和3)复杂部分。症状分类表明存在着可能的致因，并且可以尝试特定的疗程以消除该致因，而特发性则表明不能发现明显的致因，并且可能与不清楚的遗传因素有关联。关于癫痫发作类别，多数人只有一种类型的癫痫发作，而大约30％具有两类或更多类。

发生癫痫的风险自出生到20岁为1％，而在75岁时为3％。特发性癫痫一般始于2和14岁之间。2岁前的癫痫发作通常是由发育缺陷、产伤或代谢病导致的。在25岁之后开始的癫痫可能是脑创伤、肿瘤或脑血管病继发的，但50％具有未知的病因。

由于神经和内分泌***之间存在着的许多相互关系，突触囊泡功能的缺陷也能够影响内分泌功能。例如，至少两种腺体仅仅响应适当的神经递质释放而分泌其激素-肾上腺髓质和垂体后叶腺。一经分泌，激素即在血液中运输以在机体的远靶组织中发生生理学作用。显然，涉及激素分泌过多或分泌不足的内分泌病具有病理学后果。这些后果的实例有巨大症和侏儒症，分别归因于生长激素的分泌过多或分泌不足。

左乙拉西坦

左乙拉西坦(LEV；ucb L059；(S)-α-乙基-氧代-吡咯烷乙酰胺)，吡拉西坦乙基类似物的(S)-对映异构体，是在旨在鉴定第二代益智药的后续化学程式期间合成的。体内结果已证明了LEV在听原性敏感小鼠中抑制癫痫发作的出人预料的强效能力，而吡拉西坦仅仅具有微弱活性。尽管LEV是与已确立的抗癫痫药无关的分子(Margineanu等，Antiepileptic Drugs：5th版.pp.419-427.Lippincott，Philadelphia(2002))，广泛的临床试验业已证明用LEV辅助治疗(KEPPRA，uCB，S.A.，Braine-l′Allend，Belgium)在控制成人难治性部分癫痫发作中既有效又被很好地耐受。

在粗制大鼠脑膜上进行的LEV结合试验揭示了可逆、可饱和且为立体选择的特异性结合部位的存在。大鼠海马膜中所获得的结果提示LEV以适度的亲和力并且以高结合能力标记单一类别的结合部位。该结合部位被鉴定为左乙拉西坦结合部位(LBS)。在其它脑区域(皮层、小脑和纹状体)中业已获得相似的结果。Ucb L060，左乙拉西坦的(R)-对映异构体，对这些位点呈现出低大约1000倍的亲和力。LEV的结合似乎限于中枢神经***的膜上，因为放射性标记研究在一系列外周组织包括心脏、肾、脾、胰腺、肾上腺、肺和肝中不能检测到特异性结合。不过，这可能是由于与中枢神经***相比这些组织中LBS的低密度，在PC12细胞-一种外周来源的肾上腺细胞系中的确发生特异性结合。

最常用的抗癫痫药氨甲酰氮、苯妥英、丙戊酸钠、非氨酯、加巴喷丁、硫加宾、氨己烯酸、唑尼沙胺、***和氯硝西泮、以及惊厥剂叔丁基二环硫代磷酸酯(TBPS)、木防己苦毒素和荷苞牡丹碱并不能置换LEV结合(Gillard等Eor.J.Pharmacol.478：1-9.(2003)))。不过，乙琥胺、戊巴比妥、戊四氮和贝美格以与体内所观察到的活性药物浓度相当的pKi值与LEV竞争。结构相关化合物，包括吡拉西坦和阿尼西坦，也置换LEV结合。还在听原性癫痫小鼠模型中测试了左乙拉西坦类似物的抗惊厥活性。在亲和力和抗惊厥活性之间观察到极好的相关性(r²＝0.84)(Noyer等，Euro.J.Pharmacol.286：137-146.(1995))。这种高度相关是LBS结合和这类化合物抗惊厥活性之间因果关系的强有力的支持。从而，左乙拉西坦类似物与LBS的结合预期会导致脑中LBS蛋白组分功能的修饰，引起期望的抗惊厥活性治疗结果。

突触囊泡蛋白2家族

突触囊泡蛋白的突触囊泡蛋白2(SV2)家族最初是用针对来自海鳐D.ommata放电器官的胆碱能囊泡所制备的单克隆抗体鉴定的(Buckley等，J.Cell Biol.100：1284-1294.(1985))。由所述抗体标记的各个家族成员的克隆导致鉴定了三种不同的同工型：SV2A(Bajjalieh等，Science.257：1271-1273.(1992))、SV2B(Feany等，Cell.70(5)：861-867.1992)和SV2C(Janz和Sudhof，Neuroscience 94(4)：1279-1290.(1999))，它们都与原始抗体反应。这三种大鼠同工型之间的总体同源性大约为60％，SV2A和SV2C与SV2B相比彼此更为相似(Janz和Sudhof，Neuroscience 94(4)：1279-1290.(1999))。

SV2蛋白为整合膜蛋白，并与转运糖、柠檬酸及外源性化学物质的细菌和真菌转运蛋白的12跨膜家族具有重要但低水平的同源性(20-30％)(Bajjalieh等，Science.257：1271-1273.(1992))。作为12 TM超家族的推定成员，SV2蛋白呈现出数种独特的特征。它们具有相对短的游离N-和C-末端，以及连接Tm区段的短环。然而，两个值得注意的例外是跨膜区6和7之间的长胞质环以及跨膜区7和8之间的囊泡内环(其含有3个N-糖基化位点)。尚未在酵母或无脊椎动物中发现SV2蛋白的近亲同系物，尽管公知为SVOP的远缘相关突触囊泡蛋白确实具有果蝇(Drosophila)和线虫(C.elegans)同系物(Janz等，J.Neurosci.18(22)：9269-9281.(1998))。

作为家族，SV2蛋白广泛分布于脑和内分泌细胞中。这三个同工型在分布上显著重叠，并且可见共表达在同一神经元之中，甚至是在同一突触囊泡之上。SV2蛋白的一个同工型或另一个似乎存在于所有突触囊泡之上，并且它们很可能不限于含任何特定神经递质的神经元，尽管一项研究报道胆碱能囊泡可能不含SV2(Blumberg等，J.Neurochem.58(3)：801-810(1992))。因此SV2蛋白是突触囊泡的最常见蛋白之一，并且业已牵涉到对钙介导的突触囊泡胞吐作用的控制。SV2蛋白还显示出在内分泌细胞中表达，并且同另外的突触囊泡膜整合蛋白p38和p65一起，业已证明存在于内分泌致密核心颗粒膜中(Lowe等，J.Cell.Biol.106(1)：51-59(1988)。SV2A，最常见的SV2同工型，普遍地表达在整个脑中，并且也存在于内分泌细胞的分泌颗粒中。SV2B，尽管广布于脑中，但在数种脑结构中检测不到，包括海马齿状回、苍白球、丘脑网状核以及黑质网状部(Bajjalieh等，1994)。相形之下，SV2C具有相当有限的分布，并且主要地见于***发生上古老的区域如苍白球、黑质、中脑、脑干以及嗅球。它在大脑皮层以及海马区不可检测，并且低水平地见于小脑皮层(Janz和Sudhof，Neuroscience 94(4)：1279-1290.(1999))。

除了SV2蛋白之外，突触含有其它独特的调节蛋白如突触蛋白I、突触结合蛋白和CAPS，它们可介导囊泡融合或出芽。SV2A可能是形成称之为SNARE复合物的融合前复合物所必需的Ca²⁺调节蛋白(Xu等Cell 99(7)：713-722(1999))，所述复合物包括突触囊泡相关VAMP/小突触小泡蛋白和质膜蛋白突触融合蛋白以及SNAP-25。一旦Ca²⁺在突触中累积，突触结合蛋白与SV2A的结合即被抑制，且2个突触结合蛋白Ca²⁺结合结构域的二聚化即被刺激(Bajjalieh，Curr.Opin.Neurobiol.9(3)：321-328.(1999))。这种二聚化可能在组建SNARE复合物以及促进囊泡融合中起作用，因为在低Ca²⁺浓度时，SV2A保持结合于突触结合蛋白而融合将不会发生。

SV2A对突触结合蛋白的亲和力受SV2氨基末端磷酸化作用的调控(Pyle等，J.Biol.Chem.275(22)：17195-17200.(2000))。SV2蛋白在Ca²⁺运输或突触囊泡调控中起作用的可能性业已得到关于SV2A和SV2B敲除动物的研究的支持(Janz等，Neuron 24：1003-1016.(1999))。可供选择的假说是SV2蛋白尽管衍生自转运蛋白，现在在囊泡中作不同的功能之用，要么是结构作用，要么是囊泡融合或再循环及其内含物胞吐作用释放的调控作用(Janz和Sudhof，Neuroscience94(4)：1279-1290.(1999))。

业已有关于SV2蛋白敲除小鼠的两篇报道：仅研究SV2A敲除的一篇(Crowder等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96(26)：15268-15273.(1999))以及考虑SV2A和SV2B两种敲除动物以及SV2A/SV2B双敲除的另一篇(Janz等，Neuron 24：1003-1016.(1999))。

SV2A基因破坏纯合动物出生时表现正常，但不能成长，经历严重的癫痫发作，并在出生后头几周内死亡。SV2A纯合敲除小鼠经历比任何其它小鼠品系持续更长、更强且更令其衰弱的癫痫发作(Janz等，Neuron 24：1003-1016.(1999))。尽管出现出生后癫痫发作，所有SV2A敲除动物具有完全正常的大体脑形态学，包括正常水平的测试突触蛋白。此外，来自SV2A及SV2A/SV2B双敲除小鼠的海马神经元培养物都形成超微结构上正常的突触，且具有未改变的突触囊泡大小、数目和位置(Janz等，Neuron 24：1003-1016.(1999)；Crowder等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96(26)：15268-15273.(1999))。与在许多其它类型的敲除中频繁观察到的因容易检测的结构或发育异常所致的癫痫发作不同，SV2A敲除小鼠表现出强烈的癫痫发作表型而没有相伴的脑或突触的宏观或微观异常。作为脑功能的另一种标志，来自SV2A、SV2B及SV2A/SV2B敲除小鼠的原代神经元培养物中突触传递的研究显示，sIPSCs和自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)的大小和频率是正常的。电刺激在来自所有基因型的培养神经元中诱导了强健的EPSCs和IPSCs。

与SV2A相反，SV2B敲除小鼠未展现出明显的病理学(Janz等，1999)。提示这种缺乏丧失SV2B后果的一种可能原因在于其在功能上可被SV2A替代，在正常表达SV2B的每一处，似乎都共表达SV2A。

虽然SV2A及其它家族成员的功能仍然未知，一个假说是该转运蛋白同系物为一些常见突触囊泡分子的功能转运蛋白。更具体地，有证据将SV2A与钙介导的囊泡胞吐作用的调控联系起来，因此认为它可能是Ca²⁺转运蛋白。SV2A及其它家族成员可能也在突触囊泡的功能中起作用。此类作用可能包括其形成、神经递质荷载、与质膜融合、再循环、以及与其它蛋白及细胞区室和细胞器相互作用的调节方面。例如，业已证明SV2蛋白能够与突触囊泡蛋白突触结合蛋白以及胞外基质蛋白层粘连蛋白-1相互作用(Carlson，Perspect.Dev.Neurobiol.3(4)：373-386(1996))。SV2蛋白可能在调控突触前末梢的胞质或细胞器钙水平中起着重要作用，并且也可能直接或间接地与质膜上的N-型钙通道相互作用。

发明概述

本发明人发现SV2A为抗癫痫药LEV及其类似物的结合部位。某些癫痫动物模型中一系列左乙拉西坦类似物的相对结合亲和力与其抗惊厥效力之间的高度相关提供了强有力的证据，即这些类似物与SV2蛋白的结合修饰其功能以提供抗惊厥作用。

在优选的实施方案中，本发明包括治疗与突触囊泡功能相关的神经疾病、内分泌病或激素疾病的方法，包括给药调节SV2蛋白功能或活性的化合物或药剂。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括发现或建模SV2蛋白与化合物或药剂之间的相互作用的方法，所述化合物或药剂从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择。所述方法包括使SV2蛋白与所述化合物或药剂接触，测量并分析SV2蛋白与所述化合物或药剂之间的相互作用。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括鉴定SV2蛋白内的左乙拉西坦结合部位的方法。所述方法包括使SV2蛋白或其片段与从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择的化合物或药剂接触，并确定所述化合物或药剂与SV2蛋白或其片段的结合。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括测定SV2蛋白与第二蛋白之间的相互作用的方法。所述方法包括在细胞中表达SV2蛋白及目的蛋白。所述方法还包括将细胞暴露于与左乙拉西坦结合部位结合的化合物或药剂，并确定SV2蛋白与目的蛋白之间的相互作用。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括鉴定调节与突触功能相关的神经疾病、内分泌病或激素疾病的化合物或药剂的方法。所述方法包括将SV2蛋白暴露于所述化合物或药剂，并确定所述化合物或药剂是否调节SV2蛋白的活性。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括鉴定针对从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择的化合物或药剂的细胞应答的方法。所述方法包括将表达SV2蛋白的细胞暴露于所述化合物或药剂，并分析所暴露的细胞中核酸或蛋白表达的变化。核酸可以是RNA，且RNA的表达可通过杂交如微阵列上的杂交来分析。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：5的核酸序列或其互补物。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括鉴定SV2蛋白的结合伴侣(partner)的方法。所述方法包括将SV2蛋白或片段暴露于潜在的结合伴侣，并将所述蛋白或片段以及潜在的结合伴侣与(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺温育。所述方法还包括确定(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺与蛋白的结合是否受潜在结合伴侣的抑制，由此鉴定所述蛋白的结合伴侣。

又在另一优选的实施方案中，本发明包括鉴定可用于治疗神经或内分泌疾病的药剂的方法。所述方法包括将SV2蛋白或片段暴露于所述药剂和左乙拉西坦或其类似物或衍生物。所述方法还包括确定左乙拉西坦或其类似物或衍生物与该蛋白的结合是否受所述药剂调节，由此鉴定可用于治疗神经或内分泌疾病的药剂。

又在另一优选的实施方案中，本发明包括鉴定可用于治疗神经或内分泌疾病的药剂的方法。所述方法包括将SV2蛋白或片段暴露于所述药剂，并将所述蛋白或片段和药剂与(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺温育。所述方法还包括确定(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺与蛋白的结合是否受所述药剂抑制，由此鉴定所述蛋白的结合伴侣。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括发现或建模SV2蛋白或其片段或衍生物与化合物或药剂之间的相互作用的方法，其中化合物或药剂从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择。所述方法包括介由生物化学、生物物理学、纯计算技术或这些方法的一些组合创建SV2蛋白或其片段的三维模型，并创建可能潜在地结合SV2蛋白的一种潜在配体或潜在配体集合的三维模型。

在另一个优选的实施方案中，本发明包括发现或建模SV2蛋白与化合物或药剂之间的相互作用的方法，其中化合物或药剂从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择。所述方法包括确定潜在的CNS活性分子在遗传野生型动物中或在来源于此类动物的分子、细胞或组织中的生物化学、药理学、生物体、细胞或分子效应，并比较所测量的该化合物在SV2蛋白敲除或削弱(Knocked down)***的等同研究中的效应。

本发明也提供了生物素化的配体作为工具筛选化学文库，定位组织中的SV2蛋白，以及表征纯化的SV2蛋白。本发明的SV2蛋白包括SV2A、SV2B和SV2C。SV2/LBS特别是SV2A/LBS的配体及其衍生物可被生物素化，用以筛选天然存在的脑膜如动物、哺乳动物或人脑膜，或者用于筛选表达SV2蛋白的细胞系。本发明也提供了光活化的生物素化SV2/LBS配体。这些筛选测定使得鉴定与SV2互作的新药或化合物成为可能。

此外，本发明提供了纯化膜结合蛋白的方法，包括溶解来自组织的蛋白以形成溶解复合物，并分离功能形式的溶解复合物。溶解的蛋白或复合物可利用结合该蛋白的抗体进行亲和纯化。可通过此法纯化的膜结合蛋白的实例包括SV2蛋白家族如SV2A、SV2B及SV2C。可用于本发明方法的去污剂包括正十二烷基-β-麦芽糖苷及其类似物或衍生物如正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基-β-D-麦芽糖苷。

生物素化的配体也可作为工具用于评估溶解、免疫亲和纯化及层析后SV2蛋白的构象状态。

在一个实施方案中，SV2蛋白可以是融合蛋白，包含至少一种SV2蛋白或其片段以及融合伴侣。融合伴侣可以是融合标签，如多聚组氨酸标签或谷胱甘肽-S-转移酶标签。融合伴侣可以连接于SV2蛋白的N-末端或C-末端。

在另一个实施方案中，所述蛋白如SV2蛋白可缺失至少一个糖基化位点。在有些情况下，可实施定点诱变以除去SV2蛋白中的一个或多个糖基化位点。

SV2蛋白或片段可从天然来源如哺乳动物膜例如大鼠脑膜中纯化。备选地，在转化的宿主细胞上表达SV2蛋白或片段。另外，可固定SV2蛋白或片段。

在一个方面，可直接或间接地标记配体。标记可以是放射性标记如³H、荧光标记或酶。

附图的简要说明

图1描绘了大鼠大脑皮层中LEV类似物ucb 30889与LBS的可逆结合。

图2描绘了ucb 30889的饱和结合曲线。

图3显示了在外周组织中检测不到特异性结合。

图4描绘了竞争结合曲线，显示ucb 30889以比LEV高大约10倍的亲和力与LBS结合。

图5描绘了ucb 30889相对于左乙拉西坦的pIC₅₀值。

图6描绘了在大鼠脑放射自显影中未标记的左乙拉西坦对[³H]ucb 30889结合的浓度依赖性抑制。

图7描绘了[³H]ucb 30889与大鼠脑冠状面结合的放射自显影。

图8描绘了大鼠脑内[³H]ucb 30889结合的亚细胞分布。

图9描绘了通过蔗糖梯度离心对突触体级分的细分级。

图10描绘了[³H]ucb 30889对LBS的光标记以及该复合物的不可逆性。

图11描绘了[³H]ucb 30889标记的膜蛋白的凝胶电泳。

图12(A和B)描绘了转染有SV2A的COS-7细胞的免疫染色溶胞产物、粗制大鼠脑膜以及具有不同水平LBS的几种不同的PC 12溶胞产物。

图13描绘了[³H]ucb 30889与由SV2A-12.2转染、由对照β-gal表达载体转染的COS-7、或者未经转染的细胞的特异性结合。

图14描绘了比较在³H-30889存在下三种不同配体结合SV2A的IC₅₀图。

图15描绘了(A)左乙拉西坦和(B)ucb 30889的结构。

图16(A和B)描绘了[³H]ucb 30889对脑膜的结合。A.[³H]ucb30889对来自SV2A、SV2B和SV2A/SV2B敲除小鼠的脑膜的结合。单独的[³H]ucb 30889(□)，[³H]ucb 30889加1mM LEV(■)。误差条柱为用5个野生型脑和4个KO脑进行的实验的SD。每个实验进行一式三份。B.由抗-SV2单克隆抗体(与所有同工型SV2A、SV2B和SV2C交叉反应)探测的来自野生型和纯合敲除小鼠的脑膜的Western印迹。泳道1：野生型；2：SV2A敲除；3：SV2B敲除；4：SV2A/B双敲除。

图17(A和B)描绘了[³H]ucb 30889对表达hSV2A的COS-7细胞的结合。A.[³H]ucb 30889对COS-7细胞中瞬时表达的hSV2A的结合。测试了[³H]ucb 30889对未转染COS-7细胞或瞬时表达β-gal或hSV2A的COS-7细胞的结合。单独的[³H]ucb 30889(□)，[³H]ucb30889加1mM LEV(■)。B.在[³H]ucb 30889的存在下LEV、ucb L060、ucb 30889针对COS-7中瞬时表达的hSV2A的IC₅₀曲线。LEV(□)ucb30889(■)ucb L060(●)。误差条柱为SEM，n＝3。

图18(A和B)描绘了[³H]ucb 30889在竞争药物存在下的结合。A.一系列LEV化合物对小鼠脑和对hSV2A结合的相互关系，pIC₅₀s是针对[³H]ucb 30889测量的。pIC₅₀值为两次独立实验的均值，其中每次测定落入该均值的0.2个对数单位之内。B.在瞬时转染的COS-7细胞中测定的一系列LEV家族化合物对hSV2A的结合(pIC₅₀s是针对[³H]ucb 30889测量的)与小鼠听原性模型中抗癫痫发作效力的相互关系。

图19描绘了ucb-101282-1的结构。该配体是ucb 30889的生物素化衍生物。

图20描绘了大鼠脑膜中ucb-101282-1的pKi为6.3(n＝2)，这与LEV所报道的亲和力相当。

图21(A、B和C)描绘了可溶性SV2A的制备以及通过结合试验的定量。A.使用抗-SV2A抗体通过western印迹检测溶解的大鼠脑膜上清中的可溶性SV2A。B.分析左乙拉西坦和ucb 30889特异性结合可溶性SV2A的能力。C.斯卡查德分析显示[³H]ucb 30889与天然大鼠脑膜中SV2A结合的K_D为30nM，而对于可溶性蛋白为82nM。

图22描绘了SV2A伴侣的鉴定。Western印迹分析显示突触结合蛋白与来自溶解大鼠脑膜的上清的免疫纯化级分中的可溶性SV2A结合。未检测到同工型SV2B。

详细描述

1.突触囊泡蛋白2(SV2)家族的蛋白

结合LEV或其衍生物或类似物的任何SV2蛋白都可用在本文所述的测定法中。

如本文所用，SV2蛋白包括分离的蛋白、该蛋白的等位基因变体以及该蛋白的保守氨基酸置换。如本文所用，“蛋白”或“多肽”部分地是指SV2A，即由SEQ ID NO：1的核酸序列所编码的蛋白，或具有SEQ ID NO：2中所述的人氨基酸序列的蛋白或其片段；SV2B，其包括由SEQ ID NO：3的核酸序列所编码的人蛋白，或SEQ ID NO：4中所述的氨基酸序列或其片段；SV2C，其包括由SEQ ID NO：5的核酸序列所编码的人蛋白，或SEQ ID NO：6中所述的氨基酸序列或其片段；以及SVOP，其包括由SEQ ID NO：7的核酸序列所编码的人蛋白，或SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列或其片段。该术语也指天然存在的等位基因变体以及具有与上文明确叙述的稍微不同的氨基酸序列的蛋白。等位基因变体尽管拥有与上述那些稍微不同的氨基酸序列，仍将具有相同或相似的与这些蛋白相关的生物学功能。

如本文所用，与SEQ ID NO：2、4、6或8的人氨基酸序列有关的SV2蛋白家族部分地是指业已从除人之外的生物体中分离的蛋白。例如，业已鉴定SV2A核酸(SEQ ID NO：9)和蛋白(SEQ ID NO：10)、SV2B核酸(SEQ ID NO：11)和蛋白(SEQ ID NO：12)、SV2C核酸(SEQ ID NO：13)和蛋白(SEQ ID NO：14)以及SVOP核酸(SEQ ID NO：15)和蛋白(SEQID NO：16)的大鼠同系物并包含在本文之中。用于鉴定和分离与这些蛋白有关的蛋白家族其它成员的方法在下文描述。

本发明所用的SV2蛋白优选为分离形式，部分为细胞或囊泡膜碎片，在转化的宿主细胞之中表达，或者在给定的细胞或组织类型中天然地表达。如本文所用，当采用物理、机械或化学方法将蛋白从通常与该蛋白结合相关的细胞组分中取出的时候，称该蛋白是分离的。技术人员能够容易地采用标准纯化方法以获得分离的蛋白。

可用于本发明方法之中的SV2蛋白进一步包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16的***、缺失、保守氨基酸置换或剪接变体。如本文所用，“保守”变体是指氨基酸序列中并不不利地影响蛋白生物学功能的改变。当改变的序列阻止或破坏与蛋白相关的生物学功能时，则置换、***或缺失被表述为不利地影响所述蛋白。例如，可改变蛋白的总电荷、结构或疏水/亲水性质，而无不利地影响生物学活性。相应地，可改变氨基酸序列，例如使得肽更为疏水或亲水，而无不利地影响蛋白的生物学活性。如本文所用，“缺失”被定义为其中分别缺少了一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列中的变化；“***”或“添加”是指与天然存在的SV2相比，分别导致增添了一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列中的变化，而“置换”是由一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸替代造成的。

本发明的SV2蛋白进一步包括融合蛋白，其中SV2蛋白或其片段，以N-或C-末端融合于另一SV2蛋白或其片段(其可以相同或不同于第一SV2蛋白或其片段)和/或异源肽融合伴侣。所述异源肽可以是可用于SV2蛋白或其片段的表达、纯化、溶解性、鉴定、抗原性或稳定性延长的多肽序列。可用于本发明的异源融合伴侣包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多聚组氨酸标签、绿色荧光蛋白(GFP)、白蛋白以及卵白蛋白或其片段。

一般地，等位基因变体、保守置换变体以及SV2蛋白家族成员将具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16中所示全长序列具有至少大约35％、40％、50％、60％、65％、70％或75％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选至少大约80％，甚至更优选至少大约90％，并且最优选至少大约95％、97％或99％的序列同一性。就此类序列而言的同一性或同源性在文中定义为在比对序列且如有必要引入空位以实现最大百分比同源性之后，候选序列中与已知肽完全相同的氨基酸残基的百分比，而且任何保守置换并不被视为序列同一性的一部分(相关参数见B节)。融合蛋白或者N-末端、C-末端或内部延伸、缺失或***肽序列之中不应当解释为影响同源性。

设想的变体进一步包括通过例如同源重组、定点或PCR诱变而含有预定突变的那些，以及其它动物物种包括但不限于兔、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马和非人灵长类物种的相应蛋白，和所述蛋白家族的等位基因或其它天然存在的变体；以及衍生物，其中蛋白业已通过取代、化学、酶促或其它适当的手段由除天然存在的氨基酸以外的部分(例如可检测部分如酶或放射性同位素)共价修饰。

SV2蛋白的片段也可用在本发明的方法之中。特别地，可使用包含LEV结合部位的片段。此类片段可具有至少大约6或10个、15或20个、或者25或30个氨基酸残基，大约35或40个氨基酸残基，大约45或50个氨基酸残基，大约55或60个、大约65或70个氨基酸残基，或者至少大约75或更多个氨基酸残基。

本发明的方法也可利用编码SV2蛋白家族成员的核酸分子，所述SV2蛋白家族成员包括但不限于公知为SV2A、SV2B、SV2C及相关突触囊泡蛋白SVOP的大鼠和人蛋白，例如由SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16组成或包含这些序列的那些以及本文中描述的相关蛋白，优选为分离的形式。也可使用载体、质粒和转化的宿主细胞生产SV2蛋白。如本文所用，“核酸”被定义为RNA或DNA或相关分子，其编码如上文所定义的蛋白或肽，与编码此类肽的核酸序列互补，在合适的严谨条件下与此种核酸杂交且保持稳定地与之结合，或编码与SEQID NO：2、4、6、8或10的全长肽序列享有至少大约35％、40％、50％、60％、65％、70％或75％序列同一性，优选至少大约80％，更优选至少大约85％，并且甚至更优选至少大约90％、95％、97％或99％或更高同一性的多肽。可用于本发明的“核酸分子”进一步包括与SEQ ID NO：1、3、5、7或9的核苷酸享有至少大约70％或75％序列同一性，优选至少大约80％，更优选至少大约85％，并且甚至更优选至少大约90％并且最优选95％、97％、99％或更高同一性的核酸分子。本发明的核酸也包括编码包含以N-或C-末端融合于异源蛋白序列或另一SV2蛋白序列的SV2蛋白的融合蛋白的那些核酸。

核苷酸或氨基酸序列水平上的同源性或同一性是使用为序列相似性检索而量身定做的blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的算法(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(1990))通过BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析确定的。BLAST程序所用的途径在于首先考虑查询序列与数据库序列之间在带有和没有空位的情况下的相似区段，然后评价识别的所有匹配的统计学显著性，且最后仅总计满足预选显著性阈值的那些匹配。有关序列数据库相似性查找中基本问题的讨论，见Altschul等，(NatureGenetics 6，119-129(1994))。关于柱形图、说明、比对、赋值(即用于报告针对数据库序列的匹配的统计学显著性阈值)、截断值、矩阵和过滤(低复杂性)的查找参数为默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx所用的默认评分矩阵为BLOSUM62矩阵(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919(1992))，推荐用于长度超过85个(核苷酸碱基或氨基酸)的查询序列。

对于blastn，评分矩阵是由M(即一对匹配残基的奖励分)与N(即错配残基的罚分)的比值设定的，其中M和N的默认值分别为+5和-4。四个blastn参数调整如下：Q＝10(空位创建罚分)；R＝10(空位延伸罚分)；wink＝1(延查询序列每第几wink位上产生单字命中)；而gapw＝16(设置窗口宽度，其内产生引入空位的比对)。等效的Blastp参数设置为Q＝9；R＝2；wink＝1；而gapw＝32。可在10.2版的Accelrys′Wisconsin软件包中获得序列之间的空位比较，使用DNA参数GAP＝50(空位创建罚分)和LEN＝3(空位延伸罚分)，且蛋白比较中等效的设置为GAP＝8和LEN＝2。

“严谨条件”包括那些(1)采用低离子强度和高温用于洗涤，例如50℃下0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，或(2)在杂交期间采用变性剂如甲酰胺，例如42℃下50％(vol/vol)甲酰胺含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液，750mM NaCl、75mM柠檬酸钠。另一个实例是在50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt′s液、超声破碎的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖中于42℃杂交，于42℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。技术人员能够容易地确定并适当地改变严谨条件以获得清晰且可检测的杂交信号。优选的分子是在上述条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13或15的互补物杂交且编码功能蛋白的那些分子。甚至更为优选的杂交分子是在上述条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13或15的开放读框的互补链杂交的那些分子。

如本文所用，当核酸分子实质上与编码其它多肽的污染核酸分子分开时，该核酸分子被表述为是“分离”的。

A.SV2A和左乙拉西坦结合部位(LBS)

本发明包括位于SV2A蛋白上的LBS的表征和用途。

如上所述，″SV2A″包括如SEQ ID NO：2中所述的人蛋白、由SEQID NO：1所编码的人蛋白、人SV2A的物种同系物，如文中所述的SEQID NO：2的变体、以及包含LBS的SV2A片段。

II.左乙拉西坦及类似物

本发明的方法包括LEV及LEV类似物或其衍生物在鉴定新的药理学活性剂的测定中的用途。在优选的实施方案中，本发明的方法鉴定与LEV及LEV类似物或其衍生物竞争结合SV2的LBS的化合物或药剂。如本文所用，术语“竞争”和“竞争性结合”是指这样的药剂或化合物，其占据LBS上与LEV或其类似物或衍生物相同的结合部位；在与LBS的结合中置换LEV或其类似物或衍生物或被其置换；或者在与LBS的结合中抑制LEV或其类似物或衍生物或被其抑制。在另一个优选的实施方案中，本发明包括鉴定调节SV2A活性的化合物或药剂。在另一个优选的实施方案中，本发明的方法鉴定对LBS具有比LEV更小、大约相同、或更大亲和力的化合物或药剂。而在另一个优选的实施方案中，本发明的方法鉴定对LBS具有比ucb 30889更小、大约相同、或更大亲和力的化合物或药剂。又在另一个优选的实施方案中，本发明的方法鉴定比有效量的LEV以有效量调节SV2A活性更长时间的化合物或药剂。甚至在另一个优选的实施方案中，本发明的方法鉴定比有效量的LEV以有效量调节SV2A活性更短时间的化合物或药剂。

如本文所用，″左乙拉西坦″(图15A；LEV)是指如欧洲专利No.0162036 B1中所公开的化合物(S)-α-乙基-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的国际非专有名称，特此全文并入作为参考。LEV为左旋化合物，它是治疗和预防中枢神经***缺氧和局部缺血类型攻击的保护剂。该化合物在癫痫治疗中也有效。外消旋α-乙基-氧代-1-吡咯烷乙酰胺及其类似物因英国专利No.1309692而为人公知。美国专利No.3,459,738公开了2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的衍生物。

如本文所用，术语“LEV类似物或其衍生物”包括任选取代的N-烷基化2-氧代-吡咯烷衍生物。优选地，那些化合物为在吡咯烷酮环4和/或5位上取代的烷基酰胺类衍生物。任选取代的N-烷基化2-氧代-吡咯烷衍生物的实例包括但不限于：诸如国际专利申请PCT/EP01/01992中所公开的那些化合物，例如(2S)-2-[(4S)-4-(2，2-二氟乙烯基)-2-氧代吡咯烷基]丁酰胺、(2S)-2-[(4R)-2-氧代-4-丙基吡咯烷基]丁酰胺、(2S)-2-[(4S)-2-氧代-4-丙基吡咯烷基]丁酰胺以及(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺。

如本文所用，术语“LEV类似物或其衍生物”进一步包括任选取代的N-烷基化2-氧代-哌啶基衍生物。优选地，那些化合物为2-氧代-哌啶基环4和/或5和/或6位上取代的烷基酰胺类衍生物。任选取代的N-烷基化2-氧代-哌啶基衍生物的实例包括但不限于：诸如国际专利申请PCT/EP 02/05503中所公开的那些化合物，例如(2S)-2-[5-(碘代甲基)-2-氧代-1-哌啶基]丁酰胺、(2S)-2-[5-(叠氮基甲基)-2-氧代-1-哌啶基]丁酰胺、2-(2-氧代-5-苯基-1-哌啶基)丁酰胺、(2S)-2-[4-(碘代甲基)-2-氧代-1-哌啶基]丁酰胺以及(2S)-2-[4-(2-氟-2-甲基丙基)-2-氧代-1-吡咯烷基]丁酰胺。

如本文所用，术语“LEV类似物或其衍生物”包括外消旋或同分异构体形式的式I的任何acetam化合物，或其药学上可接受的盐，

其中

-R代表氢或羟基；

-R¹和R²独立地代表氢或1-4个碳原子的烷基；且

-R³和R⁴独立地代表氢、1-4个碳原子的烷基、或-(CH₂)_n-NR⁵R⁶，其中n为1、2或3，而R⁵和R⁶独立地代表氢或1-4个碳原子的烷基。

此种acetam化合物的实例包括但不限于：式I中R、R¹、R²、R³和R⁴为氢的化合物，即2-氧代-吡咯烷乙酰胺，如英国专利No.1,039,113和1,309,692中所述，以通用名吡拉西坦著称。

如本文所用，术语“LEV类似物或其衍生物”也包括任选取代的N-烷基化2-氧代-azepanyl衍生物。优选地，那些化合物为2-氧代-azepanyl环4和/或5和/或6和/或7位上取代的烷基酰胺类衍生物。任选取代的N-烷基化2-氧代-azepanyl衍生物的实例包括但不限于：诸如国际专利申请PCT/EP 02/05503中所公开的那些化合物，例如2-[5-(碘代甲基)-2-氧代-1-azepanyl]丁酰胺。

在另一个实施方案中，本发明包括与LBS结合的作为吡拉西坦衍生物或类似物的化合物或药剂。此类化合物也将包括诸如阿尼西坦和奈非西坦的分子。在优选的实施方案中，吡拉西坦衍生物或类似物是调节SV2A或其它SV2家族成员的活性的那些。

III.测定法形式

本发明的测定法包括鉴定可用于治疗神经疾病如癫痫发作、癫痫、帕金森氏病、帕金森氏运动障碍、偏头痛、阿尔茨海默病、神经性疼痛、特发性震颤、认知障碍、运动疾病，内分泌病以及肾上腺髓质相关疾病如低血糖和循环休克的药剂或化合物的方法。本发明的测定法也包括鉴定具有认知增强效果的药剂或化合物的方法，例如可以在动物认知模型中测量。特别是，本发明的测定法包括鉴定与LEV或其类似物或衍生物竞争结合SV2A的LBS、在与LBS的结合中置换LEV或其类似物或衍生物或被其置换、或者在与LBS的结合中抑制LEV或其类似物或衍生物或被其抑制的药剂或化合物的方法。

LEV、ucb 30889(图15B)以及如上文所述的其它LEV衍生物或类似物在本发明的方法中可作为结合剂用于筛选与SV2A的LBS结合的新化合物或药剂的测定法之中。在此类测定法的实施方案中，LEV、ucb30889以及衍生物或类似物可不经修饰而使用，或者可由多种方式修饰；例如通过标记，如共价或非共价地连接直接或间接地提供可检测信号的部分。在任何这些测定法中，物质都可直接或间接地标记。直接标记的可能性包括标记基团，例如放射性标记，包括但不限于[³H]、[¹⁴C]、[³²p]、[³⁵S]或[¹²⁵I]，酶如过氧化物酶和碱性磷酸酶，以及能够监控荧光强度变化、波长迁移或荧光偏振的荧光标记，包括但不限于荧光素或罗丹明。另外，可使用FRET技术分析配体与SV2A的LBS之间的相互作用。间接标记的可能性包括生物素化一个组分，紧接着结合与上述标记基团之一偶联的抗生物素蛋白，或者使用抗-配体抗体。在化合物待要连接于固相支持物的情况下，化合物也可以包括间隔臂或接头。

为鉴定与LEV和ucb 30889及衍生物竞争或互作以结合SV2A的LBS的药剂或化合物，可使用完整细胞、包含SV2A的细胞或膜碎片、或整个SV2A蛋白、或包含SV2A蛋白的LBS的片段。可在与LEV或其类似物或衍生物温育之前、同时或之后，使药剂或化合物与所述细胞、膜、SV2蛋白或片段温育。本发明的测定法能够测量有关SV2蛋白已知的任何性质或功能，突触囊泡、神经传递和/或内分泌细胞功能以及突触前积累二价阳离子包括Ca²⁺。可作为测定终点测量的SV2蛋白的性质或功能的实例包括但不限于：磷酸化状态、二价阳离子包括Ca²⁺的结合、膜转运、将二价阳离子(包括Ca²⁺)转运进入和/或运出突触囊泡、将神经递质(包括但不限于胺、乙酰胆碱、兴奋性神经递质、GABA、5-羟色胺和甘氨酸)转运进入和/或运出突触囊泡、与其它蛋白(包括但不限于层粘连蛋白和突触结合蛋白)的相互作用、如通过对蛋白水解的敏感性或者生物化学或生物物理性质的其它改变所测量的构象改变、二价阳离子通道的形成、蛋白复合物的形成或解离、突触囊泡功能、融合、胞吐作用、以及突触囊泡再循环。

本发明的测定法可被修饰或制备为任何可利用形式，包括监控LEV或其衍生物或类似物与SV2A或者SV2A蛋白的LBS结合的高通量测定法。在测试化合物文库的许多药物筛选程序中，希望进行高通量测定法以最大化给定时间期限内所调查的化合物数目。此类筛选测定法可使用完整细胞、含SV2A的细胞或膜碎片、以及无细胞或无膜***，例如可衍生自纯化或半纯化的蛋白。使用含有SV2A的膜碎片或纯化的SV2A蛋白和肽的测定法的有利之处在于通常可忽略测试化合物的细胞毒性和/或生物利用度的效应，取而代之的是所述测定法主要地集中于药物对分子靶的效应，正如可在例如两分子间结合的抑制中所显现的那样。

在竞争性筛选测定法的一个实施方案中，可设计测定法以检测测试药剂或化合物抑制ucb 30889与SV2A或包含LBS的SV2A片段、或者LEV或其衍生物或类似物与SV2A或包含LBS的SV2A片段相结合的能力。在竞争性筛选测定法的另一个实施方案中，可设计测定法以检测ucb 30889或者LEV或其衍生物或类似物抑制测试药剂或化合物与SV2A或包含LBS的SV2A片段结合的能力。可通过多种技术检测对复合物形成的抑制。例如，可使用例如可检测标记的ucb 30889、LEV或LEV衍生物或类似物定量复合物形成的调节。可使用可检测标记形式的、测定与SV2A的LBS竞争性结合的药剂或化合物来检测对复合物形成的抑制。备选地，可无需标记探针来检测SV2A蛋白与配体之间的结合。例如表面plasmon共振、核磁共振或质谱是用于此类结合测定法的上选工具。另一种方法是测量由配体结合所诱导的SV2蛋白对蛋白酶敏感性的改变。

在有些情况下，将希望固定LBS(SV2A或包含LBS的SV2A片段)或配体(LEV、ucb 30889或者测试药剂或化合物)之一，以易化复合物与非复合形式的分离，以及适应测定法的自动化。在存在和不存在LEV或ucb 30889下配体与LBS的结合，例如候选药剂或化合物与SV2A的结合，可在适合于容纳反应物的任何容器中实现。实例包括微量滴定板、试管、以及微量离心管。在一个实施方案中，可提供融合蛋白，其增加了允许LBS结合到基质上的结构域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白可吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽衍生微量滴定板上，其然后与标记的LEV、ucb 30889或者LEV衍生物或类似物以及未标记的测试药剂或化合物混合；或者备选地，与未标记的LEV、ucb 30889或者LEV衍生物或类似物以及标记的测试药剂或化合物混合。然后在有助于复合物形成的条件下温育混合物。温育后，洗涤珠子以除去任何未结合的反应物，并直接测定基质固定的标记，或在LBS/配体复合物随后解离之后在上清中测定。合适时，可从基质上解离复合物，通过SDS-PAGE分离，并使用标准电泳技术从凝胶中定量见于珠级分中的配体水平。

也可获得其它用于将蛋白固定到基质上的技术用于本测定法。例如，可利用生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合固定LBS。可使用本领域众所周知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，I11.)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化分子，并固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。备选地，可将与LBS反应但并不干扰配体结合的抗体衍生到板孔中，并通过抗体缀合在孔中捕捉LBS结合。如上所述，在所述提供蛋白的板孔中温育配体制剂和测试化合物，并且可定量孔中捕捉的蛋白/配体复合物的量。除了上文所描述的那些之外，用于检测此类复合物的例示性方法包括使用抗体免疫检测复合物，所述抗体与配体反应，或者与蛋白反应并竞争与配体的结合。

在本发明的另一个实施方案中，竞争性结合测定可利用包含LBS的细胞或组织的细胞提取物进行，以鉴定SV2结合伴侣。如本文所用，细胞提取物是指由裂解或破坏的细胞制备的制备物或级分。优选的细胞提取物的来源将是来源于人中枢神经组织或内分泌组织的细胞。特别地，细胞提取物可由特定区域制备，包括但不限于：海马、小脑、大脑、大脑皮层、垂体、髓质以及肾上腺。此外，细胞提取物可由特定的中枢神经***起源或内分泌***的原代细胞分离物制备，包括但不限于：神经元、星形胶质细胞、以及髓质的内分泌细胞。备选地，细胞提取物可由现存的细胞系，特别是神经或内分泌来源的细胞系制备。本文所考虑的细胞系包括但不限于：大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞、AtT-20、GH3和HIT细胞。

许多方法可用于获得细胞提取物。细胞可利用物理或化学破坏法破坏。物理破坏法的实例包括但不限于：超声破碎和机械剪切。化学裂解法的实例包括但不限于：去污剂裂解和酶裂解。熟练技术人员能够容易地调整用于制备细胞提取物的方法以获得用于本发明方法的提取物。

细胞提取物一经制备，则将提取物与SV2蛋白或片段以及测定中的其它组分在蛋白与结合伴侣的结合能够发生的条件下混合，紧接着添加LEV或其类似物或衍生物。备选地，可在测试药剂或化合物之前或与之一致的时间向细胞提取物中添加LEV或其类似物或衍生物。可使用多种条件，最优选的是近似于人细胞胞质中所见条件的那些条件。可改变诸如摩尔渗透压浓度、pH、温度以及所用细胞提取物浓度这类特征，以优化蛋白与结合伴侣的结合。

在适当条件下混合之后，从混合物中分离结合的复合物。可利用多种技术分离混合物。例如，可使用特异于SV2A的抗体免疫沉淀结合伴侣复合物。备选地，可使用标准化学分离技术如层析和密度/沉降离心。

在除去提取物中所见的非结合的细胞组分之后，可使用常规方法将结合伴侣从复合物上解离下来。例如，可通过改变混合物的盐浓度或pH实现解离。

如上文所讨论的那样，为有助于从混合的提取物中分离结合的结合伴侣对，可将LBS固定于固相支持物上。例如，可将LBS连接到硝酸纤维素基质或丙烯酸珠子上。将LBS连接到固相支持物上有助于从提取物中所见的其它组分中分离肽/结合伴侣对。所鉴定的结合伴侣可以是单个蛋白或由两个或多个蛋白构成的复合物。备选地，结合伴侣可依据Takayama等(Methods Mol.Biol.69：171-184.(1997))或Sauder等(J.Gen.Virol.77：991-996.(1996))的操作利用Far-Western测定法鉴定，或者通过使用表位标记的蛋白或多聚His融合或GST融合蛋白鉴定。

备选地，利用生物发光或荧光能量转移(分别为BRET和FRET)的基于哺乳动物细胞的蛋白-蛋白测定法以及酵母双杂交***可以是用于鉴定蛋白-蛋白相互作用的工具。

鉴定介由SV2蛋白起作用的药理学活性化合物的另一种途径是通过分析此类化合物对野生型及SV2敲除细胞系、组织和动物的作用。例如，可能先前业已通过在基因组野生型动物或疾病组织模型中测试、或者通过靠功能细胞测定筛选所鉴定的目的化合物，可在具有下降或低水平的功能性SV2蛋白或者完全缺乏功能性SV2蛋白的细胞、组织或动物中的等同或信息性测定中予以重测。例如，此类削弱子或敲除子可通过使用反义或RNAi技术或者通过用基因组敲除动物工作而获得。

在有些实施方案中，鉴定了抑制野生型动物神经元中N-型钙通道的化合物，紧接着在相同条件下在已使用靶向SV2 mRNA序列的RNAi或反义寡聚体将其SV2蛋白削弱的神经元中、或者备选地来自基因组SV2敲除动物的神经元中测试所述化合物。在SV2敲除神经元中作用的缺乏将是所述化合物介由SV2蛋白发挥其作用的证据。

在另一个实施方案中，具有抗惊厥性质的化合物是通过测试其抑制癫痫样场电位的能力鉴定的，所述场电位是在浸泡于含增高的钾和降低的钙的致癫痫介质之中的野生型大鼠海马切片的CA3区记录的。然后可在相同的测定法中使用SV2敲除或削弱的海马切片测试表现出抗惊厥性质的化合物。如果在无SV2蛋白表达的切片中观察到缺乏功效，这将强烈支持通过与SV2蛋白互作介导的效应。

在另一个实施方案中，可在敲除或削弱小鼠中研究与LBS结合的化合物或药剂对突触前二价阳离子贮藏的影响。在特别的实施方案中，向野生型和SV2敲除或削弱小鼠给药一定量与LBS结合的化合物或药剂。处死动物，立即取出脑并瞬时冷冻。进行薄冻干低温切片的元素成像，并通过电子探针X-射线显微分析和特征性X-射线的元素成像确定突触前神经末梢的元素组成。此法的实例由Andrews等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(6)：1713-1717(1987))公开。

IV.SV2的体外表征

本发明包括SV2蛋白家族的功能表征。在一个实施方案中，本发明包括克隆和表达大鼠及人形式的SV2蛋白SV2A、SV2B、SV2C和相关突触囊泡蛋白SVOP。在另一个实施方案中，本发明还包括鉴定包含LBS的结构域。在另外的实施方案中，本发明包括发现可能的SV2蛋白的多个功能，以及左乙拉西坦及相关配体对这些功能的影响。

在另外的实施方案中，本发明包括在真核宿主细胞中表达SV2蛋白用于功能研究。该蛋白可表达为其天然形式，或作为与荧光或其它肽标签的融合物，包括表位和亲和标签；可表达并研究该蛋白的突变形式或片段，可表达并研究该蛋白和同源蛋白之间的融合物。可使用电生理学、显微镜检或其它技术原位研究异源表达的SV2；或者可使用电生理学或其它技术从真核宿主以有功能的形式表达和纯化。

在一个特别的实施方案中，可在真核宿主中表达并纯化如上所述的天然或修饰的SV2蛋白。可纯化蛋白并掺入到人工脂囊泡或人工双层膜中用于研究。可通过生物化学手段研究SV2蛋白可能的转运功能，例如测量进出囊泡的放射性标记底物的运输。另一种可能的途径是使用电生理学在掺入到合成囊泡或人工脂膜的纯化蛋白中研究此种运输。

在另一个特别的实施方案中，本发明包括在原核宿主如大肠杆菌(E.coli)中表达SV2蛋白和纯化。在另一个特别的实施方案中，本发明包括在真核宿主中重组表达SV2蛋白和纯化，包括酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisie)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris))、COS-7、HEK293和PC12a细胞。根据本发明，可使用编码SV2蛋白、多肽片段、融合蛋白或其功能性等同体的多核苷酸序列产生指导SV2蛋白在合适的宿主细胞中表达的重组DNA分子。由于遗传密码的固有简并性，可使用其它编码实质上相同或功能上等同的氨基酸序列的DNA序列克隆和表达SV2。正如本领域技术人员将会理解的那样，生产拥有非天然存在的密码子的SV2编码核苷酸序列可能是有利的。例如，可选择特定原核或真核宿主偏好的密码子(Murray等Nuc.Acids Res.17：477-508.(1989))，以提高SV2表达率或生产具有期望性质的重组RNA转录本，例如比由天然存在的序列产生的转录本具有更长的半衰期。

在另一个实施方案中，本发明的SV2蛋白和突触囊泡中SV2通常与之相关的其它蛋白在宿主细胞中重组共表达。在优选的实施方案中，SV2蛋白与包括囊泡相关的VAMP/小突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25的SNARE复合物蛋白共表达。在优选的实施方案中，SV2A与重组表达的突触结合蛋白在宿主细胞中共表达。

在另一个实施方案中，分析了糖基化、磷酸化及其它天然或引入的蛋白修饰在SV2蛋白功能、稳定性和相互作用中的作用。可使用本领域普遍公知的方法改造编码本发明SV2蛋白的核苷酸序列，以为多种原因改变编码SV2蛋白的序列，包括但不限于：修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的变化；修饰SV2蛋白与结合伴侣的相互作用的变化；SV2蛋白溶解度和/或膜***的变化；以及影响LBS及其与配体的结合的变化。通过随机断裂以及基因片段和合成寡核苷酸的PCR重装配的DNA改组可用于改造核苷酸序列。例如，定点诱变可用于***新的限制性位点、改变糖基化模式、变更密码子偏好性、生产剪接变体、或引入突变等等。

于突触胞吐后，囊泡簇集于突触前质膜上并响应升高的Ca²⁺水平而融合。Ca²⁺在突触内累积后，突触结合蛋白与SV2A的结合受到抑制，且刺激了2个突触结合蛋白Ca²⁺-结合结构域的二聚化(C2B)，这可能在组建SNARE复合物和促进融合中起作用。低Ca²⁺时，囊泡的融合受到抑制，因为SV2A仍连接于突触结合蛋白复合物。突触结合蛋白与其它蛋白的结合是Ca²⁺依赖性的，包括ATPase VCP，SNARE蛋白SNAP-25和突触融合蛋白(Augustine，2001)。为了清楚地显示这种胞吐机制和更精确地限定SV2A在融合过程中的作用，测定了这些复合物内蛋白水平响应LBS调节的变化。在特别的实施方案中，分析了LBS配体调节SV2A与突触结合蛋白-SNARE复合物之间的相互作用的能力，并评估了哪个复合物组装阶段和哪个伴侣受到SV2A与LEV、其类似物或衍生物、或者与LEV竞争结合LBS的化合物或药剂的结合调节。在一个这样的实施方案中，利用特异于所鉴定的SV2A伴侣的抗体，以及免疫沉淀及重组GST融合蛋白亲和层析的组合，分析了配体添加后复合物中蛋白的化学计量。

在另一个这样的实施方案中，使用质谱和/或表面plasmon共振检测LBS配体对SV2A与其伴侣(如突触结合蛋白)或衍生自结合结构域的短肽之间相互作用的影响。在另一个特别的实施方案中，利用生物化学途径证明LBS配体是否与二价离子(如Ca²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)竞争并抑制其与SV2A和/或突触结合蛋白的相互作用。在另一个特别的实施方案中，通过创建PC12a细胞系、原代神经元培养物、嗜铬细胞及表达SV2蛋白和GFP之间的融合构建体的其它细胞系或原代分离物分析了SV2蛋白在突触囊泡融合和再循环中的作用。在一个这样的实施方案中，通过荧光显微镜检跟踪SV2复合物及突触囊泡胞吐和运输、以及LBS配体处理对这些事件的效果分析了这些细胞系。上述细胞类型也可用于测量囊泡融合和胞吐(使用进入囊泡的包囊化染料或测量标记神经递质的释放)以及LBS配体调节这些活动的能力。

在表征SV2蛋白及其结合伴侣的其它实施方案中，完整多蛋白复合物的富集是利用GST-融合SV2或抗-SV2抗体通过基于亲和的方法完成的。在特别的实施方案中，在PC 12细胞中过表达具有GST标签的SV2A，并通过抗所述标签的抗体连同其伴侣一起免疫沉淀。在有关的实施方案中，利用GST或多聚组氨酸标签将SV2A固定到琼脂糖珠上。在优选的实施方案中，将突触囊泡提取物、细胞提取物或脑提取物与所述珠子温育，切下SV2A，洗脱蛋白通过1D或2D凝胶分辨并分析。在另一实施方案中，这些蛋白的鉴定被用于在数据库中查找新的推定的相互作用伴侣。在另一个实施方案中，利用酵母双杂交(Y2H)***或基于哺乳动物细胞的蛋白-蛋白测定法鉴定活生物体内的蛋白-蛋白互作，以验证通过基于亲和的方法所发现的SV2结合伴侣，并利用已知的cDNA限定具体的蛋白结构域相互作用。

特异于SV2蛋白的抗体可通过用所述多肽或抗原性片段接种合适的动物生产。特异于LBS的抗体可通过接种全长SV2蛋白或包含LBS的片段生产。如果抗体是针对SV2多肽的表位生产的并且与天然或重组蛋白的至少一部分结合，则所述抗体特异于该特定的SV2。特异于SV2或特异于LBS的单克隆和/或多克隆抗体可通过抗体生产领域众所周知的许多方法中的任何一种生产，例如由Harlow和Lane(Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York.(1988))教导的那些。用于抗体诱导的SV2肽并不需要生物学活性；不过肽必需是免疫原性的。用于诱导特异性抗体的肽可以具有由至少5个氨基酸组成的氨基酸序列，优选至少10个氨基酸。它们应当模拟天然蛋白的一部分氨基酸序列，并且可含有天然存在的小分子的完整氨基酸序列。可将SV2氨基酸的短序列与另一蛋白如匙孔血蓝蛋白的短序列融合，并生产针对此嵌合分子的抗体。抗体生产不仅包括通过给动物注射刺激免疫应答，而且包括生产合成抗体或其它特异性结合分子中的类似步骤，如筛选重组免疫球蛋白文库(如参见Orlandi等Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：3833-3837.(1989)；Huse等Science 256：1275-1281.(1989))或体外刺激淋巴细胞群。现代技术(Winter G.和Milstein C.(1991)Nature 349：293-299)基于抗体形成的原理提供了许多高度特异性的结合试剂。可改造这些技术以生产特异性结合SV2或LBS的分子。

在特别的实施方案中，本发明包括SEQ ID NO：6的人SV2C蛋白，和编码它的核酸分子(SEQ ID NO：5)，以及它们的等位基因变体和功能性等同体。本发明还包括鉴定SV2C蛋白的体内分布，包括但不限于在中枢神经***、周围神经***以及内分泌细胞和组织内。本发明还包括鉴定SV2C蛋白的配体和/或结合伴侣。本发明还包括阐明SV2C蛋白的功能。

V.疾病中的SV2表达

本发明包括阐明与特定的神经疾病有关的SV2蛋白表达。在特别的实施方案中，利用特异于SV2A的抗体在对照动物和模拟癫痫、癫痫发生、帕金森氏病和认知缺陷、其它CNS障碍(见上文)以及内分泌病和肾上腺髓质相关疾病的动物的脑、脊髓和神经内分泌组织或细胞如嗜铬细胞内以区域特异性的方式探测脑组织。在另一个实施方案中，本发明包括阐明所有SV2蛋白同工型与上文所述病理学的关系，包括同工型的变化或转换。在优选的实施方案中，DNA微阵列被用于探测涉及不同神经疾病的SV2蛋白编码序列的表达及其变化。使用DNA微阵列用于确定特定核酸序列表达的实例可见于美国专利5,900,882。在另一个优选的实施方案中，通过定量PCR(qPCR)确认涉及与突触囊泡功能相关的神经障碍的区域或总体SV2蛋白表达的变化。

在另一个实施方案中，分析了敲除小鼠中LBS的存在。在优选的实施方案中，纯化了来自具有致死SV2A敲除表型、SV2B或双重敲除SV2A/B小鼠的纯化突触囊泡，并与来自野生型小鼠的突触囊泡相比较，分析了LBS的存在以及底物和/或离子摄取。

在特别的实施方案中，比较是由纯化自健康和患病动物的突触囊泡中蛋白表达水平构成的，包括但不限于上文所述的病理学，例如用于突触囊泡的蛋白绘图，以检测疾病相关蛋白。在特别的实施方案中，利用来源于健康和疾病状态的突触囊泡的1D和/或2D凝胶的比较鉴定以疾病特异性方式上调或下调的蛋白。在另一实施方案中，通过将来自野生型的突触囊泡的蛋白质组(proteome)与SV2敲除小鼠或双链RNA诱导干涉(RNAi；Krichevsky等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99(18)：11926-11929.(2002))培养的神经元的蛋白质组进行比较鉴定靶。在另一个实施方案中，本发明包括在原代神经元培养物、培养的神经元或PC12细胞中实施RNAi或反义核苷酸，以抑制或消除SV2表达。

VI.SV2蛋白上LBS定位的确定

采用了许多方法以确定LBS的定位。LBS可由连续节段的氨基酸残基组成，或者它可以是由存在于一个或多个胞外或胞内环或结构域上的氨基酸序列组成的三维结构。另外，LBS可能取决于SV2蛋白的糖基化或者可能不需要SV2蛋白的糖基化。

在特别的实施方案中，利用放射性配体特异性地光亲和标记LBS。在特别的实施方案中，放射性配体的共价连接部位是通过用SV2A抗体亲和层析或免疫沉淀以及质谱纯化并测序来自光亲和标记的突触囊泡的蛋白水解片段而确定的。

在具体的用于鉴定参与LBS配体和SV2A蛋白之间的相互作用的蛋白结构域的实施方案中，分析了SV2蛋白片段或具有氨基酸缺失、添加或置换的SV2蛋白对结合的影响。在优选的实施方案中，所选的残基将通过cDNA的定点诱变修饰。在另一个实施方案中，在SV2同工型之间交换了结构域，并鉴定了对于配体识别重要的同工型结构特征。在这种实施方案的实例中，SV2A的N-末端结构域被替换为SV2B较短的等同区域，以确定对LBS配体结合的影响。在这种实施方案的另一个实例中，在SV2A区域和SVOP区域之间制造一系列交换(swap)，以确定对配体结合的影响。此类交换可能包括各蛋白的大区域，例如含有多个跨膜区，以及蛋白的小区域，例如包括单个跨膜区。

在另一个实施方案中，使用NMR谱或X射线晶体学或圆二色性或红外光谱利用至少保持了结合活性的纯SV2A分析了SV2蛋白(或所选的结合结构域)的三维结构，用于揭示LBS部位拓扑学的分辨和设计与该受体适配的新药。如果经研究所述结合结构域需要疏水环境，则该蛋白必须在去污剂如十二烷基麦芽糖苷或衍生物中溶解(见实施例)。纯化的蛋白可通过本领域公知的方法结晶，例如由A.McPherson在″Preparation and Analysis of Protein Crystals″(John Wileyand Sons，New York，(1982))中所公开的方法。备选地，本发明的SV2蛋白也可以通过蒸汽扩散结晶，而且本领域所用的蒸汽扩散仪器可容易地在本发明的过程中采用。例如，此类仪器公开在美国专利No.4,886,646、5,096,676、5,130,105、5,221,410及5,400,741之中，特此将其公开内容并入作为参考。SV2蛋白结构及其与配体和/或结合伴侣的结合的X射线晶体学测定可利用例如美国专利No.5,978,444中所公开的方法和成像***进行。

在有些实施方案中，在宿主细胞系中重组表达SV2蛋白，包括同工型SV2A、SV2B和SV2C，以在各同工型的结合测定中筛选多样化的化合物或药剂。分析与SV2A同工型相互作用的化合物或药剂与其它SV2同工型的相互作用。在另一个实施方案中，进行结合试验以测试若干参照药物，AED，类固醇，并比较天然LBS、人和大鼠重组SV2A之间的结合动力学。

VII.本发明药剂的用途

本发明包括利用通过本发明方法鉴定的化合物或药剂调节SV2蛋白。本发明的化合物或药剂可用于调节突触囊泡功能，特别是调节与突触囊泡功能相关的疾病，或可能通过影响突触囊泡功能的有些方面而得以改善的疾病，或者也可用于调节突触囊泡功能以校正突触前功能的障碍，或者能够通过突触囊泡功能的补偿性改变得以修复的神经元信号传导紊乱。如本文所用，如果化合物或药剂能够上调或下调突触囊泡或突触囊泡与之相互作用的突触前***的至少一个组分的至少一种功能，则该化合物或药剂被表述为调节突触囊泡功能。

在优选的实施方案中，所述药剂或化合物为LEV或其类似物或衍生物。在另一个优选的实施方案中，所述化合物或药剂与SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位结合。又在另一个优选的实施方案中，所述化合物或药剂与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位。又在另一个优选的实施方案中，本发明用于治疗神经障碍的药剂包括如上文所述的N-烷基化的2-氧代-吡咯烷衍生物、N-烷基化的2-氧代-哌啶基衍生物以及N-烷基化的2-氧代-azepanyl衍生物。

在优选的实施方案中，所述化合物或药剂为抗-SV2抗体或其片段，包括与SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位结合的那些，并且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在有关的优选实施方案中，抗体片段为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段或scFV片段，而单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

在优选的实施方案中，本发明包括调节细胞中SV2蛋白的至少一种功能或活性，例如，通过将细胞暴露于与SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位结合的化合物或药剂。在特别的实施方案中，调节细胞中SV2蛋白的至少一种功能或活性包括将所述细胞在体外、体内、原位和离体暴露于所述化合物或药剂。如本文所用，调节SV2的功能包括但不限于调节离子或其它天然底物穿越突触囊泡膜的转运，调节SV2蛋白对其天然配体的结合，调节SV2蛋白对如上所述的结合伴侣的结合，以及重新调节突触囊泡的形成、融合、调控或功能。

在优选的实施方案中，调节细胞中的SV2蛋白包括调节细胞中的突触囊泡功能。如本文所用，可由通过本发明的方法鉴定的化合物或药剂调节的突触囊泡功能包括但不限于：突触前神经元中突触囊泡的形成，突触囊泡与其它突触囊泡或突触膜的融合，突触囊泡的再循环或周转，突触囊泡与突触前网格的结合，以及神经递质释放，与来自胞外基质的蛋白(层粘连蛋白-1等)的结合以及突触后密度。

在特别的实施方案中，将细胞暴露于本发明调节细胞中SV2蛋白的至少一种功能或活性的化合物或药剂，是在控制细胞环境中单价和/或二价阳离子浓度的条件下进行的。在优选的实施方案中，二价阳离子为Ca²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺中的至少一种。在优选的实施方案中，单价阳离子为K⁺。在特别的实施方案中，将细胞暴露于与左乙拉西坦结合部位结合的化合物和药剂是在具有低单价和/或二价阳离子浓度或者小大约1μM的条件下进行的。在另一个特别的实施方案中，将细胞暴露于与左乙拉西坦结合部位结合的化合物和药剂是在具有生理学单价和/或二价阳离子浓度或在约1μM和约1000μM之间的条件下进行的。又在另一个特别的实施方案中，将细胞暴露于与左乙拉西坦结合部位结合的化合物和药剂是在具有高单价和/或二价阳离子浓度或大于至少约1000μM的条件下进行的。

VIII.神经疾病的治疗

由本发明的方法鉴定的化合物或药剂能够以有效量用于治疗与突触囊泡功能相关的神经疾病。在特别的实施方案中，用所述化合物或药剂治疗调节神经疾病。在优选的实施方案中，神经疾病为癫痫发作障碍。在另一个优选的实施方案中，神经疾病从由帕金森氏病、帕金森氏运动障碍、偏头痛、阿尔茨海默病、神经性疼痛、特发性震颤和认知障碍组成的组中选择。在高度优选的实施方案中，神经疾病为癫痫。在另一个高度优选的实施方案中，用所述化合物或药剂治疗增强认知功能。

在优选的实施方案中，所述药剂或化合物为LEV或其类似物或衍生物。在另一个优选的实施方案中，所述化合物或药剂与SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位结合。又在另一个优选的实施方案中，所述化合物或药剂与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位。又在另一个优选的实施方案中，本发明用于治疗神经疾病的药剂包括如上文所述的N-烷基化的2-氧代-吡咯烷衍生物、N-烷基化的2-氧代-哌啶基衍生物以及N-烷基化的2-氧代-azepanyl衍生物。

在优选的实施方案中，所述化合物或药剂为抗-SV2抗体或其片段，包括与SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位结合的那些，并且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在有关的优选实施方案中，抗体片段为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或scFv片段，而单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

如本文所用，受试者可以是任何哺乳动物，只要该哺乳动物需要由可通过本发明的方法鉴定的化合物或药剂介导的对SV2蛋白功能或活性的调节。术语哺乳动物定义为属于哺乳纲的个体。本发明尤其可用于治疗人类受试者。

如本文所用，“有效量”是指在体内、离体或在体外有效抑制、减轻、改善、调节或控制疾病、体况或另一种给药物质、化合物或药剂的至少一种症状或效应的物质、化合物或药剂的量。此外，如本文所用，“有效量”是在体内有效增强至少一种认知功能的物质、化合物或药剂的量。

如本文所用，当药剂减轻神经疾病的至少一种症状的程度或严重性时，该药剂被表述为调节神经疾病。例如，通过给药以某种方式上调或下调或调节本发明的SV2蛋白的表达或至少一种活性的化合物或药剂，可预防癫痫中的癫痫发作，可减轻癫痫发作的幅度、强度或严重度，或者可减轻癫痫发作的发生频率。

通过本发明的方法鉴定的化合物或药剂可单独提供，或与调节特定病理学过程的其它化合物或药剂联合。例如，本发明的化合物或药剂可与其它已知药物联合给药。如本文所用，当两种药剂同时给药或以此种方式独立给药从而所述药剂将同时发挥作用时，这两种药剂被表述为是联合给药的。在本发明特别的实施方案中，由本发明的方法鉴定的化合物或药剂可与调节脑中GABA能通路的化合物或药剂联合提供。在另一个实施方案中，本发明的化合物连同金刚烷胺一起给药以联合治疗L-DOPA和迟发性运动障碍。

本发明的化合物或药剂可通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、硬膜外、经皮、局部或粘膜路途或其组合给药。给药剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗频率以及期望效应的性质。在选择治疗剂的给药途径时，药物溶解度和吸收部位是应当考虑的因素。

本发明还包括含有一种或多种调节本发明的SV2蛋白的表达或至少一种活性的化合物或药剂的组合物。尽管个体需要***，但各组分有效量最佳范围的确定落在本领域技术范围之内。典型剂量包括约0.1到约100mg/kg体重。优选剂量包括约5到约80mg/kg体重。更优选的剂量包括约10到约60mg/kg体重。最优选的剂量包括约20到约40mg/kg体重。

除了药理学活性剂外，本发明的组合物还可以含有合适的药学上可接受的载体，包括可促进活性化合物加工为可在药学上使用递送到作用部位的制剂的赋形剂和辅剂。

可配制所述化合物或药剂用于通过注射肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。用于肠胃外给药的合适制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性盐。另外，可给药作为合适的油性注射悬液的活性化合物悬液。合适的亲脂溶剂或溶媒包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射悬液可含有增加悬液粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。也可以利用脂质体封装药剂以递送到细胞之中。注射用制剂可提供为单位剂型，例如在安瓿瓶中，或者在多剂量容器中，添有防腐剂。所述组合物可采取诸如在油性或水性载体中的悬剂、溶液、或乳剂的形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，活性成分可以为粉末剂形式，以在用前与合适的溶媒如无菌无热原的水重构。

粘膜途径的给药包括但不限于口服、直肠和鼻腔给药。用于粘膜给药的制剂适合于多种剂型。如果化合物或药剂是水溶性的，则它可在合适的缓冲液中配制，例如磷酸缓冲盐溶液或其它生理学相容的溶液，优选是无菌的。备选地，如果所得的复合物在水性溶剂中具有差的溶解度，则它可与非离子型表面活性剂如Tween或聚乙二醇配制。从而，化合物及其生理学上可接受的溶剂化物可配制为通过吸入或吹入给药(通过口或鼻)，或者口服、***、肠胃外或直肠给药，或者在肿瘤的情况下，直接注射到实体瘤中。为通过吸入给药，为本发明所用的化合物方便地以由压缩包装或喷雾器提供的喷雾剂的形式递送，并使用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量量来确定。吸入器或吹入器中所用的例如白明胶的胶囊或药筒可配制为含有所述化合物以及合适的粉基如乳糖或淀粉的粉末混合物。

对于口服给药，药物制剂可以是液体形式，例如溶液、糖浆或悬液，或者可提供为药物产品，以在用前与水或其它合适的溶媒重构。此类液体制剂可通过常规手段制备，使用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(如卵磷脂或***胶)、非水溶媒(如杏仁油、油酯、或分级植物油)以及防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。药物组合物可采取例如由常规手段制备的片剂或胶囊的形式，使用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(如预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填料(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)或湿润剂(如十二烷基硫酸钠)。片剂可由本领域众所周知的方法包衣。可适当配制口服给药制剂以控释活性化合物。

对于***给药，组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

所述化合物或药剂也可配制为直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。

除了前面描述过的制剂，所述化合物或药剂也可以配制为贮存(depot)制剂。此类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。从而，例如，所述化合物可与合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或者作为略溶的衍生物，例如作为略溶的盐。脂质体和乳剂是众所周知的用于亲水药物的递送溶媒或载体的实例。

在本发明方法的实施中，本发明的化合物或药剂可单独或联合使用，或与其它治疗剂或诊断剂联合。在某些优选的实施方案中，本发明的化合物可与根据普遍接受的医学实践针对这些病况典型处方的其它化合物或药剂如抗惊厥药一起共给药。本发明的化合物可在体内被利用，通常在哺乳动物中，如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠，或者在体外利用。

IX.基因治疗

治疗中所用的SV2蛋白可在受试者中内源产生，这在治疗形式上通常称之为“基因治疗”。在具体的实施方案中，给药包含编码SV2蛋白或其功能性衍生物的序列的核酸，以通过基因治疗的方式治疗、抑制或预防与异常突触功能相关的神经疾病或障碍。基因治疗是指通过向受试者给药表达的或可表达的核酸所进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，所述核酸产生其编码的介导治疗效应的SV2蛋白。

本领域可获得的任何基因治疗的方法都可根据本发明使用。例示性的方法在下文描述。

有关基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等，ClinicalPharmacy 12：488-505.(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95.(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596.(1993)；Mulligan，Science 260：926-932.(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217.(1993)；TIBTECH11(5)：155-215.(1993))。可用的本领域公知的有关重组DNA技术的方法在Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY(1993)；以及Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中有描述。

在优选的方面，所述化合物包含编码SV2蛋白的核酸序列，所述核酸序列是在合适的宿主中表达SV2蛋白或其片段或其嵌合蛋白的表达载体的一部分。特别地，此类核酸序列具有可操作地连接于SV2蛋白编码区的启动子，所述启动子是诱导型或组成型的并且任选地是组织特异性的。在另一个特别的实施方案中，使用这样的核酸分子，其中SV2蛋白编码序列以及任何其它期望序列侧接有促进在基因组中期望位点上的同源重组的区域，从而提供抗体核酸的染色体内表达(Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935.(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435-438.(1989))。

核酸向患者的递送可以是直接的，这种情况下，患者被直接地暴露于所述核酸或核酸携带载体，或者是间接的，这种情况下，首先在体外用所述核酸转化细胞，然后将细胞移植到患者中。这两种途径分别被称之为体内或离体基因治疗。

在具体的实施方案中，可通过例如静脉内注射、局部给药(见美国专利No.5,328,470)或通过立体定位注射(参见如Chen等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057.(1994))将基因治疗载体体内递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可包括处于合适的稀释剂中的基因治疗载体，或者可包含其中包埋了基因递送载体的缓释基质。备选地，当完全的基因递送载体能够由重组细胞完整地生产时，如逆转录病毒载体，所述药物制剂可包括生产所述基因递送***的一个或多个细胞。

直接给药核酸序列，以在体内表达所编码的SV2蛋白，可通过本领域公知的众多方法中的任何一种实现，例如通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分，并如此给药从而它们成为胞内的，例如通过使用缺陷型或减毒的逆转录病毒载体或其它病毒载体进行感染(见美国专利No.4,980,286)，或者通过直接注射裸DNA，或者通过使用微粒轰击(如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂类或细胞表面受体或转染剂包被，封装在脂质体、微颗粒或微胶囊中，或者通过交联于已知进入核的肽而给药，通过交联于经历受体介导的胞吞作用的配体而给药(参见如Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432.(1987))(这可用于靶向特异性表达该受体的细胞类型)等等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中配体包含融合病毒肽以破坏内涵体，使得核酸免于溶酶体降解。又在另一个实施方案中，通过靶向特异性受体，核酸可在体内靶向用于细胞特异性摄取和表达(如参见日期为1992年4月16日(Wu等)的PCT公开WO 92/06180、日期为1992年12月23日(Wilson等)的WO 92/22635、日期为1992年11月26日(Findeis等)的WO 92/20316、日期为1993年7月22日(Clarke等)的WO 93/14188、以及日期为1993年10月14日(Young等)的WO 93/20221)。备选地，可向胞内引入核酸，并掺入到宿主细胞DNA内以通过同源重组表达(Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935.(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435-438.(1989))。

在具体的实施方案中，使用含有编码本发明的SV2蛋白的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(见Miller等，Meth.Enzymol.217：581-599.(1993))。这些逆转录病毒载体业已缺失包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中非必需的逆转录病毒序列。将编码基因治疗中待用的抗体的核酸序列克隆到一个或多个载体中，这易化了基因向患者的递送。关于逆转录病毒载体的更多细节可见Boesen等(Biotherapy6：291-302.(1994))，其描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送到造血干细胞中，以使得所述干细胞对化疗更具抗性。其它举例说明逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的参考文献有：Clowes等，J.Clin.Invest.93：644-651.(1994)；Kiem等，Blood 83：1467-1473.(1994)；Salmons等，Human Gene Therapy4：129-141.(1993)以及Grossman等，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3：110-114.(1993)。

腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒载体。在优选的实施方案中，使用腺病毒载体。腺病毒具有能够感染非***细胞的优点。Kozarsky等，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503.(1993)综述了基于腺病毒的基因治疗。Bout等，Human Gene Therapy5：3-10.(1994)证明了腺病毒载体将基因转移到恒河猴呼吸道上皮细胞中的用途。腺病毒在基因治疗中的用途的其它实例可见Rosenfeld等，Science 252：431-434.(1991)；Rosenfeld等，Cell 68：143-155.(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91：225-234.(1993)；PCT公开WO 94/12649；以及Wang，等，Gene Therapy 2：775-783.(1995).。

腺伴随病毒(AAV)也已被建议用于基因治疗(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300.(1993)；美国专利No.5,436,146)。

基因治疗的另一途径包括通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒侵染的方法将基因转移到组织培养的细胞中。通常，转移方法包括将可选择标记转移到细胞中。然后将细胞置于选择压力下，以分离业已摄取且正表达所转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送给患者。

在这个实施方案中，在体内给药所得的重组细胞之前，将核酸引入到细胞之中。此种引入可通过本领域公知的任何方法实施，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、由含所述核酸序列的病毒或噬菌体载体侵染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。用于将外来基因引入到细胞之中的众多技术是本领域公知的(如参见Loeffler和Behr，Meth.Enzymol.217：599-618.(1993)；Cohen等，Meth.Enzymol.217：618-644.(1993)；Cline，Pharmac.Ther.29：69-92.(1985))，并且可根据本发明使用，只要受体细胞所必需的发育和生理功能未被破坏即可。所述技术应当提供核酸向细胞的稳定转移，从而核酸可由该细胞表达，并且优选可遗传且可由其细胞子代表达。

可通过本领域公知的多种方法将所得的重组细胞递送给患者。优选静脉内给药重组血细胞(如造血干细胞或祖细胞)。考虑使用的细胞的量取决于期望的效果、患者状态等，并且能够由本领域技术人员确定。

能够向其中引入核酸的用于基因治疗目的的细胞涵盖任何期望的可获得的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、内分泌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或先祖细胞，例如由骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的。在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体同源的。

在重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码抗体的核酸序列引入到细胞之中，从而它们可由该细胞或其子代表达，然后体内给药所述重组细胞用于治疗作用。在具体的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。能够分离且在体外维持的任何干细胞和/或祖细胞都可潜在地根据本发明的这个实施方案使用(如参见日期为1994年4月28日的PCT公开WO 94/08598；Stemple和Anderson，Cell 71：973-985.(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Biol.21A：229.(1980)；以及Pittelkow和Scott，Mayo Clinic Proc.61：771.(1986))。

在具体的实施方案中，待引入用于基因治疗目的的核酸包含可操作地连接于编码区的诱导型启动子，从而该核酸的表达通过控制合适的转录诱导子的存在或不存在而可控。

X.关于生物素化配体的用途

本发明提供了含生物素标签的非放射性标记的SV2A/LBS配体。此类生物素化配体可用于筛选测定，没有放射性废物而具有更高的通量。

作为举例，SV2A/LBS配体的生物素化衍生物可在筛选测定(如结合)中与天然脑膜或细胞系中表达的SV2一起使用，以发现更为有效的结构。结合于SV2A的生物素标签的量可使用链霉抗生物素蛋白-荧光素或抗生物素蛋白衍生物定量。

生物素化配体也可用于评估溶解、免疫亲和纯化以及层析后SV2的构象状态。

而且，本发明提供了光活化形式的配体用于生物学样品中的标记和检测。光活化生物素化配体也可用于由组织、分离细胞、亚细胞级分和膜中定位和纯化SV2。光活化生物素化配体也可用于SV2交联以及LBS配体结合结构域的鉴定。

XII.溶解SV2及亲和纯化

本发明提供了用于溶解SV2/LBS蛋白的方法，包括用去污剂处理膜。由本发明方法溶解的膜蛋白保持活性，如通过结合测定和蛋白-蛋白相互作用研究所评价的那样。

简要地，所述方法包括在含去污剂正十二烷基-β-D麦芽糖苷的溶解缓冲液中温育膜，作为举例如大鼠脑膜，于约4℃温育大约2小时。温育溶液随后离心，以从上清中收集可溶性的SV2蛋白，具体地为SV2A蛋白。上清中可溶性SV2A蛋白的存在利用抗-SV2A抗体通过western印迹分析得到证实。上清中可溶性SV2A蛋白的结合活性用已知与SV2A结合的配体如左乙拉西坦和ucb 30889通过结合实验确定。

也可使用其它去污剂如正十二烷基-β-D麦芽糖苷的类似物，例如，正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基-β-D-麦芽糖苷。事实上，初步数据证实用这些去污剂由溶解膜获得的可溶性蛋白保持了其结合活性。

本发明也提供了亲和纯化可溶性SV2蛋白以及鉴定推定的SV2A伴侣的方法。简要地，亲和纯化包括于约4℃过夜温育来自溶解的膜的上清和抗-SV2A抗体。然后通过在缓冲液中与A蛋白-琼脂糖珠于约4℃旋转大约1小时温育该混合物。树脂用合适的缓冲液洗涤数次，并收集含有免疫纯化的SV2A蛋白的级分。

为检测亲和纯化后SV2A结合伴侣的存在，对免疫纯化级分进行western印迹分析，以检测突触结合蛋白的存在(图22)。

本发明提供了纯化膜结合蛋白的方法，包括用去污剂溶解含有所述蛋白的膜样品，以形成溶解的复合物，并分离功能形式的该溶解复合物。去污剂可以是正十二烷基-β-D麦芽糖苷或其衍生物。然后可利用免疫亲和技术分离蛋白。

通过本发明方法纯化的蛋白可用于进行对蛋白的结构研究如NMR、X射线晶体学、红外光谱、圆二色性以及本领域熟知的其它方法。本发明也提供了进行SV2蛋白相互作用研究的方法，并用于检测抑制或促进SV2与推定伴侣之间的相互作用的肽、分子和化合物。本发明可用于鉴定SV2结合伴侣。

可使用本发明溶解SV2A、SV2B和SV2C膜结合蛋白以及亲和纯化它们，用于结构研究和用于鉴定结合伴侣。

无需更多说明，相信本领域普通技术人员通过利用前述说明以及如下举例说明性的实施例，能够制造和使用本发明的化合物并实施所主张的方法。因此，如下工作实施例具体地指出了本发明的优选实施方案，而不应当阐释为以任何方式限制本发明公开的其余部分。

实施例

实施例1.用于结合研究的左乙拉西坦类似物的开发

已证明LEV结合优先位于脑中的特异性结合部位(左乙拉西坦结合部位或LBS：Noyer等，Euro.J.Pharmacol.286：137-146.(1995)；Gillard等2003))。然而，[³H]LEV对该部位仅表现出微摩尔的亲和力，使得它不适合于深入表征。该实施例描述了[³H]ucb 30889，即(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺，一种左乙拉西坦类似物的结合性质。结合实验如Noyer等(Euro.J.Pharmacol.286：137-146(1995))中所述在粗制大鼠脑膜上于4℃进行。用于平衡研究的温育时间为120分钟。对于动力学和竞争研究，使用溶于含2mM Mg²⁺的0.5ml Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中的1.3nM浓度的[³H]ucb 30889(30Ci/mmol)。脑亚结构中LBS的定位是通过在相似条件下温育的25μm厚切片的放射自显影评估的。载片然后在含0.5％BSA的50mM Tris-HCl(pH 7.4)中于4℃洗涤两次各10分钟，干燥并于-20℃暴露于[³H]Hyperfilm 3周。非特异性结合(NSB)通过在温育阶段期间纳入1mM LEV测定。

图1显示[³H]ucb 30889与大鼠脑皮层中的LBS可逆地结合。结合动力学是双相的：结合及解离的半数时间，对于快组分分别为3±2min和4±1min(25-50％的位点)，而对于慢组分分别为47±13min和61±15min。25℃时，动力学引人注目地增大，且仅保留一种组分。

图2显示[³H]ucb 30889的饱和结合曲线与均一结合部位群的标记相当。KD和Bmax分别为42±10nM和5054±704fmol/mg蛋白。Bmax类似于相似膜制备物中使用[3H]左乙拉西坦作为放射性配体估计的值(4718±413fmol/mg蛋白)。

所研究的外周组织中不能检测到特异性结合(图3)。实验条件(150μg蛋白/测定和1.3nM放射性配体)下的检测限为Bmax 200fmol/mg蛋白。这提示与外周相比，大脑皮层中存在至少多25倍的结合部位。

竞争结合曲线显示ucb 30889以比LEV高大约10倍的亲和力与LBS结合(图4)。ucb 30889的pKi(7.1±0.2)与如通过饱和结合曲线所测定的[³H]ucb 30889的K_D完全相符(图2)。许多左乙拉西坦类似物以及已知与LBS相互作用的其它化合物如戊四氮或贝美格(Noyer等，1995)的pIC₅₀值完全相同，不论是由[³H]ucb 30889还是[³H]左乙拉西坦获得的(图5)。

与[³H]ucb 30889温育的大鼠脑切片(图6)显示由[³H]ucb 30889标记的LBS弥漫定位在整个脑中，并且这种结合能被在体外结合中所观察到的相等浓度的左乙拉西坦抑制(图4)。

该实施例通过竞争结合研究和组织分布证明，ucb 30889和LEV都标记相同的部位，也就是定位于整个中枢神经***之中的LBS。与LEV相比，ucb 30889以高10倍的亲和力且以极低的非特异性结合与LBS结合。这些标准连同4℃下合适的结合动力学使得有可能使用该放射性配体对脑切片实施放射自显影结合研究(图6)，并显示LBS在大鼠脑中的解剖学分布。

实施例2.LBS的细胞和亚细胞分布

为原位鉴定和表征LBS，使用[³H]ucb 30889对LBS在脑内绘图，并研究其细胞和亚细胞分布。为进行大鼠脑放射自显影，使25μm切片与1.3nM[³H]ucb 30889在50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4)中于4℃温育120分钟。在相似条件下进行大鼠脑膜以及多种神经元细胞系的结合测定。通过在测定中纳入1mM左乙拉西坦测定非特异性结合。为进行光标记，使膜与40nM[³H]ucb 30889在相同缓冲液中于4℃温育120分钟，紧接着用紫外光辐照30分钟(Fuks等，Eur.J.Pharmacol.478：11-19(2003))。

为进行大鼠脑放射自显影，使25μm切片与1.3nM[³H]ucb 30889在50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4)中于4℃温育120分钟。图7显示ucb 30889结合部位在大鼠脑中不均一地分布。尽管在白质中没有明显结合，但在齿状回、上丘、若干丘脑核以及小脑分子层中有高水平的结合。大脑皮层、下丘脑以及纹状体中结合不那么显著。缩写：cc，胼胝体；Aca，前连合；ic，内囊；Mtg，***被盖束；Mt，***丘脑束；ML，分子层；Hi，海马；DG，齿状回；sc，上丘；CG，中央灰质；Pu，尾状核；Pv，室旁核；MG，膝状核；Po hy，后hippothalamic区；Hb，松果体缰；Pi，梨形皮层。

小脑颗粒神经元和PC12细胞中的[³H]ucb 30889结合显示出高水平的特异性结合(表1)。Kd类似于在大鼠大脑皮层中测量的数值(42nM；见实施例1)。在原代星形胶质细胞以及许多CNS相关的细胞系以及非神经元细胞系中不能检测到同样的特异性结合部位。缩写：nd，未测出。

表1

各种细胞类型中[³H]ucb 30889结合的密度和亲和力

细胞类型	Bmax	Kd
细胞类型	Bmax	Kd	大鼠小脑颗粒神经元小鼠皮层神经元小鼠皮层星形胶质细胞PC 12SK-N-SHNG108-15N1E-115HCN-1aCHO-K1COS-7	0.7pmol/mg蛋白1.4pmol/mg蛋白nd1.4pmol/mgndndndndndnd	59nM34nMnd40nMndndndndndnd

大鼠脑膜通过差速离心分离(图8)。与LBS(8A)、毒蕈碱(8B)、NMDA(8c)和外周苯二氮(8D)受体的结合分别使用[³H]ucb 30889、[³H]NMS、[³H]MK801或[³H]PK11195测定。该研究表明左乙拉西坦结合部位存在于粗制突触体(P2)、微粒体膜(P3)之中，并在突触囊泡中富集(LP2)。相反，与P2或P3相比，其它研究的受体在LP2中不更丰富。P1是含核和大碎片的低速沉淀。

利用蔗糖梯度上的分级分离从粗制突触体中分离亚细胞区室。LBS见于纯化的突触膜之中，但不存在于含纯化的线粒体级分的1.2M蔗糖沉淀之中(图9)。作为亚细胞级分纯度的对照，也分析了毒蕈碱和外周苯二氮受体的分布。数据表达为占总特异性结合的百分比。

使粗制突触体(P2级分)与40nM[³H]ucb 30889预温育，然后用紫外光辐照并洗涤。0分钟时添加1mM左乙拉西坦，并在所示时间对等份试样计数(图10A)。使用1mM左乙拉西坦测定非特异性结合(空心符)。图10B显示了同样的实验，但在无紫外光辐照下进行。这些结果表明在紫外辐照期间，放射性配体共价***到了LBS的结合结构域中。

光亲和标记在存在或不存在1mM左乙拉西坦下进行。蛋白利用7.5％(w/w)的丙烯酰胺浓度通过SDS-PAGE分辨，并评估每一凝胶切片中的放射性。主要的掺入部位发生在93,000的分子量处(图11)(Fuks等，2003)。

在该实施例中证明大鼠脑中的[³H]ucb 30889结合部位具有独特的分布模式，且并不表现出与任何具体的与癫痫典型相关的神经递质***有关联。这种新的结合部位限于神经元细胞类型和数个脑区。这种新的放射性配体可用作为光亲和标记，并与主要位于突触囊泡之中的高分子量膜蛋白共价结合。

实施例3.LBS位于SV2A之上

在该实施例中，大鼠脑中LBS的生物化学表征导致了鉴定潜在候选LBS蛋白用于克隆和结合表征的研究。基于蛋白的膜整合性质、脑特异性表达、表观大小、以及突触囊泡定位，作为定位LBS的候选物对SV2蛋白家族进行了分析。从而，克隆SV2蛋白并测定LBS配体结合。

材料：

左乙拉西坦和衍生物在UCB Pharma(Braine-I′Alleud，Belgium)合成。[³H]ucb 30889，即(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺(32 Ci/mmol)由Amersham Biosciences(Roosendaal，The Netherlands)定制标记。由Buckley和Kelly(Buckley等，J.Cell.Biol.，100，1284-94(1985))开发的抗SV2蛋白的单克隆抗体是从由NICHD赞助开发并由University of Iowa，Department ofBiological Sciences，Iowa City，IA 52242维护的发育研究杂交瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank)中获得的。该抗体与所有三种SV2同工型SV2A、SV2B和SV2C交叉反应。

野生型和敲除小鼠结合实验

SV2A敲除小鼠之前业已有报道(Crowder等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，15268-73(1999))。SV2B敲除子的产生将在别处报道。将SV2B敲除子与杂合型SV2A基因破坏动物交配以生产SV2A+/-SV2B-/-种系，其被用于产生SV2A/B敲除子。制备野生型C57-B16和SV2 KO小鼠脑膜用于结合测定，并且如以前所描述的那样稍作变动进行结合反应(Gillard等，Eur.J.Pharmacol.In Press(2003))。将冷冻全脑在含250mM蔗糖的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)(缓冲液A)中匀浆(10％w/v)。将匀浆以30,000x g于4℃旋转15分钟，并将沉淀重悬于相同的缓冲液中。在于37℃温育15分钟之后，利用同样的离心方案洗膜两次。将末次沉淀重悬于缓冲液A中，并贮存在液氮中。融化的脑膜蛋白(0.1mg/测定)在含2mM MgCl₂以及[³H]ucb 30889(1.8nM)的0.5ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中于4℃温育120分钟。在温育期结束后，通过预浸在0.1％聚乙烯亚胺中的GF/C玻璃光纤滤膜快速过滤回收膜结合的放射性配体。膜用8ml冰冷的Tris缓冲液(pH 7.4)洗涤。全部的过滤操作每个样品不超过10秒。干燥滤膜并通过液闪测定放射性。pIC50测定通过计算机化的非线性曲线拟合法进行(Graphpad Prismsoftware，San Diego，CA)。

为进行Western印迹实验，室温下用含BME的SDS-PAGE样品缓冲液提取来自野生型和敲除动物的脑匀浆等份试样。将等量的各样品(大约10μg总蛋白)上样到4-12％Tris-甘氨酸NOVEX梯度凝胶(Invitrogen Life Sciences)上并分离。在转移到硝酸纤维素膜并封闭后，印迹用与所有SV2蛋白交叉反应的单克隆抗体探测(Buckley等，J.Cell.Biol.，100，1284-94(1985))，并使用HRP-抗-小鼠二抗标记一抗。印迹由发光辣根过氧化物酶试剂显色并拍照。

[³H]ucb 30889对异源表达的hSV2A的结合实验

为在融合的转染细胞上进行结合实验(图17)，将24孔板中的细胞慢慢冷却至4℃，并用冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗一次。吸出PBS并添加溶于PBS的结合试剂。在结合实验中，在存在或不存在不同量未标记抑制剂情况下，向所有孔中添加1.8nM的[³H]ucb 30889。将细胞于4℃温育2小时，并通过迅速用冰冷PBS冲洗细胞3次终止测定。在末次吸干后，添加200μl 0.1N NaOH以裂解细胞，并在β计数器上在闪液中对样品计数。

为在事先冷冻的转染COS-7细胞上进行结合实验(图18)，将2-3×10⁴个细胞在含[³H]ucb 30889(1.8nM)和渐增浓度的未标记竞争药物的0.2ml RPMI-HEPES 25mM溶液中于4℃温育120分钟。结合反应通过过滤终止以及放射性计数如上文所述进行。

听原性癫痫发作小鼠模型

LEV及类似物的抗癫痫发作活性在声敏小鼠中通过继腹膜内预处理60分后，将小鼠暴露于90分贝、10到20-kHz持续30秒的声音刺激来评估。所报道的ED₅₀值是通过测试给药不同剂量的4到8组(n＝10)获得的，并且反应了化合物抑制阵挛性惊厥的效力。

人SV2A是由人胎脑cDNA文库中作为3609bp PCR产物克隆的，包含编码区和来自转录本的重要侧翼区。利用含SV2A编码区外加重要侧翼DNA的载体作为来源，PCR扩增编码区而不含侧翼区。将该产物克隆到GATEWAY(Invitrogen)供体载体中以易化亚克隆。只有使用直接在克隆位点上游具有强转录终止位点的克隆载体，才导致成功克隆仅编码区的SV2A cDNA。这提示该产物对大肠杆菌(E coli)可能是有毒的，即便是小量。最终pDONR GATEWAY SV2A克隆的序列分析表明它具有两个突变：一个是沉默突变，一个是Leu到Pro的突变。纠正非沉默突变，且序列分析证实克隆到了正确的全长人SV2A编码序列。

将人SV2A编码区从pDONR GATEWAY克隆载体上转移到pDEST 12.2Gateway表达载体上。该载体具有驱动引入基因的CMV启动子，以及SV40 ori，其允许在含有大T抗原的COS-7细胞系中极高水平的复制。另外，将人SV2A编码区转移到pDEST 40 Gateway表达载体中。该载体与上述的12.2载体极为类似，具有驱动hSV2A表达的CMV启动子，和SV40 ori以及新霉素抗性基因。

在COS-7细胞系中使用pDEST 12.2载体进行SV2A表达的初始试验，该细胞系以前业已展示过SV2蛋白的成功表达。测试了COS-7细胞系的³H-30889结合，没有观察到超出背景的结合，因而不存在显著可测量的左乙拉西坦结合部位(LBS)。另外，使用低LBS的PC12细胞系亚克隆PC12a建立在稳定的抗生素选择下表达hSV2A的PC12细胞库。

利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染剂将DNA转染到90％融合的COS-7细胞中。同样，利用相同的试剂将含hSV2A的载体转染到PC12a细胞系中，并进行抗生素抗性选择。利用抗-SV2A多克隆抗体(CalBiochem)测试SV2A产物在转染的COS-7细胞或转染的PC12a细胞中的表达。转染后18小时在SDS-PAGE凝胶上收集COS-7细胞溶胞产物，转移到膜上，并用抗SV2A的多克隆抗体探测，与粗制大鼠脑膜进行比较(图12A)。同样显示的有来自未转染COS-7细胞、未转染PC12a细胞(低LBS)、PC12bs细胞(高LBS)或转染有hSV2A的PC12a细胞的溶胞产物(图12B)。未转染的COS-7对照中没有观察到蛋白条带的标记，而转染的COS-7细胞表现出多条带，在80-120kD的范围内密度最高，或许是归因于所表达蛋白的多糖基化状态。另外，PC12bs以及PC12a/hSV2A样品中存在SV2A免疫反应性，但在低LBS PC12a细胞中很大程度上缺失(图12B)。

在结合实验中，测量了[³H]ucb 30889对业已转染有SV2A-12.2、或作为对照的β-gal表达载体的COS-7细胞、或者未经转染的细胞的特异性结合(图13)。24孔板的一式三份孔与1nM[³H]ucb 30889(标记为″热″)或者[³H]ucb 30889外加过量冷左乙拉西坦(50uM)(标记为″热+冷″)温育。将细胞于4℃温育2小时，然后迅速用冰冷PBS洗涤。在板上裂解细胞，转移到具有闪液的闪烁瓶中，并计数³H衰变发射。这些结果显示转染有SV2A的COS-7细胞已获得了特异性结合[³H]ucb 30889的能力。在同样的使用已知表达LBS的PC12bs细胞的完整细胞结合实验中，典型地看到“热”与“热+冷”样品之间CPM 1.5到2倍的差异，相比之下，此处看到的是5倍的差异。

进一步的研究更为详细地表征了[³H]ucb 30889对COS-7细胞中表达的SV2A的结合。在24孔板中转染COS-7细胞，并如上测定结合。添加系列浓度的左乙拉西坦或冷30889，以产生这些化合物针对COS-7细胞中表达的SV2A的IC₅₀(图14)。这些结果表明SV2A在功能上等同于业已在大鼠脑和PC12亚克隆中观察到的对左乙拉西坦的结合部位。左乙拉西坦及其类似物的LBS结合亲和力与其抗癫痫发作性质之间的相互关系，与先前的观察现象综合考虑，提供了这样的支持，即突触囊泡蛋白SV2A不仅是抗癫痫化合物左乙拉西坦的天然结合部位，而且意味着左乙拉西坦对突触囊泡的功能和调节与其抗惊厥性质之间的联系。

在独立的实验中，进行异源表达实验以验证SV2A独自单独地负责LEV的脑结合。人SV2A在COS-7细胞系中瞬时表达，如通过Western分析所验证的那样(数据未显示)，并观察到对[³H]ucb 30889的结合被过量LEV所置换(图17A)。同样条件下未观察到对未转染COS-7细胞或者由编码β-半乳糖苷酶的载体转染的COS-7细胞的结合。在测试未标记化合物从在COS-7细胞中表达的hSV2A上置换[³H]ucb 30889的能力的实验中，ucb 30889、LEV以及LEV对映异构体ucb L060的亲和力表现出与以前大鼠脑研究中所报道的((Noyer等，Eur.J.Pharmacol.286，137-146(1995)；Gillard等，2003)相同的排列次序和相似的数值(图17B)。至关重要地，ucb L060比LEV以显著更低的亲和力与hSV2A结合，这是脑中结合部位的关键特征(Noyer等，Eur.J.Pharmacol.286，137-146(1995)；Gillard等，2003)。另外，测试了[³H]ucb 30889针对在瞬时COS-7***中表达的hSV2B和hSV2C的结合。结果显示没有超出背景的结合(数据未显示)，与敲除小鼠结合研究的结果一致。

LEV和几个类似物对COS-7中表达的hSV2A的结合的测试揭示pIC50与小鼠脑(图18A)以及大鼠脑提取物(数据未显示)中获得的数值高度相关(r²＝0.98)。这些化合物对COS-7中hSV2A的亲和力与其在小鼠听原性癫痫模型中的抗癫痫发作保护效力之间存在着明显的关联(r²＝0.84)(图18B)。该数据与以前报道的大鼠脑中LEV类似物的结合与相同模型中的效力之间的关联一致(Noyer等，Eur.J.Pharmacol.286，137-146(1995))。也研究了其它AED的结合，包括丙戊酸钠、氨甲酰氮、苯妥英、乙琥胺、非氨酯、加巴喷丁、硫加宾、氨己烯酸以及唑尼沙胺。高达100μM浓度的这些AED中没有一个与[³H]ucb 30889竞争结合SV2A(数据未显示)。这验证了以前AED针对大鼠脑中LEV结合部位的结合研究(Noyer等，Eur.J.Pharmacol.286，137-146(1995)；Gillard等，Eur.J.Pharmacol.2003))。

实施例4.对调节神经疾病、内分泌病和激素疾病的化合物的测定

为了鉴定调节与突触功能相关的神经疾病以及内分泌障碍的化合物或药剂，采取研究鉴定另外的与LEV和ucb 30889竞争结合SV2蛋白的LBS的化合物。

将如实施例3中所公开的SV2A转染的COS-7细胞暴露于潜在的结合伴侣或药剂。将对照细胞仅暴露于赋形剂，或者暴露于未标记的ucb30889或LEV。暴露后，然后将细胞与[³H]ucb 30889温育，如实施例3中一样，细胞于4℃温育2小时，然后迅速用冰冷PBS洗涤。裂解细胞，转移到具有闪液的闪烁瓶中，并计数³H衰变发射。

对发现与ucb 30889竞争结合LBS的化合物进一步分析在听原性敏感小鼠中调节癫痫发作的能力。向听原性敏感小鼠给药与有效量LEV相当量的化合物。作为对照，向同样的听原性敏感小鼠给药有效量的LEV，或者并不调节癫痫发作的化合物，如吡拉西坦。

实施例5.生物素化配体作为工具筛选化学文库和表征SV2蛋白

本发明公开了利用新型生物素化配体作为工具筛选化学文库和表征SV2蛋白的方法。本发明提供了用于筛选目的的非放射性标记的含生物素标签的SV2A/LBS配体，无放射性废物且具有更高的通量。本发明也提供了光活化形式的标记和在生物学样品中进行SV2A/LBS检测。

在该实施例中，在大鼠脑膜中表征ucb-101282-1对SV2A/LBS的结合。此分子是ucb 30889的生物素化衍生物(图19)。此配体具有在大鼠脑膜中6.3的pKi(n＝2)，这等同于L059所报道的亲和力(图20)。此配体还设计为由经紫外光辐照能够与蛋白形成共价复合物的叠氮基苯基基序将生物素标签与LBS/SV2A交联。

实施例6.用于溶解SV2A及亲和纯化的方法

本发明公开了溶解SV2A和亲合纯化的方法。所述方法包括溶解SV2A/LBS蛋白，包括用去污剂处理膜。所述方法在溶解后维持了膜蛋白的活性，如在结合测定以及蛋白-蛋白相互作用研究中所评价的那样。

可溶性SV2A的制备以及通过结合测定的定量

将大鼠脑膜在含正十二烷基-β-D麦芽糖苷15mM的溶解缓冲液(Tris-HCl 20mM pH 7.4，0.25M蔗糖，蛋白酶抑制剂Complete Roche)中稀释，并于4℃温育2小时。随后，溶液以100,000g于4℃离心1小时。可溶性SV2A见于上清，如使用抗-SV2A抗体通过western印迹所检测的那样(图21A)。如所描述的那样使上清与[³H]ucb 30889温育。结合实验显示特异性结合是归因于可溶形式的SV2A。为了检测SV2A结合的特异性，研究了左乙拉西坦和ucb 30889特异性结合可溶性SV2A的能力。所述分子的亲和力等同于配体对天然膜所表现出的亲和力(图21B)。斯卡查德分析显示[³H]ucb 30889对天然膜中SV2A的K_D为30nM，而对于可溶性蛋白为82nM(图21C)。因而，可溶性SV2A的结合性质与膜结合的天然形式相似，表明可溶性蛋白在正十二烷基-β-D麦芽糖苷中维持了其天然的结构构象。

可溶性SV2A的亲和纯化以及推定的SV2A伴侣的鉴定

将来自溶解膜的上清与抗-SV2A抗体于4℃过夜温育。混合物与A蛋白-琼脂糖珠在Tris-HCl 20mM pH 7.4，0.25M蔗糖，蛋白酶抑制剂Complete(Roche)中于4℃旋转1小时。洗涤树脂数次，且收集的级分中含有免疫纯化的SV2A(图22)。如上文所解释的那样，SV2A在溶解于正十二烷基-β-D麦芽糖苷中后维持其天然构象。因此，由于突触结合蛋白是众所周知的SV2A伴侣，对免疫纯化的级分进行测试，以确定在纯化操作之后突触结合蛋白是否仍与SV2A结合。免疫纯化级分的Western分析证实存在与可溶性SV2A结合的突触结合蛋白，但未检测到同工型SV2B。从而，可利用所述溶解和纯化操作实施SV2A-蛋白相互作用的研究。

尽管业已参照上述实施例对本发明进行了详细说明，应当理解能够进行多种修饰而不会偏离本发明的精神。因此，本发明仅由如下权利要求书限定。特此将本申请所提及的所有引述专利、专利申请和出版物全文并入作为参考。

序列表

<110>UCB，S.A.

LYNCH，Berkley

NOCKA，Karl

FUKS，Bruno

<120>鉴定用于治疗癫痫发作、神经疾病、内分泌病和激素疾病的药剂的方法

<130>53529-5007-01-WO

<150>US 60/430,372

<151>2002-12-03

<150>US 60/506,764

<151>2003-09-30

<160>16

<170>patentIn version 3.1

<210>1

<211>2229

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2229)

<223>

<400>1

atg gaa gag ggc ttc cga gac cgg gca gct ttc atc cgt ggg gcc aaa 48

Met Glu Glu Gly Phe Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ile Arg Gly Ala Lys

1 5 10 15

gac att gct aag gaa gtc aaa aag cat gcg gcc aag aag gtg gtg aag 96

Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys Lys His Ala Ala Lys Lys Val Val Lys

20 25 30

ggc ctg gac aga gtc cag gac gaa tat tcc cga aga tcg tac tcc cgc 144

Gly Leu Asp Arg Val Gln Asp Glu Tyr Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

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Phe Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Phe Pro Ala Pro Ser Asp Gly

50 55 60

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Tyr Tyr Arg Gly Glu Gly Thr Gln Asp Glu Glu Glu Gly Gly Ala Ser

65 70 75 80

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Ser Asp Ala Thr Glu Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

85 90 95

gaa tat cag ggc att ccc cgg gca gag tct ggg ggc aaa ggc gag cgg 336

Glu Tyr Gln Gly Ile Pro Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Gly Glu Arg

100 105 110

atg gca gat ggg gcg ccc ctg gct gga gta agg ggg ggc ttg agt gat 384

Met Ala Asp Gly Ala Pro Leu Ala Gly Val Arg Gly Gly Leu Ser Asp

115 120 125

ggg gag ggt ccc cct ggg ggc cgg ggg gag gca caa cga cgg aaa gaa 432

Gly Glu Gly Pro Pro Gly Gly Arg Gly Glu Ala Gln Arg Arg Lys Glu

130 135 140

cga gaa gaa ctg gcc caa cag tat gaa gcc atc cta cgg gag tgt ggc 480

Arg Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Ala Ile Leu Arg Glu Cys Gly

145 150 155 160

cac ggc cgc ttc cag tgg aca ctg tat ttt gtg ctt ggt ctg gcg ctg 528

His Gly Arg Phe Gln Trp Thr Leu Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu

165 170 175

atg gct gac ggt gtg gag gtc ttt gtg gtg ggc ttc gtg ctg ccc agc 576

Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu Pro Ser

180 185 190

gct gag aaa gac atg tgc ctg tcc gac tcc aac aaa ggc atg cta ggc 624

Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Asp Ser Asn Lys Gly Met Leu Gly

195 200 205

ctc atc gtc tac ctg ggc atg atg gtg gga gcc ttc ctc tgg gga ggt 672

Leu Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Leu Trp Gly Gly

210 215 220

ctg gct gac cgg ctg ggt cgg agg cag tgt ctg ctc atc tcg ctc tca 720

Leu Ala Asp Arg Leu Gly Arg Arg Gln Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ser

225 230 235 240

gtc aac agc gtc ttc gcc ttc ttc tca tct ttt gtc cag ggt tac ggc 768

Val Asn Ser Val Phe Ala Phe Phe Ser Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly

245 250 255

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Thr Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser

260 265 270

atc ccc att gtc ttc tcc tat ttc tcc gag ttt ctg gcc cag gag aaa 864

Ile Pro Ile Val Phe Ser Tyr Phe Ser Glu Phe Leu Ala Gln Glu Lys

275 280 285

cga ggg gag cat ttg agc tgg ctc tgc atg ttt tgg atg att ggt ggc 912

Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile Gly Gly

290 295 300

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Val Tyr Ala Ala Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp

305 310 315 320

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Ser Phe Gln Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg Val Phe

325 330 335

gtc ctc gtc tgc gcc ttt cct tct gtg ttt gcc att ggg gct ctg acc 1056

Val Leu Val Cys Ala Phe Pro Ser Val Phe Ala Ile Gly Ala Leu Thr

340 345 350

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355 360 365

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Glu Ala Trp Met Val Leu Lys Gln Val His Asp Thr Asn Met Arg Ala

370 375 380

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Lys Gly His Pro Glu Arg Val Phe Ser Val Thr His Ile Lys Thr Ile

385 390 395 400

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His Gln Glu Asp Glu Leu Ile Glu Ile Gln Ser Asp Thr Gly Thr Trp

405 410 415

tac cag cgc tgg ggg gtc cgg gcc ttg agc cta ggg ggg cag gtt tgg 1296

Tyr Gln Arg Trp Gly Val Arg Ala Leu Ser Leu Gly Gly Gln Val Trp

420 425 430

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Gly Asn Phe Leu Ser Cys Phe Gly Pro Glu Tyr Arg Arg Ile Thr Leu

435 440 445

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Met Met Met Gly Val Trp Phe Thr Met Ser Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu

450 455 460

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465 470 475 480

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Ala Ser Arg Thr Lys Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr

485 490 495

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Phe Asn Phe Thr Leu Glu Asn Gln Ile His Arg Gly Gly Gln Tyr Phe

500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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Leu His Asn Lys Glu Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu

580 585 590

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Gly Ala Tyr Met Val Tyr Phe Val Ser Phe Leu Gly Thr Leu Ala Val

595 600 605

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Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Lys Ile Gly Arg

610 615 620

ctc aga atg ctt gct ggc tcc agc gtg atg tcc tgt gtc tcc tgc ttc 1920

Leu Arg Met Leu Ala Gly Ser Ser Val Met Ser Cys Val Ser Cys Phe

625 630 635 640

ttc ctg tct ttt ggg aac agt gag tcg gcc atg atc gct ctg ctc tgc 1968

Phe Leu Ser Phe Gly Asn Ser Glu Ser Ala Met Ile Ala Leu Leu Cys

645 650 655

ctt ttt ggc ggg gtc agc att gca tcc tgg aat gcg ctg gac gtg ttg 2016

Leu Phe Gly Gly Val Ser Ile Ala Ser Trp Asn Ala Leu Asp Val Leu

660 665 670

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675 680 685

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Leu Asn Ala Leu Cys Lys Leu Ala Ala Val Leu Gly Ile Ser Ile Phe

690 695 700

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Thr Ser Phe Val Gly Ile Thr Lys Ala Ala Pro Ile Leu Phe Ala Ser

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gct gcc ctt gcc ctt ggc agc tct ctg gcc ctg aag ctg cct gag acc 2208

Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Lys Leu Pro Glu Thr

725 730 735

cgg ggg cag gtg ctg cag tga 2229

Arg Gly Gln Val Leu Gln

740

<210>2

<211>742

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Glu Glu Gly Phe Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ile Arg Gly Ala Lys

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Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys Lys His Ala Ala Lys Lys Val Val Lys

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Gly Leu Asp Arg Val Gln Asp Glu Tyr Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Tyr Gln Arg Trp Gly Val Arg Ala Leu Ser Leu Gly Gly Gln Val Trp

420 425 430

Gly Asn Phe Leu Ser Cys Phe Gly Pro Glu Tyr Arg Arg Ile Thr Leu

435 440 445

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485 490 495

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500 505 510

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580 585 590

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Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Lys Leu Pro Glu Thr

725 730 735

Arg Gly Gln Val Leu Gln

740

<210>3

<211>2052

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2052)

<223>

<400>3

atg gat gac tac aag tat cag gac aat tat ggg ggc tat gct ccc agt 48

Met Asp Asp Tyr Lys Tyr Gln Asp Asn Tyr Gly Gly Tyr Ala Pro Ser

1 5 10 15

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Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Asn Glu Ser Asn Pro Glu Glu Asp Ala Gln

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

aag atg gcg ccc tcc aga atg gac agc ctt cgg ggc cag aca gac ctg 240

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65 70 75 80

atg gct gag agg ctg gaa gat gag gag cag ttg gcc cac cag tac gag 288

Met Ala Glu Arg Leu Glu Asp Glu Glu Gln Leu Ala His Gln Tyr Glu

85 90 95

acc atc atg gat gag tgt ggc cat ggc cgc ttc cag tgg atc ctc ttt 336

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gct gac gag gaa gag tta gcc cag cag tat gag ctg ata atc caa gaa 432

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130 135 140

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645 650 655

Val Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asp Arg Arg Ala Thr Gly Phe Gly

660 665 670

Phe Leu Asn Ala Leu Cys Lys Ala Ala Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile

675 680 685

Phe Gly Ser Leu Val Ser Ile Thr Lys Ser Ile Pro Ile Leu Leu Ala

690 695 700

Ser Thr Val Leu Val Cys Gly Gly Leu Val Gly Leu Cys Leu Pro Asp

705 710 715 720

Thr Arg Thr Gln Val Leu Met

725

<210>7

<211>1647

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1647)

<223>

<400>7

atg gag gag gac tta ttc cag cta agg cag ctg ccg gtt gtg aaa ttc 48

Met Glu Glu Asp Leu Phe Gln Leu Arg Gln Leu Pro Val Val Lys Phe

1 5 10 15

cgt cgc aca ggc gag agt gca agg tca gag gac gac acg gct tca gga 96

Arg Arg Thr Gly Glu Ser Ala Arg Ser Glu Asp Asp Thr Ala Ser Gly

20 25 30

gag cat gaa gtc cag att gaa ggg gtc cac gtg ggc cta gag gct gtg 144

Glu His Glu Val Gln Ile Glu Gly Val His Val Gly Leu Glu Ala Val

35 40 45

gag ctg gat gat ggg gca gct gtg ccc aag gag ttt gcc aat ccc act 192

Glu Leu Asp Asp Gly Ala Ala Val Pro Lys Glu Phe Ala Asn Pro Thr

50 55 60

gat gat act ttc atg gtg gaa gat gca gtg gaa gcc att ggc ttt gga 240

Asp Asp Thr Phe Met Val Glu Asp Ala Val Glu Ala Ile Gly Phe Gly

65 70 75 80

aaa ttt cag tgg aag ctg tct gtt ctc act ggc ttg gct tgg atg gct 288

Lys Phe Gln Trp Lys Leu Ser Val Leu Thr Gly Leu Ala Trp Met Ala

85 90 95

gat gcc atg gag atg atg atc ctc agc atc ctg gca cca cag ctg cat 336

Asp Ala Met Glu Met Met Ile Leu Ser Ile Leu Ala Pro Gln Leu His

100 105 110

tgc gag tgg agg ctc cca agc tgg cag gtg gca ttg ctg acc tcg gtg 384

Cys Glu Trp Arg Leu Pro Ser Trp Gln Val Ala Leu Leu Thr Ser Val

115 120 125

gtc ttt gta ggc atg atg tcc agc tcc acg ctc tgg gga aat atc tca 432

Val Phe Val Gly Met Met Ser Ser Ser Thr Leu Trp Gly Asn Ile Ser

130 135 140

gac cag tac ggc agg aaa aca ggg ctg aag atc agc gtg ctg tgg act 480

Asp Gln Tyr Gly Arg Lys Thr Gly Leu Lys Ile Ser Val Leu Trp Thr

145 150 155 160

ctg tac tat ggc atc ctt agt gca ttt gcg ccc gtg tat agc tgg atc 528

Leu Tyr Tyr Gly Ile Leu Ser Ala Phe Ala Pro Val Tyr Ser Trp Ile

165 170 175

ctg gtg ctc cgg ggc ctg gtg ggc ttc ggg atc gga gga gtt ccc cag 576

Leu Val Leu Arg Gly Leu Val Gly Phe Gly Ile Gly Gly Val Pro Gln

180 185 190

tcg gtg acg ctg tat gcc gag ttc ctt ccc atg aaa gcc aga gct aaa 624

Ser Val Thr Leu Tyr Ala Glu Phe Leu Pro Met Lys Ala Arg Ala Lys

195 200 205

tgt att ttg ctg att gag gta ttc tgg gcc atc ggg aca gtg ttc gag 672

Cys Ile Leu Leu Ile Glu Val Phe Trp Ala Ile Gly Thr Val Phe Glu

210 215 220

gtc gtc ctg gct gtg ttc gtg atg ccc agc ctg ggc tgg cgt tgg ctg 720

Val Val Leu Ala Val Phe Val Met Pro Ser Leu Gly Trp Arg Trp Leu

225 230 235 240

ctc atc ctc tca gct gtc ccg ctc ctc ctc ttt gcc gtg ctg tgt ttc 768

Leu Ile Leu Ser Ala Val Pro Leu Leu Leu Phe Ala Val Leu Cys Phe

245 250 255

tgg ctg cct gaa agt gca agg tat gat gtg ctg tca ggg aac cag gaa 816

Trp Leu Pro Glu Ser Ala Arg Tyr Asp Val Leu Ser Gly Asn Gln Glu

260 265 270

aag gca atc gcc acc tta aag agg ata gca act gaa aac gga gct ccc 864

Lys Ala Ile Ala Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Glu Asn Gly Ala Pro

275 280 285

atg ccg ctg ggg aaa ctc atc atc tcc aga cag gaa gac cga ggc aaa 912

Met Pro Leu Gly Lys Leu Ile Ile Ser Arg Gln Glu Asp Arg Gly Lys

290 295 300

atg agg gac ctt ttc aca ccc cat ttt aga tgg aca act ttg ctg ctg 960

Met Arg Asp Leu Phe Thr Pro His Phe Arg Trp Thr Thr Leu Leu Leu

305 310 315 320

tgg ttt ata tgg ttt tcc aat gca ttc tct tac tac ggg tta gtt cta 1008

Trp Phe Ile Trp Phe Ser Asn Ala Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Val Leu

325 330 335

ctc acc aca gaa ctc ttc cag gca gga gat gtc tgc ggc atc tcc agt 1056

Leu Thr Thr Glu Leu Phe Gln Ala Gly Asp Val Cys Gly Ile Ser Ser

340 345 350

cgg aag aag gct gta gag gca aaa tgc agc ctg gcc tgc gag tac ctg 1104

Arg Lys Lys Ala Val Glu Ala Lys Cys Ser Leu Ala Cys Glu Tyr Leu

355 360 365

agt gag gag gat tac atg gac ttg ctg tgg acc acc ctc tct gag ttt 1152

Ser Glu Glu Asp Tyr Met Asp Leu Leu Trp Thr Thr Leu Ser Glu Phe

370 375 380

cca ggt gtc ctt gtg act ctg tgg att att gac cgc ctg ggg cgc aag 1200

Pro Gly Val Leu Val Thr Leu Trp Ile Ile Asp Arg Leu Gly Arg Lys

385 390 395 400

aag acc atg gcc ctg tgc ttt gtc atc ttc tcc ttc tgc agc ctc ctg 1248

Lys Thr Met Ala Leu Cys Phe Val Ile Phe Ser Phe Cys Ser Leu Leu

405 410 415

ctg ttt atc tgt gtt gga aga aat gtg ctc act ctg tta ctc ttc att 1296

Leu Phe Ile Cys Val Gly Arg Asn Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Ile

420 425 430

gca aga gcg ttt att tct gga ggc ttt caa gcg gca tat gtt tac aca 1344

Ala Arg Ala Phe Ile Ser Gly Gly Phe Gln Ala Ala Tyr Val Tyr Thr

435 440 445

cct gag gtc tac ccc acg gca acg cgg gcc ctc ggc ctg ggc acc tgc 1392

Pro Glu Val Tyr Pro Thr Ala Thr Arg Ala Leu Gly Leu Gly Thr Cys

450 455 460

agc ggc atg gca aga gtg ggt gct ctc atc act ccg ttc atc gcc cag 1440

Ser Gly Met Ala Arg Val Gly Ala Leu Ile Thr Pro Phe Ile Ala Gln

465 470 475 480

gtg atg ctg gaa tcc tct gtg tac ctg act ctg gca gtt tac agt ggc 1488

Val Met Leu Glu Ser Ser Val Tyr Leu Thr Leu Ala Val Tyr Ser Gly

485 490 495

tgc tgc ctc ctg gct gcc ctg gcc tcc tgc ttt ttg ccc att gag acc 1536

Cys Cys Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Cys Phe Leu Pro Ile Glu Thr

500 505 510

aaa ggc cga gga ctg cag gag tcc agc cac cgg gag tgg ggc cag gag 1584

Lys Gly Arg Gly Leu Gln Glu Ser Ser His Arg Glu Trp Gly Gln Glu

515 520 525

atg gtc ggc cga gga atg cac ggt gca ggt gtt acc agg tcg aac tct 1632

Met Val Gly Arg Gly Met His Gly Ala Gly Val Thr Arg Ser Asn Ser

530 535 540

ggc tct cag gaa tag 1647

Gly Ser Gln Glu

545

<210>8

<211>548

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Met Glu Glu Asp Leu Phe Gln Leu Arg Gln Leu Pro Val Val Lys Phe

1 5 10 15

Arg Arg Thr Gly Glu Ser Ala Arg Ser Glu Asp Asp Thr Ala Ser Gly

20 25 30

Glu His Glu Val Gln Ile Glu Gly Val His Val Gly Leu Glu Ala Val

35 40 45

Glu Leu Asp Asp Gly Ala Ala Val Pro Lys Glu Phe Ala Asn Pro Thr

50 55 60

Asp Asp Thr Phe Met Val Glu Asp Ala Val Glu Ala Ile Gly Phe Gly

65 70 75 80

Lys Phe Gln Trp Lys Leu Ser Val Leu Thr Gly Leu Ala Trp Met Ala

85 90 95

Asp Ala Met Glu Met Met Ile Leu Ser Ile Leu Ala Pro Gln Leu His

100 105 110

Cys Glu Trp Arg Leu Pro Ser Trp Gln Val Ala Leu Leu Thr Ser Val

115 120 125

Val Phe Val Gly Met Met Ser Ser Ser Thr Leu Trp Gly Asn Ile Ser

130 135 140

Asp Gln Tyr Gly Arg Lys Thr Gly Leu Lys Ile Ser Val Leu Trp Thr

145 150 155 160

Leu Tyr Tyr Gly Ile Leu Ser Ala Phe Ala Pro Val Tyr Ser Trp Ile

165 170 175

Leu Val Leu Arg Gly Leu Val Gly Phe Gly Ile Gly Gly Val Pro Gln

180 185 190

Ser Val Thr Leu Tyr Ala Glu Phe Leu Pro Met Lys Ala Arg Ala Lys

195 200 205

Cys Ile Leu Leu Ile Glu Val Phe Trp Ala Ile Gly Thr Val Phe Glu

210 215 220

Val Val Leu Ala Val Phe Val Met Pro Ser Leu Gly Trp Arg Trp Leu

225 230 235 240

Leu Ile Leu Ser Ala Val Pro Leu Leu Leu Phe Ala Val Leu Cys Phe

245 250 255

Trp Leu Pro Glu Ser Ala Arg Tyr Asp Val Leu Ser Gly Asn Gln Glu

260 265 270

Lys Ala Ile Ala Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Glu Asn Gly Ala Pro

275 280 285

Met Pro Leu Gly Lys Leu Ile Ile Ser Arg Gln Glu Asp Arg Gly Lys

290 295 300

Met Arg Asp Leu Phe Thr Pro His Phe Arg Trp Thr Thr Leu Leu Leu

305 310 315 320

Trp Phe Ile Trp Phe Ser Asn Ala Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Val Leu

325 330 335

Leu Thr Thr Glu Leu Phe Gln Ala Gly Asp Val Cys Gly Ile Ser Ser

340 345 350

Arg Lys Lys Ala Val Glu Ala Lys Cys Ser Leu Ala Cys Glu Tyr Leu

355 360 365

Ser Glu Glu Asp Tyr Met Asp Leu Leu Trp Thr Thr Leu Ser Glu Phe

370 375 380

Pro Gly Val Leu Val Thr Leu Trp Ile Ile Asp Arg Leu Gly Arg Lys

385 390 395 400

Lys Thr Met Ala Leu Cys Phe Val Ile Phe Ser Phe Cys Ser Leu Leu

405 410 415

Leu Phe Ile Cys Val Gly Arg Asn Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Ile

420 425 430

Ala Arg Ala Phe Ile Ser Gly Gly Phe Gln Ala Ala Tyr Val Tyr Thr

435 440 445

Pro Glu Val Tyr Pro Thr Ala Thr Arg Ala Leu Gly Leu Gly Thr Cys

450 455 460

Ser Gly Met Ala Arg Val Gly Ala Leu Ile Thr Pro Phe Ile Ala Gln

465 470 475 480

Val Met Leu Glu Ser Ser Val Tyr Leu Thr Leu Ala Val Tyr Ser Gly

485 490 495

Cys Cys Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Cys Phe Leu Pro Ile Glu Thr

500 505 510

Lys Gly Arg Gly Leu Gln Glu Ser Ser His Arg Glu Trp Gly Gln Glu

515 520 525

Met Val Gly Arg Gly Met His Gly Ala Gly Val Thr Arg Ser Asn Ser

530 535 540

Gly Ser Gln Glu

545

<210>9

<211>3844

<212>DNA

<213>褐鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221>CDS

<222>(400)..(2628)

<223>

<400>9

cctcagccct gtggctggac cccctccctc acccggggac tccctgaccc ggggaaccaa 60

gctcaggtct ccagagcctc ccagaagaaa aataggcagc cctccctgaa atatcttggc 120

tcctcagttt atcctttcca acctggctcc cccttcccag ttcccctccc tactccctgt 180

ctccctcccc aactcaccct actgaactgg gtgcagagca aagccctttt cgcccttttc 240

cccatctgga cttctctggc cagttcctct tagtccgatc ccaaagacac tggaacacat 300

ttctaaaggg tcttcttgat ccctccaatt cattgagcaa agggctgaaa aagaagcaga 360

gagtaaggta gagccagtga ctcgccccca agccccatc atg gaa gaa ggc ttt 414

Met Glu Glu Gly Phe

1 5

cga gac cga gca gcg ttc atc cgt ggg gcc aaa gac att gcc aag gaa 462

Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ile Arg Gly Ala Lys Asp Ile Ala Lys Glu

10 15 20

gtt aag aag cac gcg gcc aag aag gtg gtg aag ggt ctc gsc aga gtc 510

Val Lys Lys His Ala Ala Lys Lys Val Val Lys Gly Leu Asp Arg Val

25 30 35

cag gat gaa tat tcc cga agg tcc tac tcc cgc ttt gag gag gag gag 558

Gln Asp Glu Tyr Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg Phe Glu Glu Glu Glu

40 45 50

gat gat gat gac ttc cct gcc cct gct gac ggc tat tac cgc gga gaa 606

Asp Asp Asp Asp Phe Pro Ala Pro Ala Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Glu

55 60 65

ggg gcc cag gat gag gag gaa ggt ggc gct tcc agt gat gcc act gag 654

Gly Ala Gln Asp Glu Glu Glu Gly Gly Ala Ser Ser Asp Ala Thr Glu

70 75 80 85

ggc cac gat gag gat gat gag atc tac gag gga gaa tat cag ggc atc 702

Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Gly Ile

90 95 100

ccc cgg gca gag tct ggg ggc aaa ggc gaa cgg atg gca gat ggg gca 750

Pro Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Gly Glu Arg Met Ala Asp Gly Ala

105 110 115

ccc ctg gct gga gtg aga ggg ggc tta agt gat ggg gag ggt ccc cct 798

Pro Leu Ala Gly Val Arg Gly Gly Leu Ser Asp Gly Glu Gly Pro Pro

120 125 130

ggg ggt cgc ggg gag gcg cag cgg cgt aaa gat cgg gaa gaa ttg gct 846

Gly Gly Arg Gly Glu Ala Gln Arg Arg Lys Asp Arg Glu Glu Leu Ala

135 140 145

cag cag tat gag acc atc ctc cgg gag tgc ggc cat ggt cgc ttc cag 894

Gln Gln Tyr Glu Thr Ile Leu Arg Glu Cys Gly His Gly Arg Phe Gln

150 155 160 165

tgg aca ctc tac ttc gtg ctg ggt ctg gcg ctg atg gcc gat ggt gta 942

Trp Thr Leu Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Asp Gly Val

170 175 180

gag gtc ttt gtg gtg ggc ttt gtg ctg ccc agt gct gag aaa gat atg 990

Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu Pro Ser Ala Glu Lys Asp Met

185 190 195

tgc ctg tcg gac tcc aac aaa ggc atg cta ggc ctc att gtg tac ctg 1038

Cys Leu Ser Asp Ser Asn Lys Gly Met Leu Gly Leu Ile Val Tyr Leu

200 205 210

ggc atg atg gtg ggg gcc ttc ctc tgg gga ggc ctg gct gat cgg ctg 1086

Gly Met Met Val Gly Ala Phe Leu Trp Gly Gly Leu Ala Asp Arg Leu

215 220 225

ggt cgg aga cag tgt ctg ctc atc tcg ctc tca gtc aac agc gtc ttc 1134

Gly Arg Arg Gln Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Val Asn Ser Val Phe

230 235 240 245

gct ttc ttc tca tcc ttc gtc cag ggt tat ggc acc ttc ctt ttc tgc 1182

Ala Phe Phe Ser Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly Thr Phe Leu Phe Cys

250 255 260

cgc ctc ctt tct ggg gtt ggg att ggt ggt tcc atc ccc att gtc ttc 1230

Arg Leu Leu Ser Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser Ile Pro Ile Val Phe

265 270 275

tcc tat ttt tcg gag ttt ctg gcc cag gag aaa cgt ggg gag cat ttg 1278

Ser Tyr Phe Ser Glu Phe Leu Ala Gln Glu Lys Arg Gly Glu His Leu

280 285 290

agc tgg ctc tgt atg ttc tgg atg att ggt ggc gtg tat gca gct gca 1326

Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile Gly Gly Val Tyr Ala Ala Ala

295 300 305

atg gcc tgg gcc atc atc ccc cac tat ggg tgg agt ttc cag atg ggc 1374

Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp Ser Phe Gln Met Gly

310 315 320 325

tct gct tac cag ttc cac agc tgg agg gtc ttt gtc ctc gtc ttt gcc 1422

Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg Val Phe Val Leu Val Phe Ala

330 335 340

ttt ccc tct gtg ttt gcc atc ggg gct ctg act acg cag ccg gag agt 1470

Phe Pro Ser Val Phe Ala Ile Gly Ala Leu Thr Thr Gln Pro Glu Ser

345 350 355

ccc cgc ttc ttc tta gag aat ggg aag cac gat gag gcc tgg atg gtg 1518

Pro Arg Phe Phe Leu Glu Asn Gly Lys His Asp Glu Ala Trp Met Val

360 365 370

ctg aag cag gtt cat gac acc aac atg cga gcc aag ggc cat cct gag 1566

Leu Lys Gln Val His Asp Thr Asn Met Arg Ala Lys Gly His Pro Glu

375 380 385

cga gtc ttc tca gta acc cac att aaa acg att cat cag gag gat gaa 1614

Arg Val Phe Ser Val Thr His Ile Lys Thr Ile His Gln Glu Asp Glu

390 395 400 405

ttg att gag atc cag tca gac aca gga acc tgg tac cag cgc tgg gga 1662

Leu Ile Glu Ile Gln Ser Asp Thr Gly Thr Trp Tyr Gln Arg Trp Gly

410 415 420

gtg cgg gct ttg agc ctg ggg ggt cag gtt tgg ggg aac ttc ctc tcc 1710

Val Arg Ala Leu Ser Leu Gly Gly Gln Val Trp Gly Asn Phe Leu Ser

425 430 435

tgc ttc agt cca gag tac cgg cgc atc act ctg atg atg atg ggg gta 1758

Cys Phe Ser Pro Glu Tyr Arg Arg Ile Thr Leu Met Met Met Gly Val

440 445 450

tgg ttc acc atg tcc ttc agc tac tac ggt ttg act gtc tgg ttt ccc 1806

Trp Phe Thr Met Ser Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Thr Val Trp Phe Pro

455 460 465

gac atg atc cgc cat ctc cag gct gtg gac tat gca gcc cga acc aaa 1854

Asp Met Ile Arg His Leu Gln Ala Val Asp Tyr Ala Ala Arg Thr Lys

470 475 480 485

gtg ttc cca ggg gag cgc gtg gag cac gtg aca ttt aac ttc aca ctg 1902

Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr Phe Asn Phe Thr Leu

490 495 500

gag aat cag atc cac cga ggg gga cag tac ttc aat gac aag ttc atc 1950

Glu Asn Gln Ile His Arg Gly Gly Gln Tyr Phe Asn Asp Lys Phe Ile

505 510 515

ggg ctg cgt ctg aag tca gtg tcc ttt gag gat tcc ctg ttt gag gaa 1998

Gly Leu Arg Leu Lys Ser Val Ser Phe Glu Asp Ser Leu Phe Glu Glu

520 525 530

tgt tac ttt gaa gat gtc aca tcc agc aac aca ttc ttc cgc aac tgc 2046

Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Ser Asn Thr Phe Phe Arg Asn Cys

535 540 545

aca ttc atc aac acc gtg ttc tac aac acg gac ctg ttt gag tac aag 2094

Thr Phe Ile Asn Thr Val Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Glu Tyr Lys

550 555 560 565

ttc gtg aac agc cgc ctg gtg aac agc aca ttc ctg cac aat aag gaa 2142

Phe Val Asn Ser Arg Leu Val Asn Ser Thr Phe Leu His Asn Lys Glu

570 575 580

ggt tgc cca cta gat gtg aca ggg acg ggc gaa ggt gcc tac atg gtg 2190

Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu Gly Ala Tyr Met Val

585 590 595

tac ttt gtc agc ttc ttg ggg aca ctg gct gtg ctc cct gga aat att 2238

Tyr Phe Val Ser Phe Leu Gly Thr Leu Ala Val Leu Pro Gly Asn Ile

600 605 610

gtg tct gct ctg ctc atg gac aag att ggc agg ctc aga atg ctt gct 2286

Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Lys Ile Gly Arg Leu Arg Met Leu Ala

615 620 625

ggt tcc agt gtg ttg tcc tgt gtt tcc tgc ttc ttc ctg tct ttt ggg 2334

Gly Ser Ser Val Leu Ser Cys Val Ser Cys Phe Phe Leu Ser Phe Gly

630 635 640 645

aac agt gag tca gcc atg atc gct ctg ctc tgc ctt ttt ggg gga gtc 2382

Asn Ser Glu Ser Ala Met Ile Ala Leu Leu Cys Leu Phe Gly Gly Val

650 655 660

agt att gca tcc tgg aac gcg ctg gac gtg ctg act gtt gaa ctc tac 2430

Ser Ile Ala Ser Trp Asn Ala Leu Asp Val Leu Thr Val Glu Leu Tyr

665 670 675

cct tcc gac aag agg acg acg gcc ttc ggc ttc ctg aat gcc ctg tgt 2478

Pro Ser Asp Lys Arg Thr Thr Ala Phe Gly Phe Leu Asn Ala Leu Cys

680 685 690

aag ctg gca gct gta ctg ggc atc agc atc ttc acg tcc ttt gtg gga 2526

Lys Leu Ala Ala Val Leu Gly Ile Ser Ile Phe Thr Ser Phe Val Gly

695 700 705

atc acc aag gcc gct ccc atc ctc ttc gcc tca gct gcg ctt gcc ctt 2574

Ile Thr Lys Ala Ala Pro Ile Leu Phe Ala Ser Ala Ala Leu Ala Leu

710 715 720 725

ggt agc tct ctg gct ctg aag ctg cct gag acc cgg gga cag gtg ctg 2622

Gly Ser Ser Leu Ala Leu Lys Leu Pro Glu Thr Arg Gly Gln Val Leu

730 735 740

cag tga gggatggggg agtgtctcag gggctttagg gatggcaggc acactgtgac 2678

Gln

caataatttc ttttatccct accctgccct gctgtcctgg tcctactccg tgtttggtgt 2738

cttagctgtg tgcctgtgtg catgtgtgtg accctgacgg gcaggggcta cggggagggt 2798

ccctttgtcc catgtttggg aggagggact ccccacctgc tgccaccctc aactttgcac 2858

aaggagsagg ctgagctgca tccttctctc cctcagtgtt agcaggggtg gggacgactg 2918

tttctctgct ccaggtgttc cagaatttct gcctttccca tcattccctc cgcctaggcc 2978

ctggtgaacc acaggtatgg agttatagtg ggggctgagg cttggaccaa aagaacttct 3038

tgagtgggag cctcccaagg atgctgggga gtagcaataa accttagcct ccgttttcac 3098

ctcaattcag gctacaagtg tgaagcctgg attttatgga attagttttc tgattcttat 3158

ttatatgtaa gttctgaggc agcttagctg gactgtgtgt ggatgtatsc atacactcat 3218

atgtgtgtgt gtgtgcgccg cgtgcgtgtg cgtgtgtgta tgtgtgccat ggggtagggg 3278

taccactata ctgttcaatt ataagccaag agtagtagtt tcagtgagca cacacacaac 3338

actgtttttc tatcgtaact cccagaatct tgtacctgtg ttggggctgc aggcagaagt 3398

ccttggtcag gctggggtga gccctgcaat cttgggggac ctgagggcac ctgacaagga 3458

ctttctcctt cctctagaga ggttctaccc actagccaca gccctcccat ctgacctgtc 3518

cacacaggca gtgtatcaga ggaaagaaag ggaaaataac caggcacaca tggtcaaacc 3578

agcaggtctg aaagcacaag aagctggggc aggggcagga agcaggggtc catcccctaa 3638

cccttctcaa aaaggctggg tcgtgaggga cccctaatgc agggacctga agcctcagtt 3698

tccccatctt gcccttccac agaacagcct ctgtaggtag agctgccccc cgtcctaccc 3758

tactcttgtg gctgctttct ttggtactct tcccactccc accgtagctg tgscgtgttg 3818

tagtttttag ctgtttgtaa aatgtt 3844

<210>10

<211>742

<212>PRT

<213>褐鼠

<400>10

Met Glu Glu Gly Phe Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ile Arg Gly Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys Lys His Ala Ala Lys Lys Val Val Lys

20 25 30

Gly Leu Asp Arg Val Gln Asp Glu Tyr Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

Phe Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Phe Pro Ala Pro Ala Asp Gly

50 55 60

Tyr Tyr Arg Gly Glu Gly Ala Gln Asp Glu Glu Glu Gly Gly Ala Ser

65 70 75 80

Ser Asp Ala Thr Glu Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

85 90 95

Glu Tyr Gln Gly Ile Pro Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Gly Glu Arg

100 105 110

Met Ala Asp Gly Ala Pro Leu Ala Gly Val Arg Gly Gly Leu Ser Asp

115 120 125

Gly Glu Gly Pro Pro Gly Gly Arg Gly Glu Ala Gln Arg Arg Lys Asp

130 135 140

Arg Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Thr Ile Leu Arg Glu Cys Gly

145 150 155 160

His Gly Arg Phe Gln Trp Thr Leu Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu Pro Ser

180 185 190

Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Asp Ser Asn Lys Gly Met Leu Gly

195 200 205

Leu Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Leu Trp Gly Gly

210 215 220

Leu Ala Asp Arg Leu Gly Arg Arg Gln Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ser

225 230 235 240

Val Asn Ser Val Phe Ala Phe Phe Ser Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly

245 250 255

Thr Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser

260 265 270

Ile Pro Ile Val Phe Ser Tyr Phe Ser Glu Phe Leu Ala Gln Glu Lys

275 280 285

Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile Gly Gly

290 295 300

Val Tyr Ala Ala Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp

305 310 315 320

Ser Phe Gln Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg Val Phe

325 330 335

Val Leu Val Phe Ala Phe Pro Ser Val Phe Ala Ile Gly Ala Leu Thr

340 345 350

Thr Gln Pro Glu Ser Pro Arg Phe Phe Leu Glu Asn Gly Lys His Asp

355 360 365

Glu Ala Trp Met Val Leu Lys Gln Val His Asp Thr Asn Met Arg Ala

370 375 380

Lys Gly His Pro Glu Arg Val Phe Ser Val Thr His Ile Lys Thr Ile

385 390 395 400

His Gln Glu Asp Glu Leu Ile Glu Ile Gln Ser Asp Thr Gly Thr Trp

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

Ala Ala Arg Thr Lys Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Phe Phe Arg Asn Cys Thr Phe Ile Asn Thr Val phe Tyr Asn Thr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Glu Tyr Lys Phe Val Asn Ser Arg Leu Val Asn Ser Thr Phe

565 570 575

Leu His Asn Lys Glu Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu

580 585 590

Gly Ala Tyr Met Val Tyr Phe Val Ser Phe Leu Gly Thr Leu Ala Val

595 600 605

Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Lys Ile Gly Arg

610 615 620

Leu Arg Met Leu Ala Gly Ser Ser Val Leu Ser Cys Val Ser Cys Phe

625 630 635 640

Phe Leu Ser Phe Gly Asn Ser Glu Ser Ala Met Ile Ala Leu Leu Cys

645 650 655

Leu Phe Gly Gly Val Ser Ile Ala Ser Trp Asn Ala Leu Asp Val Leu

660 665 670

Thr Val Glu Leu Tyr Pro Ser Asp Lys Arg Thr Thr Ala Phe Gly Phe

675 680 685

Leu Asn Ala Leu Cys Lys Leu Ala Ala Val Leu Gly Ile Ser Ile Phe

690 695 700

Thr Ser Phe Val Gly Ile Thr Lys Ala Ala Pro Ile Leu Phe Ala Ser

705 710 715 720

Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Lys Leu Pro Glu Thr

725 730 735

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740

<210>11

<211>2052

<212>DNA

<213>褐鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2052)

<223>

<400>11

atg gat gac tac agg tat cgg gac aac tat gag ggc tat gcc cct aat 48

Met Asp Asp Tyr Arg Tyr Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Tyr Ala Pro Asn

1 5 10 15

gat ggc tac tac cgg ggc aat gag cag aac ccg gaa gaa gat gca cag 96

Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Asn Glu Gln Asn Pro Glu Glu Asp Ala Gln

20 25 30

agc gat gtt aca gaa ggc cac gat gaa gag gat gag atc tat gag ggc 144

Ser Asp Val Thr Glu Gly His Asp Glu Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

35 40 45

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Glu Tyr Gln Gly Ile Pro His Pro Asp Asp Val Lys Ser Lys Gln Thr

50 55 60

aag atg gca ccg tcc aga gca gat ggc ctt cgg ggc cag gca gac ctg 240

Lys Met Ala Pro Ser Arg Ala Asp Gly Leu Arg Gly Gln Ala Asp Leu

65 70 75 80

atg gct gag aga atg gaa gat gag gag cag ctc gct cac cag tac gag 288

Met Ala Glu Arg Met Glu Asp Glu Glu Gln Leu Ala His Gln Tyr Glu

85 90 95

acc atc att gat gag tgt ggc cat ggg cgc ttc cag tgg acc ctc ttt 336

Thr Ile Ile Asp Glu Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Thr Leu Phe

100 105 110

ttc gtc ttg gtc ttg gcc ttg atg gct gac gga gtg gaa gtg ttt gtg 384

Phe Val Leu Val Leu Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val

115 120 125

gtg agc ttt gct ctg cca agt gca gag aaa gat atg tgt ctg tca agt 432

Val Ser Phe Ala Leu Pro Ser Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Ser

130 135 140

tcc aag aaa gga atg ctc ggg ctg att gtc tac cta gga atg atg gca 480

Ser Lys Lys Gly Met Leu Gly Leu Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Ala

145 150 155 160

gga gcc ttc atc ctg ggg ggc ctg gct gat aaa ctg gga agg aag aag 528

Gly Ala Phe Ile Leu Gly Gly Leu Ala Asp Lys Leu Gly Arg Lys Lys

165 170 175

gtc ctc agc atg tcc ttg gct atc aat gct tcc ttt gcc tcc ctc tcc 576

Val Leu Ser Met Ser Leu Ala Ile Asn Ala Ser Phe Ala Ser Leu Ser

180 185 190

tcc ttc gtg cag gga tat gga gct ttc ctc ttc tgc aga ctc atc tca 624

Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly Ala Phe Leu Phe Cys Arg Leu Ile Ser

195 200 205

ggc ata ggt att ggg ggc tcc ctg cca att gtt ttt gcc tac ttt tct 672

Gly Ile Gly Ile Gly Gly Ser Leu Pro Ile Val Phe Ala Tyr Phe Ser

210 215 220

gag ttc tta tca cgg gag aaa cgc ggt gag cat ctc agc tgg ctg ggt 720

Glu Phe Leu Ser Arg Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Gly

225 230 235 240

atc ttc tgg atg act ggg ggc atc tac gca tct gcc atg gcc tgg agc 768

Ile Phe Trp Met Thr Gly Gly Ile Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ser

245 250 255

atc att cca cac tat ggc tgg ggc ttc agc atg gga acc aat tat cac 816

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260 265 270

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Phe His Ser Trp Arg Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Ala Thr

275 280 285

gtg tcc atg gtg gcc ctg aag ttc atg cca gaa agc ccc agg ttc ctg 912

Val Ser Met Val Ala Leu Lys Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu

290 295 300

ctg gag atg ggc aag cat gat gaa gcc tgg atg att ctc aag caa gtc 960

Leu Glu Met Gly Lys His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Gln Val

305 310 315 320

cat gac acc aac atg aga gct aag ggg acc cct gag aag gtg ttc acg 1008

His Asp Thr Asn Met Arg Ala Lys Gly Thr Pro Glu Lys Val Phe Thr

325 330 335

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Val Ser His Ile Lys Thr Pro Lys Gln Met Asp Glu Phe Ile Glu Ile

340 345 350

cag agt tca aca ggg act tgg tac cag cgc tgg ttg gtc agg ttc atg 1104

Gln Ser Ser Thr Gly Thr Trp Tyr Gln Arg Trp Leu Val Arg Phe Met

355 360 365

acc att ttc aaa cag gtg tgg gat aac gcc ttg tac tgt gtg atg gga 1152

Thr Ile Phe Lys Gln Val Trp Asp Asn Ala Leu Tyr Cys Val Met Gly

370 375 380

ccc tac aga atg aac acc ctg att ctg gct gtg gtc tgg ttc acc atg 1200

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385 390 395 400

gcc tta agt tac tat ggc ctg aca gtg tgg ttc ccc gac atg atc cgg 1248

Ala Leu Ser Tyr Tyr Gly Leu Thr Val Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg

405 410 415

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420 425 430

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Glu His Val His Gly Ala Thr Ile Asn Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile

435 440 445

cac caa cat ggg aag ctt gtg aac gat aag ttc ata aag atg tac ttt 1392

His Gln His Gly Lys Leu Val Asn Asp Lys Phe Ile Lys Met Tyr Phe

450 455 460

aag cat gtc ctc ttt gag gac aca ttc ttt gac aaa tgc tat ttt gaa 1440

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465 470 475 480

gat gtg aca tcc aca gat act tat ttc aag aac tgc acc att gaa tcg 1488

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485 490 495

act acc ttc tac aac aca gac ctc tac aaa cac aag ttc att gac tgt 1536

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500 505 510

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Arg Phe Ile Asn Ser Thr Phe Leu Glu Gln Lys Glu Gly Cys His Met

515 520 525

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Asp Phe Glu Glu Asp Asn Asp Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Phe Leu

530 535 540

ggc agc ctg tct gtc ttg cct ggg aac ata att tct gcc ctg ctc atg 1680

Gly Ser Leu Ser Val Leu Pro Gly Asn Ile Ile Ser Ala Leu Leu Met

545 550 555 560

gac aga atc gga aga ctt aag atg att ggt ggc tcc atg ctc atc tct 1728

Asp Arg Ile Gly Arg Leu Lys Met Ile Gly Gly Ser Met Leu Ile Ser

565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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Ala Leu Asp Val Ile Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asn Gln Arg Ala

610 615 620

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625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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<211>683

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Gly Ala Phe Ile Leu Gly Gly Leu Ala Asp Lys Leu Gly Arg Lys Lys

165 170 175

Val Leu Ser Met Ser Leu Ala Ile Asn Ala Ser Phe Ala Ser Leu Ser

180 185 190

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195 200 205

Gly Ile Gly Ile Gly Gly Ser Leu Pro Ile Val Phe Ala Tyr Phe Ser

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp Gly Phe Ser Met Gly Thr Asn Tyr His

260 265 270

Phe His Ser Trp Arg Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Ala Thr

275 280 285

Val Ser Met Val Ala Leu Lys Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Gly Ser Leu Ser Val Leu Pro Gly Asn Ile Ile Ser Ala Leu Leu Met

545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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<210>13

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<212>DNA

<213>褐鼠

<220>

<221>CDS

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<223>

<400>13

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1

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5 10 15 20

gag gtg aag aag caa aca gtg aag aag gtg aac cag gca gtg gac cgg 331

Glu Val Lys Lys Gln Thr Val Lys Lys Val Asn Gln Ala Val Asp Arg

25 30 35

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Ala Gln Asp Glu Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr Ser Arg Phe Gln Asp Glu

40 45 50

gat gat gat gat gac tac tac cca cct gga gaa acc tac agt ggg gag 427

Asp Asp Asp Asp Asp Tyr Tyr Pro Pro Gly Glu Thr Tyr Ser Gly Glu

55 60 65

gcc aat gat gat gaa ggc tca agt gaa gcc act gag ggt cac gat gaa 475

Ala Asn Asp Asp Glu Gly Ser Ser Glu Ala Thr Glu Gly His Asp Glu

70 75 80

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Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Gly Ile Pro Ser Thr Asn

85 90 95 100

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105 110 115

tac aag gac cgc aga gag ctg gag tca gag agg agg gct gat gag gag 619

Tyr Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Ser Glu Arg Arg Ala Asp Glu Glu

120 125 130

gag ctc gcc cag cag tat gag ctg ata atc caa gag tgt ggc cat ggc 667

Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Leu Ile Ile Gln Glu Cys Gly His Gly

135 140 145

cgt ttc cag tgg gcc ctt ttc ttc gtc ctg ggc atg gct ctc atg gca 715

Arg Phe Gln Trp Ala Leu Phe Phe Val Leu Gly Met Ala Leu Met Ala

150 155 160

gac ggc gtg gag gtg ttt gtg gtg ggc ttt gtg tta ccc agt gca gag 763

Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu Pro Ser Ala Glu

165 170 175 180

aca gac cta tgc ata ccg aat tca gga tct gga tgg cta ggc agc ata 811

Thr Asp Leu Cys Ile Pro Asn Ser Gly Ser Gly Trp Leu Gly Ser Ile

185 190 195

gtg tac ctc ggg atg atg gtg ggg gcg ttc ttc tgg gga gga ctg gca 859

Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Phe Trp Gly Gly Leu Ala

200 205 210

gac aaa gtg gga agg aag cag tct ctt ctg att tgc atg tcc gtc aac 907

Asp Lys Val Gly Arg Lys Gln Ser Leu Leu Ile Cys Met Ser Val Asn

215 220 225

gga ttc ttt gcc ttc ctt tct tca ttt gtc caa ggt tac ggc ttc ttt 955

Gly Phe Phe Ala Phe Leu Ser Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly Phe Phe

230 235 240

ctc ctc tgt cgt ttg ctt tca gga ttc ggg att gga ggc gcc att ccc 1003

Leu Leu Cys Arg Leu Leu Ser Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Pro

245 250 255 260

act gtg ttc tcc tac ttt gct gaa gtc ctg gcc cgg gag aag cgc ggt 1051

Thr Val Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Val Leu Ala Arg Glu Lys Arg Gly

265 270 275

gag cac ctc agt tgg ctc tgc atg ttc tgg atg att ggc ggt atc tat 1099

Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile Gly Gly Ile Tyr

280 285 290

gct tca gcc atg gcc tgg gcc atc atc ccc cac tat ggg tgg agc ttc 1147

Ala Ser Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp Ser Phe

295 300 305

agc atg ggc tca gcc tac cag ttc cac agc tgg cgc gtc ttc gtc atc 1195

Ser Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg Val Phe Val Ile

310 315 320

gtc tgt gcc ctc ccg tgc gtc tcc tcg gtg gtg gcc ctc acc ttc atg 1243

Val Cys Ala Leu Pro Cys Val Ser Ser Val Val Ala Leu Thr Phe Met

325 330 335 340

ccc gaa agc cct cgg ttc ttg ctg gag gta gga aaa cat gat gaa gcc 1291

Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Glu Val Gly Lys His Asp Glu Ala

345 350 355

tgg atg att ctg aag cta att cat gat acc aac atg aga gcc cgg ggc 1339

Trp Met Ile Leu Lys Leu Ile His Asp Thr Asn Met Arg Ala Arg Gly

360 365 370

cag cca gag aag gtc ttc acg gta aat aaa atc aag act ccc aag caa 1387

Gln Pro Glu Lys Val Phe Thr Val Asn Lys Ile Lys Thr Pro Lys Gln

375 380 385

ata gat gag ctg att gag att gag agc gac aca gga acc tgg tac cgg 1435

Ile Asp Glu Leu Ile Glu Ile Glu Ser Asp Thr Gly Thr Trp Tyr Arg

390 395 400

agg tgt ttt gtt cgg atc cgc aca gaa ctg tac gga att tgg ttg act 1483

Arg Cys Phe Val Arg Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Ile Trp Leu Thr

405 410 415 420

ttt atg aga tgc ttc aac tac ccg gtc agg gaa aac acc ata aag ctt 1531

Phe Met Arg Cys Phe Asn Tyr Pro Val Arg Glu Asn Thr Ile Lys Leu

425 430 435

acg att gtt tgg ttc acc ctg tcc ttt ggg tac tat gga ctg tcc gtt 1579

Thr Ile Val Trp Phe Thr Leu Ser Phe Gly Tyr Tyr Gly Leu Ser Val

440 445 450

tgg ttc cca gat gtc att aaa cac ctc cag tct gac gag tac gcc ctg 1627

Trp Phe Pro Asp Val Ile Lys His Leu Gln Ser Asp Glu Tyr Ala Leu

455 460 465

ctg act cgg aat gtg cag aag gat aaa tat gca aac ttt agc att aac 1675

Leu Thr Arg Asn Val Gln Lys Asp Lys Tyr Ala Asn Phe Ser Ile Asn

470 475 480

ttc acc atg gaa aac cag gtc cac acc gga atg gaa tat gac aat ggc 1723

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485 490 495 500

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505 510 515

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Phe Lys Ser Cys Thr Phe Asp Asp Val Thr Ser Val Asn Thr Tyr Phe

520 525 530

aag aac tgc acg ttt att gat acc ctt ttt gag aac aca gat ttt gag 1867

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535 540 545

ccc tat aaa ttc ata gac agc gag ttt caa aac tgc tcg ttt ctt cac 1915

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550 555 560

aat aag acg gga tgt cag att act ttt gac gac gac tac agt gcc tac 1963

Asn Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp Tyr Ser Ala Tyr

565 570 575 580

tgg att tac ttt gtc aac ttt ctc ggg aca ttg gca gtg tta cca gga 2011

Trp Ile Tyr Phe Val Asn Phe Leu Gly Thr Leu Ala Val Leu Pro Gly

585 590 595

aat atc gtg tct gct ctc ctg atg gac agg atc ggg cgc tta acg atg 2059

Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Arg Ile Gly Arg Leu Thr Met

600 605 610

cta ggt ggc tcc atg gtg ctc tcg ggg atc agc tgc ttc ttc ctg tgg 2107

Leu Gly Gly Ser Met Val Leu Ser Gly Ile Ser Cys Phe Phe Leu Trp

615 620 625

ttt ggc acc agc gaa tcc atg atg ata ggc atg ctg tgc ttg tac aac 2155

Phe Gly Thr Ser Glu Ser Met Met Ile Gly Met Leu Cys Leu Tyr Asn

630 635 640

gga ctg acc atc tca gcg tgg aac tct ctt gat gta gtc acg gtg gaa 2203

Gly Leu Thr Ile Ser Ala Trp Asn Ser Leu Asp Val Val Thr Val Glu

645 650 655 660

cta tac ccc aca gac cgg aga gca acg ggc ttt ggc ttc ttg aac gca 2251

Leu Tyr Pro Thr Asp Arg Arg Ala Thr Gly Phe Gly Phe Leu Asn Ala

665 670 675

ctc tgt aaa gca gcg gcc gtc ctg gga aac tta ata ttc ggc tcc ttg 2299

Leu Cys Lys Ala Ala Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile Phe Gly Ser Leu

680 685 690

gtc agc atc acc aaa gca atc cct atc ctg ctg gct tcc acc gtg ctc 2347

Val Ser Ile Thr Lys Ala Ile Pro Ile Leu Leu Ala Ser Thr Val Leu

695 700 705

gtg tgt gga gga ctc gtg ggg ctg cgc ctg ccc gac aca aga acc cag 2395

Val Cys Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Leu Pro Asp Thr Arg Thr Gln

710 715 720

gtt ctg atg tga caaaagccat tctcttctct caccatgggt cagccctatt 2447

Val Leu Met

725

gcctgactca aggcttcaga gtttttatgt atagaaaggt ggccaagtat cagaactcaa 2507

acttttgctg tgacgtaaat gtagctgtgt attgtccccg ccagtgtgat ttgcagggtc 2567

ctccccctcc cccgcgcctt gttatctttt cctaattgtg atgttcctgc ttccg 2622

<210>14

<211>727

<212>PRT

<213>褐鼠

<400>14

Met Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Arg Thr Ser Leu Met Lys Gly Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys Lys Gln Thr Val Lys Lys Val Asn Gln

20 25 30

Ala Val Asp Arg Ala Gln Asp Glu Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

Phe Gln Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Tyr Tyr Pro Pro Gly Glu Thr

50 55 60

Tyr Ser Gly Glu Ala Asn Asp Asp Glu Gly Ser Ser Glu Ala Thr Glu

65 70 75 80

Gly His Asp Glu Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Gly Ile

85 90 95

Pro Ser Thr Asn Gln Gly Lys Asp Ser Ile Val Ser Val Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Gly Asp Glu Tyr Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Ser Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Asp Glu Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Leu Ile Ile Gln Glu

130 135 140

Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Ala Leu Phe Phe Val Leu Gly Met

145 150 155 160

Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu

165 170 175

Pro Ser Ala Glu Thr Asp Leu Cys Ile Pro Asn Ser Gly Ser Gly Trp

180 185 190

Leu Gly Ser Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Phe Trp

195 200 205

Gly Gly Leu Ala Asp Lys Val Gly Arg Lys Gln Ser Leu Leu Ile Cys

210 215 220

Met Ser Val Asn Gly Phe Phe Ala Phe Leu Ser Ser Phe Val Gln Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Phe Phe Leu Leu Cys Arg Leu Leu Ser Gly Phe Gly Ile Gly

245 250 255

Gly Ala Ile Pro Thr Val Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Val Leu Ala Arg

260 265 270

Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile

275 280 285

Gly Gly Ile Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr

290 295 300

Gly Trp Ser Phe Ser Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg

305 310 315 320

Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Cys Val Ser Ser Val Val Ala

325 330 335

Leu Thr Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Glu Val Gly Lys

340 345 350

His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Leu Ile His Asp Thr Asn Met

355 360 365

Arg Ala Arg Gly Gln Pro Glu Lys Val Phe Thr Val Asn Lys Ile Lys

370 375 380

Thr Pro Lys Gln Ile Asp Glu Leu Ile Glu Ile Glu Ser Asp Thr Gly

385 390 395 400

Thr Trp Tyr Arg Arg Cys Phe Val Arg Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Gly

405 410 415

Ile Trp Leu Thr Phe Met Arg Cys Phe Asn Tyr Pro Val Arg Glu Asn

420 425 430

Thr Ile Lys Leu Thr Ile Val Trp Phe Thr Leu Ser Phe Gly Tyr Tyr

435 440 445

Gly Leu Ser Val Trp Phe Pro Asp Val Ile Lys His Leu Gln Ser Asp

450 455 460

Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Arg Asn Val Gln Lys Asp Lys Tyr Ala Asn

465 470 475 480

Phe Ser Ile Asn Phe Thr Met Glu Asn Gln Val His Thr Gly Met Glu

485 490 495

Tyr Asp Asn Gly Arg Phe Leu Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe

500 505 510

Lys Asp Ser Val Phe Lys Ser Cys Thr Phe Asp Asp Val Thr Ser Val

515 520 525

Asn Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Phe Ile Asp Thr Leu Phe Glu Asn

530 535 540

Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Gln Asn Cys

545 550 555 560

Ser Phe Leu His Asn Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp

565 570 575

Tyr Ser Ala Tyr Trp Ile Tyr Phe Val Asn Phe Leu Gly Thr Leu Ala

580 585 590

Val Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Arg Ile Gly

595 600 605

Arg Leu Thr Met Leu Gly Gly Ser Met Val Leu Ser Gly Ile Ser Cys

610 615 620

Phe Phe Leu Trp Phe Gly Thr Ser Glu Ser Met Met Ile Gly Met Leu

625 630 635 640

Cys Leu Tyr Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ala Trp Asn Ser Leu Asp Val

645 650 655

Val Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asp Arg Arg Ala Thr Gly Phe Gly

660 665 670

Phe Leu Asn Ala Leu Cys Lys Ala Ala Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile

675 680 685

Phe Gly Ser Leu Val Ser Ile Thr Lys Ala Ile Pro Ile Leu Leu Ala

690 695 700

Ser Thr Val Leu Val Cys Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Leu Pro Asp

705 710 715 720

Thr Arg Thr Gln Val Leu Met

725

<210>15

<211>1647

<212>DNA

<213>褐鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1647)

<223>

<400>15

atg gag gag gac ctg ttc cag ctc agg cag ttg ccg gtg gtg aaa ttc 48

Met Glu Glu Asp Leu Phe Gln Leu Arg Gln Leu Pro Val Val Lys Phe

1 5 10 15

cgc cgc aca gga gag agc gca cgg tca gag gac gac gcg gct tcc ggg 96

Arg Arg Thr Gly Glu Ser Ala Arg Ser Glu Asp Asp Ala Ala Ser Gly

20 25 30

gaa cat gat gtt cag att gag ggg gtc cga gtg ggc cta gaa gct gtc 144

Glu His Asp Val Gln Ile Glu Gly Val Arg Val Gly Leu Glu Ala Val

35 40 45

gag ctg gat gat gga gca gct gtc ccc aag gag ttt gcc aat ccc act 192

Glu Leu Asp Asp Gly Ala Ala Val Pro Lys Glu Phe Ala Asn Pro Thr

50 55 60

gat gac act ttc atg gtc gaa gat gcg gtg gaa gcc att ggg ttc gga 240

Asp Asp Thr Phe Met Val Glu Asp Ala Val Glu Ala Ile Gly Phe Gly

65 70 75 80

aga ttc cag tgg aag ctc tct gtt ctc acc ggc ttg gct tgg atg gcg 288

Arg Phe Gln Trp Lys Leu Ser Val Leu Thr Gly Leu Ala Trp Met Ala

85 90 95

gac gcc atg gag atg atg att ctg agc atc ctg gcg cct cag ctg cac 336

Asp Ala Met Glu Met Met Ile Leu Ser Ile Leu Ala Pro Gln Leu His

100 105 110

tgc gag tgg cga ctc ccc agc tgg cag gtg gcg ctg ctg act tcg gtg 384

Cys Glu Trp Arg Leu Pro Ser Trp Gln Val Ala Leu Leu Thr Ser Val

115 120 125

gtc ttc att ggt atg atg tcc agt tct acg ctc tgg gga aac atc tcg 432

Val Phe Ile Gly Met Met Ser Ser Ser Thr Leu Trp Gly Asn Ile Ser

130 135 140

gat cag tat ggc agg aaa aca ggg ctg aag atc agt gtg ttc tgg acc 480

Asp Gln Tyr Gly Arg Lys Thr Gly Leu Lys Ile Ser Val Phe Trp Thr

145 150 155 160

ctg tac tac ggc atc ctc agc gct ttc gcg cca gtg tat agc tgg atc 528

Leu Tyr Tyr Gly Ile Leu Ser Ala Phe Ala Pro Val Tyr Ser Trp Ile

165 170 175

ctg gtg ctc cga ggc ctc gtg ggc ttt ggg att gga ggg gtg cct cag 576

Leu Val Leu Arg Gly Leu Val Gly Phe Gly Ile Gly Gly Val Pro Gln

180 185 190

tcg gtg acc ctg tac gcc gag ttc ctc ccc atg aag gcc aga gcc aag 624

Ser Val Thr Leu Tyr Ala Glu Phe Leu Pro Met Lys Ala Arg Ala Lys

195 200 205

tgc att ttg ctg att gag gtt ttc tgg gcc atc ggg acc gtg ttc gag 672

Cys Ile Leu Leu Ile Glu Val Phe Trp Ala Ile Gly Thr Val Phe Glu

210 215 220

gtg ctt ctg gct gtg ttt gtg atg ccc agc ctg ggc tgg cgc tgg ctg 720

Val Leu Leu Ala Val Phe Val Met Pro Ser Leu Gly Trp Arg Trp Leu

225 230 235 240

ctg ctg ctg tcg gcc gct cca cta ctt gtc ttt gct gtt ctg tgt ttc 768

Leu Leu Leu Ser Ala Ala Pro Leu Leu Val Phe Ala Val Leu Cys Phe

245 250 255

tgg ctg cca gag agt gct agg tac gat gtg ctg tct ggg aac cag gaa 816

Trp Leu Pro Glu Ser Ala Arg Tyr Asp Val Leu Ser Gly Asn Gln Glu

260 265 270

aag gcg att gct acc tta aag cgg atc gca aca gaa aat gga gcc ccc 864

Lys Ala Ile Ala Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Glu Asn Gly Ala Pro

275 280 285

atg cct ctg ggg aag ctc atc atc tcc aga cag gaa gac cga ggc aaa 912

Met Pro Leu Gly Lys Leu Ile Ile Ser Arg Gln Glu Asp Arg Gly Lys

290 295 300

atg agg gac ctt ttc aca ccc cac ttt cgt tgg aca act ctg ctg ctg 960

Met Arg Asp Leu Phe Thr Pro His Phe Arg Trp Thr Thr Leu Leu Leu

305 310 315 320

tgg ttt ata tgg ttc tcc aat gcc ttc tct tat tac ggc ttg gtt ctg 1008

Trp Phe Ile Trp Phe Ser Asn Ala Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Val Leu

325 330 335

ctc acc aca gaa ctc ttc cag gcc gga gat gtt tgc agc atc tcc agc 1056

Leu Thr Thr Glu Leu Phe Gln Ala Gly Asp Val Cys Ser Ile Ser Ser

340 345 350

cgg aag aag gcg gtg gaa gcc aaa tgc agc ctg gct tgt gag tac ctc 1104

Arg Lys Lys Ala Val Glu Ala Lys Cys Ser Leu Ala Cys Glu Tyr Leu

355 360 365

agc aaa gag gat tac atg gac ctg ctg tgg acc acc ctg tct gag ttc 1152

Ser Lys Glu Asp Tyr Met Asp Leu Leu Trp Thr Thr Leu Ser Glu Phe

370 375 380

cca ggt gtc ctt gtg act ctg tgg gtc atc gac cgc ctg ggc cgc aag 1200

Pro Gly Val Leu Val Thr Leu Trp Val Ile Asp Arg Leu Gly Arg Lys

385 390 395 400

aag acc atg gct ctg tgt ttc gtc atc ttt tcc ctc tgc agc ctc ctg 1248

Lys Thr Met Ala Leu Cys Phe Val Ile Phe Ser Leu Cys Ser Leu Leu

405 410 415

ctg ttc atc tgc att gga aga aat gtg cta acc ctc tta ctg ttc att 1296

Leu Phe Ile Cys Ile Gly Arg Asn Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Ile

420 425 430

gca aga gcg ttt att tct gga ggc ttc caa gca gcc tac gtt tac acg 1344

Ala Arg Ala Phe Ile Ser Gly Gly Phe Gln Ala Ala Tyr Val Tyr Thr

435 440 445

cct gag gtg tat cca acg gcg acg agg gcg ctg ggc ctg ggc acc tgc 1392

Pro Glu Val Tyr Pro Thr Ala Thr Arg Ala Leu Gly Leu Gly Thr Cys

450 455 460

agc ggc atg gcg aga gtg ggc gcg ctc atc act cca ttc ata gct cag 1440

Ser Gly Met Ala Arg Val Gly Ala Leu Ile Thr Pro Phe Ile Ala Gln

465 470 475 480

gtg atg ctg gaa tct tcc gtg tac ctg acc ctg gcc gtc tac agt ggc 1488

Val Met Leu Glu Ser Ser Val Tyr Leu Thr Leu Ala Val Tyr Ser Gly

485 490 495

tgc tgc ctc ctt gct gcc ttg gcc tcc tgc ttt ctg ccc atc gag acc 1536

Cys Cys Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Cys Phe Leu Pro Ile Glu Thr

500 505 510

aaa ggc cga gca ctg cag gag tcc agc cac cgg gag tgg ggc cag gag 1584

Lys Gly Arg Ala Leu Gln Glu Ser Ser His Arg Glu Trp Gly Gln Glu

515 520 525

atg gtt ggc cga ggg aca aac agc aca ggc gtc ccc agg tcg aac tct 1632

Met Val Gly Arg Gly Thr Asn Ser Thr Gly Val Pro Arg Ser Asn Ser

530 535 540

ggc tct cag gag tag 1647

Gly Ser Gln Glu

545

<210>16

<211>548

<212>PRT

<213>褐鼠

<400>16

Met Glu Glu Asp Leu Phe Gln Leu Arg Gln Leu Pro Val Val Lys Phe

1 5 10 15

Arg Arg Thr Gly Glu Ser Ala Arg Ser Glu Asp Asp Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Glu His Asp Val Gln Ile Glu Gly Val Arg Val Gly Leu Glu Ala Val

35 40 45

Glu Leu Asp Asp Gly Ala Ala Val Pro Lys Glu Phe Ala Asn Pro Thr

50 55 60

Asp Asp Thr Phe Met Val Glu Asp Ala Val Glu Ala Ile Gly Phe Gly

65 70 75 80

Arg Phe Gln Trp Lys Leu Ser Val Leu Thr Gly Leu Ala Trp Met Ala

85 90 95

Asp Ala Met Glu Met Met Ile Leu Ser Ile Leu Ala Pro Gln Leu His

100 105 110

Cys Glu Trp Arg Leu Pro Ser Trp Gln Val Ala Leu Leu Thr Ser Val

115 120 125

Val Phe Ile Gly Met Met Ser Ser Ser Thr Leu Trp Gly Asn Ile Ser

130 135 140

Asp Gln Tyr Gly Arg Lys Thr Gly Leu Lys Ile Ser Val Phe Trp Thr

145 150 155 160

Leu Tyr Tyr Gly Ile Leu Ser Ala Phe Ala Pro Val Tyr Ser Trp Ile

165 170 175

Leu Val Leu Arg Gly Leu Val Gly Phe Gly Ile Gly Gly Val Pro Gln

180 185 190

Ser Val Thr Leu Tyr Ala Glu Phe Leu Pro Met Lys Ala Arg Ala Lys

195 200 205

Cys Ile Leu Leu Ile Glu Val Phe Trp Ala Ile Gly Thr Val Phe Glu

210 215 220

Val Leu Leu Ala Val Phe Val Met Pro Ser Leu Gly Trp Arg Trp Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Ser Ala Ala Pro Leu Leu Val Phe Ala Val Leu Cys Phe

245 250 255

Trp Leu Pro Glu Ser Ala Arg Tyr Asp Val Leu Ser Gly Asn Gln Glu

260 265 270

Lys Ala Ile Ala Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Glu Asn Gly Ala Pro

275 280 285

Met Pro Leu Gly Lys Leu Ile Ile Ser Arg Gln Glu Asp Arg Gly Lys

290 295 300

Met Arg Asp Leu Phe Thr Pro His Phe Arg Trp Thr Thr Leu Leu Leu

305 310 315 320

Trp Phe Ile Trp Phe Ser Asn Ala Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Val Leu

325 330 335

Leu Thr Thr Glu Leu Phe Gln Ala Gly Asp Val Cys Ser Ile Ser Ser

340 345 350

Arg Lys Lys Ala Val Glu Ala Lys Cys Ser Leu Ala Cys Glu Tyr Leu

355 360 365

Ser Lys Glu Asp Tyr Met Asp Leu Leu Trp Thr Thr Leu Ser Glu Phe

370 375 380

Pro Gly Val Leu Val Thr Leu Trp Val Ile Asp Arg Leu Gly Arg Lys

385 390 395 400

Lys Thr Met Ala Leu Cys Phe Val Ile Phe Ser Leu Cys Ser Leu Leu

405 410 415

Leu Phe Ile Cys Ile Gly Arg Asn Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Ile

420 425 430

Ala Arg Ala Phe Ile Ser Gly Gly Phe Gln Ala Ala Tyr Val Tyr Thr

435 440 445

Pro Glu Val Tyr Pro Thr Ala Thr Arg Ala Leu Gly Leu Gly Thr Cys

450 455 460

Ser Gly Met Ala Arg Val Gly Ala Leu Ile Thr Pro Phe Ile Ala Gln

465 470 475 480

Val Met Leu Glu Ser Ser Val Tyr Leu Thr Leu Ala Val Tyr Ser Gly

485 490 495

Cys Cys Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Cys Phe Leu Pro Ile Glu Thr

500 505 510

Lys Gly Arg Ala Leu Gln Glu Ser Ser His Arg Glu Trp Gly Gln Glu

515 520 525

Met Val Gly Arg Gly Thr Asn Ser Thr Gly Val Pro Arg Ser Asn Ser

530 535 540

Gly Ser Gln Glu

545

Claims

1.治疗与突触囊泡功能相关的神经疾病、内分泌病或激素疾病的方法，包括给药调节SV2蛋白功能或活性的化合物或药剂。

2.权利要求1的方法，其中神经疾病从由癫痫发作、癫痫、帕金森氏病、帕金森氏运动障碍、偏头痛、阿尔茨海默病、神经性疼痛、特发性震颤、认知障碍和运动疾病组成的组中选择。

3.权利要求1的方法，其中化合物或药剂结合SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位。

4.调节细胞中SV2蛋白的至少一种功能或活性的方法，包括将细胞暴露于结合SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂。

5.权利要求4的方法，其中化合物或药剂调节左乙拉西坦与左乙拉西坦结合部位的结合。

6.发现或建模SV2蛋白与化合物或药剂之间的相互作用的方法，其中化合物或药剂从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择，所述方法包括：

a)使SV2蛋白与所述化合物或药剂接触；和

b)测量并分析SV2蛋白与所述化合物或药剂之间的相互作用。

7.权利要求6的方法，其中分析是通过对SV2蛋白的蛋白水解处理以观察配体结合对蛋白水解降解的差别效应。

8.权利要求6的方法，其中分析是通过三维建模或其它纯计算技术。

9.权利要求8的方法，其中三维建模是介由核磁共振光谱或X-射线晶体学。

10.权利要求6的方法，其中分析是通过结合研究。

11.权利要求6或10中任一项的方法，其中SV2蛋白是从天然来源纯化的。

12.权利要求11的方法，其中SV2蛋白是由真核或原核宿主中***到表达载体中的克隆核苷酸驱动的异源表达蛋白纯化的。

13.鉴定SV2蛋白内的左乙拉西坦结合部位的方法，包括：

a)使SV2蛋白或其片段与从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择的化合物或药剂接触；和

b)测定所述化合物或药剂与SV2蛋白或其片段的结合。

14.权利要求13的方法，其中SV2蛋白或其片段包含至少一个氨基酸置换、缺失或添加。

15.权利要求14的方法，其中氨基酸残基的添加、缺失或置换消除至少一个糖基化位点。

16.权利要求15的方法，其中糖基化位点的消除是介由定点诱变。

17.权利要求13的方法，其中SV2蛋白为包含至少一个SV2蛋白或其片段与融合伴侣的融合蛋白。

18.权利要求17的方法，其中融合伴侣为融合标签。

19.权利要求18的方法，其中融合标签为多聚His标签或谷胱甘肽-S-转移酶。

20.测定SV2蛋白与第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：

a)在细胞中表达SV2蛋白及目的蛋白；

b)将细胞暴露于与左乙拉西坦结合部位结合的化合物或药剂；和

c)确定SV2蛋白与目的蛋白之间的相互作用。

21权利要求20的方法，其中第二蛋白从由细胞膜蛋白、囊泡膜蛋白、胞质蛋白、细胞骨架蛋白和胞内基质蛋白组成的组中选择。

22.权利要求20的方法，其中目的蛋白为突触结合蛋白。

23.权利要求20的方法，其中目的蛋白为SNARE复合物的成员。

24.权利要求23的方法，其中SNARE复合物的成员为突触囊泡相关的VAMP/小突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25。

25.权利要求20的方法，其中SV2蛋白缺失至少一个糖基化位点。

26.鉴定调节与突触功能相关的神经疾病、内分泌病或激素疾病的化合物或药剂的方法，包括：

a)将SV2蛋白暴露于所述化合物或药剂；和

b)确定所述化合物或药剂是否调节SV2蛋白的活性。

27.权利要求3、4、5、6、20或26中任一项的方法，其中所述化合物或药剂为左乙拉西坦或其类似物或衍生物，或抗-SV2抗体或其片段。

28.权利要求13或27中任一项的方法，其中所述化合物或药剂与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位。

29.权利要求13或27中任一项的方法，其中所述化合物或药剂为抗-SV2抗体或其片段。

30.权利要求29的方法，其中抗-SV2抗体或其片段结合SV2蛋白的左乙拉西坦结合部位。

31.权利要求29的方法，其中抗-SV2抗体或其片段从由多克隆抗体和单克隆抗体组成的组中选择。

32.权利要求31的方法，其中抗体片段从由Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段和scFv片段组成的组中选择。

33.权利要求31的方法，其中单克隆抗体从由嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组中选择。

34.鉴定针对从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择的化合物或药剂的细胞应答的方法，包括：

a)将表达SV2蛋白的细胞暴露于所述化合物或药剂；和

b)分析所暴露的细胞中核酸或蛋白表达的变化。

35.权利要求20或34中任一项的方法，其中将细胞暴露于与左乙拉西坦结合部位结合的化合物或药剂的步骤是在具有从由小于大约1μM、在大约1μM和大约1000μM之间以及至少大约1000μM组成的组中选择的二价阳离子浓度的条件下实施的。

36.分离的核酸分子，包含SEQ ID NO：5的核酸序列或其互补物。

37.分离的多肽，包含由权利要求36的分离的核酸分子编码的氨基酸序列。

38.权利要求37的分离的多肽，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

39.权利要求26的方法，其中确定所述化合物或药剂是否调节SV2蛋白活性的步骤选自下组：

a)测量至少一种单价阳离子或二价阳离子的跨膜运输；

b)测量SNARE复合物的形成；

c)测量Ca²⁺通道的形成或活性；

d)测量SV2与至少一种其它蛋白的相互作用；

e)测量至少一种底物的跨膜运输；和

f)测量突触囊泡融合、胞吐作用或突触囊泡再循环。

40.权利要求39的方法，其中单价阳离子从由H⁺、Cl^-、Na⁺和K⁺组成的组中选择。

41.权利要求35或39中任一项的方法，其中二价阳离子从由Ca²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺组成的组中选择。

42.权利要求41的方法，其中至少一种二价阳离子为Ca²⁺。

43.权利要求39的方法，其中至少一种其它蛋白为突触结合蛋白。

44.权利要求39的方法，其中至少一种其它蛋白为层粘连蛋白-1。

45.权利要求39的方法，其中至少一种底物从由胺、乙酰胆碱、兴奋神经递质、GABA、5-羟色胺、甘氨酸或其它氨基酸、糖和有机离子组成的组中选择。

46.鉴定SV2蛋白的结合伴侣的方法，包括：

a)将SV2蛋白或片段暴露于潜在的结合伴侣；

b)将所述蛋白或片段以及潜在的结合伴侣与(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺温育；和

c)确定(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺与蛋白的结合是否受潜在结合伴侣的抑制，由此鉴定所述蛋白的结合伴侣。

47.鉴定可用于治疗神经或内分泌疾病的化合物或药剂的方法，包括：

a)将SV2蛋白或片段暴露于所述药剂和左乙拉西坦或其类似物或衍生物；和

b)确定左乙拉西坦或其类似物或衍生物与该蛋白的结合是否受所述药剂调节，由此鉴定可用于治疗神经疾病的药剂。

48.权利要求47的方法，其中左乙拉西坦或其类似物或衍生物被直接或间接地标记。

49.权利要求47的方法，其中SV2蛋白或片段与左乙拉西坦或其类似物或衍生物的温育在所述药剂之前、在添加所述药剂之后、或和所述药剂同时。

50.权利要求47的方法，其中SV2蛋白或片段与左乙拉西坦温育。

51.权利要求47的方法，其中神经疾病从由癫痫、癫痫发生、癫痫发作障碍、惊厥、断瘾性癫痫发作、神经障碍、双相性精神障碍、躁狂、抑郁、焦虑、偏头痛、神经痛、三叉神经痛、慢性疼痛病症、神经性疼痛、麻醉相关的超兴奋性、脑缺血、头部创伤、肌强直、因药物或酒精滥用、依赖性或戒除所引发的兴奋状态、中风、肌阵挛、特发性震颤、抽搐、图雷特综合征、运动障碍、痉挛状态、运动疾病、新生儿脑出血、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病、神经变性疾病和痴呆组成的组中选择。

52.药物组合物，包含如权利要求26或47任一项的方法中所鉴定的化合物或药剂，所述化合物不同于如附图15中所描述的化合物。

53.治疗神经或内分泌疾病的方法，其包括向需要此种治疗的个体给药如权利要求26或47任一项的方法中所鉴定的化合物或药剂，所述化合物不同于如附图15中所描述的化合物。

54.根据权利要求53的方法，其中神经疾病从由癫痫、癫痫发生、癫痫发作障碍、惊厥、断瘾性癫痫发作、神经障碍、双相性精神障碍、躁狂、抑郁、焦虑、偏头痛、神经痛、三叉神经痛、慢性疼痛病症、神经性疼痛、麻醉相关的超兴奋性、脑缺血、头部创伤、肌强直、因药物或酒精滥用、依赖性或戒除所引发的兴奋状态、中风、肌阵挛、特发性震颤、抽搐、图雷特综合征、运动障碍、痉挛状态、运动疾病、新生儿脑出血、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病、神经变性疾病和痴呆组成的组中选择。

55.根据权利要求53的方法，其中内分泌疾病从由涉及至少一种激素分泌过多或分泌不足的内分泌病、巨大症、侏儒症、肾上腺髓质相关疾病、低血糖和循环休克组成的组中选择。

56.权利要求1、20、26、34或47中任一项的方法，其中SV2蛋白为SV2A。

57.权利要求56的方法，其中SV2A蛋白包含SEQ ID NO：2。

58.权利要求13、27或47中任一项的方法，其中左乙拉西坦的类似物或衍生物为(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺。

59.权利要求58的方法，其中左乙拉西坦的类似物或衍生物从由N-烷基化2-氧代-吡咯烷衍生物、N-烷基化2-氧代哌啶基衍生物和N-烷基化2-氧代-azepanyl衍生物组成的组中选择。

60.鉴定可用于治疗神经或内分泌疾病的药剂的方法，包括：

a)将SV2蛋白或片段暴露于所述药剂；

b)使所述蛋白或片段和药剂与(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺温育；和

c)确定(2S)-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代吡咯烷-1-基]丁酰胺与蛋白的结合是否受所述药剂抑制，由此鉴定所述蛋白的结合伴侣。

61.发现或建模SV2蛋白或其片段或衍生物与化合物或药剂之间的相互作用的方法，其中化合物或药剂从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择，所述方法包括：

a)介由生物化学、生物物理学、纯计算技术或这些方法的一些组合创建SV2蛋白或其片段的三维模型；和

b)创建可能潜在地结合SV2蛋白的一种潜在配体或潜在配体集合的三维模型。

62.权利要求61的方法，进一步包括使用纯计算技术将SV2蛋白的三维模型与潜在配体的三维模型对接。

63.发现或建模SV2蛋白与化合物或药剂之间的相互作用的方法，其中化合物或药剂从由左乙拉西坦、左乙拉西坦类似物或衍生物、或者与左乙拉西坦或其类似物或衍生物竞争结合左乙拉西坦结合部位的化合物或药剂组成的组中选择，所述方法包括：

a)确定潜在的CNS活性分子在遗传野生型动物中或在来源于此类动物的分子、细胞或组织中的生物化学、药理学、生物体、细胞或分子效应；和

b)比较所测量的该化合物在SV2蛋白敲除或削弱***的等同研究中的效应。

64.分离功能活性膜结合SV2蛋白复合物的方法，包括：

a)用去污剂溶解包含SV2蛋白的组织；和

b)分离SV2蛋白复合物。

65.权利要求64的方法，其中所述方法进一步包括通过免疫亲和纯化SV2蛋白复合物。

66.权利要求65的方法，其中进一步纯化SV2蛋白复合物以获得SV2蛋白。

67.权利要求64的方法，其中去污剂为正十二烷基-β-D-麦芽糖苷或其衍生物或类似物。

68.权利要求64的方法，其中组织为脑膜。

69.权利要求64的方法，进一步包括鉴定与SV2蛋白复合的分子。

70.权利要求64至69中任一项的方法，其中SV2蛋白为SV2A蛋白、SV2B蛋白或SV2C蛋白。

71.通过权利要求64的方法获得的纯化的SV2蛋白复合物。

72.权利要求71的纯化的SV2蛋白复合物，其中SV2蛋白为SV2A蛋白、SV2B蛋白或SV2C蛋白。