CN101023176B - 具有改良生长特性的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改良植物生长特性的方法，其通过增加植物中LRR受体激酶或其同源物的表达和/或活性来实现。此类方法之一包括将RLK827核酸分子或其功能性变体引入植物。本发明还涉及具有改良生长特性的转基因植物，该植物具有调节的LRR受体激酶编码核酸的表达。本发明还涉及可用于本发明方法中的构建体。

Description

具有改良生长特性的植物及其制备方法
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及改良植物生长特性的方法。更具体的，本发明涉及通过增加LRR受体激酶(RLK827)或其同源物在植物中的表达和/或活性来增加植物产量和/或生物量的方法。本发明还涉及具有LRR受体激酶或其同源物的编码核酸表达增加的植物，该植物相对于对应的野生型植物具有改良的生长特性。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。
鉴于不断增长的世界人口和农业用地面积的缩小，增加农业效率和增加园艺植物的多样性一直是农业研究的主要目标。作物和园艺改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这种选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传成分的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类操作动物和植物的种质。植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后把该遗传物质引入到植物中。此种技术导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状的植物的开发。具有特殊经济利益的性状是生长性状，例如高产量。产量通常定义为作物产生的可衡量经济价值。这可以从数量和/或质量方面定义。产量直接取决于一些因素，例如，器官的数量和尺寸，植物结构(例如，枝条的数量)，种子产量等等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是确定产量的重要因素。可以通过优化上述因素之一来提高作物产量。
植物的生长和发育取决于环境信号以及内部信号，例如激素介导的信号传导、胁迫和养料信号传导、细胞周期控制或发育信号传导。细胞通过细胞表面受体将信号转导到细胞内部，从而感知这些信号。这些受体中的一些是蛋白激酶。蛋白激酶包含一个酶的大家族，其通过羟基氨基酸的磷酸化介导真核细胞对刺激的响应。根据其底物的特异性，这些酶分为两大类：丝氨酸/苏氨酸特异性酶或酪氨酸特异性酶。可以将参与信号转导的激酶归为主要由酪氨酸激酶组成的不同家族。动物中的受体酪氨酸激酶(RTK)具有统一的结构，由胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞质酪氨酸激酶结构域组成。在植物酪氨酸激酶中，类受体激酶(RLK)蛋白质也有突出的作用。已知植物中有600多种不同的RLK。它们具有和动物RTK类似的结构，在图1中给出了分类(Shiu和Bleecker，Proc.Natl.Acad.Sci USA 98，10763-10768，2001)。已经鉴定了一些植物RLK蛋白质，例如BRI1(brassinoid信号传导)，CLV1(分生组织分化)，HAESA(花器官的脱落)，XA21(真菌检测)CR4(叶和胚乳的发育)，FLS2(鞭毛蛋白/病原体检测)，SRK(自交不亲和性)等(Becraft，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.18，163-192，2002；Diévart和Clark，Curr.Opin.Plant Biol.6，507-516)。大约200种植物RLK具有富亮氨酸重复序列(LRR)。LRR是23到25个残基的序列基序，其包含共有序列LxxLxLxxN/CxL，其中x可以是任何氨基酸。这些LRR存在于蛋白质中，具有多种功能，例如激素受体相互作用、酶抑制、细胞黏着和细胞运输，并且LRR结构域常以串连排列组织。已显示LRR对于细胞骨架的形态和动态是重要的。这些基序的主要功能似乎是提供用于形成蛋白质-蛋白质相互作用的多样化结构构架(Kobe和Kajava，Curr.Opin.Struct.Biol.11，725-732，2001)。
富亮氨酸重复序列和激酶结构域的组合是将外部信号介导到细胞中的受体蛋白质的特征。认为它们通过这种机制运作，即其中一个或多个LRR结构域(主要是胞外的)用为胞外信号传感器，而激酶结构域通常在内部，通过磷酸化胞内靶标并由此起始信号转导来参与信号的转导。RLK在植物中参与多个过程，如植物发育、抗病性或自交不亲和性。本发明显示植物生长特性，尤其是产量可以通过调节RLK编码核酸植物中的表达来改良。
国际专利申请WO 03/072763公开了在植物中过量表达时，使植物生长和种子产量增加的类受体激酶。但是，该RLK蛋白质在其非胞质结构域中不含有任何LRR结构域，而代替此结构域的是富含脯氨酸的结构域。另一份公开(WO 00/04761)报道了当RKN受体激酶过量表达时，根的生长增强。类似的，BRI1受体激酶的过量表达会产生调节的产量在WO98/59039中提示但是没有说明。但是在后两种情形中所使用的RLK在非胞质结构域中包含22个LRR结构域，典型的是类受体激酶LRR-X亚家族。至今为止没有报道说明甚至提示LRR-I亚家族的类受体激酶可用于改良植物生长特性，尤其是增加产量。
令人惊讶的发现相对于对应的野生型植物，在植物中增加RLK827蛋白质的表达和/或活性使得植物具有改良的生长特性，尤其是增加的产量。
RLK827是类受体激酶，其与作为类受体激酶LRR-I亚家族成员的LRRPK结构相关(Shiu和Bleecker，2001)。从N端开始，成熟RLK827蛋白质具有长的推定非胞质结构域、单一的跨膜结构域以及在C端胞质部分中的激酶结构域。类受体激酶根据其非胞质结构域的组成分类，所述的组成可以包括富含脯氨酸序列、凝集素结构域、LRR结构域、EGF重复、TNFR重复、奇异果甜蛋白或凝集素结构域等。类受体激酶的大基团在非胞质结构域具有富亮氨酸重复序列(LRR)。各种LRR亚家族在这些富亮氨酸重复序列的数量和位置上彼此不同(综述，参见Shiu和Bleecker，2001)。RLK827的推定非胞质结构域特征在于在其C端部分存在1到3个串连的富亮氨酸重复序列；因此RLK827属于LRR-I受体激酶亚家族。受体激酶的各种LRR亚家族还在它们的染色体分布上彼此不同。通常它们以串连重复排列。染色体的串连重复、大规模重复和重排至少部分是植物中LRR类受体激酶进化和扩增的原因。因此，除了一些例外，LRR-I受体激酶分布在拟南芥(Arabidopsis)染色体I、II和III上。
本发明的一个实施方案提供了改良植物生长特性的方法，其包括增加RLK827多肽或其同源物的表达和/或活性，以及任选选择具有改良生长特性的植物。
有利的，实施本发明的方法得到了具有多种改良生长特性的植物，如改良的生长、改良的产量、改良的生物量、改变的构造或改良的细胞***，每种都是相对于对应的野生型植物。优选的，改良的生长特性至少包括比对应的野生型植物增加的产量。优选的，增加的产量是增加的种子产量，包括增加的(饱满)种子数，增加的种子总重量和增加的收获指数。
本文所定义的术语“增加的产量”意指分别相对于对应的野生型植物，如下任何一个或多个方面的增加：(i)植物的一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分、增加的根生物量或任何其他可收获部分的增加的生物量；(ii)增加的总种子产量，其包括种子生物量(种子重量)的增加并且其可以是每株植物种子重量(总种子重量)的增加或单个种子基础上的增加；(iii)增加的(饱满)种子数；(iv)增加的种子尺寸；(v)增加的种子体积；(vi)增加的单个种子面积；(vii)增加的单个种子长度；(viii)增加的收获指数，它表示为可收获部分如种子的产量对总生物量的比例；(ix)每个圆锥花序小花增加的数量，其从所计数的种子总数以及初级圆锥花序的数量推论出来；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其从所计的饱满种子数和它们的总重量推论出来。增加的TKW可源于增加的种子尺寸(长度、宽度或其二者)和/或种子重量。增加的TKW可源于胚胎尺寸和/或胚乳尺寸的增加。
以谷类为例，产量增加可以表现为下列一种或多种：每公顷或英亩植物数量增加、每株植物穗数量的增加、畦数、每畦种子数、粒重、TKW、穗的长度/直径的增加等。以稻为例，产量增加可以表现为下列一种或多种的增加：每公顷或英亩植物数量、每株植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序花的数量，种子饱满率的增加、TKW的增加等。产量的增加还可产生改变的构造或可以作为改变的构造的结果发生。
优选的，实施本发明的方法使得植物具有增加的产量和/或增加的生物量。更具体的，实施根据本发明的方法使得植物具有增加的种子产量。优选的，增加的种子产量包含分别相对于对照植物，在下列一种或多种的增加：饱满种子数、总种子重量和收获指数。因此，本发明提供了增加植物产量的方法，该方法包括在植物中增加RLK827多肽或其同源物的表达和/或活性。
由于根据本发明的修饰植物具有增加的产量，因此，相对于在其生活周期对应阶段的相应野生型植物的生长速度，这些植物很可能表现出增加的生长速度(至少是在其生活周期的一部分)。生长速度增加可以是对植物的一个或多个部分或细胞类型(包括种子)特异性的，或者可以基本遍布整株植物。具有增加的生长速度的植物可以具有更短的生活周期。植物的生活周期意指从干的成熟种子生长到植物产生干的成熟种子(类似于起始物质)的阶段所需的时间。此生活周期可以受到如早期活力、生长速度、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速度的增加可以发生在植物生活周期的一个或多个阶段或者基本遍布整个植物生活周期期间。在植物生活周期的早期阶段增加的生长速度反映了增强的活力。生长速度的增加可以改变植物的收获周期，这使得植物可以比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速度充分增加，可以允许播种相同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，接着播种和收获更多的稻植物，所有这些都在一个常规生长期内)。类似的，如果生长速度充分增加，可以允许播种不同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，例如接着播种和任选收获大豆、马铃薯或任何其他适当的植物)。在一些植物的情形下，从同一根状茎收获多次也是可能的。改变植物的收获周期可以使得每英亩每年生物量的产出增加(由于任何特定植物可以生长和收获次数(指在一年中)的增加)。生长速度的增加还使得转基因植物可以比它们的野生型对应物在更广的地域栽培，这是因为生长作物的区域性限制通常决定于种植时(初期)或收获时(晚期)的不利环境条件。如果收获周期缩短，那么可以避免此类不利条件。可以通过生长实验测绘生长曲线，得到多个参数来确定生长速度，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大尺寸的50％时所用的时间)以及T-90(植物达到其最大尺寸的90％时所用的时间)等。
本发明方法的实施提供了具有增加的生长速度的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速度的方法，该方法包括在植物中增加RLK827多肽或其同源物的表达和/或活性。
与对照植物相比，无论植物是否在无胁迫条件下或植物是否接触多种胁迫，产生产量和/或生长速度的增加。植物一般通过生长更加缓慢来应答所接触的胁迫。在严重的胁迫条件下，植物甚至完全停止生长。另一方面，本文将中等胁迫定义为植物所接触的不引起植物完全停止生长且没有能力恢复生长的任何胁迫。根据农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，在栽培的作物植物中通常不会遇到严重胁迫。因而，中等胁迫诱导的受损生长通常是农业所不希望的特征。中等胁迫是植物所接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物所接触的日常生物和/或非生物(环境)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或寒冷/冻结温度引起的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫还可以由化学制剂引起。生物胁迫通常是那些由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。
在任何植物中可以有利地修饰上述生长特性。
本文所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代以及部分植物，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花，以及组织和器官，其中前述每种包括目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的特异性修饰。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样的，其中前述每种包含目的基因/核酸。
尤其可用于本发明方法中的植物包括藻类、蕨类植物以及属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、冰草属物种(Agropyron spp.)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦(Avenasativa)、阳桃(Averrhoa carambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris )、芸苔属物种(Brassicaspp.)、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属物种(Carya spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffeaspp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucuscarota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、  大豆属物种(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、浮萍属物种(Lemna spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、苹果属物种(Malus spp.)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、稷(Panicummiliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、酸浆属物种(Physalisspp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum.)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄属物种(Solanum spp.)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Viciaspp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zeamays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等。
根据本发明优选的特征，植物是包含大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花的作物植物。更优选的，本发明的植物是单子叶植物，如甘蔗。最优选的是谷类，如稻、玉米、小麦、粟、大麦、燕麦或高粱。
可以通过增加RLK827多肽的水平来增加RLK827蛋白质的活性。可选的，当RLK827的水平没有变化或者甚至是当RLK827的水平减少时，活性也可以增加。当该多肽的内部性质改变时，例如通过产生突变体或选择比野生型更有活性的变体，可以发生这种情况。
本文所定义的术语“RLK827或其同源物”指具有激酶活性并且在其成熟形式中包含非胞质结构域(胞外结构域)、单一的跨膜结构域和推定胞质激酶结构域的类受体激酶(RLK)。非胞质结构域或RLK827包含至少一个但不多于3个富亮氨酸重复序列(LRR)结构域，优选存在2个LRR结构域，更优选是3个LRR结构域。更优选的，非胞质结构域的长度范围在250和550个氨基酸之间。非胞质结构域优选包含氨基酸序列基序LRxFP(E/D)GxRNC(Y/F)(SEQ ID NO：33)，其中x可以是任何氨基酸并且至多2个其他氨基酸可以用在表2中列出的保守性替换来置换。优选的，在此基序中的第一个x是Y或A，并且第二个x优选是V、F、E和A中的一个。
术语“RLK827或其同源物”还指的是具有与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的优选顺序为至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％。
术语“RLK827或其同源物”包含RLK827(SEQ ID NO：2)、其旁系同源物和直系同源物。使用总体对比算法，如程序GAP(GCG WisconsinPackage，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，用默认参数设置确定全序列同一性。
使用特型数据库例如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.de/)或Pfam(Bateman等人，Nucleic AcidsResearch 30(1)：276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)来鉴定RLK827蛋白质中的多种结构域。
激酶结构域是SEYKc类型(SMART登录号SM00221，Interpro登录号IPR004040)，并且可能具有双特异性Ser/Thr/Tyr激酶活性。在催化结构域的N端，在赖氨酸残基附近存在富含甘氨酸的一段残基，其已经被证明参与ATP的结合。在催化结构域的中心部分，存在对于酶的催化活性重要的保守天冬氨酸残基。
此外，LRR结构域本领域熟知并且在Pfam(登陆PF00560)中被定义为在一些具有多种功能的蛋白质中串连排列的20到29个残基序列基序，所述的功能如激素受体相互作用、酶抑制、细胞黏着和细胞运输。近期的研究显示LRR蛋白质参与早期哺乳动物发育、神经发育、细胞极化、基因表达的调节和程序性细胞死亡信号传导。这些基序的首要功能似乎是提供用于蛋白质-蛋白质相互作用形成的多样化结构构架。LRR蛋白质的序列分析表明存在一些不同的LRR亚家族。很明显来自不同亚家族的重复从不同时存在并且极可能独立进化。但是，所有主要类的LRR似乎在凹面具有带有平行β-折叠的弯曲马蹄型结构，并且在凸面大部分具有螺旋元件。通过重复的不同长度以及共有序列的特征，已经鉴定了至少6个LRR蛋白质家族。对应着β链和临近的环区域的LRR的11个残基节段(LxxLxLxxN/CxL)通常在LRR蛋白质中是保守的，而重复的剩余部分是很不相同的。除此不同外，每种这些可变部分在两端均包含2个半转角并且在中间包含通常由螺旋形成的“线性”区段(如链从头到尾沿着线性路径)。凹面和临近的环是LRR蛋白质上最常规的蛋白质相互作用表面。一些LRR蛋白质-配体复合物的3D结构显示LRR结构域的凹面对于与α-螺旋相互作用而言是理想的，因此支持了更早期的结论，即伸长和弯曲的LRR结构提供了用于实现不同的蛋白质-蛋白质相互作用的卓越构架。分子模型表明通常保守的并且比前面提出的LxxLxLxxN/CxL更短的模式LxxLxL足够使具有20-到30-残基重复的蛋白质具有特征性马蹄型弯曲。LRR827蛋白质的LRR结构域不同于本领域已知的常规LRR结构域，但是可以通过适当的计算机算法(优选是在Pfam数据库中使用的那些)鉴别出来。
跨膜结构域长约15到30个氨基酸并且通常由形成α-螺旋的疏水残基组成。它们通常是在疏水性的基础上预测出来(例如Klein等人，Biochim.Biophys.Acta 815，468，1985；或Sonnhammer等人，In J.Glasgow，T.Littlejohn，F.Major，R.Lathrop，D.Sankoff，和C.Sensen编著，Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systemsfor Molecular Biology，175-182页，Menlo Park，CA，1998.AAAI出版)。
搜索和鉴定RLK827同源物的方法是本领域技术人员熟悉了解的。此类方法包括使用本领域熟知的用于比对或比较序列的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2；482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448(1988))，比较计算机可读形式的SEQ ID NO 1或2代表的序列和在公共数据库如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL Nucleotide  Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中获得的序列。进行BLAST分析的软件通过National Centre for Biotechnology Information(NCBI)公开可用。下面提到的同源物是使用BLAST默认参数(BLOSUM62矩阵，空位开放罚分为11且空位延伸罚分为1)鉴定出的，优选使用全长序列用于分析。
落入“RLK827多肽或其同源物”定义中的实例包括拟南芥蛋白质At1g51850、At1g51805、At1g51810、At2g04300、At3g21340、At1g49100。应当注意的是相关的推定类受体激酶的群以串连方式位于拟南芥染色体1上，其包括At1g51800、At1g51805、At1g51810、At1g51820、At1g51830、At1g51840、At1g51850、At1g51860、At1g51870、At1g51880和At1g51890，它们中的至少4个与RLK827高度相关。
应当理解的是术语RLK827多肽或其同源物不限于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQID NO：17和SEQ ID NO：19所代表的序列，而是任何符合下列标准的多肽都可适用于本发明的方法：(i)具有胞质激酶结构域并且(ii)在用跨膜区域从激酶结构域分离的蛋白质的推定非胞质部分中具有至少一个，但不多于3个LRR结构域，并且优选具有SEQ ID NO：33的共有序列，该激酶结构域包含STYKc共有序列和/或(iii)是RLK827的旁系同源物或直系同源物，并且与SEQ ID NO：2的序列具有至少25％的序列同一性。优选的，激酶结构域是功能性的，意味着RLK827多肽或其同源物具有激酶活性。
为了确定RLK827的激酶活性，一些测定是可用的并且在本领域中是公知的(例如Current Protocols in Molecular Biology，1和2卷，Ausubel等人(1994)，Current Protocols；或者是在线的，例如http://www.protocol-online.org)。简要的，激酶测定通常包括(1)使激酶蛋白质接触含有待磷酸化的靶位点的底物多肽；(2)适当的条件下，在适当激酶缓冲液中进行靶位点的磷酸化；(3)在恰当的反应期后将磷酸化的产物从未磷酸化的底物中分离出来。激酶活性的存在或缺乏是通过磷酸化靶标的存在或缺乏来确定的。另外，可以进行定量测量。纯化的RLK827蛋白质，或者含有或富含RLK827蛋白质的细胞提取物可以用作激酶蛋白质的来源。备选的，可以使用Zhao等人(Plant Mol.Biol.26，791-803，1994)的方法，其中稻类受体激酶的胞质结构域在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并测定激酶活性。作为底物，小肽是尤其适合的。肽在磷酸化位点基序中必须含有一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。可以在Biochimicaet Biophysica Acta 1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位点的汇编。此外，肽底物可以优选具有净正电荷，以利于结合到磷酸纤维素滤器上(可用于将磷酸化的肽从未磷酸化的肽中分离出来并且检测磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位点基序，可以使用常规酪氨酸激酶底物。例如，“Src相关肽”(RRLIEDAEYAARG)是许多受体和非受体酪氨酸激酶的底物。为了确定合成肽磷酸化的动力参数，需要肽浓度的范围。对于起始反应，可使用0.7-1.5mM的肽浓度。对于每种激酶，重要的是要确定活性的最佳缓冲液、离子强度和pH。标准5×激酶缓冲液通常含有5mg/ml BSA(防止激酶与测定管吸附的牛血清蛋白)、150mM Tris-Cl(pH 7.5)、100mM MgCl2。绝大部分酪氨酸激酶需要二价阳离子，尽管一些酪氨酸激酶(例如胰岛素-、IGF-1-和PDGF受体激酶)需要MnCl2替代MgCl2(或除了MgCl2外还需要MnCl2)。根据经验为每种蛋白激酶确定二价阳离子的最佳浓度。常用的磷酰基(phophoryl)基团供体是放射性标记的[γ-32P]ATP(通常是0.2mM终浓度)。在肽中掺入的32P可以通过在闪烁计数器中的硝化纤维素干垫上测量活性来确定。
可选的，RLK827多肽或其同源物的活性可以通过在稻植物(尤其是在稻的变种Nipponbare)中，在稻GOS2启动子调控下表达RLK827多肽或其同源物来测定，这使得植物比对应的野生型植物具有增加的产量。例如，此产量的增加可以作为饱满种子数、种子总重量和/或收获指数的增加中的一种或多种来测量。
RLK827多肽或其同源物的编码核酸可以是任何天然或合成核酸。如本文所定义的RLK827多肽或其同源物是由RLK827核酸分子编码的。因此本文所定义的术语“RLK827核酸分子”或“RLK827基因”是如上所定义的RLK827多肽或其同源物的任何编码核酸分子。RLK827核酸分子的实例包括由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 31所代表的那些核酸中的任一项。RLK827核酸及其功能性变体可适用于进行本发明的方法。RLK827核酸的功能性变体包括部分RLK827核酸分子和/或能够与RLK827核酸分子或与RLK827同源物的编码核酸分子杂交的核酸。在功能性变体的范围中，术语“功能性”指的是编码具有激酶活性，并包含非胞质(胞外)结构域以及通过跨膜结构域将其从非胞质结构域中分开的C端激酶结构域的多肽的变体RLK827核酸分子(即一部分或杂交序列)，该非胞质结构域包含至少1个但不多于3个LRR基序，且优选还包含如上所定义的SEQ ID NO：33的氨基酸序列基序。
植物中类受体激酶的LRR-I类型具有模块结构，并且已经表明一个LRR蛋白质能够结合不同的配体，例如番茄SR160受体及其番茄同源物tBRI1能结合油菜素内酯激素和长距离的信号传导肽——***素。油菜素内酯和***素不竞争结合，这表明它们结合到不同的位点。因此，假设以保留或改变LRR活性的方式改造LRR结构域(例如通过改变LRR结构域的数量，或通过进行结构域堆积(结合相同或不同的配体)，或结构域改组)，这可用于产生进行本发明方法的变体RLK827核酸分子。以类似的方式，可以改造激酶结构域以增强激酶活性。变体优选的类型包括结构域缺失、堆积或改组产生的那些(参见例如He等人.，Science 288，2360-2363，2000，或美国专利5,811,238和6,395,547)。
本文定义的术语部分指的是一段包含至少150个核苷酸的DNA。可以通过对RLK827核酸制造一个或多个缺失来制备部分。该部分可以以分离的形式使用或者例如，它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，以产生组合了一些活性(它们中的一种是蛋白激酶活性)的蛋白质。当融合到其他编码序列时，由翻译产生的所得多肽要比RLK827部分预测的多肽大。可用于本发明方法的部分至少包含激酶结构域，优选的进一步包含非胞质LRR结构域和位于激酶结构域N端的跨膜结构域，更优选的是该部分在非胞质结构域中包含至少1个但不多于3个LRR结构域，最优选的，该部分在非胞质结构域包含至少1个但不多于3个LRR结构域，以及如上所定义的SEQ ID NO：33的氨基酸序列基序。优选的，功能性部分是SEQID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18中任一项所代表的核酸的一部分。
本文所定义的术语“杂交”是基本同源的互补核苷酸序列相互退火的过程。杂交过程可以完全发生在溶液中，即互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠子或任何其他树脂上。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。
在诸如Southern杂交和Northern杂交的核酸杂交实验中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且随环境参数而不同。本领域技术人员认识到在杂交和洗涤中可以改变多种参数，并且所述变化将保持或改变严格条件。
Tm是在确定的离子强度和pH下，50％的靶标序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm依赖于溶液条件、碱基组成以及探针的长度。例如，较长的序列在较高温度下特异杂交。杂交的最大速率是在Tm低于大约16℃到32℃下得到的。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体的形成；对于高达0.4M的钠浓度，这个作用是明显的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％的甲酰胺虽然使杂交速率降低，但使杂交在30至45℃进行。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。一般对于大探针，每％碱基错配使Tm降低大约1℃。取决于杂交体的类型，Tm可以使用下列公式计算：
·DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺
·DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
·寡-DNA或寡-RNAd杂交体：
对于＜20个核苷酸： Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，但是仅仅在0.01-0.4M的范围精确。
b仅仅对30％至75％范围的％GC精确。
cL＝双链体中碱基对的长度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数目)+(A/T数目)。
注解：对于每1％甲酰胺，Tm降低大约0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低Tm大约30℃。
杂交的特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异性杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低以及洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。一般而言，用于核酸杂交试验或基因扩增检测方法的合适的严格条件如上所述。也可以选择更高或更低的严格条件。一般而言，低严格条件选择为比在确定的离子强度和pH下特异性序列的热解链温度(Tm)低大约50℃。中等严格条件是当温度比Tm低20℃时，而高严格条件时当温度比Tm低10℃时。例如，严格条件是那些至少，例如条件A-L的严格性；并且简化的严格条件是至少，例如条件M-R的严格性。非特异性的结合可以使用一些已知技术中的任一种(例如用含有蛋白质的溶液将膜封闭，添加异源RNA、DNA和SDS到杂交缓冲液中，以及用RNA酶处理)来调控。
杂交和洗涤条件的实例在表1中列出：
表1：
“杂交体长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列和鉴别本文所述的保守区来确定杂交体长度。
在杂交和洗脱缓冲液中可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后洗脱15分钟。杂交和洗脱可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和高达50％甲酰胺。
*Tb-Tr：对于预期长度少于50个碱基对的杂交体，杂交温度应该比杂交体的熔解温度Tm低5-10℃，根据上述公式确定Tm。
±本发明还包括用PNA或修饰的核酸取代任意一个或多个DNA或RNA杂交体配偶体。
为了定义严格性水平的目的，通常参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)。
例如，SEQ ID NO：2或其同源物的编码核酸可以用在杂交实验中。可选的，其片段可以用作探针。根据鉴别RLK的序列原料库，可以选择不同的片段来杂交。例如，当需要有限数量的与RLK827具有高序列同一性的同源物时，可以使用保守性较低的片段用于杂交，如GGTAGACTCGCCAAAGAATTTGAACCACTCGTTGAT(SEQ ID NO：1的核苷酸第184至219位)。通过比对SEQ ID NO 2及其同源物，可以设计与杂交探针作用相当的核酸片段。杂交序列优选至少包含激酶结构域，优选还包含非胞质LRR结构域和位于激酶结构域N端的跨膜结构域，更优选此部分在非胞质结构域中包含至少1个但不多于3个LRR结构域，最优选此部分在非胞质结构域中包含至少1个但不多于3个LRR结构域以及如上所定义的SEQ ID NO：33的氨基酸序列基序。
在杂交和洗涤后，依赖于探针标记的类型，可以通过放射自显影(当使用放射性探针时)或者通过化学发光、免疫检测、通过荧光或显色检测来检测双链体。可选的，可以进行核糖核酸酶保护试验来检测RNA:RNA杂交体。
RLK827核酸分子或其变体可以来自任何天然来源或人工来源。可以从微生物来源如细菌、酵母或真菌，或者从植物、藻类或动物(包括人)来源中分离核酸/基因或其变体。可以通过严谨的人工操作，在组成和/或基因组环境方面从核酸的天然形式对其进行修饰。核酸优选是植物来源的，既可以是来自相同的植物物种(例如来自其待引入的植物物种)或来自不同的植物物种。核酸可以分离自双子叶物种，优选分离自十字花科(Brassicaeeae)，更优选的分离自拟南芥。更优选的，分离自拟南芥的RLK827是SEQ ID NO：1所代表的，并且RLK827氨基酸序列是SEQ IDNO：2所代表的。
可用于本发明方法中的功能性变体还包括可选的RLK827核酸分子或基因的剪接变体。本文所用的术语“可选择的剪接变体”涵盖这样的核酸序列变体，即其中选定的内含子和/或外显子已经切除、置换或添加。这样的变体是其中蛋白质的生物学活性保持未受影响的那些变体，其可以通过选择性的保留蛋白质的功能片段来获得。此类剪接变体可以是天然发现的或可以是人造的。用于产生这种剪接变体的方法是本领域熟知的。优选的剪接变体是SEQ ID NO：1所代表的核酸的剪接变体。更优选的剪接变体是这样的多肽剪接变体，其编码保留激酶活性并且在蛋白质的推定非胞质部分中具有至少1个但不多于3个LRR结构域，所述推定非胞质部分被跨膜区域从激酶结构域分开。更优选的剪接变体另外在推定非胞质结构域中还包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列基序。最优选的RLK827核酸分子的剪接变体是编码如上所定义的RLK827多肽的那些。
可用于本发明方法中的功能性变体另外包括编码RLK827多肽或其同源物的核酸的等位变体，优选的是SEQ ID NO 1所代表核酸的等位变体。更优选的，等位变体所编码的多肽具有激酶活性，并且在被跨膜区域从激酶结构域分开的推定非胞质部分中具有至少1个但不多于3个LRR结构域。更优选的，等位变体另外在推定非胞质结构域中还包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列基序。最优选的RLK827核酸分子的等位变体是编码如上所定义的RLK827多肽的那些。等位变体天然存在，并且包括在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小的***/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大的一类序列变体。
还可以通过以引入遗传修饰(优选在RLK827基因的基因座中)来增加RLK827多肽或其同源物的表达和/或活性。本文中所定义的基因的基因座意指包括目的基因和编码区上游或下游10kb的基因组区域。
例如，遗传修饰可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入：TDNA激活、TILLING、定点诱变、同源重组、定向进化或者通过在植物中引入和表达编码RLK827多肽或其同源物的核酸。在引入遗传修饰后，接下来的步骤是选择RLK827多肽增加的表达和/或活性，这种表达和/或活性的增加使得植物具有改良的生长特性。
T-DNA激活标签(Hayashi等人.Science 258，1350-1353，1992)涉及在目标基因的基因组区域或基因编码区域上游或下游10KB中***通常包含启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA，如此构型以便启动子指引靶基因表达。通常，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。该启动子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通过农杆菌属感染随机***到植物基因组中，并导致靠近该***T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体(在本案中为植物)中表达的任何启动子。例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部突变技术)，把遗传修饰引入到RLK827基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定，并最终分离能显示RLK827活性的RLK827核酸分子的诱变变体。TILLING还能够选择携带这类突变变体的植物。这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现出的更高的RLK827活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei和Koncz(1992)，In：C Koncz，N-H Chua，J Schell编著，Methods in Arabidopsis Research.World Scientific，Singapore，16-82页；Feldmann等人，(1994)In：EMMeyerowitz，CR Somerville编著，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172页；Lightner和Caspar(1998)，In：J Martinez-Zapater，JSalinas编著，Methods on Molecular Biology，82卷，Humana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中库中异源双链体的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum NatureBiotechnol.18，455-457，2000，Stemple Nature Rev.Genet.5，145-150，2004)。
定点诱变可用于产生保留了活性(即蛋白激酶活性)的RLK827核酸或其部分的变体。一些方法可用来实现定点诱变，最常用方法是基于PCR的方法(见例如Ausubel等人.，Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著，http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向进化也可以用来产生具有增加的生物学活性的RKS11或RKS4多肽或其直系同源物或其部分的编码RLK827核酸分子或其部分的变体。定向进化由下列组成：DNA改组的重复，随后适当的筛选和/或选择(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生保留了RLK827功能并因此可用于本发明方法中的新的RLK827等位基因和变体的技术的实例。
同源重组能够在基因组的指定选择位置引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓physcomitrella。用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9，3077-3084)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002)Nature Biotechnol.20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的RLK827核酸分子或其变体)不需要靶向到RLK827基因的基因座中，但是可以被引入到高表达的区域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替换内源基因，或另外引入到内源基因中。
根据本发明优选的实施方案，可以通过在植物中引入和表达编码RLK827多肽或其同源物的核酸来改良植物的生长特性。
引入遗传修饰(在本案中不需要在RLK827基因的基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达RLK827多肽或其同源物的编码核酸。上述RLK827多肽或其同源物具有激酶活性并且包含非胞质(胞外)结构域和通过跨膜结构域将其从非胞质结构域中分离出的C端激酶结构域，所述的非胞质结构域包含至少1个但不多于3个LRR基序，并且优选还包含如上所定义的SEQ ID NO：33的氨基酸序列基序。优选的，RLK827多肽或其同源物与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的优选顺序为至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或***，且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。
术语“同源物”涵盖两种特殊形式的同源性，即直系同源序列和旁系同源序列，它们涉及用于描述基因遗传关系的进化概念。
术语“旁系同源”涉及某物种基因组内的基因复制，产生旁系同源基因。RLK827的旁系同源物可以容易地通过对一组序列进行BLAST分析来鉴定，所述序列来自与查询序列相同的物种。
术语“直系同源”涉及不同生物体中因物种形成所致的同源基因。例如，单子叶植物物种中的直向同源物可以通过实施所谓的交互blast搜索很容易地找到。这可以通过第一次blast完成，其包括在任何序列数据库如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公众可用的NCBI数据库中，对所讨论的序列(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)进行blast。如果寻找的是稻的直系同源物，所讨论的序列将再次与例如来自NCBI上可用的稻Nipponbare的28,469的全长cDNA克隆进行blast。当起始于核苷酸时可以使用BLASTn或tBLASTX，或者当起始于蛋白质时可以使用BLASTP或TBLASTN，并使用标准缺省值。可以过滤blast结果。之后将过滤结果或未过滤结果的全长序列与所讨论的序列所来源生物的序列进行反向blast(第二次blast)。然后对第一次和第二次blast的结果进行比较。当第二次blast的结果与RLK827核酸或RLK827多肽具有最高相似性时，就找到了直系同源物，例如，如果生物之一是拟南芥，那么就找到了旁系同源物。在大家族的情况下，使用ClustalW，接着使用相邻连接树以帮助观察聚类(clustering)。使用交互BLAST方法，鉴别出由EST CB631540，CB628137.1和CB31541.1所代表的稻的直系同源物(单一基因登录号Os.26918)。优选的直系同源物是在交互BLAST搜索中与RLK827或其旁系同源物具有最高相似性的那些。稻的同源物的其他实例在SEQ ID NO24、26、28、30和32中给出。
同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，并且不同的残基***到它的位置上。氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；***片段通常是大约1到10个氨基酸残基。优选的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代(表2)。为了产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以被其他具有相似性质(如类似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的氨基酸所置换。保守性取代表是本领域所熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。
表2：保守性氨基酸取代的实例：
    残基     保守性取代     残基     保守性取代
    Ala     Ser     Leu     Ile；Val
    Arg     Lys     Lys     Arg；Gln
    Asn     Gln；His     Met     Leu；Ile
    Asp     Glu     Phe     Met；Leu；Tyr
    Gln     Asn     Ser     Thr；Gly
    Cys     Ser     Thr     Ser；Val
    Glu     Asp     Trp     Tyr
    Gly     Pro     Tyr     Trp；Phe
    His     Asn；Gln     Val     Ile；Leu
    Ile     Leu，Val
在上述氨基酸性质不是很关键的情况下，可以产生保守性较低的取代。
同源物还可以是蛋白质的“***变体”的形式，即将其中一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中的预定位点。***可包括氨基端和/或羧基端的融合，以及单个或多个氨基酸的序列内***。通常，氨基酸序列内的***将小于氨基端或羧基端的融合，约为1到10个残基的数量。氨基端或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交***的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征在于从该蛋白质除去一个或多个氨基酸。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易的制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、***或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。
RLK827多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与蛋白质天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQID NO：2所示的，其可以包括天然和非天然存在氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然存在的改变的、糖基化的、酰基化的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。与其所衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可包括一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其他配体，如结合以便于其检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。
根据本发明优选的方面，希望增强或增加RLK827核酸分子或其变体的表达。得到基因或基因产物表达增强或增加的方法在本领域中详细记载并且包括例如用适当的启动子驱动的过量表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将作用为启动子或增强子元件的分离的核酸引入至多核苷酸非异源形式的适当位置上(一般为上游)，从而上调RLK827核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利5,565,350号；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子以适当的方向和与本发明基因的距离引入植物细胞中，从而调控基因的表达。
如果希望多肽表达，通常需要在多核苷酸编码区的3’-端包含聚腺苷酸化作用区域。聚腺苷酸化作用区域可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或可选的来自其他植物基因，或较小优选的来自其他真核基因。
还可以将内含子序列添加到5’非翻译区或部分编码序列的编码序列以增加在细胞溶胶中聚集的成熟信息的量。已经表明在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子能在mRNA和蛋白质水平上使基因表达增加达1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1，1183-1200(1987))。当将内含子置于转录单位的5’端附近时，基因表达的此类内含子增强通常是最大的。本领域已知玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的用途。总体上参见The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和/或表达可用于本发明方法中的核苷酸序列。
因此，本发明提供了基因构建体，其包含：
(i)RLK827核酸分子或其功能性变体
(ii)能驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个调控序列；及可选的
(iii)转录终止序列。
可用于本发明方法的构建体可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建。基因构建体可***到载体中，该载体可以是商购的，适于转化到植物中并适于在转化的细胞中表达目的基因。
植物使用包含目的序列(即RLK827核酸或其功能性变体)的载体转化。目的序列与一个或多个调控序列(至少与启动子)有效连接。术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，是指能影响与它们连接的序列表达的调节核酸序列。上述术语包括来源于经典真核生物基因组基因的转录调节序列(包括精确转录起始所需的TATA框，带或不带CCAAT框序列)以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在这种情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任何类型的启动子来驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即对发育、化学、环境或物理刺激应答而具有诱导的或增加的转录起始。作为胁迫诱导型启动子(即当植物接触多种胁迫条件时激活的启动子)的诱导型启动子的实例是水胁迫诱导型启动子WS118。另外的或可选的，启动子可以是组织特异性启动子，即能够在特定组织如叶、根、种子组织等中优选起始转录的这种。种子特异性启动子的实例是稻油质蛋白18 kDa启动子(Wu等人(1998)J Biochem 123(3)：386-91)。
优选的，RLK827核酸或其功能性变体与组成型启动子有效连接。组成型启动子在其生长和发育的绝大部分(但不必是所有)阶段有转录活性并且基本上在各处都表达。优选的，组成型启动子是GOS2启动子(来自稻)(在SEQ ID NO：3中第1到2193位核苷酸)。要明确的是本发明的适用性不限于SEQ ID NO：1所代表的RLK827核酸，本发明的适用性也不限于由GOS2启动子所驱动的RLK827核酸的表达。其他也可用来驱动RLK827核酸表达的组成型启动子在下表3中显示。
表3：组成型启动子的实例
基因来源 表达模式 参考文献
肌动蛋白 组成型 McElroy等人，Plant Cell，2：163-171，1990
CAMV 35S 组成型 Odell等人，Nature，313：810-812，1985
CaMV 19S 组成型 Nilsson等人，Physiol.Plant.100：456-462，1997
GOS2 组成型 de Pater等人，Plant JNov；2(6)：837-44，1992
泛素 组成型 Christensen等人，PlantMol.Biol.18：675-689，1992
稻亲环蛋白 组成型 Buchholz等人，Plant MolBiol.25(5)：837-43，1994
玉米H3组蛋白 组成型 Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
肌动蛋白2 组成型 An等人，Plant J.10(1)；107-121，1996
任选的，一个或多个终止子序列也可引入植物的构建体中。术语“终止子”包括调控序列，其位于转录单位末端的DNA序列，标志初级转录本的3′加工和聚腺苷酸化以及转录的终止。其他调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子和增强子序列。此类序列是已知的，或本领域技术人员可以很容易的获得。
在SEQ ID NO：3中给出了包括有效连接至GOS2启动子的RLK827核酸并且进一步包含终止子序列的表达盒实例。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为附加型基因元件(如质粒或黏粒)维持的情况。优选的复制起点包括但不局限于f1-ori和colE1。
遗传构建体任选地可包含选择标记基因。如本文所用，术语“选择性标记基因”包括赋予表达该基因细胞表型，以便于鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的新陈代谢性状或允许可视选择。选择标记基因的实例包括能赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视标记基因导致颜色的形成(例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、发光(如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
本发明还包括通过本发明方法获得的植物。本发明因此提供了可通过本发明方法获得的植物，该植物在其中引入了RLK827核酸或其功能性变体，或者该植物在其中引入了遗传修饰，优选在RLK827的基因座中。
本发明还提供了产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达RLK827核酸或其功能性变体。
更具体的，本发明提供了产生具有改良的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入RLK827核酸或其功能性变体；并且
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
核酸可以直接引入到植物细胞或植物本身中(包括引入到植物的组织、器官或任何其他部分)。根据本发明优选的特征，核酸优选通过转化引入植物中。
本文所涉及的术语“转化”包括把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移所用的方法如何。无论是通过器官发生还是胚胎发生能够随后克隆繁殖的植物组织，可以用本发明的遗传构建体转化，并从其再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用且最适于转化的特定物种的克隆繁殖***而不同。例示性的靶标组织包括叶圆盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子体、胼胝体组织、已存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定的被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择的，它可以整合到宿主基因组中。以本领域技术人员所知的方法，所得的转化植物细胞然后可用来再生转化植物。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利的，任何转化方法都可用于将目的基因引入到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪颗粒轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185)；DNA或RNA包被颗粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。优选使用任何用于稻转化的已知方法，其通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化产生表达RLK827基因的转基因稻植物，所述的方法例如在任何以下文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6，271-282，1994)，其公开的内容以其全文在此引用作为参考。在谷类转化情形下，优选的方法如Ishida等人(NatureBiotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129，13-22，2002)所述，其公开的内容以其全文在此引用作为参考。
通常在转化以后，选择存在有与目的基因共转移的植物可表达基因所编码的一个或多个标记的植物细胞或细胞群，接着将转化的材料再生成整株植物。
DNA转移和再生之后，可评价推定转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选的或另外的，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。因此将转化的植物细胞培养为成熟植物包括步骤选择和/或再生和/或生长至成熟。
产生的转化植物可通过多种方法进行繁殖，如通过无性繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精以产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。
产生的转化生物可以是多种形式的。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根茎被嫁接到未转化的接穗中)。
本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及囊括由任何上述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代表现出与由本发明方法在亲代中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明还包括含有分离的RLK827核酸或其功能性变体的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明还延及本发明植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和鳞茎。本发明另外涉及直接来自此类植物的可收获部分的产物，如干的颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明还包括RLK827核酸或其功能性变体的用途，以及RLK827多肽或其同源物的用途。
一种此类用途涉及改良植物的生长特性。优选的用途涉及改良植物的产量，更优选的用途涉及增加种子产量。种子产量可以包括下列一种或多种：增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数等。
RLK827核酸或其功能性变体，或RLK827多肽或其同源物可以用在育种方案中，其中鉴定了与RLK827基因或其变体遗传连锁的DNA标记。RLK827或其变体，或RLK827或其同源物可以用来定义分子标记。之后可以将此DNA或蛋白质标记用在育种方案中以选择具有改变的生长特性的植物。RLK827基因或其变体可以是例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中任一项所代表的核酸。
还发现RLK827的等位变体在标记辅助的育种方案中的用途。此类育种方案有时需要通过植物的诱变处理引入等位变异，例如使用EMS诱变；可选的，该方案可以开始于收集无意引起的“天然”来源的等位变体。之后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是选择步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性。通常通过监控含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长特性来进行选择，所述的所讨论序列的等位变体如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31中任一项的不同等位变体。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外可选的步骤包括使已鉴定优良等位变体的植物与另一种植物杂交。例如，这可用于产生目标表型特征的组合。
RLK827核酸或其变体还可用作探针，以对基因进行遗传和物理作图，这些基因是与之连锁的性状的一部分和标志。此类信息可用于植物育种，以开发具有所需表型的品系。RLK827核酸或其变体的此类用途仅需要长度至少为15个核苷酸的核酸序列。RLK82 7核酸或其变体可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹可使用RLK827核酸或其变体进行探测。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测Southern印迹，该Southern印迹含有代表亲本和确定的遗传杂交后代的一组个体的限制酶处理的基因组DNA。记录DNA多态性的分离，并用来计算RLK827核酸或其变体在之前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在遗传作图中植物基因来源的探针的制备和用途在Bematzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter 4，37-41，1986)中描述。众多出版物描述了使用上述方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系及其他的个体组可用于作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。
核酸探针也可用于物理作图(即，将序列置于物理图上；参见Hoheisel等人，在Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。虽然现在的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几个到几百KB；参见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。
基于核酸扩增的多种遗传和物理作图方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16，325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和制备引物对，以用于扩增反应或引物延伸反应。此类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在采用基于PCR的遗传作图方法中，有必要鉴定跨越了对应于此核酸序列区域作图的亲代之间的DNA序列差异。但是，这对作图方法通常不是必要的。
以此方式可以实施产生、鉴定和/或分离具有改变的RLK827表达和/或活性，表现出改良的生长特性的修饰植物。
RLK827核酸或其功能性变体，或RLK827多肽或其同源物还可以用作生长调节剂。由于已经表明这些分子可用于改良植物的生长特性，它们也是有用的生长调节剂，如除草剂或生长刺激物。本发明因此提供了一种用作生长调节剂的组合物，其包含RLK827核酸或其功能性变体，或RLK827多肽或其同源物以及合适的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明的方法产生如上所述的具有改良生长特性的植物。这些改良的生长特性也可与其他经济学上有利的性状组合，如进一步增产性状、对各种胁迫的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。
附图说明
本发明现在将参考以下附图进行描述，其中：
图1给出了植物类受体激酶结构的全图(改编自Shiu & Bleecker，2001)。箭头指示了RLK827的结构以及RLK827所属的亚家族。
图2显示了SEQ ID NO：2结构的示意图。三角形指示了具有ATP-结合位点标记的序列。
图3显示了二元载体p031，其用于在稻中转化和表达受到稻GOS2启动子(内参PRO0129)调控的拟南芥RLK827(内参CDS0827)。
图4详细说明了用于实施本发明方法的序列的实例。“At”号指的是MIP登录号(http://mips.gsf.de/)；其他标识符指的是基因文库登录号。
实施例
本发明现在将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。
DNA操作：除非另外说明，否则重组DNA技术按照(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a Iaboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)中描述的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1：基因克隆
使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，PCR扩增拟南芥AtRLK827(内部编码CDS0827)。对从幼苗提取的RNA进行反转录以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。文库的平均***大小为1.5kb，并且克隆的原始数为1.59×107cfu。原始滴度确定为9.6×105cfu/ml，并且在第一轮扩增以后变成6×1011cfu/ml。质粒提取以后，将200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR扩增的引物prm00405(SEQ IDNO：4，正义)和prm00406(SEQ ID NO：5，反向互补)包含用于Gateway重组的AttB位点。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在标准条件下进行PCR。同样使用标准方法扩增和纯化2750bp的PCR片段。然后进行Gateway方法的第一步，即BP反应，在此期间，PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生“进入克隆”(entry clone)”p3080(根据
Figure S05830856220070316D000341
术语)。质粒pDONR201作为
Figure S05830856220070316D000342
technology的一部分购自Invitrogen。
实施例2：载体构建和稻的转化
继之在LR反应中使用进入克隆p3080和用于稻转化的指定载体。该载体包含位于T-DNA边界内的以下部分作为功能性元件：植物选择性标记；可视标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子位于该Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将得到的表达载体p031(图3)转化到农杆菌属菌株LBA4404中，并且随后转化到稻植物中。使转化的稻植物生长，并且然后检验实施例3中所述的参数。
实施例3：转化体的评估：生长测量
产生了大约15到20个独立的T0转化体。将初级转化体从组织培养箱转移到温室中生长，并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1后代发生3∶1的转基因存在/缺乏分离。对于这些事件中的每一个，通过可视标记选择，选择了10个包含转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及10个缺乏转基因的T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移到温室中。每个植物具有一个唯一的条形标签以将表型数据与对应植物明确联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆的土壤中并在下列环境状态下生长：光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000勒克斯或更多、日间温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置上并排生长。从播种期到成熟期，植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度取得数字图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
收获成熟的初级圆锥花序、装袋并贴上条码标签，然后在37℃烤箱中干燥三天。随后将圆锥花序脱粒并且收集所有的种子。使用鼓风装置将饱满外壳和空外壳分开。在分离后，使用可商购的计数仪器对两批种子进行计数。弃去空外壳。在分析天平上称重饱满的外壳并且使用数字成像测量种子的截面积。此方法得到一组下面描述的种子相关参数。
这些参数是使用图像分析软件，以自动方式从数字图像中得到并且进行统计分析的。将对不平衡设计进行修正的双因素ANOVA(方差分析)用作统计模型，用于植物表型特征的全面评估。对用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总效应，亦称之为整体基因效应。如果F检验的值显示数据具有显著性，那么结论是有“基因”效应，这意味着基因的存在或定位引起了效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F测验的5％概率水平。
为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是以与转基因植物相同的方式处理的，但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，并且此位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文中此类基因效应也称为“基因的线性效应(line effect of the gene)”。通过比较t值和t分布得到p值，或者通过比较F值和F分布得到p值。p值给出了零假设(即没有转基因的作用)为正确的概率。
将在第一个实验中得到的数据在使用T2植物的第二个实验中来证实。选择了具有正确表达模式的3个品系用于进一步分析。通过监控标记基因表达来筛选T1中的来自阳性植物(杂合子和纯合子)的一批种子。对于每一个所选事件，随后保存几批杂合种子用于T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。
在T2代中评估了总数为120的RLK827转化植物，即每个事件有40个植物，其中有20个转基因阳性以及20个阴性。
由于进行了具有重叠事件的两个实验，进行组合分析。这可用于检查两个实验中效应的一致性，并且如果在这种情形下，其可用于从两个实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过对比卡方分布的似然比测定得到p值。
实施例4：转化体的评估：种子相关参数的测量
当对上述种子进行分析时，发明人发现用RLK827基因构建体转化的植物比缺乏RLK827转基因的植物具有更高的饱满种子数、更高的种子总重量和增加的收获指数。在T1代中得到的植物阳性结果在T2代中再次得到。作为实例，给出了品系OS2的数据(表4)。
表4：
Figure S05830856220070316D000371
饱满种子数：
通过计数分离步骤之后保留的饱满外壳的数目确定饱满的种子数。品系OS2的T1代在饱满种子数上显示出41％的显著性增加。此增加在T2代中也观察到(+54％)。T1和T2数据的组合分析证明对饱满种子数的效应是高显著性的(p值为0.0079)。
种子总产量：
通过对从植物中收获的全部饱满外壳进行称重，来测量每株植物的种子总产量(种子总重量)。不仅饱满种子的数量增加了，而且种子总重量也增加了。在第一代中，增加为43％，该增加是统计学显著的。此增加在T2代中得到了证实，并且组合分析显示种子产量的增加是显著性的(p值为0.0065)。
收获指数：
品系OS2还具有增加的收获指数。在本发明中将收获指数定义为种子总产量和地上面积(mm2)之间的比值，再乘以因子106。在T1和T2中，都观察到了收获指数的正效应(分别增加了48％和57％，p值分别为0.0007和0.0527)。在此相同，T1和T2数据的组合分析表明了显著性效应(p值为0.0003)。
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Claims (31)

1.相对于对应的野生型植物，改良植物的生长、改良植物的产量、改良植物的生物量中的任一种的方法，其包括增加SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的活性，
和/或通过增加SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的编码核酸分子的表达。
2.权利要求1的方法，其中所述增加活性和/或增加表达通过在SEQID NO：2所示的RLK827多肽的编码基因的基因座中引入遗传修饰来实现。
3.权利要求2的方法，其中所述遗传修饰通过定点诱变、同源重组、TILLING、定向进化和T-DNA激活中的一种来实现。
4.相对于对应的野生型植物，改良植物的生长、改良植物的产量、改良植物的生物量中的任一种的方法，其包括在植物中引入和表达编码SEQID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子。
5.权利要求4的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子在植物中过量表达。
6.根据权利要求1或4的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子是植物来源的。
7.根据权利要6的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子来自双子叶植物。
8.根据权利要6的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子来自十字花科。
9.根据权利要6的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子来自拟南芥。
10.根据权利要求1或4的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子与组成型启动子有效连接。
11.根据权利要求10的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。
12.根据权利要求1或4的方法，其用于增加产量。
13.根据权利要求12的方法，其中所述增加产量是增加种子产量。
14.根据权利要求13的方法，其中所述增加种子产量选自(i)增加种子生物量；(ii)增加饱满种子数；(iii)增加种子尺寸；(iv)增加种子体积；(v)增加收获指数；以及(vi)增加千粒重中的任一项或多项，其中所述收获指数为可收获部分的产量对总生物量的比例。
15.构建体在用于改良植物的生长、产量、生物量中的任一种中的用途，所述构建体包括：
(i)编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子；
(ii)能够驱动(i)中核酸分子表达的一个或多个调控序列。
16.权利要求15的用途，其中所述构建体包括转录终止序列。
17.根据权利要求15的用途，其中所述调控序列是组成型启动子。
18.根据权利要求17的用途，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。
19.制备具有改良的生长、改良的产量、改良的生物量中的任一种的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)向植物中引入编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子；
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
20.相对于对应的野生型植物，具有改良的生长、改良的产量、改良的生物量中的任一种的转基因植物的细胞，所述改良的生长、改良的产量、改良的生物量中的任一种由引入所述植物中的编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子产生。
21.根据权利要求20的转基因植物的细胞，其中改良的生长、改良的产量、改良的生物量中的任一种由在SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的编码基因的基因座中的遗传修饰产生。
22.根据权利要求20或21的转基因植物的细胞，其中所述植物是单子叶植物。
23.根据权利要求20或21的转基因植物的细胞，其中所述植物是谷类。
24.根据权利要求22的转基因植物的细胞，其中所述植物是甘蔗。
25.根据权利要求23的转基因植物的细胞，其中所述植物是稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。
26.编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子的用途，或者SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的用途，其用于改良植物的生长、产量、生物量中的任一种。
27.根据权利要求26的用途，其用于改良植物的产量。
28.根据权利要求26的用途，其用于改良植物的种子产量。
29.根据权利要求28的用途，其中所述改良的种子产量包括下列一种或多种：增加的饱满种子数、增加的种子重量、增加的收获指数和增加的千粒重，其中所述收获指数为可收获部分的产量对总生物量的比例。
30.用于改良植物的生长、改良植物的产量、改良植物的生物量中的任一种的组合物，其包含编码SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽的核酸分子。
31.用作生长调节剂的组合物，其包含SEQ ID NO：2所示的RLK827多肽。
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