CN101022798A - 作为低氧选择性抗肿瘤剂的磺酰肼类 - Google Patents

Abstract

新颖的磺酰肼类含磷酸基的前药具有式(I)、(II)、(III)和(IV)。公开了药物组合物及其在治疗癌症中的用途。上述前药包括其对映异构体、立体异构体及互变异构体，以及可药用盐或溶剂化物和所有阶段的代谢产物。上述前药优选活化于低氧肿瘤中，且既可单独给药又可与其它抗癌剂或与光疗和放射治疗组合。其中R＝C_1－10烷基，或C_1－10卤代烷基(优选为含有不超过5个卤素基团，优选为2－氯乙基)；R′和R″独立地为C_1－10烷基，或C_5－20芳基或杂芳基(优选为甲基)；R₁为H、C_1－10烷基、C_1－10烷氧基、C_5－20芳基或杂芳基或C_5－20芳氧基或杂芳氧基(优选为甲基和乙基)；X为O、NH或NR(优选为O)；Y为(CH₂)_n，其中N＝1、2、3、4或5(优选n＝2和3)；或Y＝芳基或杂芳基(优选为对苯基)；A＝CH或N(优选为CH)；及B＝CH＝CH、O、S、NH或NR(优选为CH＝CH)；或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

Description

作为低氧选择性抗肿瘤剂的磺酰肼类

发明领域

本发明涉及代谢活化的呈现出对哺乳动物的抗肿瘤活性的磺酰肼前药(SHPs)。治疗瘤形成尤其包括癌症的方法，是本发明的附加部分。

相关申请

本申请要求下列申请的优先权：于2004年9月21日申请的美国临时申请号US60/611,623；于2004年10月1日申请的美国临时申请号US60/615,419；于2004年10月6日申请的美国临时申请号US60/616,500，这些申请的任何一个作为参考在此全部引用。

发明背景

实体瘤的根除需要一些策略以处理在这些肿瘤的缺氧区域有恶性细胞的能存活的种群。不足的和缺乏组织的脉管***是迅速增长的肿瘤块的主要特征，其导致充氧不足，高组织间隙压，和含氧低的、休眠的或生长周期缓慢及远离血液供应的细胞群，因此在实体瘤中不充足的脉管***导致低氧和难于达到药物细胞毒水平(Hockel，等 Cancer Res.1991，51：6098)。放射不能产生足够的氧自由基以导致细胞毒性(Brizel，等   Radiother Oncol.1999，53：113)，因此在这些区域的放射治疗是无效的。而且，细胞毒药物的活性也会削弱。因此，这些区域的细胞频繁地造成疾病的复发。以氧依赖性细胞毒素治疗，如产生破坏细胞DNA的氧自由基的X-照射，及常规的靶向于肿瘤块的富氧的、迅速增长的部分的化学疗法以后，抗性低氧细胞部分能再次形成肿瘤(Stratford，等 Anticancer Drug Des.1998，13：519)。而且，低氧细胞受到促进变异选择性的环境的支配，这些变异导致肿瘤向攻击性逐渐增强的表型进展值。例如，低氧选择在p53-介导的细胞凋亡方面有缺陷的细胞，提高变异率，上调涉及药物抵抗、血管发生，和肿瘤侵袭(包括HIF-1α)的基因，以及因此伴随有转移性更强的表型(Ashur-Fabian等， Pro Natl Acd Sci USA.2004，101：12236)。

作为低氧选择性细胞毒素的前药一般必须是单电子还原酶(如NADPH：细胞色素(P450)还原酶)的底物。在氧存在下，单电子的还原的前药基团(radical)，氧化还原循环回到母体前药，防止活化级联的发展及具有细胞毒性的破坏DNA物质的释放。在低氧条件下，自由基阴离子的进一步还原改变前药的化学作用以允许细胞毒物质的释放(Yang，等 Cancer Res.2003，63：1520)。硝基芳香族和硝基杂环化合物迅速地经历单电子还原到硝基自由基阴离子(radical anion)(Korbelik，等 Mutal Res，1980，78：201)。这些分子迅速与氧发生反应再次产生母体分子。然而，在氧存在下，它们进一步还原产生羟胺衍生物以及然后最终为苯胺形式。而硝基为强吸电子基，羟胺基为强给电子基。这导致芳香环或杂环的化学作用的主要改变，触发活化级联和母体药物的释放。

作为烷化剂，最近已经开发了一系列能够产生活性氯乙基化物质的新颖1，2-二(磺酰基)肼前药(SHPs)(Sartorelli等，US006,040,338，2000；US005,637,619，1997；US005,256,820，1993；US005,214,068，1993；US005,101,072，1992；US004,849,563，1989；及US004,684,747，1987)。已经表明抗肿瘤活性是由于氯乙基化以及随后的DNA交联导致的(Shealy等， J Med Chem.1984，27：664)。

1，2-二(甲磺酰基)-2-(2-氯乙基)-肼羧酸1-(4-硝基苯基)乙基酯(KS119)，当前的SHP系列的先导化合物需要酶的硝基还原以产生烷基化物质(alkylatingspecies)90CE，如图1中所示。因此KS119利用实体瘤的低氧、还原性环境，因此在正常的富氧组织的细胞和低氧肿瘤细胞间产生可利用的差别(Shyam等， J Med Chem.1999，42：941；和Seow等， Proc Natl Acad Sci USA.2005，102：9282)。

然而，KS119在水性溶液中相当不溶，甚至在为了适应本药临床需要的共溶体系(如聚乙二醇(PEG)和乙醇)中没有足够的溶解度(＜5mg/mL)。因此，我们的目的是合成KS119的类似物，使(a)能提高它的水中的溶解度和在pH值3到8的水性溶液中的稳定性；(b)能形成氯乙基化物质；和(c)能保持低氧选择活性。

对于本发明，我们认为水溶性的根据本发明化合物满足上述条件。这样的SHP(KS119W)的实例是在图2中所示的包含磷酸基(phosphate-containing)的KS119的类似物，原因如下：

(a)一般地，含磷酸基(phosphate-bearing)类似物，包括它的盐形式应该有良好的水溶性及在中性pH值的稳定性；

(b)根据本发明的化合物的生物转化过程通过碱性磷酸酶(AP)断裂氧-磷键以形成酚类中间体，如图2所示。

(c)2-硝基酚中间体的生物转化在低氧环境下选择性活化，以产生羟胺衍生物或苯胺形式。

(d)上述氨基类似物的中间体随后经历断裂导致氯乙基化物质(90CE)的形成。低氧环境下，90CE的释出仅在硝基的还原时发生。

(e)本发明的化合物被认为是90CE的前药，90CE已被确认为一种抗肿瘤疾病状态(包括，例如，多种实体瘤)的广谱抗癌的烷化剂。

发明目的

发明的一个方面，本发明的一个目的是提供化合物，药物组合物和***(包括动物和人的癌症)的方法。

发明的另一个发面，本发明的一个目的是提供***的方法，其利用在低氧环境中呈现良好抗癌特性及增强活性、药物动力学、生物利用度和降低毒性的特性。

发明的另一个目的是提供对于传统化学疗法试剂的治疗抵抗的癌症治疗的组合物和方法，及通过与其它抗癌剂或与光疗和放射疗法组合治疗癌症。

它们中的一项或多项及/或本发明的其它目的可由下面的发明说明书中迅速得到。

发明简述

本发明涉及根据结构I或II的化合物：

其中R为C_1-10烷基，或C_1-10卤代烷基；

R′或R″为C_1-10烷基，或C_5-20芳基或杂芳基；

R₁为H；C_1-10烷基、C_1-10烷氧基；

X为O、NH、或NR；

R(P)为含磷酸基的烷基，例如，R(P)为Y’OPO(OH)₂，其中Y为(CH₂)_n、O(CH₂)_n、NH(CH₂)_n、NR(CH₂)_n，n为1-5，Y为芳基或杂芳基；

Ar(N)为含硝基的芳基，例如，

其中A为CH、CR或N；及B为CH＝CH、O、S、NH或NR；及Ar(NP)为含磷酸基且含硝基的芳基，例如，

其中A为CH、CR或N；及B为CH＝CH、O、S、NH或NR；及Y为(CH₂)_n、O(CH₂)_n、NH(CH₂)_n、NR(CH₂)_n、OCOO(CH₂)_n、NHCOO(CH₂)_n；n为1-5，或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

本发明也涉及到如式I、II、III和IV的化合物

其中R＝C_1-10烷基，或C_1-10卤代烷基(优选含有不超过5个卤素基团，更优选2-氯乙基)；

R′和R″为独立C_1-10烷基，或C_5-20芳基或杂芳基(优选甲基)；

R₁为H、C_1-10烷基、C_1-10烷氧基、C_5-20芳基或杂芳基或C_5-20芳氧基或杂芳氧基(优选甲基和乙基)；

X为O、NH或NR(优选O)；

Y为(CH₂)_n、O(CH₂)_n、NH(CH₂)_n、NR(CH₂)_n、OCOO(CH₂)_n、NHCOO(CH₂)_n；n＝1、2、3、4或5(优选为n＝2和3)；或Y＝芳基或杂芳基(优选对-苯基)；

A＝CH或N(优选为CH)；和

B＝CH＝CH、O、S、NH或NR(优选为CH＝CH)；或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

在优选的方面，本发明涉及到根据结构IA的化合物：

其中R＝C_1-10烷基，或C_1-10卤代烷基；R_i＝H；C_1-10烷基，C_1-10烷氧基；X＝O、NH或NR；A＝CH、CR或N；及B＝CH＝CH、O、S、NH或NR或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

本发明的上述化合物包括其对映异构体、立体异构体及互变异构体，以及可药用盐、溶剂化物、多晶型物和来自所有阶段的代谢产物。

这些化合物中的优选药物为结构IA的4-硝基苯基系列化合物，其中A为CH；B为CH＝CH；X为O；R为CH₂CH₂Cl；R₁为CH₃；磷酸基团可以为游离酸或盐(优选为Tris)。在肼-羧酸1-(4-硝基苯基)乙基酯(KS119W)的尤其优选方面，对映异构体的R构型结构(VNP40541)为更优选。

如前所述，根据本发明的化合物及尤其根据本发明优选的组合物为***极其有效的化合物。它们也呈现至少一种或多种改善，如与KS119相比增强抗肿瘤的活性，降低毒性，更高的水溶性，或更良好的药物代谢分布。

根据本发明这些化合物在低氧肿瘤优先活化，且能单独给药，或与其它抗癌剂或与光疗或放射疗法组合。

根据本发明的化合物可用于治疗癌症，以及许多其它情况和/或疾病状态的药物组合物。本发明的实施例可作为合成呈现生物学活性的其它化合物的中间体以及确定本化合物生物学活性的标准。在一些申请中，本化合物可用于治疗微生物感染，尤其包括病毒、细菌及真菌感染。这些化合物包括在上文公开的有效量的任何一种或多种化合物，任选地与可药用的添加剂、载体或赋形剂组合。

本发明的另一方面涉及癌症的治疗，包括对需要其的患者给药有效量的上文描述的化合物，所述化合物任选地与可药用的添加剂、载体或赋形剂组合。本发明也涉及治疗哺乳动物瘤形成的方法，所述方法包括向患有癌症的患者给药上文描述的有效量的化合物。对恶性实体瘤、白血病及淋巴瘤的治疗，包括向患者给药抗肿瘤有效量的一种或多种这些药物是本发明的优选实施方案。使用本发明的化合物对其它不同相关疾病状态的治疗也可能是有效的。此方法也可用于比较检验，如确定相关类似物的活性，以及用于确定患者癌症对一种或多种根据本发明的化合物的敏感性的测试。

附图和表简述

图1表示推断的KS119活化机理。

图2表示化学实施方案的样品(KS119W)及所提出的根据本发明在低氧条件下它们的活化的机理。

图3和4表示合成根据本发明化合物的化学图解。

图5到7表示在涉及根据本发明的低氧条件的选择性活化的本申请中提出的实验结果。

图8到9表示在涉及根据本发明的优选实施方案的有效性和毒性的本申请中提出的实验结果。

发明详述

以下术语将在整个说明书中使用以描述本发明。

在整个说明书中使用术语“患者”来描述动物，包括哺乳动物及优选人，用根据本发明的组合物向它们提供治疗，包括预防治疗。对于具体动物如人患者的具体的感染、病症或疾病状态的治疗，术语患者涉及具体的动物。

在整个说明书中使用术语“有效量”来描述根据本发明的化合物的浓度或量，所述浓度或量可用于在治疗的疾病或病症中产生有利的改变，根据治疗的疾病或病症，改变可为减轻，癌症或肿瘤的生长或尺寸的下降，有利的生理学结果，微生物的生长或产生的减少等等。

除另有说明，文中应用的术语“化合物”涉及任何在此公开的具体的化学化合物。在上下文的使用中，本术语一般涉及单个化合物，但也可涉及立体异构体及/或光学异构体(包括消旋体混合物)，以及具体的对映异构体，或所公开化合物的对映异构富集的混合物，以及互变异构体。

在整个说明书中使用术语“瘤形成”来描述导致瘤形成形成和生长的病理过程，即，通过细胞扩增比正常组织生长更快，且在受到使新增长停止的刺激后继续生长的异常组织。瘤形成可能是不同的组织块，其可以是良性(良性肿瘤)或恶性(癌瘤)。在此引用，使用术语瘤形成描述所有癌性疾病状态和包括或包含伴随恶性血原性、腹水性、和实体肿瘤的病理过程。术语“癌症”和术语“肿瘤”在本申请中可与术语“瘤形成”互换。

可使用根据本发明的组合物治疗的癌症，包括例如，胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子***、子宫体癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌、脑癌/中枢神经***(CNS)癌、头颈癌、咽喉癌、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病、尤因肉瘤、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、毛细胞性白血病、口/咽癌、食道癌、喉癌、黑素瘤、肾及其它淋巴癌。对肿瘤的治疗包括向患者给药抗肿瘤有效量的一种或多种这些药物是本发明的优选实施方案。

在整个说明书中使用术语“烷基”来描述烃基，包括1到7个碳单位。在本发明使用的烷基包括直链或支链的基团，如优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、环己基、甲基环丙基和甲基环己基。

术语“芳基”涉及取代的或未取代的一价芳香基，所述芳香基具有单个环(如苯基)或多个稠环(如萘基)的。术语“芳氧基”涉及连接烷氧基的芳基，优选为通过另一个基团(例如磺酰基)相连。

术语“杂芳基”涉及杂环芳香环基团，在该环中含一个或多个氮、氧或硫原子，例如咪唑基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、噻吩基及吲哚基。术语“杂芳氧基”涉及连接烷氧基的杂芳基，优选为通过另一个基团(例如磺酰基)相连。

在整个说明书中使用术语“盐”来描述任何与根据本发明化合物的用途一致的盐。其中当化合物用于药学适应症时，包括癌症的治疗，术语“盐”应表示可药用盐，与作为药物的化合物的用途一致。

在优选发面，本发明涉及如结构(IA)的化合物：

其中R＝C_1-10烷基，或C_1-10卤代烷基；R₁＝H；C_1-10烷基、C_1-10烷氧基；X＝O、NH、或NR；A＝CH、CR或N；及B＝CH＝CH、O、S、NH或NR。

根据本发明的化合物包括对映异构体、立体异构体及其互变异构体，以及可药用盐、溶剂化物、多晶型物及所有阶段的代谢产物。

本化合物代表中间体的前药形式，所述中间体据信通过氯乙基化或甲基化机理呈现DNA交联活性。新的前药设计的原理是通过一系列酶的激活和迅速断裂将酶激活的前药转变为活化的烷基化物质(90CE)。通过碱性磷酸酶(AP)活化完成脱磷酸作用以得到中间体1；通过硝基还原(NR)酶催化硝基还原以形成中间体2；及随后苯基断裂产生90CE，见图2。

根据本发明的化合物在低氧肿瘤中优选活化，且能单独给药或与其它抗癌剂或与光疗或放射治疗组合。

根据本发明的化合物首要作用为它们的抗肿瘤活性，包括它们的抗实体肿瘤活性。而且，这些组合物还可以作为中间体用于其它有用的抗肿瘤剂的化学合成，所述抗肿瘤剂的作用依次为治疗剂或其它的目的，包括作为实验的标准品。

化合物中优选药物为结构IA的4-硝基苯基系列，其中A为CH；B为CH＝CH；X为O；R为CH₂CH₂Cl；R₁为CH₃；磷酸基团可以为游离酸或盐。在肼-羧酸1-(4-硝基苯基)乙基酯(KS119W)的尤其优选方面，对映异构体的R构型结构(VNP40541)比S构型结构(VNP40551)更为优选。

根据本发明的化合物通过本领域众所周知的技术的调整来合成并且从90CE衍生。已公开了从2-羟乙基-肼的两步法合成90CE(参见，Shyam等 J Med Chem.1993，36：3496，及 J Med Chem.1996，39：796)。在此具体描述的化合物的类似物将用上述的一般技术和类似的本领域中可用的合成方法容易地合成，而不用进行不必要的实验。

通过具体的方法，例如，图3中所示，化合物I的1，2-二(甲磺酰基)-2-(取代)肼-碳酸酯(carbonates)(5，R＝CH₂CH₂Cl)分别通过下列步骤合成：适当的α-烷基4-硝基芳基甲醇或N-烷基-N-(4-硝基芳基甲基)胺(3或4，其中R₁为-CH₃；R^*为磷酸基团的保护基团，例如，二乙基或二叔丁基或2-三甲基甲硅烷基乙基(TMSE)基团，与碳酰氯(20％甲苯溶液)或其等价物，例如三碳酰氯或氯甲酸三氯甲酯(参见，Majer，等 J Org Chem.1994，59：1937；及Pridgen，等 J Org Chem.1989，54：3231))反应，并与90CE进一步原位缩合。当使用N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)作为碱且将反应保持在0℃，在无水的乙腈-二氯甲烷溶剂中过夜时，此偶联反应可得到高产率。化合物I(6，R＝CH₂CH₂Cl)的肼-酰胺可通过相似的碳酰氯-偶联途径合成(Lin，等US006,855,695，2005)。

5或6在去-二烷基-保护后，可迅速转变为相应的磷酸游离酸(7或8)。例如，二乙基酯的去保护可用三甲基甲硅烷溴化物(TMSBr)处理(Matulic-Adamic，等 J Org Chem.1995，60：2563)，二叔丁基酯的去保护可用三氟乙酸(TFA)处理(Durgam等 J Med Chem.2005，48：4919)，及二TMSE酯的去保护也可用TFA(Dolye等US006,458,816，2002)或用BF₃-Et₂O(Jansson等Tetrahedron Lett.1986，27：753)处理。磷酸游离酸形式的7或8通过快速柱色谱(FCC)纯化，例如正相硅胶或反相硅胶，并且在冻干后得到作为药物物质所需的SHP化合物。

如图4中所示，α-烷基4-硝基芳基甲醇(3)能由相应的烷基芳基酮(9)采用对映异构体的选择性还原而合成。还原催化剂能选自商业上可用的试剂，如2-Me-CB S-唑硼烷(oxazaborolidine)/BH₃(Mathre，等 J Org Chem..1993，58：2880)或二异松莰基氯硼烷(Brown，等 J Am Chem Soc.1998，110：1539)或硼-(3-蒎基)-9硼杂双环[3.3.1]壬烷(Alpine-borane)(Ramachadran，等Tetrahedron：Asymm.5：1061)。也可以使用酮的不对称氢化(Ohkuma等J AmChem Soc.1998，120：13529；和Baar等JAm Chem Soc.2004，126：8216)。

N-烷基-N-(对硝基芳基甲基)胺(4)可由相应的烷基芳基酮制备。例如，使用硼氢化钠作为还原剂，12各自与甲胺还原胺化得到相应的N-芳基甲基-N-甲胺(4)。

在温和条件下，芳香环上的羟基能与氯代磷酸基反应以提供它们相应的二烷基保护的膦羧基-芳基化合物(即3或12)。使用亚磷酸盐、四氯化碳、DIPEA和催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)达到苯酚的选择性磷酸化(Silverberg，等 Tetrahedron Lett.1996，37：771)。通常，磷酸化可以先于不对称还原或磷酸化可以在还原性胺化后完成。用于这些反应设计的适合的4-硝基芳基化合物(9或11)的合成在本技术领域中是众所周知的且使用标准的化学技术如硝化和丙烯酰化(acrylation)。

合成后，粗产物一般通过反相硅胶色谱和冻干法纯化。用适合的碱性溶液或胺处理KS119W(或VNP40541)能容易地产生各自的水溶性盐如钠盐、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)盐、三乙醇胺盐、三乙基胺盐或二甲基吡啶盐。所述公开化学合成方法的改变可以由本领域普通技术人员容易得到，以提出可选的本化合物的合成路线。

基于本新颖化学化合物的药物组合物包括以治疗有效量治疗病症或疾病如癌症的上述化合物，任选地，与可药用的添加剂、载体或赋形剂混合。

一些化合物的药物剂型可以用作预防没有显示出的的疾病或病症的预防剂。

本化合物或它们的衍生物能以可药用盐形式提供。如本文中所用，术语“可药用盐”涉及适合的根据本发明的活性化合物的盐，所述盐保持所希望的母体化合物的生物学活性。这些盐的非限制性的例子包括磷酸盐的钠盐和钾盐，其它如TRIS盐、三乙醇胺盐、三乙胺盐、二甲基吡啶盐或其它在本领域已知的可药用盐。

活性化合物的修饰可影响溶解度、药物代谢动力学参数和活性物质的代谢率，因此在递送活性物质上提供对照。而且，修饰能影响化合物的抗癌活性，在一些情况下，相对于母体化合物提高活性。这能容易地根据本领域现来技术中已知方法通过制备衍生物和检测抗癌活性来评价。

本发明的化合物可混合到用于所有的给药途径的制剂中，所述给药途径包括，例如肠胃外给药和口服给药，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、颊内、经皮和栓剂形式。肠胃外给药及尤其静脉内或肌肉内给药为优选。

基于这些新颖化学化合物的药物组合物包括上述治疗癌症和在此描述的其它疾病及病症的治疗有效量的化合物，任选地与可药用的添加剂、载体和/或赋形剂混合。本领域的普通技术人员将理解治疗有效量的一种或多种根据本发明的化合物，将改变所治疗的感染或病症、其严重度、所采用的治疗方案、所用药物的药物代谢动力学，以及所治疗的患者(动物或人)。

在本发明的药学方面，根据本发明的化合物优选与可药用的载体混合制剂。一般地，药物组合物给药优选为肠胃外给药，并尤其优选静脉注射或肌肉注射的剂型，但是很多制剂通过其它肠胃外途径给药，所述肠胃外途径如经皮肤、含服(buccal)、皮下、栓剂或其它途径，包括通过口服途径给药。用无菌盐水静脉注射和肌肉注射的制剂为优选给药方式。当然，本领域的普通技术人员可在说明书教导的范围内改变制剂以提供具体给药途径的多种制剂，而不使本发明的组合物不稳定或累及它们的治疗活性的制剂。具体而言，本发明的化合物的修饰使它们更易溶于水或其它载体，例如，可通过较小的改变(如盐制剂等)容易地完成，所述改变为本领域的普通技术人员所熟知。也可以在现有技术范围内改变具体化合物的给药途径和剂量用药法，以调整本发明化合物的药物代谢动力学以达到对于患者的最大有效量。

本领域技术人员将利用本发明可适用的前药形式的有利的药物代谢动力学参数，递送本发明化合物到宿主有机体或患者的靶点使化合物的预期效果最大化。

活性化合物的给药的范围可从甚至每天频率少于一次的连续给药(静脉滴注)，包括快速注射给药、静脉注射或肌肉注射，到每天几次给药，并且可包括局部、胃肠外、静脉注射、肌肉注射、皮下、经皮肤(其可以包括渗透促进剂)、含服和栓剂给药，其它给药途径包括例如口服给药。

为制备根据本发明的药物组合物，治疗有效量的一种或多种根据本发明的化合物优选根据制备剂型的常规的药物组合技术与可药用的载体密切混合。载体可以有多种形式，取决于给药如静脉注射或肌肉注射所需制剂的形式。在制备适合剂型的药物组合物中，可以使用任何常用的药学介质。对于胃肠外制剂，载体可包括无菌的水或氯化钠水溶液或5％的葡萄糖水溶液(D5W)，其与其它有助于分散的成分混合，所述成分如乙醇和其它可药用的溶剂，包括DMSO，及其它。当然，当使用溶液并溶液保持无菌时，组合物和载体也必须为无菌。还可以制备可注射的悬浮液，在该情况下，可采用适合的液体载体、悬浮剂等。

使用于胃肠外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液能包括下列成分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、D5W溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如TRIS、醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、组氨酸或碳酸氢钠溶液；及调整张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。胃肠外制剂能包封于安瓿、一次性的注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量瓶。如果为静脉注射给药，优选的载体包括，例如，生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

制备口服剂型的药物组合物，可使用任何一种或多种常用的药学介质。因此，对于流体口服制剂如悬浮剂、酏剂或溶液，可以使用的合适的载体和添加剂包括水、二醇类、油类、醇类、芳香剂、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂如粉剂、片剂、胶囊及对于固体制剂如栓剂，可以使用的合适的载体和添加剂包括淀粉、糖载体(如葡萄糖、甘露醇、乳糖及相关载体)、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。视需要，片剂或胶囊可通过标准技术进行肠溶包衣或持续释放。

在一个实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将使化合物免于从身体快速消除，如控释制剂，包括植入及微囊化递送***。

能使用生物可降解的，生物相容的的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类及聚乳酸。对于本领域中的技术人员这些制剂的制备方法是显而易见的。

脂质体悬液也可以作为可药用的载体。这些可以根据本领域技术人员的已知方法制备。例如，制备脂质体制剂可以通过将适合的脂质溶解于无机溶剂中，之后将无机溶剂蒸发，在容器表面留下一薄层干燥的脂质。然后将活性化合物的水性溶液加入到容器中。然后用手搅动容器使脂质原料从容器的边缘游离并使脂质团粒分散，从而形成脂质体悬液。在本发明的这一方面，普通技术人员可使用其它已知的制备方法。

可以使用本发明的化合物治疗动物，尤其为哺乳动物，包括人类，如患者。因此，人、马、犬、牛和其它动物，并且具体而言为患有肿瘤的哺乳动物，并且具体而言为癌症，或在此描述的其它疾病，能通过向患者给药有效量的一种或多种根据本发明的化合物或其衍生物或其可药用盐进行治疗，根据所治疗的疾病，上述化合物或其衍生物或其可药用盐任选与可药用的载体或稀释剂一起使用，所述载体或稀释剂既可单独使用，又可与其它已知的药学试剂组合。该治疗也能与其它常规的癌症治疗如放射治疗或手术组合。

活性化合物以足够递送给患者对于所需适应症的治疗有效量，而对治疗患者不引起严重毒性作用的量包含于可药用的载体或稀释剂中。

本化合物是反应中间体的前药形式。在一些药物剂型中，可以将本化合物修饰为其它前药形式，以利用活性化合物的具体给药途径。本领域的普通技术人员将认识到如何容易地将本化合物修饰为其他前药形式，促进活性化合物递送到患者的靶点。普通技术人员还将利用可应用的前药形式有利的药物代谢动力学参数，递送本化合物到患者的靶点以使预期的化合物的抗瘤形成效果最大化。

包括在根据本发明的治疗有效制剂中的化合物的量是治疗癌症的有效量。一般地，剂型中的根据本发明的化合物的治疗有效量的范围通常为低于约0.05mg/kg到约500mg/kg(所治疗患者的体重)，或多得多，取决于所用的化合物、所治疗的瘤形成的种类、活性化合物定位于所治疗的组织的能力、给药途径和患者的化合物的药物代谢动力学。在治疗癌症的情况下，化合物优选以一次约0.05mg/kg到约250mg/kg或更多的量给药。在所治疗的患者中，该剂量范围通常产生活性化合物的有效血中水平浓度，所述血中水平浓度为约0.01到约500毫克每毫升血液。治疗的持续期可以为一天或多天或可以持续几个月或相当长(几年)，这取决于所治疗疾病的状态。在更优选的实施方案中，给药患者0.1mg/kg到100mg/kg的本化合物，每天两次到每14天一次，持续期为1周到52周。

患者中活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、分布、失活和***率，以及本领域技术人员已知的的其它因素。应当指出，对患者的所给剂量也可以根据要缓解的症状的严重程度而变化。还应当理解的是，对于任何具体的患者，具体的剂量用药方法应随时间根据个体的需要和给药或指导组合物给药的人的专业判断而调整，且在此提到的浓度范围仅作参考并不限定所提出组合物的范围或使用。活性成分可以一次给药，或可以分成很多小剂量在不同间隔时间给药。

根据本发明的活性化合物可以与其它不损害所希望的作用的活性物质或补充所希望的作用的物质混合，如其它抗癌剂(在某些情况下取决于所希望的治疗或靶点)、抗生素、抗真菌药、抗炎药或抗病毒化合物及其它。

这些根据本发明的化合物优选在低氧肿瘤中活化，并且能单独给药或与其它抗癌药或与光疗或放射治疗组合。

根据本发明的化合物可以单独给药或与其它药物组合，尤其包括本发明的其它化合物。根据本发明的这些方面，治疗有效量的一种或多种根据本发明的化合物与治疗有效量的至少一种另外的抗瘤形成/抗癌剂共同给药，所述抗瘤形成/抗癌剂如抗代谢药、依托泊苷、多柔比星、紫杉醇、长春新碱、环磷酰胺(cyclophosphamide)或丝裂霉素C，及多种其它化合物，包括拓扑异构酶I和拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、托泊替康、喜树碱及依立替康，其它药物如吉西他滨和基于喜树碱和顺铂的药物。理论上，通过破坏DNA的机理而起作用的本化合物，将与通过减少或阻止DNA修复的机理而起作用的化合物协同作用。因此，本化合物可以有利地与任何以减少或阻止DNA修复的机理而作用的化合物组合，尤其包括促进DNA修复的酶的抑制剂，如核苷酸还原酶(RR)抑制剂和O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)抑制剂。通过“共同给药”意味着，向患者给药本发明的化合物使得本发明的化合物和共同给药的化合物可以同时在患者的血流中被检测到，无论这些化合物实际上是何时给药，包括同时给药。在许多情况下，本化合物与传统的抗癌剂共同给药产生意想不到的协同作用(即不仅是相加)结果。在另一个实施方案中，将根据本发明的化合物同时或按顺序与抗生素(结合或非结合)、病毒或细菌给药。抗生素、病毒或细菌可以携带酶或编码酶的基因，所述酶激活本发明描述的化合物。所述酶包括但不限于NR。

不限定于理论的方法，据信根据本发明的化合物主要通过作为低氧选择性的氯乙基化剂的功能诱导它们在治疗恶性肿瘤的治疗效果。

已经大体描述了本发明，现以下列阐明优选的和其它的实施方案和比较的具体实施例作为参考。所包括的实施例并非限定本发明的范围，因为其范围在上文所述及在附加的权利要求中更宽。本申请实施例部分中没有具体呈现的其它化合物可以根据类似的方法学和/或已呈现的和本领域已知的方便的合成法容易的合成。简单地直接根据详细合成方法学或改编/修饰本领域已知的所用技术的合成方法学，普通技术人员可以容易地合成所有提到和描述过的化合物，而不用进行过度的实验。

实施例

所有购买的试剂均为商品质量并未进一步纯化而使用，必要时在使用前将溶剂干燥和/或蒸馏。所有NMR谱(¹H、¹³C及³¹p)在Bruker AC300谱议上测定。化学位移以相对四甲基硅烷的百万分之几(ppm)测定。耦合常数以赫兹(Hz)记录。快速柱色谱(FCC)用Merck硅胶60(230-400目筛)进行，且反相柱色谱(RPCC)以CAT胶(Water，制备C-18，125，55-105μm)填充，以milli-Q级去离子水洗脱。

实施例1-2

酚类化合物的磷酸化

一般方法A。室温下，向经搅拌的适合的酚类化合物(10.0mmol)的乙腈(15mL)溶液加入DMAP(1mmol)和DIPEA(20mmol)。将反应混合物冷却到-13℃。滴加氯磷酸二烷基酯(10mmol)的乙腈(5mL)溶液以保持内部温度小于-10℃。将反应混合物升温至0℃，然后持续搅拌2小时，以TLC监测反应完成。将反应混合物通过旋转蒸发浓缩，且以二氯甲烷和0.5M KHSO₄的水溶液处理油状残余物。有机层通过无水MgSO₄干燥，然后过滤并浓缩得到棕色粘稠油状物。可以使用粗制二烷基膦羧基-芳基化合物而不进一步纯化。

1-(3-二乙基膦羧基-4-硝基苯基)乙醇(13)。根据一般方法A，R-1-(3-羟基-4-硝基苯基(nitrophaenyl))乙醇(18.2g，100mmol)与氯磷酸二乙酯(15.0mL，100mmol)反应，得到所需产物13(32.0g，100％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ 1.36(t，J＝7.1Hz，6H)，1.47(d，J＝6.6Hz，3H)，3.02(br s，1H)，4.25和4.27(q，J＝7.1Hz，4H)，4.91(q，J＝6.6Hz，4H)，7.26-7.31(m，1H)，7.55(s，1H)，7.90(dd，J＝8.5，0.8Hz，1H)。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ16.1和16.2，25.3，65.6和65.7，68.8，119.6，122.2，126.0，140.0，143.5和143.6，154.4。

³¹P NMR(121MHz，CDCl₃)δ-6.7。

一般方法B。将酚类化合物(10mmol)，DIEA(20mmol)和DMAP(1mmol)的乙腈(20mL)溶液置于-50℃浴中。向上述***液中加入CCl₄(50mmol)和亚磷酸二烷基酯(10mmol)。反应溶液在室温下保存2小时。通过旋转蒸发除去溶剂。以0.5M KHSO₄水溶液和二氯甲烷处理残余油状物。分离后，通过无水MgSO₄干燥、蒸发和真空干燥，可以使用粗制二烷基膦羧基-芳基化合物而不进一步纯化。

1-(3-二乙基膦羧基-4-硝基苯基)乙醇(13)。根据一般方法B，R-1-(3-羟基-4-硝基苯基(nitrophaenyl))乙醇(15.0g，82.4mmol)与氯磷羧二乙酯(10.6mL，82.4mmol)反应，得到所需产物13(27.1g，100％)。

实施例3

苯甲醛类的格利雅(Grignard)反应

一般方法。在-50℃，经45分钟，  向4-硝基苯甲醛类(4-nitrobenzaldehydes)(10mmol)的无水THF(30mL)溶液中缓慢加入格利雅试剂，如溴化甲基镁的***(25mmol)溶液。在加入格利雅试剂过程中，反应混合物的温度保持在-40℃以下。可将反应混合物升温至室温，且搅拌3.5小时。将反应混合物冷却到-10℃，且用5％的盐酸(25mL)淬灭。将反应混合物用水(25mL)稀释且产物用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。将合并的有机萃取物用水冲洗到pH值为5，通过无水Na₂SO₄干燥，过滤及浓缩。将残余物用快速硅胶色谱纯化，以25％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱。蒸发及真空干燥后，得到α-烷基4-硝基苯甲醇。

1-(3-羟基-4-硝基苯基)乙醇(14)。根据一般方法，由3-羟基-4-硝基苯甲醛(90.0g，539mmol)得到所需红色油状产物14(40.0g，41％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ1.50(d，J＝6.6Hz，3H)，2.06(br s，1H)，4.93(q，J＝6.3Hz，1H)，6.98(dd，J＝8.8，1.9Hz，1H)，7.17(d，J＝1.7Hz，1H)，8.08(d，J＝8.8Hz，1H)，10.6(s，1H)。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ25.3，69.5，116.3，117.6，125.5，155.5，156.9。

实施例4

苯乙酮类的还原

一般方法。向手性(R或S)-2-甲基-CBS-唑硼烷(oxazaborlidine)的A溶液(1.0M甲苯溶液，240mL)加入1.0M BH₃-THF溶液(120mL)，将所得溶液冷却到-50℃。经4小时，向上述溶液中同时缓慢加入3’-羟基-4’-硝基苯乙酮(100g)的THF/甲苯(200mL/800mL)溶液及1.0M BH₃-THF溶液(1.0L)，同时剧烈搅拌。反应混合物在-50℃持续搅拌2-3小时，通过HPLC监测反应完成。然后于-50℃向反应器中滴加丙酮(200mL)。于-50℃搅拌10分钟后，将反应混合物升温至环境温度，且搅拌1.5小时。于45℃浴上旋转蒸发浓缩，残余物以饱和Na₂CO₃水溶液(2L)处理。将混合物在50℃加热30分钟，然后冷却到室温。加入叔丁基甲基醚(TBME，1L)和己烷(1L)，将混合物于室温(RT)搅拌1小时，然后分离。向水层滴加入浓HCL调pH值为6，同时保持温度在25℃。以乙酸乙酯(3×2L)萃取该混合物，且浓缩有机相。得到棕色油状的粗产物，且将其在己烷中重结晶纯化。

R-1-(3-羟基-4-硝基苯基)乙醇(15)。根据一般方法，由3-羟基-4-硝基苯乙酮(100g，0.55mol)得到所需黄色固体产物15(52g，51％，99.3％ee)。

实施例5

苯甲醛(benzaldehydes)的还原性胺化

一般方法。向苯甲醛(10mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入2N甲胺的THF(20mmol)溶液。将反应溶液保持在室温过夜且过滤沉淀物。将滤液浓缩和真空干燥，且将所得粗制油状物溶解于甲醇(50mL)中。于0℃向上述溶液中逐份加入NaBH₄(20mmol)，将溶液持续搅拌4小时。蒸发后，将残余物分散于水(50mL)和二氯甲烷(50mL)中。将水相分离，并以二氯甲烷(50mL)萃取一次。合并的有机相通过无水MgSO₄干燥、过滤、浓缩并真空干燥。粗制N-苄基-N-甲胺足够纯可以使用，无需进一步纯化。

N-(4-二乙基膦羧基苄基)-N-甲胺(16)。根据一般方法，由二乙基膦羧基-苯甲醛(29.9g，116mmol)得到黄色油状的15(22.3g，71％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.31(d，J＝8.0Hz，2H)，7.17(d，J＝8.5Hz，2H)，4.21(m，4H)，3.73(s，2H)，2.42(s，3H)和1.34(t，J＝6.9Hz，6H)。

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ149.4(d)，135.6，129.3，119.5(d)，64.2(d)，54.5，35.1和15.7(d)。

³¹P NMR(121MHz，CDCl₃)δ-5.5。

实施例6-7

碳酰氯偶联反应

一般方法A。在经搅拌的90CE(10mmol)的乙腈(40mL)溶液中加入碳酰氯(20％甲苯溶液，10mmol)和DIPEA(10mmol)。在0℃保持20分钟，向溶液中加入N-(二烷基膦羧基-苄基)-N-甲胺(10mmol)和DIEA(10mmol)。最终反应溶液保持在5℃过夜。蒸发后，用水和二氯甲烷处理残余物。将合并的有机相通过无水MgSO₄干燥、过滤及蒸发。得到相应的油状的受保护的磷酸酯。

一般方法B。于0℃向20％碳酰氯的甲苯(30mmol)溶液中加入DIPEA(12mmol)。缓慢加入1-(3-二乙基膦羧基-4-硝基苯基)乙醇(10mmol)的乙腈(15mL)溶液。在室温下将反应混合物搅拌2小时，然后浓缩。将残余物溶解于乙腈(15mL)中，加入DIPEA(15mmol)和90CE(10mmol)并冷却到20℃以下。混合物在室温下搅拌2小时。蒸发溶剂后，以水和二氯甲烷处理残余物。以1％的HCL溶液(35mL)冲洗有机相，通过无水MgSO₄干燥，且蒸发至干。以快速硅胶色谱(以40-50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱)纯化残余物，浓缩和高真空干燥得到相应的油状的受保护的磷酸酯。

1，2-二(甲磺酰基)-2-(2-氯乙基)肼-羧酸1-(3-二乙基膦羧基-4-硝基苯基)乙基酯(16)。根据一般方法B，由1-(3-二乙基膦羧基-4-硝基苯基)乙醇(114.3g，358mmol)得到16(151.2g，71％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ1.30-1.42(m，6H)，1.69和1.70(d，J＝6.6Hz，3H)，3.16和3.21(s，3H)，3.46和3.47(s，3H)，3.65-3.75(m，2H)，3.80-3.92(m，1H)，4.00-4.10(m，1H)，4.20-4.35(m，4H)，5.95和5.96(q，J＝6.6Hz，1H)，7.34和7.36(d，J＝8.2Hz，1H)，7.60和7.65(s，1H)，7.96和7.97(d，J＝8.5Hz，1H)。

³¹P NMR(121MHz，CDCl₃)δ-6.7。

实施例8

磷酸游离酸(phosphate free acid)的形成。

一般方法。以过量TMSBr(100mmol)处理各自的二乙基保护的磷酸(phosphate)(10mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液，于5℃过夜。蒸发及在真空中干燥，得到玻璃状固体的粗制磷酸游离酸。向粗制化合物(10mmol)中加入水(约30mL)。在环境温度下搅拌悬浮液2小时，然后加入最小量的水使其完全溶解。以10％乙腈的去离子水溶液的RPCC纯化水溶液。该部分以UV或³¹P NMR及其组合检测。冻干后，得到纯化的白色或米色的磷酸基游离酸粉末。

1，2-二(甲磺酰基)-2-(2-氯乙基)肼-羧酸1-(3-二氢膦羧基-4-硝基苯基)乙基酯(17)。根据一般方法，将1，2-二(甲磺酰基)-2-(2-氯乙基)肼-羧酸1-(3-二乙基膦羧基-4-硝基苯基)乙基酯(73.9g，124mmol)去保护，得到白色粉末17(52.8g，80％)。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ1.58和1.59(d，J＝6.1Hz，3H)，3.25和3.29(s，3H)，3.54和3.55(s，3H)，3.65-3.83(m，2H)，3.85-4.00(m，2H)，5.97和5.99(q，J＝6.1Hz，1H)，7.42(d，J＝8.2Hz，1H)，7.60和7.65(s，1H)，7.96和7.97(d，J＝8.4Hz，1H)。

³¹P NMR(121MHz，DMSO-d₆)δ-5.6。

实施例9

磷酸盐的形成

一般方法。KS119W(200mg)溶液和化学计量的碱溶解于水(2.0mL)中并在20℃搅拌1小时；将该溶液冻干20小时；然后将所得固体用NMR和HPLC分析。

KS119W的一钠盐(18)。将5％的NaHCO₃溶液(210mL)缓慢加入到搅拌的KS119W(66.1g，122.4mmol)的甲醇(70mL)和水(400mL)的溶液中，直到pH值为4.0-4.5。将反应混合物用二氯甲烷(2×500mL)冲洗后用***(200mL)冲洗去除分解的杂质。于30℃以下将水相部分浓缩。将残余物溶解于丙酮(200mL)并在用力搅拌下将其缓慢加入到冷的(10℃)***(2.0L)中。所得浆液在0℃下搅拌1小时，过滤，以***(200mL)冲洗，然后用己烷(200mL)冲洗，并干燥，得到浅黄色固体18(109.7g，86％)。

¹H NMR(300MHz，D₂O)δ1.37和1.38(d，J＝6.6Hz，3H)，2.91和3.00(s，3H)，3.24和3.25(s，3H)，3.30-3.50(m，2H)，3.55-3.75(m，2H)，5.69和5.70(q，J＝6.6Hz，1H)，7.06(d，J＝8.1Hz，1H)，7.24和7.25(s，1H)，7.65(d，J＝8.4Hz，1H)。

¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ22.5，41.2，41.3，41.8，41.9，42.5，42.6，52.9，53.1，77.1，77.2，118.6，118.8，120.0，120.2，124.9，141.5，145.8，145.9，147.7，147.8，151.4。

³¹P NMR(121MHz，DMSO-d₆)δ-4.09。

实施例10

水溶液中溶解度和稳定性的测定

通过在玻璃瓶中的2.0mL水中加入递增量药物，可视地测定KS119W(或VNP40541)的溶解度。室温下，该瓶在Glas Col旋转仪上振摇，直到药物完全溶解。将额外的定量的药物加入，并振摇该瓶，直到完全溶解。继续此过程，直到不再有药物溶解。得到KS119W(或VNP40541)的溶解度大于400mg/mL。KS119W(或VNP40541)的水溶液呈浅黄色。

通过加入过量药物到含有的2.0mL水的玻璃瓶中，相似地测定新合成的KS119W盐的溶解度。室温下，该瓶在Glas Col旋转仪上振摇24小时。将含有未溶解的药物的悬浮液离心，小心分离上清液，并以HPLC分析药物浓度。所测定的来自Mg(OH)₂、NaOH、KOH、BET和TRIS的KS119W盐的水中溶解度(mg/mL)分别为：51.2，67.2，71.0，58.7和70.5。

研究VNP40541的稳定性。将样品(20mg/mL)溶解于20mM的柠檬酸中，并滴定pH值到2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0。对于用于缓冲液的催化对照，在不存在柠檬酸下，也将药物滴定到pH值为2.0，5.0和6.0。于40℃将样品保存3小时、24小时和3天，并于常温保存24小时、3天。上面每个时间点完成后，将样品放置于-15℃的冷藏箱。每个制品(preparention)的对照样品也放置于冷藏箱中。通过HPLC重复分析每个样品，在不同的时间点，测定各个药物的浓度。如下表1中所示，结果清楚地表明在40℃24小时后观察到明显的降解。柠檬酸的存在没有明显地影响降解。

表1.pH值和柠檬酸盐缓冲液的存在对VNP40541的短期稳定性的影响。

HPLC测定结果相对于储存于-15℃的对照样品表示。

pH	柠檬酸	24小时室温		3小时40℃		24小时40℃
								最终pH值	测定	最终pH值	测定	最终pH值	测定
		2.02.03.04.05.05.06.06.07.0	20mM无20mM20mM20mM无20mM无20mM	2.002.043.074.085.035.126.176.097.07	99.3％99.4％99.3％100.1％99.4％99.7％98.6％100.0％99.7％	2.002.043.074.075.045.146.166.107.06	98.8％98.9％98.9％99.8％98.8％99.4％99.0％99.3％99.6％							2.022.063.064.095.065.106.106.016.96	92.3％91.7％91.3％92.2％92.2％92.5％93.8％93.8％94.0％

实施例11

需氧/低氧细胞存活研究

通过一块***13号(流入)针和18号(流出)针的橡胶板，用5％CO₂、不同浓度的氧气的混合物，以氮气调节所述混合物的平衡，以建立不同的低氧环境，将接种在稀释牛奶的玻璃瓶(glass milk dilution bottles)中的EMT6或CHO(转染的亲代或人细胞色素P-450还原酶)细胞通气2小时。然后注射药物而不破坏低氧。两小时后，收集细胞并置于产克隆试验以检测存活部分，与未处理的对照组比较。

对于体外分析，必须在上述图2所示AP-催化反应中，将KS119W转变为KS119OH(1)，因为磷酸化的母体药物不能通过细胞膜。下面在此部分所表明的体外研究中均使用KS119OH。

在反映正常空气(21％氧气)或含有0.1％氧气的严重低氧大气的充氧水平下，将EMT6鼠乳腺癌细胞暴露于KS119或KS119OH的分级浓度下。如图5所示，结果表明在充氧条件下两个药物实质上无活性，当药物浓度高达25μM时对EMT6细胞有非常小的细胞毒性。在0.1％氧气下，10μM药物浓度的两个药物都表现出接近5个数量级大小的细胞杀伤的有效的细胞毒性作用。

相似地，在氧气的分级浓度0.05％到21％范围，将EMT6细胞暴露于10或25μM的KS119和KS119-OH，以测定氧气浓度对药物活性的影响。结果如图6所示，在氧气浓度低于10％氧气下表现了明显的药物活性，在氧气浓度下实体瘤(阴影柱)中测到相当大的活性。

而且，将KS119W(VNP40541和VNP40551)的R和S对映异构体转化为相应的去磷酸化形式，以在体外需氧/低氧细胞实验中研究。关于效力和需氧/低氧二者的差别，结果表明R-KS119OH和S-KS119OH对EMT6细胞的体外细胞毒活性与母体消旋体药物非常相似。

如图1和2中所示，KS119OH(1)如KS119能在低氧条件下被单电子还原酶(如细胞色素P-450还原酶)还原，产生自发释放DNA烷化和细胞毒性物质90CE的羟胺或苯胺(2)的中间体。为表明KS119W(消旋体或两种对映异构体)可以在低氧下由细胞色素P-450还原酶活化，将转染的及过表达该还原酶的CHO细胞暴露于药物，且将该细胞株对这些药物的的敏感性与表达低的基础水平的酶的未转染的亲代株进行比较。如表2所示，结果表明仅在低氧下，对于所有3种药物，细胞色素P-450还原酶大概等同地敏化CHO细胞株。如KS119，细胞色素P-450还原酶可在低氧条件下活化KS119OH。

表2.细胞色素P-450还原酶的表达对R、S和消旋体KS119OH细胞毒性的影响

	0.1％氧气中的存活部分
				药物(10μM)	VNP40541	VNP40551	KS119W
CHO-SCS-II	0.04737	0.1188	0.3336
				CHO-450red	0.001368	0.002553	0.009444
					空气中的存活部分
药物(10μM)	VNP40541	VNP40551	KS119W
				CHO-SCS-II	1.086	1.148	1.185
CHO-450red	0.9277	1.015	0.8791

实施例13

体外抗肿瘤活性的评估

在实体和液体瘤模型中评估上述前药的抗肿瘤作用，该模型包括B16-F10鼠黑素瘤、HTB177人肺癌模型、DLD1人结肠癌、EMT-6鼠乳腺癌、L1210鼠白血病、淋巴瘤、***癌、胰腺癌和头颈癌。静脉、口服和腹膜内以10mg/kg到2000mg/kg的剂量给药前药；它们的给药有不同的给药方案，如每天4次、每天1次、或高达60剂量的每几天一次。将待测的肿瘤细胞皮下植入小鼠，肿瘤细胞植入后(第0天)立即将其随机分组。给小鼠腹膜内注射(ip)0.1mL的PBS或药物的快速注射剂。按照设计好的给药方案治疗。每周一次以公式L×H×W/2测量肿瘤的三维尺寸，其中L、H和W分别表示长、宽和高。如体重减轻和动物表现确定，在小鼠中的这些药物毒性为轻微的。

在鼠肿瘤模型和人异种移植物模型中研究KS119的有效性。将EMT-6鼠乳腺癌细胞(3×10⁵个细胞/小鼠)皮下植入到Balb/c小鼠中。将H460人肺癌细胞、HT29人结肠癌细胞和SHP77人肺癌细胞作为实体异种移植物分别植入nu/nu CD-1小鼠和Scid/Beige小鼠(7×10⁷个细胞/小鼠)。植入后，在肿瘤长到150到200mm³的尺寸以后，开始以KS119治疗。将KS119在含有聚乙二醇300(PEG)、乙醇、柠檬酸和抗坏血酸的溶剂中配制。

通过每天将剂量为80和100mg/kg的KS119腹膜内注射给药，如图7所示为代表性研究的结果。数据表明KS119产生边缘的而不是统计学意义的对所有所测的肿瘤模型的显著的抗肿瘤作用。KS119在所有所测肿瘤生长的抑制率为30到50％。与载体对照组相比，抑制率是有意义的(p＜0.05)。

将等摩尔剂量的KS119W和KS119的有效性在EMT-6肿瘤和H460肿瘤模型中对比。用0.25M碳酸氢钠溶液配制KS119W。当肿瘤达到150到200mm³时开始治疗，持续最多达2周。每天通过腹膜内注射给药小鼠剂量为80和100mg/kg的KS119和剂量为97.6和121.3mg/kg的KS119W。如H460肿瘤的实施例所示(图8)，KS119和KS119W都抑制小鼠肿瘤的生长。与等摩尔剂量的KS119相比，KS119W明显更有效且产生更好的抗肿瘤活性。在用KS119W治疗的121.6mg/kg×7剂量和97.2mg/kg×10剂量组中最终肿瘤体积与对照组比较分别减小78％和60％；然而，在用等摩尔剂量的KS119治疗的100mg/kg和80mg/kg剂量组减少仅40％。KS119和KS119W的毒性为剂量依赖性。为评估治疗的毒性，治疗后检测体重和外周血细胞数。用上述剂量的两种药物治疗的小鼠没有明显的血液毒性或严重的体重减轻。

为公平地从两种KS119W的对映异构体中为将来临床开发选出较好的化合物，得到VNP40541(R型)和VNP40551(S型)的最大耐受剂量(MTD)，且结果在表3中表明。

表3.比较两种对映异构体的MTD结果

小鼠	Nude CD-1	BAL B/c	Scid/Beige
				VNP40541	140mpk×10	100mpk×5	110mpk×8
VNP40551	80mpk×10	85mpk×5	85mpk×8

如表4所示，在小鼠三个样品肿瘤模型中评估VNP40541和VNP40551。因此，它们已经显示出十分相似的效力和治疗窗，然而VNP40541已经明显地表现出较低毒性，尤其是可观测的水肿较少。

表4.对映异构体的效力和治疗窗

	H460/Nude小鼠		EMT6/BLAB-c小鼠		SHP77/Scid-Beige
							剂量(mpk)	抑制率(％)	剂量(mpk)	抑制率(％)	剂量(mpk)	抑制率(％)
	VNP40541	80-140	52-80	85-115	58-69	110							83
VNP40551							40-80	53-80	55-85	52-78	85	82

通过使用剂量低于MTD的KS119W与非毒性剂量的CTX组合抗CD-1nude小鼠的EMT-6鼠乳腺癌和H460人肺癌，来评估KS119W与环磷酰胺(CTX)的组合治疗。允许肿瘤生长到大约200mm³的大小。在H460肿瘤模型中，动物接受4剂量的180mg/kg和1剂量的240mg/kg的KS119或接受每个动物每次剂量为100mg/kg的CTX，在肿瘤植入后的15、22、27、34和43天后腹膜内注射所述药物。在组合研究中，在给药KS119W两小时后给药CTX。如图9中所示，单独用KS119W导致78％的肿瘤生长抑制，而CTX仅有54％的抑制。KS119W和CTX组合治疗导致90％的肿瘤抑制。与所有对照组相比组合治疗的抑制为具有统计学意义的，p值分别为0.003、0.015和0.038。组合使用剂量的附加毒性是易控制的；单独用180mg/kg qw×4剂量的KS119W导致4.5％的最大净体重减轻，而使用相同剂量并组合使用每周100mg/kg的4剂量的CTX导致8.6％的体重减轻，但没有死亡。在EMT-6肿瘤模型中也观察到相似的肿瘤生长抑制的程度。以每天97mg/kg的7剂量的KS119W治疗导致59％的肿瘤抑制率，且CTX以100mg/kg的剂量，每周腹膜内注射一次4剂量对小鼠EMT-6肿瘤生长产生可以忽略的影响。当对动物用KS119和CTX组合治疗时，观测到明显的抗肿瘤作用。KS119W和CTX组合导致91.8％的EMT-6肿瘤生长抑制。这些结果表明药物KS119W与CTX组合具有额外的抗肿瘤作用。

本领域的技术人员可以理解，前面的说明和实施例为实施本发明的说明，但不仅限于此。可以进行在此详述的各种变化，而不背离以下权利要求限定的本发明的精神和范围。

Claims (52)

1.根据式I、II、III和IV的化合物：

其中R＝C_1-10烷基，或C_1-10卤代烷基(优选含有不超过5个卤素基团，优选为2-氯乙基)；

R′和R″独立地为C_1-10烷基，或C_5-20芳基或杂芳基(优选甲基)；

R₁为H、C_1-10烷基、C_1-10烷氧基、C_5-20芳基或杂芳基或C_5-20芳氧基或杂芳氧基(优选为甲基和乙基)；

X为O、NH或NR(优选为O)；

Y为(CH₂)_n、O(CH₂)_n、NH(CH₂)_n、NR(CH₂)_n、OCOO(CH₂)_n、NHCOO(CH₂)_n；

n为1、2、3、4或5(优选n＝2和3)；或Y为芳基或杂芳基(优选为对苯基)；

A为CH或N(优选为CH)；及

B为CH＝CH、O、S、NH或NR(优选为CH＝CH)；或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

2.根据结构(IA)的权利要求1的化合物：

结构IA

其中R为C_1-10烷基，或C_1-10卤代烷基；R₁为H、C_1-10烷基，C_1-10烷氧基；X为O、NH或NR；A为CH、CR或N；及B为CH＝CH、O、S、NH或NR；或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

3.根据权利要求1或2的化合物，其中R为-CH₃或-CH₂CH₂Cl。

4.根据权利要求1、2或3的化合物，其中R为-CH₂CH₂Cl。

5.根据权利要求1或2的化合物，其中R1选自H、C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基，其中烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基或取代的己基。

6.根据权利要求1-5中任一项的化合物，其中C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基为-CH₃或-OCH₃。

7.根据权利要求6的化合物，其中C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基为-CH₃。

8.根据权利要求1-6中任一项的化合物，其中X选自O、NH或NR。

9.根据权利要求8的化合物，其中X选自O。

10.根据权利要求1-10中任一项的化合物，其中A选自CH、CR或N。

11.根据权利要求10的化合物，其中A选自CH。

12.根据权利要求1-11中任一项的化合物，其中B选自CH＝CH、O、S、NH或NR。

13.根据权利要求12的化合物，其中B为CH＝CH。

14.根据权利要求1-13或52中任一项的化合物的对映异构体、立体异构体或互变异构体。

15.根据权利要求1或2的化合物，其中所述磷酸基团为游离酸或可药用盐或溶剂化物。

16.根据权利要求1-15或52中任一项的化合物的代谢产物。

17.药物组合物，包括用于治疗瘤形成的有效量的根据权利要求1或52的化合物，任选地与可药用的添加剂、载体或赋形剂组合。

18.药物组合物，包括治疗瘤形成的有效量的根据权利要求2的化合物，任选地与可药用的添加剂、载体或赋形剂组合。

19.根据权利要求17或18的组合物，其中R为-CH₃或-CH₂CH₂Cl。

20.根据权利要求17-19中任一项的组合物，其中R为-CH₂CH₂Cl。

21.根据权利要求17-20中任一项的组合物，其中R₁选自H、C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基，其中烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基或取代的己基。

22.根据权利要求21的组合物，其中C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基为-CH₃或-OCH₃。

23.根据权利要求22的组合物，其中C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基为-CH₃。

24.根据权利要求17-23中任一项的组合物，其中X选自O、NH或NR。

25.根据权利要求24的组合物，其中X为O。

26.根据权利要求17-26中任一项的组合物，其中A选自CH、CR或N。

27.根据权利要求26的组合物，其中A为CH。

28.根据权利要求17-27中任一项的组合物，其中B选自CH＝CH、O、S、NH或NR。

29.根据权利要求28的组合物，其中B为CH＝CH。

30.组合物，包括根据权利要求17-30或52中任一项的化合物的对映异构体、立体异构体或互变异构体。

31.根据权利要求17-30和52中任一项的组合物，其中所述磷酸基团为游离酸或其可药用盐或溶剂化物。

32.根据权利要求17-31和52中任一项的组合物，其中所述化合物为根据结构I化合物的代谢产物。

33.一种在需要治疗的患者中治疗癌症的方法，包括向所述患者给药有效量的根据权利要求1-16或52中任一项的化合物，任选地与可药用的添加剂、载体或赋形剂组合。

34.一种在需要治疗的患者中治疗癌症的方法，包括向所述患者给药有效量的根据权利要求2的化合物，任选地与可药用的添加剂、载体或赋形剂组合。

35.根据权利要求34的方法，其中R为-CH₃或-CH₂CH₂Cl。

36.根据权利要求35的方法，其中R为-CH₂CH₂Cl。

37.根据权利要求34的方法，其中R₁选自H、C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基，其中烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基或取代的己基。

38.根据权利要求37的方法，其中C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基为-CH₃或-OCH₃。

39.根据权利要求38的方法，其中C₁-C₁₀烷基或C₁-C₁₀烷氧基为-CH₃。

40.根据权利要求34的方法，其中X为O、NH或NR。

41.根据权利要求40的方法，其中X为O。

42.根据权利要求34的方法，其中A为CH、CR或N。

43.根据权利要求42的方法，其中A为CH。

44.根据权利要求34的方法，其中B为CH＝CH、O、S、NH或NR。

45.根据权利要求44的方法，其中B为CH＝CH。

46.根据权利要求34的方法，其中所述化合物包括权利要求1-16或52中任一项的化合物的对映异构体、立体异构体或互变异构体。

47.根据权利要求34的方法，其中所述磷酸基团为游离酸或其可药用盐或溶剂化物。

48.根据权利要求34的方法，其中所述化合物为根据结构I的化合物的代谢产物。

49.根据权利要求34的方法，其中所述化合物可单独给药或与其它抗癌剂组合给药或与光疗或放射治疗组合给药。

50.根据权利要求34的方法，其中所述癌症为胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子***、子宫体癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、脑癌/中枢神经***癌、头颈癌、咽喉癌、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、黑素瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病、尤因肉瘤、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、维尔姆斯瘤、成神经细胞瘤、毛细胞性白血病、或来源于口/咽、食道或喉的癌症。

51.根据权利要求1-16或52中任一项的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

52.根据结构I或II的化合物：

结构I    结构II

其中R为C_1-10烷基或C_1-10卤代烷基；

R′和R″为C_1-10烷基，或C_5-20芳基或杂芳基；

R₁为H；C_1-10烷基、C_1-10烷氧基；

X为O、NH或NR；

R(P)为含磷酸基的烷基，例如，R(P)为Y′OPO(OH)₂，其中Y为(CH₂)_n、O(CH₂)_n、NH(CH₂)_n、NP(CH₂)_n，n为1-5，Y为芳基或杂芳基；

Ar(N)为含硝基的芳基，例如，

Ar(N)＝

其中A为CH、CR或N；及B为CH＝CH、O、S、NH或NR；及Ar(NP)为含磷酸基且含硝基的芳基，例如，

Ar(NP)＝

其中A为CH、CR或N；及B为CH＝CH、O、S、NH或NR；及Y为(CH₂)_n、O(CH₂)_n、NH(CH₂)_n、NR(CH₂)_n、OCOO(CH₂)_n、NHCOO(CH₂)_n；n为1-5；或其可药用盐、溶剂化物、多晶型物或代谢产物。

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