CN101013128A - 包含纳米结构的分析或分离用装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体,其上活性纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元及其上固定的活性试剂,且所述结构单元在纳米结构活性区中的分布密度大于10个/μm2,和所述纳米结构单元由平均粒径1-500nm的纳米粒子形成,所述纳米粒子包括含有下述有机物的纳米粒子和它们的衍生物:苯乙烯、丙烯酸酯、聚乳酸。本发明还涉及包含上述纳米结构活性载体的试剂盒。本发明纳米结构活性载体和试剂盒具有高的反应效率。
Description
技术领域
本发明涉及用于分离或/和分析的高灵敏度纳米结构活性载体、特别是芯片、酶标板、平面层析试剂条、层析凝胶。本发明还涉及含本发明纳米结构活性载体的试剂盒及应用,特别是芯片试剂盒、酶标试剂盒、平面层析试剂盒及其应用。
背景技术
本发明是我们先前的发明PCT/CN2004/00437的继续。
在PCT/CN2004/00437中,发明目的是以较低的成本提高分析、分离中活性载体的反应效率,从而提高检测灵敏度或/和特异性、或/和降低检测时间、或/和提供更多种类的具有足够高灵敏度的固相载体。这一目的,通过纳米结构活性载体来实现。该发明的纳米结构活性载体具有确定的纳米结构特征(例如,纳米结构活性区及其中纳米结构单元分布及分布密度,纳米结构覆盖率等)及纳米性质特征(表面积提高率、吸附能力提高率、吸附量衰减速率比、灵敏度提高率、识别信号衰减速率比等)。该发明的具有确定的纳米结构特征及纳米性质特征的纳米结构活性构载体,不同于普通意义的“含活性试剂的纳米粒子包被载体”。
在PCT/CN2004/00437中,纳米粒子可以被用来制备该发明的纳米结构活性载体。在这儿,我们进一步给出以下纳米粒子制备的纳米结构活性载体:含有下述有机物的纳米粒子和它们的衍生物:苯乙烯、丙烯酸脂、聚乳酸。
发明内容
本发明的主要目的是以较低的成本提高分析、分离中活性载体的反应效率,从而提高反应灵敏度或/和特异性、或/和降低反应时间、或/和提供更多种类的具有足够高灵敏度的固相载体。本发明的目标通过本发明的纳米结构活性载体的开发来实现。
根据本发明的第一个方面,其提供一种用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体,其包含纳米结构活性区,所述纳米结构活性区包含常规固相载体及其上固定的活性纳米结构,所述活性纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元及其上固定的活性试剂,所述纳米结构单元包括凸出高度大于3nm、且凸出半高处至少一维尺寸在1-500nm之间的纳米凸体,且所述纳米凸体在所述纳米结构活性区中的分布密度大于10个/μm2,其中所述纳米结构单元由平均粒径1-500nm的纳米粒子形成,所述纳米粒子包括含有下述有机物的纳米粒子和它们的衍生物:苯乙烯、丙烯酸脂、聚乳酸。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述纳米结构活性区具有下述之一或多个特征:A).所述纳米凸体的分布密度大于100个/μm2;B).纳米结构覆盖率大于50%;C).表面积提高率大于400%;D).吸附能力提高率大于150%;E).灵敏度提高率大于300%;F).识别信号衰减速率比小于70%,或/和吸附量衰减速率比小于80%。
特别要强调的是,确定的纳米结构特征及纳米性质特征,使本发明中的纳米结构活性载体不同于一般意义上含有纳米粒子的活性载体。尽管某些文件中的活性载体是包括固相载体和固相载体上的纳米粒子的活性载体,而我们在大量的试验中惊奇地发现:不同特征(例如不同表面形貌特征)的活性载体,其活性(例如检测灵敏度)可以是非常不同的。本发明的纳米结构活性载体具有确定特征,才具有确定的高活性(例如检测灵敏度)。本发明的纳米结构活性载体具有确定的纳米结构特征(例如,纳米结构活性区及其中纳米结构单元分布及分布密度,纳米结构覆盖率等)及纳米性质特征(表面积提高率、吸附能力提高率、吸附量衰减速率比、灵敏度提高率、识别信号衰减速率比等)。本发明的纳米结构活性载体的纳米性质特征可能与述及的纳米结构有关,也可能与未述及的纳米结构有关。
在本发明的一个实施例中,我们将讨论研究它们的差别,例如形貌差别。在电子探针显微镜(DFM)和电子扫描显微镜帮助下,可以观察到表面一些凸起但凸出尺寸远大于纳米尺寸的凸体,很可能是纳米粒子的聚集体。而且,大尺寸的纳米粒子聚集体可能失去了、至少部分失去了部分纳米结构特性。总之,在没有严格的结构设计的条件下形成的含活性纳米粒子的活性载体是与本发明的纳米结构活性载体不相同的。只有拥有上述特征的活性载体,才是本发明的纳米结构活性载体。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述纳米粒子的平均粒径小于100nm、优选小于50nm、更优选小于30nm。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述常规固相载体包括由以下之一组或多组材料或其衍生物制成的尺寸大于1000nm的固相载体:玻璃、硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、聚合物材料及它们的复合物,所述衍生物包括结合有用以结合所述活性试剂的基团或/和包被有机物的衍生物。所述固相载体包括面状载体(例如生物芯片、酶标板等的片基)、粒状载体(例如层析凝胶、特别是微米粒子层析凝胶)和膜状载体(例如平面层析条)。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述衍生物含下述一种或多种基团: 氨基、醛基、环氧基、氨基肼、二乙氨基乙基、二乙基-(2-羟丙基)氨乙基、羧基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、烷基、氨基酸基、合成多肽基。这些基团具有结合所述活性试剂的性质。在本发明中,纳米粒子表面可以引入的基团的范围很大。例如氨基酸衍生物、聚氨基酸(例如聚耐氨酸)、聚氨基衍生物,也可利用本实施例的方法制作本发明的活化纳米粒子。在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,还可利用包被有机物来使纳米粒子具有结合所述活性试剂的基团。例如,包被有机物包括下述一种或多种有机物:包括聚乙烯吡咯烷酮、吐温类表面活性剂在内的表面活性剂,包括聚氨基酸在内的聚电解质,包括聚硅氧烷在内的亲油有机物,包括葡聚糖衍生物、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺在内的离子交换聚合物,和包括肝素钠、抗原、抗体在内的亲和物质。所述表面基团还可以是长臂衍生基团R-(CH2)x-,其中R是衍生基团,x等于或大于2、优选大于4、更优选大于6。本发明方法中的包被衍生物可以是一重或多重包被衍生物。例如,包被有分散剂或/和分散稳定剂的氧化硅粒子上(一重包被),还可以包被PVP(二重包被),继续还可以包被蛋白质A(三重包被)等等。因此,可以选择的包被有机物的范围是非常的大。所述表面基团或/和包被有机物可以固定在纳米粒子上或/和常规固相载体上。
根据本发明第一方面的纳米结构活性载体,其包括下述组之一:活性纳米粒子/片基复合物、活性纳米粒子/微米粒子复合物、活性纳米粒子/纳米结构片基复合物、活性纳米粒子/纳米结构微米粒子复合物、及它们的组合物。
根据本发明第一方面的纳米结构活性载体,其为下述组之一:纳米结构分析芯片、纳米结构酶标板、纳米结构平面层析试剂条、及包括纳米结构层析活性凝胶在内的纳米结构活性分离固定相。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述活性试剂包括核苷酸和/或寡核苷酸。在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述活性试剂包括多肽。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述分离或/和分析的目标物包括多肽或/和与多肽相互作用的药物。公知的可与目标多肽作用的活性试剂很多,例如离子交换剂、药物、多肽、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、抗原、以及病毒、细胞或它们的组成。在此类纳米结构活性载体中,所述活性纳米结构与所述固相载体之间可以不通过核苷酸配对结合,例如下述一种或多种方式结合:共价键结合、非特异性物理化学吸附、抗原-抗体吸附、及亲和吸附,而且所述结合是通过固相载体或/和纳米粒子表面的连接剂实现的,所述连接剂包括表面基团或/和包被有机物或/和所述活性试剂。在第20030207296号美国专利申请中,纳米粒子与片基之间的结合必须通过核酸的配对作用来进行,不适合处理核酸以外的物质例如多肽的检测和分离。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,所述分离或/和分析的目标物包括核酸或/和与核酸相互作用的药物。
在根据本发明第一方面的纳米结构活性载体中,一种或多种纳米粒子与固相载体之间有一重或多重活性试剂、或/和一种或多种活性试剂与固相载体之间有一重或多重纳米粒子、或/和所述至少一重纳米粒子与另一重纳米粒子之间有一重或多重活性试剂。一种或多种纳米粒子与载体之间有多重活性试剂的纳米结构活性载体例如是如下制备的:分别将载体包被一重活性试剂1形成活性试剂1包被载体,并将纳米粒子包被一重另一种活性试剂2(活性试剂1和2之间可发生配对反应)形成活性试剂2/纳米粒子复合物,再将活性试剂2/纳米粒子复合物包被或点样至活性试剂1包被载体上,形成活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-载体形式的复合物。当活性试剂层数大于2时以此类推。一重纳米粒子与另一层纳米粒子之间有多重活性试剂的纳米结构活性载体有很多种类,例如活性试剂3-纳米粒子-活性试剂3-活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-载体或活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1-载体等。一种或多种活性试剂与载体之间有多重纳米粒子的纳米结构活性载体可如下制备:先将一种或一种以上所述纳米粒子与多种所述活性试剂结合在一起形成多种活性纳米粒子(例如活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2、活性试剂3-纳米粒子-活性试剂2、活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1等),再将这些活性纳米粒子先后或同时结合在所述载体上,形成诸如活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1-载体、活性试剂3-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1-载体等形式的纳米结构活性载体。
根据本发明的第二个方面,其提供一种包含上述本发明第一方面的用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体的试剂盒。
根据本发明第二方面的试剂盒,其还包含一种定量或/和定性分析标记***,所述标记***包括至少一种纳米标记物,所述纳米标记物包含标记活性试剂、标记物质和纳米粒子。例如,所述纳米标记物为标记活性试剂/纳米粒子/分子标记物质复合物、或/和标记活性试剂/含标记物质纳米粒子复合物。本发明配基/纳米粒子/分子标记物质复合物为混合物或纯化物,纯化物含有一种或多种分子标记物质、一种或多种纳米粒子、一种或多种标记活性试剂以及任选的封闭剂。本发明标记物可标记的目标物较广泛,例如:肽及与多肽相互作用的药物、等等。本发明标记物也可标记核酸及与核酸相互作用的药物。本发明中的标记活性试剂为用于与目标物结合从而实现对目标物标记的试剂,例如抗原、抗体、单链或多链DNA、RNA、核苷酸、以及病毒、细胞或它们的组成等。在上述标记***中,活性试剂/纳米结构/分子标记物质复合物的制备方法较多,例如:将所述一种或多种配基、一种或多种纳米粒子、以及一种或多种所述分子标记物质按下列之一种方式结合:将所述配基与所述纳米粒子结合再与所述分子标记物质结合、将所述纳米粒子与所述分子标记物质结合再与所述配基结合、将所述配基与所述分子标记物质结合再与所述纳米粒子结合、将所述配基与所述分子标记物质和所述纳米粒子同时结合、及基于这些方式的组合。本发明的复合物的制备方法简单、制备物水溶性好且灵敏度高。
在根据本发明第二方面的试剂盒中,所述纳米粒子为上述纳米粒子。
在根据本发明第二方面的试剂盒中,所述所述标记物质包括下述一种或多种物质:荧光物质、化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料。例如,下述物质之一种或多种:荧光素、罗丹明、海藻蛋白、银盐、酶、碱性黑、碱性紫、胺基黑、考马斯亮蓝、结晶紫、等等。
根据第二方面的试剂盒,包括用于多肽或/和与多肽相关的药物分离或/和分析的试剂盒,包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒。根据第二方面的试剂盒,包括用于核酸或/和与核酸相关的药物分离或/和分析的试剂盒。
根据本发明的第三方面,其提供一种分离或/和分析方法,其中包括使用根据本发明第二方面的分析或/和分离试剂盒来捕捉或/和分离样品目标物。根据本发明的第三方面的方法,例如至少包括:(a)准备样品、反应器及标记***,所述样品可能含有目标物,所述反应器包含固定有活性试剂的上述纳米结构活性载体,所述标记***包含标记物,且所述标记物为常规标记物或/和上述纳米标记物;(b)用所述反应器固定所述目标物,然后通过所述标记物对所捕获的目标物进行标记;或(c)使所述目标物结合在所述全部或部分标记物上,然后通过所述目标物与所述固定化活性试剂反应固定在反应器上;(d)对步骤(b)或(c)中的结果进行检测、分析。
本发明的用于分离或/和分析的纳米结构活性载体的优点是:灵敏度高、制作简便成本低(例如可明显降低活性试剂用量)、反应效率高、反应速度高。
本发明的试剂盒的优点是:制作简便、分离或/和分析速度快、灵敏度高。在含纳米结构活性载体和配基/纳米粒子/分子标记物质复合物时,本发明的试剂盒的优点是:集中了纳米结构活性载体和配基/纳米粒子/分子标记物质复合物的优点、灵敏度很高、检测速度很高、制作简便。
本发明的分离或/和分析方法的优点是:成本低、灵敏度高、速度快。在含纳米结构活性载体和配基/纳米粒子/分子标记物质复合物时,本发明的方法的优点是:大大提高了灵敏度或/和大大提高了速度。
具体实施方式
术语定义
本发明术语“试剂盒”是指包含有活性载体的用品,例如装置、组成、耗材、等等。试剂盒包括分析试剂盒和分离试剂盒。分析试剂盒是指定量或/和定性分析过程中所用的包含有活性载体的用品,例如仪器、耗材、装置、等等。分析试剂盒例子有分析芯片、酶标板、亲和电泳条、亲和层析柱、平面层析试剂条、分析芯片试剂盒、酶标板试剂盒、亲和电泳试剂盒、传感器、等等。定量或/和定性分析过程可以在体外进行、也可以在体内进行。分离试剂盒是指分离过程中所用的包含有活性载体的用品,例如仪器、耗材、装置(例如层析装置)、等等。分离过程是通过分离方法获得样品的全部或部分组分的过程。
本发明中,术语“活性区”是指固定有所述活性试剂的区域,活性区可以包含整个固相载体也可以只包含固相载体的一个或互相独立的多个区域(例如微阵列芯片);术语“非活性区”是指活性区以外的区域;术语“纳米结构活性区”是指活性区中除含有所述活性试剂、还含有具有本发明的确定特征(例如纳米结构单元分布及分布密度等)的纳米结构的区域,其包括所述纳米结构、固定在纳米结构上的活性试剂及任选存在的未固定有所述纳米结构的常规固相载体表面,纳米结构活性区可以包含整个固相载体也可以只包含固相载体的一个或互相独立的多个区域(例如纳米结构芯片);术语“非纳米结构活性区”是指活性区中纳米结构活性区以外的区域,非纳米结构区可以含有纳米结构但其不具有纳米结构活性区的特征。
本发明中,术语“纳米结构活性区的纳米结构覆盖率”是指覆盖有所述纳米结构的常规固相载体的表面积在纳米结构活性区包含的常规固相载体的总表面积中的比率:纳米结构覆盖率=纳米结构覆盖的常规固相载体表面积/常规固相载体总表面积。本发明中,术语“纳米结构活性区表面积提高率”是指纳米结构活性区与其所含的所述常规固相载体的比表面积之比:表面积提高率=(纳米结构活性区比表面积/其所含常规固相载体的比表面积)×100%。表面积提高率可以直接测定也可以间接测定。本发明中,术语“纳米结构活性区的灵敏度提高率”是指纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体的分析灵敏度之比:灵敏度提高率=(纳米结构活性区灵敏度/非纳米结构活性载体灵敏度)×100%;术语“纳米结构活性区的吸附能力提高率”是指纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体的吸附能力之比:吸附能力提高率=(纳米结构活性区吸附能力/非纳米结构活性载体吸附能力)×100%;术语“非纳米结构活性载体”是指不含本发明的纳米结构活性区的活性载体,例如HCV抗原点样至还氧基玻片形成的芯片(纳米结构活性载体的例子有本发明的HCV抗原包被氧化硅纳米粒子悬浮液点样至还氧基玻片形成的芯片)。吸附能力中被吸附物的选择,取决于所固定的所述活性试剂。本发明中,术语“纳米结构活性区的识别信号衰减速率比”是指纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体在分析时的识别信号随目标物低浓度下降而衰减的速度比较:识别信号衰减速率比=(纳米结构区识别信号随目标物低浓度下降而衰减的速度/非纳米结构活性载体识别信号随目标物低浓度下降而衰减的速度)×100%;术语“纳米结构活性区的吸附量衰减速率比”是指纳米结构区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度比较:吸附量衰减速率比=(纳米结构活性区吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度/非纳米结构活性载体吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度)×100%。
本发明术语“活性试剂”是指用以赋于所述纳米结构活性载体以反应活性(例如与目标物反应的活性)的试剂,包括配基(相当于英语中的Ligand)和离子交换剂。配基例如:离子交换剂、药物、多肽、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、抗原、以及病毒、细胞或它们的组成。本发明术语“标记活性试剂”是指包含于标记物中、通过其与目标物相互作用(包括亲和作用、离子交换、亲油作用、等等)实现对目标物标记的物质,包括配基(相当于英语中的Ligand),例如:抗原、抗体、配体、配体指数增强***进化技术筛选的适配分子、配基、多肽、多糖、共酶、辅因子、抗生素、类固醇、病毒、细胞等。本发明术语“多肽”相当于英语中的“polypeptide”,包括天然或合成蛋白质、蛋白质片断、合成肽、等等,免疫检测中通常的目标物和检测中通用的配基、例如抗原、抗体、等等都属于多肽。
本发明术语“固相载体”,是指可作为本发明的活性纳米结构的载体的固相物质。所述固相载体包括面状载体(例如生物芯片、酶标板等的片基)、粒状载体(例如层析凝胶、特别是微米粒子层析凝胶)和膜状载体(例如平面层析条)。本发明中,固相载体包括常规载体和纳米结构载体,其中所述常规载体为表面未固定有纳米结构的固相载体,所述纳米结构载体为表面固定有纳米结构的固相载体。本发明术语“片基”是指其具有固定功能的一面具有宏观平面的固相载体,例如:分析芯片片基、酶标板片基、电泳胶片、平面层析载体等。
本发明术语“纳米粒子”是指在三维空间中至少有一维小于500nm、优选小于100nm、更优选小于50nm的固相载体粒子。术语“活性纳米粒子”,或活性试剂/纳米粒子复合物,是指活性试剂与纳米粒子通过共价或/和非共价结合形成的复合物。术语“活性纳米粒子/片基复合物”,或“活性试剂/纳米粒子/片基复合物”是指包含有活性试剂、纳米粒子、片基的一种复合组成,其中活性试剂、纳米粒子、片基间的结合可以有不同的形式,例如:活性试剂-纳米粒子-片基、活性试剂-纳米粒子-活性试剂-片基、活性试剂-纳米粒子-活性试剂-纳米粒子-片基、活性试剂-纳米粒子-活性试剂-纳米粒子-活性试剂-片基等。本发明术语“基片”是指以片基为基础的、结合有无其它结构(例如隔离结构)的用以在固定活性试剂后形成芯片的产品。基片上可以有一个或多个片基池。单片基池基片上通常没有隔离结构,此时基片既是片基(例如市售的氨基玻片)。多片基池基片上有隔离结构,此时基片包括片基和隔离结构。片基池在固定上活性试剂后形成反应器,多片基池片基形成多反应器芯片。片基是用以固定活性试剂及其它助剂(假如有的话)的片基,其表面化学性质和光学性质是影响芯片性能及成本的重要因素。
本发明术语“反应器”是指其中固定有活性载体与目标分子发生特异性反应的场所及与其连通的其它相关结构,例如开放式多反应器生物芯片中的反应池和相关的隔离结构和进出液结构等、96孔酶标板中的孔、快速检测试剂盒的试剂条等。
本发明术语“分析芯片”简称为“芯片”,包括但不限于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray,是指定性和/或定量分析中的一种检测装置,其反应器中微量活性试剂同样品中的目标分子发生特异反应的结果可以以可寻址的方式进行识别。芯片的核心是其中的反应器,反应器的核心是其中的芯片片基和固定在芯片片基上的活性试剂。芯片包括微流路芯片(相当于英语中的MicrochannelBiochip)和微阵列芯片(相当于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray),但众所周知不包括现有的快检试剂条。本发明的芯片含有单反应器或多反应器且有无标记***,反应器中活性试剂在片基上的分布密度大于10点/cm2、优选方案大于20点/cm2,且每个活性试剂点的面积不大于1mm2。生物芯片由于其高通量和微型化特点,有着广泛的应用范围,包括基因表达检测、基因筛选、药物筛选、疾病诊断治疗、环境监测和治理、司法鉴定等领域。灵敏度和特异性是生物芯片检测的二个主要质量指标,而载体、特别是活性载体是决定灵敏度和特异性的关键之一。术语“纳米结构芯片”为至少含有一个本发明所述纳米结构活性区(例如探针微阵列中的一个样点)。一个芯片可以有多个反应器,一个反应器可以有多个含活性试剂的样点(探针点),只要其中有一个样点为本发明的纳米结构活性区,则芯片为本发明的纳米结构活性载体或纳米结构芯片。
本发明术语“层析”相当于英语“Chromatography”,包括亲和层析、反相层析、疏水层析、离子交换层析、等等,其分为平面层析(例如快检试剂条和快检试剂盒)和柱层析等。
本发明术语“分子标记物质”是指用以形成或参与形成检出信号、并在标记时具有分子形态的物质,例如芯片检测常用标记物中的罗丹明、CY3、CY5等。
在本发明中,术语“纳米凸体”是指至少一维具有尺寸1-1000nm的仅有一个顶部的凸体,例如一个固定于固相载体、或其它结构上的纳米粒子;术语“纳米结构单元”是指至少一维具有尺寸1-1000nm的结构单元,例如一个纳米粒子;术语“纳米结构”是指由纳米结构单元为结构单元构成的高度小于1000nm的结构,例如由纳米结构单元或纳米凸体形成的树枝状、深丘状、网状、或其它几何形貌,及其间纳米结构单元或纳米凸体的相互关系(例如所述树枝状可以有向上的或平行于表面的走向等;在附图1中,可以看到这些纳米凸体或含纳米凸体的树状体);术语“纳米结构区”是指纳米结构载体上具有本发明的确定特征(例如纳米结构单元分布及分布密度等)的区域,其包括所述纳米结构及任选存在的未固定有所述纳米结构的常规固相载体表面;术语“非纳米结构区”是指纳米结构载体上纳米结构区以外的区域,非纳米结构区可以含有纳米结构但其不具有纳米结构区特征;术语“凸出距离”是指上述凸体沿其顶部至其底部的距离;术语“凸出半距处横断面”是指上述凸体在其凸出距离一半处垂直于这一距离的面。本发明纳米结构载体包括纳米结构区和任选存在的非纳米结构区。所述分离或/和分析的目标物包括下述一组或多组物质:多肽、与多肽相互作用的药物、核酸、与核酸相互作用的药物。
以下将通过实施例更为详细地说明本发明。
实施例
以下实施例中,所用纳米粒子为含下述有机物的纳米粒子和它们的衍生物:苯乙烯、丙烯酸脂、聚乳酸。所用含聚苯乙烯的纳米粒子分别为氨基化聚苯乙烯纳米粒子(粒径约25nm,产品号K2 005,Merck KGAA Estapor)和羧基化苯乙烯/丙烯酸脂纳米粒子(粒径50-75nm,产品号A1 005,Merck KGAA Estapor);含丙烯酸脂的纳米粒子为羧基化苯乙烯/丙烯酸脂纳米粒子(粒径50-75nm,产品号A1 005,Merck KGAA Estapor);含聚乳酸的纳米粒子为氨基化聚乳酸纳米粒子(粒径250nm,目录号860311-10,Corpuscular Inc.).以下实施例中的制备方法,除了适于上述有机纳米粒子外,也适于含上述有机物的有机-无机复合纳米粒子。
实施例1:纳米粒子衍生物的制备方法
本实施例中,含氨基的有机纳米粒子上引入氨基酸基。按照已知的肽合成方法,氨基酸基也可加到含羧基、羰基、等有机基团的纳米粒子上。本实施例的制备方法,还可用于制备结合下述一种或多种基团的纳米粒子衍生物:醛基、环氧基、氨基肼、羧基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、合成多肽基、等等。本实施例所用氨基酸基列于表1。
表1
活化剂 | 活化基团 | 活化基团分子量 | 保护基团 | 提供者 |
氨基肼 | 氨基肼基 | 30 | Fmoc | 成都凯泰新技术有限责任公司 |
精氨酸 | 精氨酸基 | 157.2 | Fmoc,PBF | 成都泰格化工研究所 |
天冬酰氨 | 天冬酰氨基 | 115.1 | Fmoc | 成都泰格化工研究所 |
甘氨酸 | 甘氨酸基 | 58.1 | Fmoc | 成都泰格化工研究所 |
耐氨酸 | 耐氨酸基 | 129 | Fmoc | 成都泰格化工研究所 |
谷氨酰氨 | 谷氨酰氨基 | 129 | Fmoc | 成都泰格化工研究所 |
将含氨基的纳米粒子悬浮液与氨基酸溶液(例如以DMF为溶剂)混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度,反应介质,反应温度,反应时间,等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。此一键合反应也是能否获得本发明纳米粒子衍生物、从而获得本发明纳米结构活性载体的关键步骤之一。
制作方法可参考我们先前的发明(申请号PCT/CN2006/002659)。反应完成后,对悬浮液进行多次离心(2-8℃,20000g)以去除未固定在纳米粒子上的反应物和反应介质,然后获得纳米粒子的悬浮液。若活化剂含保护基团(例如Fmoc),还要脱去这些保护基团。脱保护方法选自己知的肽合成中的脱保护方法。
实施例2:活性纳米粒子的制备方法
以下实施例中,府用的活性试剂如下表2所示。本发明的制备方法,也适于其它活性试剂,例如:药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。
表2
活性试剂 | 来源 |
EBV-VCA-P18抗原(EBV Ag) | 自制* |
丙肝病毒抗原(HCV Ag) | 北京大学人民医院肝病研究所 |
爱滋病毒抗原(HIV Ag) | 北京大学人民医院肝病研究所 |
梅毒抗原 | 北京大学人民医院肝病研究所 |
抗乙肝病毒表面抗体(HBs Ab) | 北京大学人民医院肝病研究所 |
蛋白质A | 上海生物制品研究所 |
羊抗人二抗 | 北京生物制品研究所 |
●制作方法参考:Tranchand-Bunel,D.,Auriault,C.,Diesis,E.,Gras-Masse,H.(1998)Detection of human antibodiesusing“convergent”combinatorial peptide libraries or“mixotopes”designed form a nonvariable antigen:Application to the EBV viral capsid antigen p18,J.PeptideRes.52,1998,495-508。
本实施例所制备的活性纳米粒子,所用纳米粒子选自含上述有机物的纳米粒子和实施例1制备的它们的衍生物,所用活性试剂选自于表2。
本实施例活性纳米粒子制备方法包括以下步骤:将纳米粒子在超声振荡下分散配制成浓度1/50-1/25000(w/v)的纳米粒子液,再将浓度为0.1-2mg/ml的活性试剂溶液分别与其作1∶1混合,在室温下反应1小时。如需纯化,在20000rpm/min条件下离心。本实施例所获活性纳米粒子,包括含NH2-基团的聚苯乙烯纳米粒子,和实施例1制备的纳米粒子衍生物上分别固定表2中的各种活性试剂形成的活性纳米粒子,例如:EBV Ag/NH2-聚苯乙烯纳米粒子、HCVAG/NH2-聚苯乙烯纳米粒子、HIV Ag/NH2-聚苯乙烯纳米粒子、HBsAb/NH2-聚苯乙烯纳米粒子、二抗/NH2-聚苯乙烯纳米粒子、EBV Ag/氨基酸基-聚苯乙烯纳米粒子、HCV Ag/氨基酸基-聚苯乙烯纳米粒子、HIV Ag/氨基酸基-聚苯乙烯纳米粒子、HBs Ab/氨基酸基-聚苯乙烯纳米粒子、二抗/氨基酸基-聚苯乙烯纳米粒子、等等。
活性纳米粒子中活性试剂固定量的测定,通过离心分离制备过程中的活性纳米粒子/活性试剂混合物,从上清液中测定未固定的活性试剂剩余量来计算。本实施例所制备的活性纳米粒子,每mg纳米粒子上活性试剂固定量在1mg以上。
实施例3:纳米结构活性载体的制备
在以下实施例中所用的固相载体如下表3所示。其中,定向排列的纳米线基片购自美国Immuna公司(线径80nm,线长400nm-3μm,纳米线在载体上的平均分布密度约50-100纳米线/μm2)。本发明同样适于由以下材料或其衍生物制成的芯片片基:硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物。
表3
片基 | 表面聚合物 | 衍生基团 | 来源 |
1、芯片片基: |
载玻片 | - | - | 美国TeleChem International,Inc公司 |
氨基玻片 | - | 氨基 | 美国TeleChem International,Inc公司 |
醛基玻片 | - | 醛基 | 美国Te leChem International,Inc公司 |
环氧基玻片 | - | 环氧基 | 美国TeleChem International,Inc公司 |
氨基肼玻片 | - | 氨基肼 | 自制* |
有机硅包被玻片 | 有机硅 | - | 自制** |
氨基酸基玻片 | - | 氨基酸基 | 自制** |
2、纳米结构片基 | |||
纳米线基片 | 有机硅 | - | 自制** |
纳米粒子包被片 | - | 氨基 | 自制*** |
3、酶标板片基 | |||
96孔聚苯乙烯板 | 深圳金灿华实业有限公司 | ||
4、平面层析试剂条 | |||
硝基纤维膜条 | 福建泉州长立生化有限公司 | ||
尼龙纤维膜条 | 福建泉州长立生化有限公司 | ||
5、微米颗粒 | |||
硅胶(粒径40-60μm) | 中国科学院化学研究所 | ||
Sephadex A50 | Pharmacia公司 |
*:制作方法参考Melnyk O等,Peptide arrays for highly sensitiveand special antibody-binding fluorescence arrays,BioconjugChem.13:713-20.2002。
**:制作方法可参考我们先前的发明(申请号PCT/CN2006/002659)
***:制作方法参考我们先前的发明(申请号PCT/CN2004/00437)
本实施例中,所用活性试剂见表2,所用固相载体见表3,所用活性纳米粒子为实施例2中制备的活性纳米粒子(优选活性试剂固定量大于2mg活性试剂/mg纳米粒子的活性纳米粒子)。本实施例中,分析芯片、ELISA多孔板、快检试剂条的制备方法,分别参考用相应经典方法的制备,只是使用高度分散的活性纳米粒子悬浮液(体积浓度1/100至1/50000)为加样液。例如:
1)纳米结构分析芯片的制备和鉴定
本实施例中制备生物芯片的方法包括使活性纳米粒子与芯片片基反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度,反应介质,反应温度,反应时间,等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。
(1).点样
将活性试剂/活化纳米粒子混合物制成悬浮液,其中:纳米粒子浓度在1%至万分之一之间选择(优选五百分之一至万分之一),所含活性试剂的浓度在0.1-2.0mg/ml之间选择(优选0.1-0.3mg/ml)。再按常规的点样方法将悬浮液加至芯片片基,形成探针点。每种活性试剂/活化纳米粒子混合物点2个点。在一些情况下,除上述探针点外,还将活性试剂溶液(活性试剂浓度在0.5-2.0mg/ml之间选择)按常规的点样方法加至芯片片基,形成非纳米结构探针点。每种活性试剂/活化纳米粒子混合物和活性试剂点2个点。所有探针点在芯片片基上形成M×N探针阵列。其中M大于1,N大于1。所用点样仪为DY-2003生物芯片点样仪(中国科学院电工研究所制备)。
(2).孵化
点样后,在一定温度(4-37℃内选择)下和一定时间(1-24小时)内进行片基上的固定化反应。
(3).钝化
孵化后,使芯片在一定温度(4-37℃内选择)下和一定时间(1-15小时)内与一定浓度(1-30mg/ml)的钝化剂(小牛血清或牛奶或其它已知钝化剂)反应,以减小芯片上的非特异吸附活性。
固定在固相载体上的活性纳米粒子,还可以通过热处理增加其固定稳定性。例如,将上述制备的芯片用小牛血清白蛋白封闭后不清洗掉蛋白质,干燥后在50℃加温10小时然后冷却,至少可增加部分芯片上纳米结构的稳定性。公知的活性试剂的加热保护剂很多,例如除白蛋白外还有糖类(葡聚糖、麦芽糖、等等)。加热条件除考虑到加强纳米结构的稳定性,还考虑到在保护剂存在下活性试剂的稳定性。纳米结构稳定性的提高表现为,经热处理法处理(例如37℃15小时以上、60℃10小时以上,或150℃1小时以上)的部分芯片(例如表7中的芯片19和20)与未经热处理法处理的相应芯片相比,两者在超声清洗2小时后的灵敏度,前者比后者为高。此方法可获得众多稳定性高的纳米结构芯片。
本实施例制备的纳米结构芯片,其中固定的活性试剂,除多肽外也可是其它生物物质,例如单链或多链DNA、RNA、以及病毒。
(4).鉴定
以下实施中,纳米结构单元及其分布,纳米凸体及其高度、半高处的最小尺寸及其分布密度的测定,利用SPA-300HV型扫描探针显微镜(DFM)和电子扫描显微镜进行。DFM检测在成都电子科技大学分析测试中心进行,扫描电子显微镜检测在四川大学分析测试中心进行,比表面积的检测在中国科学院有机化学研究所分析试验室进行,芯片片基吸附量利用公知的芯片检测方法通过建立标准曲线进行。尽管利用不同的检测仪器和计算方法可能会有数据差别,但原则上一些数据明显大于另一些数据的时候,这些数据的比值还是有意义的。本实施例制备的纳米结构载体中,纳米结构单元均为非定向排列。
本实施例制备的纳米结构活性载体中,纳米结构单元均为非定向排列。本实施例在优化条件下制备的纳米结构活性载体:1).高度大于3nm、且凸出半高处至少一维尺寸在1-500nm的纳米凸体的分布密度大于10个/μm2、甚至大于50个/μm2;2).活性区中纳米结构覆盖率均大于30%、甚至大于70%乃至80%;3).表面积提高率均大于200%、甚至大于400%、个别大于650%;4).吸附能力提高率均大于115%、甚至大于130%、个别大于180%;5).灵敏度提高率均大于120%、甚至大于150%、个别大于600%;6).识别信号衰减速率比均小于90%、甚至小于70%、个别小于50%;7).吸附量衰减速率比均小于90%、甚至小于80%、个别小于70%。
2)纳米结构ELISA微孔板的制备和鉴定
本实施例中制备生物芯片的方法包括使活性纳米粒子与酶标微孔板孔底反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度,反应介质,反应温度,反应时间,等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。例如,将活性试剂浓度为0.01-0.1μg/ml的上述活性纳米粒子悬浮液,按公知的酶标板包被方法与微孔板孔底接触,将活性纳米粒子包被到表3中的96孔板微孔内,包被后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。本实施例中所用活性纳米粒子为实施例2制备的活性纳米粒子。
纳米结构ELISA微孔板的鉴定参考上述1)纳米结构分析芯片的鉴定(4),结果亦类似。
3).纳米结构快检试剂条的制备
本实施例中制备纳米结构快检试剂条的方法包括使活性纳米粒子与膜条反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度,反应介质,反应温度,反应时间,等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。例如,将活性试剂浓度为0.1-1.0mg/ml的上述活性纳米粒子悬浮液,按公知的快检试剂条的包被方法进行点样(检测线),再按常规方法分别点上兔抗羊IgG质控线后用牛血清白蛋白溶液封闭,再组装上加样区、胶体金标记羊抗人标记物区、吸水区组合而成。本实施例中所用活性纳米粒子为实施例2制备的活性纳米粒子,所用膜条选自表3。
4).活性纳米粒子/微米粒子复合物的制备
本实施例的活性纳米粒子/微米粒子复合物可应用于制备分析芯片或层析凝胶。本实施例所用微米粒子为表3中的微米粒子,包括常规层析凝胶:硅胶(粒径40-60μm,中国科学院化学研究所)、Sephadex(Pharmacia)。本实施例中所用活性纳米粒子为实施例2制备的活性纳米粒子。本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的微米粒子:陶瓷、金属氧化物、金属、磁性微米粒子、其它聚合物材料微米粒子(例如聚苯乙烯类、聚酰胺类、聚多糖类)、它们的复合物微米粒子,及纳米粒子包被微米粒子。
本实施例活性纳米粒子/微米粒子复合物的制备,通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度,反应介质,反应温度,反应时间,等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。例如,将微米粒子放入活性纳米粒子悬浮液(纳米粒子体积百分比1/10000-1/50000)中浸泡24小时以上,然后洗涤烘干。
鉴定方法可参考上述鉴定方法。例如,本实施例中活性纳米粒子,在优化条件下分别包被硅胶和Sephadex A 50制得的活性纳米粒子/微米粒子复合物,它们的表面积提高率大于350%;吸附能力提高率大于130%;吸附量衰减速率比均小于80%。
本实施例制备的活性纳米粒子/微米粒子复合物,可用作层析胶,也可用作其它反应介质,例如光学编码的活性纳米粒子/微米粒子复合物。其中,不同编码的复合物具有不同的光学性质(例如不同的发射光波长、不同的发射光强、等等),还可以具有其它性质,例如磁性。这种复合物可被应用于多目标物液相检测技术,例如所谓的液相芯片技术。
本实施例所制备的活性纳米粒子/固相载体复合物,可以为多活性试剂纳米结构载体,即一个纳米结构活性区内含二种或二种活性试剂的纳米结构活性载体,包括:活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1-片基,和活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-片基。其中活性试剂1可以与活性试剂2进行配对反应且活性试剂1比活性试剂2更易与片基结合。本实施例中一种活性试剂(活性试剂2,例如HBsAb)既作为试剂使用又作为连接剂使用,另一种活性试剂仅作为连接剂使用(活性试剂1,例如HBsAg)。
本实施例中,活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1-片基的制备方法为:将纳米粒子浓度为1/25000(W/V)的活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2和活性试剂1-纳米粒子-活性试剂1悬浮液作1∶1混合后,按通常的点样方法点样至片基上。每种活性纳米粒子点2个点,形成3×2阵列,然后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。所得芯片记作芯片223。点样时HBsAb浓度为3mg/ml。
本实施例中,活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2-活性试剂1-片基复合物的制备方法为:将纳米粒子浓度为1/12500(W/V)的活性试剂2-纳米粒子-活性试剂2和活性试剂1作1∶1混合后,按通常的点样方法点样至片基上。每种活性纳米粒子点2个点,形成3×2阵列,然后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。点样时HBsAb浓度为3mg/ml。
实施例4:纳米粒子标记物的制备
本实施例所制备的标记活性试剂/纳米粒子/分子标记物质复合物为用于芯片的纳米粒子标记物。
本实施例所用标记活性试剂包括多肽,例如HCV抗原及羊抗人二抗(北京天坛生物制品股份有限公司)。本实施例的方法也适于其它标记活性试剂,例如:药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。
本实施例所用纳米粒子分别为上述有机纳米粒子和实施例1制备的纳米粒子衍生物,所用分子标记物质为罗丹明(Molecularprobes公司)。本实施例的方法也适于其它标记物质,例如荧光物质、化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料。
本实施例对照标记物为未用含纳米粒子液体处理的常规标记物(例如,罗丹明标记羊抗人二抗,美国Jackson ImmunoRresearchLaboratories公司)。
1)准备
本实施例配基-分子标记物质复合物制备方法为公知的罗丹明标记抗抗体的制备方法。
本实施例中所用的活性纳米粒子制备方法为:将纳米粒子在超声振荡下分散配制成浓度为1/50(1/125)-1/10000(1/25000)(w/v)的纳米粒子液,再将浓度为2mg/ml的标记活性试剂溶液分别与其作1∶1混合,在室温下避光反应2小时。混合物的纯化方法为,混合产物滴入装有凝胶的旋转管,在4000r/min条件下离心,取收集管液体。
本实施例纳米粒子-分子标记物质复合物制备方法为:将纳米粒子在超声振荡下分散配制成浓度为1/1000(1/125)(w/v)的纳米粒子液,再将浓度为2mg/ml的分子标记物质溶液分别与其作1∶1混合,在室温下反应1小时。如有必要纯化,混合物的纯化方法为:混合产物滴入装有凝胶的旋转管,在4000r/min条件下离心,取收集管液体。
2)配基/纳米粒子/分子标记物质复合物的制备
本实施例制备方法,其中所述配基、分子标记物质和纳米粒子的结合,包括下列一种或多种方式:将上述活性纳米粒子与分子标记物质结合(A)、将上述纳米粒子-分子标记物质与配基结合(B)、将按公知方法制备的分子标记物质标记配基与纳米粒子结合(C)、将配基与分子标记物质和纳米粒子同时结合(D),其中所述结合其产物为混合物和纯化物均可。本实施例制备的部分配基/纳米粒子/分子标记物质复合物列于表6中。
3)比较
本实施例所用芯片为按公知芯片制备方法制备的(片基为环氧基玻片,配基分别为丙肝病毒抗原(HCV Ag)和爱滋病毒抗原(HIVAg))。
比较方法与公知的芯片应用方法相同,本实施例在优选条件下制备的纳米标记物,其灵敏度比不含纳米粒子的对照标记物比较有明显提高,例如提高200%以上、甚至400%以上。
实施例5:芯片试剂盒的制备及应用
1)试剂盒的制备
本实施例试剂盒含实施例3中制备的本发明纳米结构芯片。本实施例试剂盒中的标记物,可以是实施例4中制备的纳米粒子标记物,也可以是任何其它结构标记物。
2)试剂盒的应用
试剂盒的应用,按已知的芯片试剂盒的应用方法进行。例如,在本实施例中,1号样为HCV抗体阳性血清,2号样为HIV1+2抗体阳性人血清,3号样为阴性对照物(HCV抗体和HIV1+2抗体都为阴性的血清对照物)。所有的样品均经使用经典的ELISA方法在血清20倍稀释反应条件下预先检测。本实施例的标记物为罗丹明标记羊抗人二抗(美国Jackson ImmunoRresearch Laboratories公司)。
实验时前述3种样品分别加入以HCV抗原、HIV1+2抗原为活性试剂的所述芯片的反应池中。其中对照芯片为环氧基玻片按常规的点样方法固定有相同活性试剂制备的芯片。加样量为15μl,反应30分钟后洗涤5次,洗涤液每次加入量为25μl。标记物加入量为15μl,反应后洗涤5次,洗涤液每次加入量为25μl,干燥后在35/50下进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪),扫描激发光波长532nm,发射光波长570nm,读取的信号经处理软件(JAGUAR II)处理,然后取平均值后根据Cut-off值判定阴(-)阳(+)性得到结果。与对照芯片比较,本发明纳米结构芯片表现出灵敏度提高的结果,例如提高200%以上、甚至400%以上、个别达1000%以上。含纳米粒子标记物的试剂盒,比不含纳米粒子标记物的试剂盒,其灵敏度提高150%以上。
实施例6:酶标试剂盒的制备及应用
1)试剂盒的制备
本实施例试剂盒为含纳米结构活性载体的酶标试剂盒。本实施例试剂盒含实施例3中制备的本发明酶标多孔板。对照酶标板为上述多孔板按常规的包被方法固定有相同活性试剂制备的酶标板。本实施例试剂盒中的标记物,可以是实施例4中的方法制备的纳米粒子酶标记物,也可以是任何其它结构标记物。
2)应用
试剂盒的应用,按已知的酶标试剂盒的应用方法进行。例如,在本实施例中,所用样品为EBV IgA阳性血清、EBV IgA阴性血清。所有的样品均经使用经典的ELISA方法在血清20倍稀释反应条件下预先检测。
实验时2种样品分别加入上述对照酶标板及3个纳米结构酶标板中,每种样品加4个反应池。加样时样品作适当稀释,加样量为100μl,反应温度37℃。洗涤液每次加入量为300μl,洗涤3次。标记物加入量为100μl,反应温度37度,反应时间30分钟。加入底物的反应条件和与经典的ELISA法相同。利用酶标仪(ThermoLabsystems,上海雷勃分析仪器有限公司)进行比色分析,8孔平均结果根据Cut-off值判定阴(-)阳(+)性。与对照酶标板比较,本发明纳米结构酶标板表现出灵敏度提高的结果,例如提高200%以上、甚至400%以上。含纳米粒子标记物的试剂盒,比不含纳米粒子标记物的试剂盒,其灵敏度提高120%以上。
实施例7:快捡试剂盒的制备及应用
本实施例试剂盒为含纳米结构活性载体的快检试剂盒。
1)试剂盒的制备
本实施例试剂盒为含纳米结构活性载体的快检试剂盒。本实施例试剂盒含实施例3中制备的本发明快检试剂条。对照快检试剂条为上述膜条按常规的包被方法固定有相同活性试剂制备的快检试剂条。
2)应用
试剂盒的应用,按已知的快检试剂盒的应用方法进行。例如,在本实施例中,样品1和2分别为HCV抗体阳性血清和HCV抗体阴性血清,所有的样品均预先用经典的ELISA方法检测确定其阴、阳性。实验时,2种样品分别加入上述制备的6种快检试纸条。加样时样品作适当稀释,加样量为50μl,加样后接着加入洗涤液试纸条缓慢吸至质控线出现。与对照试剂条比较,本发明纳米结构试剂条表现出灵敏度提高的结果,例如提高150%以上。
Claims (16)
1、一种用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体,其特征在于:该纳米结构活性载体包含纳米结构活性区,所述纳米结构活性区包含常规固相载体及其上固定的活性纳米结构,所述活性纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元及其上固定的活性试剂,所述纳米结构单元包括凸出高度大于3nm、且凸出半高处至少一维尺寸在1-500nm之间的纳米凸体,且所述纳米凸体在所述纳米结构活性区中的分布密度大于10个/μm2,其中所述纳米结构单元由平均粒径1-500nm的纳米粒子形成,所述纳米粒子包括含有下述有机物的纳米粒子和它们的衍生物:苯乙烯、丙烯酸脂、聚乳酸。
2、根据权利要求1所述的纳米结构活性载体,其特征在于:该纳米结构活性载体包含的所述纳米结构活性区具有下述之一或多个特征:
A).所述纳米凸体的分布密度大于100个/μm2;
B).纳米结构覆盖率大于50%;
C).表面积提高率大于400%;
D).吸附能力提高率大于150%;
E).灵敏度提高率大于300%;
F).识别信号衰减速率比小于70%,或/和吸附量衰减速率比小于80%。
3、根据权利要求1或2所述的纳米结构活性载体,其中所述纳米粒子的平均粒径小于100nm。
4、根据权利要求1或2所述的纳米结构活性载体,其中所述纳米粒子的平均粒径小于50nm。
5、根据权利要求1或2所述的纳米结构活性载体,其中所述纳米粒子的平均粒径小于30nm。
6、根据权利要求1或2所述的纳米结构活性载体,其中所述常规固相载体包括由以下之一组或多组材料或其衍生物制成的尺寸大于1000nm的固相载体:玻璃、硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、聚合物材料及它们的复合物,所述衍生物包括结合有用以结合所述活性试剂的基团或/和包被有机物的衍生物。
7、根据权利要求1或6所述的纳米结构活性载体,其中所述衍生物含下述一种或多种基团:氨基、醛基、环氧基、氨基肼、二乙氨基乙基、二乙基-(2-羟丙基)氨乙基、羧基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、烷基、氨基酸基、合成多肽基。
8、根据权利要求1或2所述的纳米结构载体,其包括下述组之一:活性纳米粒子/片基复合物、活性纳米粒子/微米粒子复合物、活性纳米粒子/纳米结构片基复合物、活性纳米粒子/纳米结构微米粒子复合物、及它们的组合物。
9、根据权利要求1或2所述的纳米结构载体,其为下述组之一:纳米结构分析芯片、纳米结构酶标板、纳米结构平面层析试剂条、及包括纳米结构层析活性凝胶在内的纳米结构活性分离固定相。
10、根据权利要求1或2所述的纳米结构载体,其中所述活性试剂包括核苷酸和/或寡核苷酸。
11、根据权利要求1或2所述的纳米结构载体,其中所述活性试剂包括多肽。
12、一种包含权利要求1-11之一所述用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体的试剂盒。
13、根据权利要求12所述的试剂盒,其还包含一种定量或/和定性分析标记***,所述标记***包含至少一种纳米标记物,所述纳米标记物包含标记活性试剂、标记物质和纳米粒子。
14、根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述纳米粒子为权利要求1、3、4、5或7所述纳米粒子。
15、根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述标记物质包括下述一种或多种物质:荧光物质、化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料。
16、一种包含权利要求1-11之一所述用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体的制备和应用的一种包含权利要求1-11之一所述用于分离或/和分析反应器的纳米结构活性载体的分离或/和分析方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102768285A (zh) * | 2011-05-05 | 2012-11-07 | 辅英科技大学附设医院 | 自动化数组芯片检测装置 |
CN103998940A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-08-20 | 株式会社岛津制作所 | 用于操作对象成分的芯片装置及使用其的方法 |
CN107436350A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-12-05 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法 |
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2007
- 2007-02-13 CN CN 200710048474 patent/CN101013128A/zh active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102768285A (zh) * | 2011-05-05 | 2012-11-07 | 辅英科技大学附设医院 | 自动化数组芯片检测装置 |
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CN107436350A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-12-05 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法 |
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