CN100589792C

CN100589792C - 红缨合耳菊在抑制酪氨酸酶及抗紫外线中的应用

Info

Publication number: CN100589792C
Application number: CN200710031637A
Authority: CN
Inventors: 张焜; 徐学涛; 杜志云; 竺琴; 程芬; 赵肃清; 方岩雄; 黄宝华
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Jiangmen large Health International Innovation Research Institute
Priority date: 2007-11-23
Filing date: 2007-11-23
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2027-11-23
Also published as: CN101181209A

Abstract

本发明公开了一种红缨合耳菊在抑制酪氨酸酶及抗紫外线中的应用，红缨合耳菊及其提取物或有效成分作为酪氨酸酶抑制剂；用于美白或抗紫外线的化妆品或药物，其中含有红缨合耳菊及其提取物或有效成分，以及药学上可接受的辅助剂；通过对酪氨酸酶的抑制作用、黑色素细胞的测试、紫外扫描、抗自由基氧化以及人体实验验证红缨合耳菊及其提取具有皮肤美白功效以及抗紫外线能力，其中红缨合耳菊的正丁醇及乙酸乙酯萃取物有很强的皮肤美白功效以及抗紫外线能力。

Description

红缨合耳菊在抑制酪氨酸酶及抗紫外线中的应用

技术领域

本发明涉及红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及水等有机溶剂的提取部分在抑制酪氨酸酶及抗紫外线中的应用。

背景技术

人类皮肤的颜色取决于黑色素的含量与分布，当黑色素过速增长和分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，从而产生人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病。酪氨酸酶广泛存在于在人体中是产生黑色素的关键酶，酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，而多巴醌经多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化成为黑色素。目前常用美白化妆品的主要机理是通过抑制酪氨酸酶活性或阻断酪氨酸氧化生成黑色素，从而减少黑色素的生成而达到美白皮肤的效果。因此美白剂对酪氨酸酶活性抑制率的高低成为衡量该美白剂美白效果的重要指标。

自由基是引起衰老的重要因素，而紫外线是皮肤自由基的主要来源，射线会引起体内生物分子和水分子均裂，产生大量自由基。自由基的特徵是氧化，它极不稳定，时刻伺机寻找可以结合的分子，它一旦和其它分子结合，会损害构成遗传基因的正常的细胞，甚至于产生新的细胞-肿瘤细胞。这种氧化的过程，既能直接导致细胞死亡，也会使细胞突变为癌细胞和衰老细胞，使人患上各种疾病，包括色斑、皱纹等皮肤病。因此，在祛斑的同时，加强抗自由基是十分重要。

东方人希望通过美白护肤品的使用而得到白晰、光洁的皮肤，而欧美消费者主要利用功能性美白化妆品来减轻和消除老年斑、黄褐斑等色素沉积。现今，国内外美白化妆品市场日趋活跃，美白剂的开发研究不断深入，多种美白剂相继应多种美白组分相继应用于化妆品，推动着护肤美容化妆品的发展。如果一种活性成分既具有美白功效，又能吸收大量紫外线起防晒作用或具有清除自由基作用，那么这样的美白剂就体现了全美白的概念，这是美白剂开发的重要方向。目前，已经有了一些这样的美白剂如Vc曲酸酯，具备很强的美白和清除自由基作用；曲酸亚麻酸酯具有美白和吸引紫外线功效。而在当今社会化妆品回归“纯天然”的趋势下，天然的美白护肤已占据主流。所以筛纯天然的植物全美白剂是美白护肤品重要方向，如鞣花酸，是从石榴果皮和树皮提取的针状结晶物，在整个紫外线区域均有较强的吸收作用，同时，动物实验表明，它的美白功效要优于曲酸。

发明内容

红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen多年生具根状茎草本，根状茎木质，直立或斜升，具被绒毛的纤维状根。通常上部有花序枝，叶具长柄，卵形，卵状披针形或长圆状披针形。产西藏东南部，生于林缘或灌丛边、草坡，海拔1500～3900米。

红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen及其提取物或有效成分作为酪氨酸酶抑制剂。

红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen的提取物制备方法是称取红缨合耳菊全草，用40～90％的乙醇(体积比)浸泡8～56h，经旋转蒸发浓缩后得到水溶液，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取水溶液(等体积分三次萃取)；萃取液经减压蒸馏后得到膏体，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇提取物、水溶物。

上述红缨合耳菊的乙酸乙酯萃取物作为酪氨酸酶抑制剂。

上述红缨合耳菊的正丁醇萃取物作为酪氨酸酶抑制剂。

一种用于美白或抗紫外线的化妆品或药物，其中含有红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen及其提取物或有效成分，以及药学上可接受的辅助剂。

上述用于美白或抗紫外线的化妆品或药物，其中含有红缨合耳菊乙酸乙酯萃取物，以及药学上可接受的辅助剂。

上述用于美白或抗紫外线的化妆品或药物，其中含有红缨合耳菊正丁醇萃取物，以及药学上可接受的辅助剂。

所述的化妆品或药物是制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen的活性提取组分用于酪氨酸酶抑制剂、抗紫外线及抗自由基氧化的各种含有上述四种组分的制剂。

红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen及红缨合耳菊Synotis erythropappa(Bureau & Franch.)C.Jaffrey & Y.L.Chen的乙酸乙酯、正丁醇组分既具有美白功效，又能吸收大量紫外线起防晒作用及或具有清除自由基作用。

本发明的有益效果是通过对酪氨酸酶的抑制作用、黑色素细胞的测试、紫外扫描、抗自由基氧化以及人体实验验证红缨合耳菊及其提取具有皮肤美白功效以及抗紫外线能力。其中红缨合耳菊的正丁醇及乙酸乙酯萃取物有很强的皮肤美白功效以及抗紫外线能力。

本发明是通过以下方案实现：

具体实施方式

实施例1

提取：

准确称取50g干燥的全草，用40～90％的乙醇(体积比)浸泡8～56h，经旋转蒸发浓缩后得到水溶液，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇依次萃取水溶液(等体积分三次萃取)。萃取液经减压蒸馏后得到膏体，得到石油醚萃取物0.54g，乙酸乙酯萃取物3.5g，正丁醇萃取物5.9g，水溶物7.2g。

实施例2

酪氨酸酶活性测试：

酪氨酸酶活力的测定是基于L-酪氨酸和L-DOPA的酶催化氧化产物——多巴色素在475nm处有最大吸收。酪氨酸酶活力单位(U/min)规定：以每分钟多巴色素在475nm处的吸光度(A475)增加0.001为一个酶活力单位。所以，通过测定酶催化反应体系的A475随时间的增长直线，从直线斜率即可求得酶活力。

二酚酶活力的测定是以0.5mmol·L^-1的L-DOPA为底物，在3mL0.05mol·L^-1磷酸缓冲液(pH 6.8)的测活体系中，先加0.1mL含不同浓度的抑制剂(溶于DMSO溶液中)于比色杯中，再加2.8mL预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加0.1mL酪氨酸酶水溶液，立刻混匀，在30℃恒温下测定波长为475nm的吸光值随时间的增长直线，从直线斜率求得酶活力。测定二酚酶时，酶的终质量浓度为6.67mg·L^-1，DMSO终质量分数为3.33％。仪器为紫外分光光度计。一般以导致酶活力下降50％的抑制剂浓度(IC₅₀)来表征抑制剂的功效。酪氨酸酶活性测试结果见表1。结果表明正丁醇和乙酸乙酯部分有强的酪氨酸酶抑制作用，其中正丁醇部分最强。

表1：各组分对酪氨酸酶活性测试结果

实施例3

黑色素瘤细胞测试：

瘤细胞培养

无菌条件下，将1×10⁵个/mL的B16细胞接种于含10％(体积分数)的小牛血清的RPMI1640培养基的培养瓶中，在5％(体积分数)CO₂培养箱中培养，每3d用0.25％胰酶消化传代一次。待细胞生长到对数期，用PBS洗涤，0.25％胰酶消化，细胞计数板计数。电镜观察细胞形态变化。调整细胞2×10⁴个/ml。分别接种于两个96孔板中，每孔100μl，置37℃ 5％ CO₂孵箱中孵育24h后，弃上清液，添加待测药物，每组药物最终质量浓度分别为1000mg/L、500mg/L、125mg/L、32mg/L、8mg/L。每一浓度设4个孔，对照组不加药物，代之同量维持液，空白孔不接种细胞。37℃ 5％的CO₂孵箱中孵育72h。

黑色素细胞增殖抑制率

四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)：药物作用72h后，每孔加入5g/L MTT溶液10μl，4h后弃上清液，每孔加入DMSO 100μL，振荡10min左右，在酶标仪上检测各孔吸光度值，以空白孔调零，波长为490nm。黑色素细胞增殖抑制率＝(1-各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100％。黑色素细胞增殖抑制率越高说明样品毒性越大。

测试结果为四种药物对黑色素细胞的毒性作用大小依次是：乙酸乙酯＞水＞正丁醇＞石油醚。四种组分除乙酸乙酯外的测试结果与显微镜观察结果一致，在不同浓度下对黑色素细胞的增殖几乎无抑制作用，其对细胞增殖的抑制率均低于5％(p＞0.05)，即后三种组分基本无细胞毒性。而乙酸乙酯组分细胞毒性大些。

酪氨酸酶活力影响

抑制小鼠黑色素细胞中酪氨酸酶活力试验：药物作用3d后，弃去上清液，用pH 6.8 PBS冲洗两遍，每孔加90μL含1％(体积分数)Triton X-100的PBS。冰浴中超声破碎，每孔加10μl 1×10^-2mol/L的L-Dopa，37℃孵育60min，于490nm处比色，空白孔调零，测各孔吸光度值。酪氨酸酶活性抑制率＝(1-各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100％。

正丁醇组分终浓度1000mg/L、500mg/L、125mg/L、32mg/L、8mg/L所对应的酪氨酸酶抑制率为71％、68％、63％、50％、22％

乙酸乙酯组分终浓度1000mg/L、500mg/L、125mg/L、32mg/L、8mg/L所对应的酪氨酸酶抑制率为68％、59％、53％、31％、20％

可见正丁醇和乙酸乙酯组分都有很好的酪氨酸酶抑制作用。而且基本没有毒性。

实施例4

紫外扫描

紫外线按照波长的长短分为三个区：波长在315至400纳米之间的紫外线称为UV-A区，该区的紫外线不能被臭氧有效吸收，但是也不会造成地表生物圈的损害，事实上这一波段少量的紫外线是地表生物所必需的；波长为280至300纳米的紫外线称之为UV-B区，这一波段的紫外辐射可能到达地表并对人类和生态***造成极大危害；波长为200至280纳米紫外线部分称为UV-C区，该区紫外线波长短能量高，不过该区的紫外线能被大气中的臭氧和氧气完全吸收，即使是平流层的臭氧发生损耗，UV-C区波段的紫外线也不会到达地球，所以不会对地球表面造成不良影响。

波长介于290～320纳米的中波长紫外线，对皮肤损伤最大会令表皮具保护作用的脂质层氧化，使皮肤变干；进一步则使表皮细胞内的核酸和蛋白质变性，产生急性皮炎(即晒伤)等症状，皮肤会变红、发痛。严重时，比如长时间的曝晒，还容易导致皮肤癌变。此外，长期伤害还会引起黑色素细胞的变异，造成难以消除的太阳斑。

将一定浓度的样品经紫外分光光度计全波长扫描，结果表明乙酸乙酯组分、正丁醇组分对波长为290～320nm的紫外线有很强的吸收。

实施例5

各组分美白的人体实验

将藏药组分添加到常用的无美白效果的乳膏中，随机选择皮肤健康的成人前臂内侧2cm×2cm区域为受试部位，一侧为试验区，一侧为对照区。每周末用色度计测定一次，测试4周。根据皮肤色度减退程度评价美白剂的功效。共测试20人次，其中16人有不同程度的美白效果，3人有轻微的美白效果，1人无效果。

实施例6

DPPH法测试抗氧化能力的测试

各组分提取物对DPPH自由基的清除作用，将样品溶液2ml与2×10^-4mol/LDPPH溶液均匀混合。30min后在517nm处测定其吸光度(Ai)，同时用同法测定2×10^-4mol/L DPPH溶液与2ml溶剂混合后的吸光度(Ac)，以及2ml提取液与2ml溶剂混合后的吸光度(Aj)。依据下列公式计算抑制率：抑制率＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％

一般以导致抑制率下降50％的抑制剂浓度(EC₅₀)来表征抑制剂的效果。抑制效果见表二，结果表明正丁醇和乙酸乙酯部分有很强的自由基清除效果，其中以乙酸乙酯部分最强。

表二：各组分抗氧化能力的测试结果

Claims

1.一种红缨合耳菊提取物的制备方法，该制备方法的步骤如下：首先，称取红缨合耳菊全草，用乙醇浸泡8～56h，经旋转蒸发浓缩后得到水溶液，然后，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取水溶液；萃取液经减压蒸馏后得到膏体，即得到石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物，水溶物。

2.一种用于美白或抗紫外线的化妆品或药物，其中含有如权利要求1所述制备方法中得到的红缨合耳菊乙酸乙酯萃取物，以及药学上可接受的辅助剂。

3.一种用于美白或抗紫外线的化妆品或药物，其中含有如权利要求1所述制备方法中得到的红缨合耳菊正丁醇萃取物，以及药学上可接受的辅助剂。

4.根据权利要求2或3所述的美白或抗紫外线的化妆品或药物，其特征是所述的化妆品或药物是制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。