CN100584949C

CN100584949C - 烯酮还原酶基因和左旋二酮的微生物生产

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Publication number: CN100584949C
Application number: CN03822613A
Authority: CN
Inventors: 片冈道彦; 清水昌
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-09-23
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2023-09-19
Also published as: EP1543125A2; AU2003273910A1; EP1543125B1; CN1751123A; US7592166B2; DE60313784D1; WO2004027065A2; US20060128000A1; JP2006500018A; WO2004027065A3; ATE361982T1

Abstract

本发明公开了一种分离的DNA，包含编码具有烯酮还原酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述酶的特征在于以下理化性质：(a)分子量：61，300±5，000Da(利用凝胶过滤估测，由一个亚基组成)；(b)辅助因子：NADPH和NADH；(c)底物特异性：对α，β-不饱和酮有活性；(d)最适温度：55-60℃，pH 7.4；和(e)最适pH值：pH 4.5-8.5。

Description

烯酮还原酶基因和左旋二酮的微生物生产

本申请涉及编码烯酮还原酶的DNA，包含该DNA的表达载体，导入了该DNA的微生物，和利用该微生物从2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮(以下称为酮基异佛尔酮(ketoisophorone)生产(6R)-2，2，6-三甲基-1，4-环己烷二酮(以下称为左旋二酮(levodione)的方法。

左旋二酮是一种在合成例如玉米黄质的旋光活性类胡萝卜素方面有用的中间物。从酮基异佛尔酮生产左旋二酮的微生物生产过程是已知的(US4,156,100)。分离自乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、作用于酮基异佛尔酮以生产左旋二酮的烯酮还原酶在2002年2月22日提交的欧洲专利申请No.02003967.3中有描述。这个酶的特点在于下列理化性质：

(a)分子量：61,300±5,000Da(利用凝胶过滤测定。由一个亚基组成。)

(b)辅助因子：NADPH和NADH

(c)底物特异性：作用于α，β-不饱和酮

(d)最适宜的温度：55-60℃，pH 7.4

(e)最适pH值：pH 4.5-8.5

此处使用的术语“烯酮还原酶(enone reductase)”包括按照生物化学和分子生物学国际协会命名委员会(NC-IUBMB)提供的酶命名法定义的催化羰基活化的双键的酶还原的蛋白质。还涉及具有烯酮还原酶的上述活性的蛋白质，该蛋白质优选催化酮基异佛尔酮转化成左旋二酮。涉及左旋二酮生物合成的烯酮还原酶的基因对于改善左旋二酮的微生物生产产量非常有用。

本发明提供编码烯酮还原酶的分离的DNA序列。

该分离的DNA序列可被更确切地表征为(a)它编码具有SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列的酶，或(b)它编码酶的变体，选自(i)等位变体，和(ii)具有一个或多个氨基酸的添加、***、删除和/或替换并具有申明的酶活性的酶。

更特别地，本发明提供来源于乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母(Candidamacedoniensis))IFO 0960的基因的DNA序列，选自(i)SEQ ID NO：1所示的序列，(ii)SEQ ID NO：1所示DNA序列的等同编码变体(isocoding variant)或等位基因变体(allelic variant)，(iii)SEQ ID NO：1所示DNA序列的衍生物，具有一个或多个核苷酸的添加、***、删除和/或替换并编码具有所述酶活性的多肽，(iv)在严紧杂交条件下与(i)或(ii)的核苷酸序列的互补序列杂交、并编码具有所述酶活性的多肽的DNA序列，和(v)与(i)的核苷酸序列具有至少80％的同一性并编码具有所述酶活性的多肽的DNA序列。

乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960菌株可以从大阪发酵研究所(IFO)，17-85 Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，大阪，532-8686，日本，公开地获得。

通过杂交鉴别DNA序列的操作指南对于本领域的技术人员是公知的。杂交可在严紧条件下发生，在该条件下仅当杂交物中探针和目标序列，例如用该探针处理的多核苷酸具有至少70％的同一性时，杂交物才会形成。已知的是杂交的严紧度、包括洗涤步骤，受缓冲液成分、温度和盐浓度变化的影响，或由它们决定。杂交反应优选在与洗涤步骤相比相对低的严紧度下进行。

例如，5×SSC缓冲液、大约50-68℃的温度，可用于杂交反应。此时探针也可以和那些与该探针的序列具有小于70％同一性的多核苷酸杂交。这种杂交物不太稳定，在严紧条件下洗涤时会被除去。这可以通过，例如在大约50-68℃的温度下将盐浓度降低到2×SSC、随后到0.5×SSC来实现。也可以选择性地将盐浓度降低到0.1×SSC。多核苷酸片段，例如，与使用的探针的序列具有至少70％或至少80％、或至少90％到95％的同一性的多核苷酸片段，可以通过以约1-2℃为一级逐步地升高杂交温度来分离。

在本发明的上下文中“严紧条件”是指在缓冲液中，例如，在由5×SSC、0.1％(w/v)N-十二烷基肌氨酸、0.02％(w/v)SDS、1％封闭试剂(RocheDiagnostics，Cat.No.1096 176)组成的缓冲液中50℃过夜杂交，在杂交的洗涤步骤中在室温下用2×SSC、0.1％(w/v)SDS洗涤5分钟，洗两次，随后在68℃用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS洗涤15分钟，洗两次。

DNA序列可以从乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960菌株，或另一个或有关的生物体例如，可以是该DNA序列的烯酮还原酶编码区的等位变体或种系变体中克隆出来。同样包括在本发明的范围中的还有DNA序列的衍生物，其具有不同核苷酸的添加、***、删除和/或替换从而产生编码同样的或功能上等同的左旋二酮还原酶的多肽。该编码的蛋白质也可包含产生沉默变化并产生功能上等同的烯酮还原酶的氨基酸残基的添加、删除和/或替换。

本发明的DNA还指包含与目的基因的表达有关的调控序列例如启动子和终止子的基因组DNA，以及仅包含5′和3′非翻译区中短片段侧翼之间的开放阅读框的cDNA。

在本发明中使用的烯酮还原酶基因、重组体表达载体、和重组生物体可通过以下步骤获得：

-从可以提供本发明的烯酮还原酶的微生物分离染色体DNA并用该染色体DNA构建基因文库。

-通过菌落或噬菌斑杂交、PCR克隆、Southern印迹杂交等从染色体DNA中克隆烯酮还原酶基因。

-通过通常的方法确定如上获得的烯酮还原酶基因的核苷酸序列并构建包含并有效地表达该烯酮还原酶基因的重组表达载体。

-通过转化，转导，转接合或电穿孔构建携带重组表达载体上或染色体上的烯酮还原酶基因的重组生物体。

用于分离或克隆编码本发明烯酮还原酶的DNA的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA中分离。可利用简并的聚合酶链式反应(以下称为PCR)从这样的基因组DNA中克隆本发明的DNA序列。

根据部分氨基酸序列的信息，可合成作为PCR引物的寡聚核苷酸。用于通过PCR克隆烯酮还原酶基因的引物可以以纯化的烯酮还原酶的肽片段的氨基酸序列为依据，烯酮还原酶是来自包括，但不限于，假丝酵母属(Candida)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)，在最优选的实施方式中，来自乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960。烯酮还原酶的DNA片段(部分DNA序列)利用所述引物和例如C.kefyr染色体DNA的模板通过PCR扩增产生。扩增的DNA片段可以用作探针来克隆编码整个烯酮还原酶的基因组片段。包含其编码区以及调控区例如启动子或终止子的完整基因可以从染色体中克隆，例如，在测序之后，利用依据获得的DNA片段的部分序列的引物，通过反向PCR法克隆，或通过利用上述PCR法获得的DNA片段作为探针，在进行标记后，筛选在适当宿主中构建的噬菌体载体或质粒载体的基因文库来克隆。

通常，作为宿主菌株的大肠杆菌和大肠杆菌载体、噬菌体载体例如λ噬菌体载体、质粒载体或酵母载体常被用于文库的构建，随后进行基因操作例如测序、限制性消化、连接等。在分离了包含其编码区以及调控区的完整基因的全部必需部分之后，获得的片段被亚克隆入适当的质粒载体，其可被方便地用于测序和构建烯酮还原酶的完整基因。在本发明中，***片段被亚克隆入pUC18载体。核苷酸序列可以通过公知的方法例如双脱氧链终止法来确定。

本发明的分离的DNA序列可按照本领域公知的方法，用来鉴别和克隆来自其他不同的属或种的编码具有烯酮还原酶活性的多肽的DNA。

本发明还涉及重组DNA，优选的是包含编码烯酮还原酶的序列的载体和/或质粒。所述重组DNA载体和/或质粒可包含调控区例如启动子和终止子以及烯酮还原酶基因的开放阅读框。可用本领域普通技术人员公知的方法构建表达载体，其包含编码烯酮还原酶的核苷酸序列和适当的转录的和翻译的调控元件，包括对所述核苷酸序列的编码序列的表达是必需的或是有利的所有组件。也可使用特殊的起始和终止信号为编码烯酮还原酶的序列实现更有效的翻译。编码烯酮还原酶的分离的DNA序列可以用各种方法进行操作以准备所述多肽的表达。取决于表达载体，在***载体之前对编码烯酮还原酶的核苷酸序列进行的操作是可取的或必需的。利用克隆方法修改核苷酸序列的技术是本领域公知的。可以利用各种表达载体/宿主***来包含和表达编码烯酮还原酶的序列。

本发明还提供该重组DNA转化宿主生物的用途。重组DNA的适宜的形式可以是载体。用重组DNA转化的宿主生物在生产烯酮还原酶的多肽以及改善左旋二酮的生产过程方面是有用的。因而，本发明还提供这样的转化的宿主细胞(重组微生物)和该重组DNA编码的多肽。

本发明还提供生产该重组DNA编码的多肽的方法，包括在适合于酶表达的条件下培养所述转化的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述多肽。重组微生物的培养可以是有氧的或厌氧的、pH值从4.0到9.0、温度在从10到60℃的范围内、培养15分钟到72小时，优选的，pH值从5.0到8.0、温度在20到40℃的范围内，培养30分钟到48小时。取决于序列和/或使用的载体，所述重组细胞生产的烯酮还原酶可以是分泌的或包含在细胞内部的。然后可以通过传统步骤从培养基或重组细胞中分离所述烯酮还原酶。

本发明进一步提供左旋二酮的生产过程，包括用所述烯酮还原酶多肽接触酮基异佛尔酮。

本发明的烯酮还原酶在辅助因子NADH或NADPH的存在下，按照以下公式催化酮基异佛尔酮还原成左旋二酮：

该反应可以在例如Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液的溶剂中进行。

优选的反应条件是pH值从4.5到8.5，更优选的从5.0到8.0，温度范围从10到60℃，更优选的从20到60℃，反应时间5分钟到72小时，更优选的15分钟到48小时。

本发明还提供左旋二酮的生物生产方法，包括在适合于左旋二酮的生产的条件下用如上所述的重组微生物接触酮基异佛尔酮，其中包括在作为底物的酮基异佛尔酮存在下培养所述重组微生物，并从反应混合物中分离生成的左旋二酮。

重组微生物的生长的细胞或静止细胞培养物，或固定化细胞，或无细胞抽提物等，都可用于左旋二酮的生产。

生长的细胞培养物可以通过在营养培养基中培养所述重组微生物来获得，培养基包含糖类，例如葡萄糖或蔗糖，醇类，例如乙醇或甘油，脂肪酸，例如油酸和硬脂酸或它们的酯，或油类，例如菜籽油或豆油，作为碳源；硫酸铵，硝酸钠，蛋白胨，氨基酸，玉米浆，麦麸，酵母抽提物等，作为氮源；硫酸镁，氯化钠，碳酸钙，磷酸氢钾，磷酸二氢钾等，作为无机盐来源；和麦芽提取物，肉膏等，作为其他的营养物来源。重组微生物的培养可以是有氧的或厌氧的、pH值从4.0到9.0、温度在从10到60℃的范围内、培养15分钟到72小时，优选的，pH值从5.0到8.0、温度在20到40℃的范围内，培养30分钟到48小时。在培养期间对培养物适当的搅拌将有助于细胞生长或反应的进行。

利用如此获得的生长的细胞培养物，可通过任何本领域公知的方法来制备静止细胞培养物或固定化细胞或无细胞抽提物。

生产左旋二酮的优选的条件是pH值从4.0到9.0，温度范围从10到60℃，反应15分钟到72小时。

生产左旋二酮的更加优选的条件是pH值从5.0到8.0，温度范围从20到60℃，反应30分钟到48小时。

取决于其他的反应条件，反应混合物中酮基异佛尔酮的浓度可以变化，但通常在0.1g/l到300g/l之间，优选的在1g/l到30g/l之间。

在如上所述反应混合物中酶生产的或生物生产的左旋二酮可以通过有机溶剂例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯或正丁烷来提取。提取物可以通过已知的方法分析，如气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析法或纸层析法等。在气相色谱法中，作为例子可以使用以下条件：柱：ULBON HR 20M(Shinwa，Japan)0.25mm×30m；柱温度：160℃(恒定)；注入器温度：250℃；运载气体：He(大约1ml/min)。

在反应之后，反应混合物中的左旋二酮可以，例如，通过用容易使左旋二酮溶解的、不与水混合的有机溶剂例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯、或乙酸正丁酯进行提取来回收。左旋二酮的进一步提纯可以通过浓缩提取物直接结晶左旋二酮或通过各种层析法的组合，例如薄层层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、或高效液相色谱法来进行。

以下的实施例进一步说明本发明。

实施例1：乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的烯酮还原酶的部分氨基酸序列

C.kefyr的冻干纯化的烯酮还原酶(在2002年2月22日提交的欧洲专利申请No.02003967.3中描述)用赖氨酰肽链内切酶消化，产生的消化物用Smart***分离，例如，将1nmol纯化的酶溶于包含8M尿素的25μl 50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.6)中，在37℃孵育1小时。此后，添加25μl 50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.6)使尿素浓度变为4M。然后，添加0.5μl 12nmol/ml赖氨酰肽链内切酶(Wako，Japan，0.006nmol，E/S＝1/167)，在30℃孵育6小时。产生的肽用以下条件通过Smart***分离：柱：μRPC C2/C18 SC2.1/10(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，英国)；流速：100μl/min；液体A：0.1％TFA；液体B：0.1％TFA+80％ CH₃CN；梯度：100％A(0-15分钟)；100％A→100％B(15-75分钟)；柱温度：室温；检测：214nm，280nm。

肽(K-15，K-25.1，K6.1，K6.2，K30，K13.2，K-1.1，K-1.2，K-33，K-25.2，K-20，K-17，K-22，K-4.1，K-13.1，和K-9)被分离出来，用蛋白质测序仪分析这些多肽的氨基酸序列，例如，通过用491HT脉冲液体蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，California)自动进行Edman降解，得到肽K-15：SEQ ID NO：3；肽K-25.1：SEQ ID NO：4；肽K-6.1：SEQ ID NO：5；肽K-6.2：SEQ ID NO：6；肽K-30：SEQ ID NO：7；肽K-13.2：SEQ ID NO：8；肽K-1.1：SEQ ID NO：9；肽K-1.2：SEQ ID NO：10；肽K-33：SEQ IDNO：11；肽K-25.2：SEQ ID NO：12；肽K-20：SEQ ID NO：13；肽K-17：SEQ ID NO：14；肽K-22：SEQ ID NO：15；肽K-4.1：SEQ ID NO：16；肽K-13.1：SEQ ID NO：17；肽K-9：SEQ ID NO：18。

将获得的部分氨基酸序列与保存在SWISS PROT(版本37.0+/06-14，99年6月)、PIR(版本60.0，99年5月)和PRF(版本99-05，99年5月)蛋白质数据库中的蛋白质序列进行对比。利用Blast(J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)和Fasta(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448，1988)程序进行序列对比。结果，发现与已知的老黄酶(Old Yellow Enzymes)有高同源性。

实施例2：乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的染色体DNA的制备

乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的细胞在200ml培养基中培养。通过离心收集细胞并悬浮在10ml TES缓冲液中。向细胞悬液中添加3ml0.5M EDTA、0.5ml消解酶溶液和0.5ml蛋白酶K溶液。在37℃轻轻地搅拌孵育0.5小时后，添加2ml 10％SDS并搅拌。在加H₂O使体积到达20ml之后，添加10ml TE饱和的苯酚和10ml氯仿并搅拌。离心后收集上层液，添加同样体积的苯酚/氯仿并混合。离心后，收集上层液并添加0.1倍体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇。利用缠绕玻璃棒收集DNA沉淀，用70％、80％和90％乙醇冲洗，干燥并悬浮于5ml包含10μl 5mg/ml RNase A的TE缓冲液中。通过在4℃下轻轻地搅拌过夜完全溶解DNA。再添加10μl 5mg/mlRNase A，DNA溶液在37℃孵育2小时。在用苯酚/氯仿处理后，回收水层，DNA用乙醇沉淀，然后离心。团状物重悬浮于50ml TE缓冲液中。如此获得的基因组DNA的浓度是88ng/μl。

实施例3：乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的部分烯酮还原酶基因的克隆

利用制备的基因组DNA作为模板，通过利用热循环仪(Perkin-ElmerCetus Instruments，USA)进行简并的PCR扩增获得烯酮还原酶基因的部分序列。简并的PCR引物根据实施例1中获得的部分氨基酸序列(K-15，K-13.1和K-9)设计，如下：

有义引物1(SEQ ID NO：19)

反义引物2(SEQ ID NO：20)

PCR反应(50μl)利用176ng染色体DNA(获得自实施例2)作为模板，150pmol每种简并的引物，2.5nmol每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.5单位的Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo，Kyoto，Japan)，和5μl EX Taq缓冲液(Takara Shuzo)进行。最初的模板变性步骤为94℃ 4分钟。94℃ 1分钟、50℃1分钟和72℃ 1.5分钟的扩增循环重复35次。在附加的72℃反应10分钟之后，扩增出包含部分烯酮还原酶基因的DNA片段(约1kb)。将该片段克隆到测序载体上，通过双脱氧链链终止法确定DNA序列。Taq着色引物测序试剂盒与自动测序仪(DNA测序仪373A，Applied Biosystems)一同使用。如此获得的烯酮还原酶的部分DNA序列和推测的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22所示。

实施例4：乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的完整烯酮还原酶基因的克隆

用反向PCR克隆实施例3中获得的部分烯酮还原酶DNA序列侧翼的上游和下游序列。

1μg乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的基因组DNA(获得自实施例2)用10单位Nco I(Takara Shuzo，Kyoto，Japan)在包含0.01％BSA的50μlK缓冲液中消化。在37℃反应过夜后，用苯酚/氯仿处理反应混合物，回收水层，DNA用乙醇沉淀，然后离心。DNA团状物重悬浮于1ml包含700单位T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)的T4 DNA连接酶缓冲液中。在15℃反应过夜后，用苯酚/氯仿处理反应混合物，回收水层，DNA用乙醇沉淀，然后离心。DNA团状物重悬浮于TE缓冲液中用作PCR的模板。PCR引物根据实施例3中获得的部分烯酮还原酶基因序列设计，如下：IA1(用于上游区的反义引物)＝SEQ ID NO：23和IS1(用于下游区的有义引物)＝SEQ ID NO：24。

PCR反应(50μl)利用250ng模板DNA，5pmol每种引物，2.5nmol每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP，2.5单位的Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)和5μlEX Taq缓冲液(Takara Shuzo)进行。最初的模板变性步骤为94℃ 4分钟。94℃1分钟、60℃ 1分钟和72℃ 4分钟的扩增循环重复30次。在附加的72℃反应10分钟后，扩增出包含烯酮还原酶基因的上游和下游序列的DNA片段(约4kb)。将该片段克隆到测序载体上，确定DNA序列。

通过将如此获得的序列与实施例3获得的部分烯酮还原酶DNA序列组合，获得了包含其编码区以及调控区例如启动子或终止子的预计的完整基因序列。如此获得的烯酮还原酶的预计的完整序列如SEQ ID NO：25所示，它包含编码区以及其侧翼的上游和下游区(预计的ORF是148-1359)。

然后，通过如下的PCR，获得了包含其编码区以及侧翼的上游和下游区的烯酮还原酶的实际的完整序列。

使用乳酒假丝酵母(马其顿假丝酵母)IFO 0960的基因组DNA(获得自实施例2)作为模板。根据上面获得的预计的烯酮还原酶基因序列(SEQ IDNO：25)设计PCR引物，在SEQ ID NO：26(有义)和SEQ ID NO：27(反义)中说明。

PCR反应(50μl)利用900ng模板DNA，10pmol每种引物，2.5nmol每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP，100nmol MgCl₂，1.5单位的LA Taq聚合酶(TakaraShuzo)和5μl LA Taq缓冲液(Takara Shuzo)进行。最初的模板变性步骤为94℃2分钟。94℃ 1分钟、60℃ 1分钟和74℃ 1.5分钟的扩增循环重复23次。在附加的74℃反应7分钟后，扩增出包含烯酮还原酶基因的完整序列的DNA片段(约1.3kb)。将该片段克隆到测序载体上，确定DNA序列。

如此获得的包含其编码区以及侧翼的上游和下游区的烯酮还原酶的完整DNA序列如SEQ ID NO：28所示(ORF为55-1266)。

实施例5：烯酮还原酶基因的表达和利用具有C.kefyr的烯酮还原酶基因的大肠杆菌进行左旋二酮生产

通过PCR扩增获得一个仅包含烯酮还原酶基因的ORF(1212bp)的DNA片段。使用引物ExS(SEQ ID NO：29)和ExA(SEQ ID NO：30)进行PCR。

携带烯酮还原酶基因的完整序列(获得自实施例4)的载体被用作模板。PCR反应(50μl)利用250ng模板DNA，10pmol每种引物，2.5nmol每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.5单位的Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)和5μlPyrobest缓冲液(Takara Shuzo)进行。最初的模板变性步骤为94℃ 1分钟。94℃0.5分钟、60℃ 1分钟和75℃ 1.5分钟的扩增循环重复15次。在附加的75℃反应5分钟后，扩增出仅包含烯酮还原酶基因的ORF的DNA片段(约1.2kb)。

使用pET Directional

表达试剂盒(Invitrogen Corporation，USA)按照厂家提供的使用手册，将该扩增的烯酮还原酶基因片段克隆到载体pET101/D-TOPO上。将如此获得的携带烯酮还原酶基因的载体(pET101/D-TOPO-ER)导入大肠杆菌BL21(DE3)，选出几个克隆利用自动测序分析仪(DNA测序仪373A，Applied Biosystems)进行序列分析。将其中一个显示了与C.kefyr的烯酮还原酶序列完全相同的序列的克隆，大肠杆菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]选出，用于进一步实验。还制备出大肠杆菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO]菌株作为对照。

将大肠杆菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]和大肠杆菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO]菌株接种到包含0.05mg/ml氨苄青霉素和2％(W/V)酪蛋白氨基酸(Difco laboratories，USA)的M9基本培养基(每试管5ml)中，在37℃下培养。当610nm处的光密度到达0.4时，向培养基添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其浓度达到0.01mM，继续培养8-10小时。然后通过离心收集细胞，一部分细胞用于SDS-PAGE分析。结果，仅当使用重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]时，才观察到预计为45kDa的IPTG诱导的蛋白带。

其余收集的细胞重悬浮于2ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。该混悬液用于证实从酮基异佛尔酮生产左旋二酮的活性。将该混悬液分成两部分(各1ml)，添加33mM(最终浓度，以下缩写为f.c.)酮基异佛尔酮和280mM(f.c.)D-葡萄糖、有或者没有0.37mM(f.c.)NAD⁺、15单位/ml(f.c.)葡糖脱氢酶，开始反应。在30℃下反应过夜。反应混合物用乙酸乙酯提取以回收乙酸乙酯层中的左旋二酮。通过气相色谱法分析提取物。结果，仅当使用重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]时，才检测到左旋二酮。

序列表

<110>DSM IP资产公司(DSM IP ASSETS B.V.)

<120>烯酮还原酶基因和左旋二酮的微生物生产

<130>NDR5231

<140>PCT/EP03/10473

<141>2003-09-19

<150>EP 02021098.5

<151>2002-09-23

<160>32

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1212

<212>DNA

<213>乳酒假丝酵母

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1212)

<400>1

atg tcg tac atg aac ttt gac cct aag cca ttg gga gac acc aat atc 48

Met Ser Tyr Met Asn Phe Asp Pro Lys Pro Leu Gly Asp Thr Asn Ile

1 5 10 15

ttc aag cca atc aag atc ggt aac aat gag cta aaa cac aga gta gtc 96

Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Lys His Arg Val Val

20 25 30

atg cca gca ttg act aga atg aga gcc att gca cca gga aac atc cca 144

Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro Gly Asn Ile Pro

35 40 45

aac act gaa tgg gcc gag gaa tac tac aga caa cgt tct caa tac cct 192

Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg Ser Gln Tyr Pro

50 55 60

ggt acc ctt att atc acg gaa ggt act ttc cct tct gcg caa tca ggt 240

Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Gln Ser Gly

65 70 75 80

ggt tac cca aat gtg cca ggt atc tgg tcc aaa gag caa ttg gct gaa 288

Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu Gln Leu Ala Glu

85 90 95

tgg aaa aag atc ttc aat gca atc cat gag aac aaa tcg ttc gtg tgg 336

Trp Lys Lys Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Asn Lys Ser Phe Val Trp

100 105 110

gtg caa ttg tgg gtt cta ggt aga caa gca tgg cca gaa gtg ttg aag 384

Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Trp Pro Glu Val Leu Lys

115 120 125

aag gaa ggt ttg cgt tac gat agt gct acc gat gac ttg tac atg ggt 432

Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asp Leu Tyr Met Gly

130 135 140

gaa gaa gaa aaa gag cgt gcc tta aag gct aac aac cca cag cac ggt 480

Glu Glu Glu Lys Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asn Asn Pro Gln His Gly

145 150 155 160

atc acc aag gaa gaa atc aag cag tac atc aag gag tac gtg gat gct 528

Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu Tyr Val Asp Ala

165 170 175

gcc aag aaa gcc atc gat gca ggt gca gac ggt gtg caa atc cat tct 576

Ala Lys Lys Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val Gln Ile His Ser

180 185 190

gcc aac ggt tac ttg ttg aac cag ttt ttg gac cct att tct aac aac 624

Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ile Ser Asn Asn

195 200 205

aga acc gac gag tac ggt gga tcg atc gag aac cgt gcg aga ttc act 672

Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe Thr

210 215 220

ttg gaa gtg gtc gat gcc gtt gtc gat gca gtt ggt gcc gaa aga acc 720

Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Val Gly Ala Glu Arg Thr

225 230 235 240

tcc atc aga ttc tct cca tac ggt act ttt ggt acc atg tcc ggt ggt 768

Ser Ile Arg Phe Ser Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Thr Met Ser Gly Gly

245 250 255

gag aac cct ggc atc gtt gct caa tat gca tac gtc att ggt gag ttg 816

Glu Asn Pro Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Ile Gly Glu Leu

260 265 270

gaa aag aga gct aga gct ggc aag aga ttg gcg ttc atc gat ttg gtc 864

Glu Lys Arg Ala Arg Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Ile Asp Leu Val

275 280 285

gag cct cgt gtg acc gac cca ttc cta cca gaa ttc gag aag tgg ttc 912

Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Phe Leu Pro Glu Phe Glu Lys Trp Phe

290 295 300

aag gaa ggt acc aac gaa ttc atc tac tct atc tgg aag ggt cca gtt 960

Lys Glu Gly Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro Val

305 310 315 320

ctc aga gtt ggt aac tat gct ttg gac cca gat caa gcc act ctc gac 1008

Leu Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Pro Asp Gln Ala Thr Leu Asp

325 330 335

tct aag aag cct aac act ttg atc ggt tac ggt aga tcc ttc atc gcc 1056

Ser Lys Lys Pro Asn Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Ser Phe Ile Ala

340 345 350

aac cca gac ttg gtg tac cgt ttg gaa aag ggt ttg cca ttg aac aag 1104

Asn Pro Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn Lys

355 360 365

tat gat aga aac acc ttt tac aca ttc act aag gaa ggt tac acc gat 1152

Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Tyr Thr Phe Thr Lys Glu Gly Tyr Thr Asp

370 375 380

tac cca agc tac gaa gaa tcc gtc gca aag ggt tac aag aaa gag gaa 1200

Tyr Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val Ala Lys Gly Tyr Lys Lys Glu Glu

385 390 395 400

aag aag tac taa 1212

Lys Lys Tyr

<210>2

<211>403

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>2

Met Ser Tyr Met Asn Phe Asp Pro Lys Pro Leu Gly Asp Thr Asn Ile

1 5 10 15

Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Lys His Arg Val Val

20 25 30

Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro Gly Asn Ile Pro

35 40 45

Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg Ser Gln Tyr Pro

50 55 60

Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Gln Ser Gly

65 70 75 80

Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu Gln Leu Ala Glu

85 90 95

Trp Lys Lys Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Asn Lys Ser Phe Val Trp

100 105 110

Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Trp Pro Glu Val Leu Lys

115 120 125

Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asp Leu Tyr Met Gly

130 135 140

Glu Glu Glu Lys Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asn Asn Pro Gln His Gly

145 150 155 160

Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu Tyr Val Asp Ala

165 170 175

Ala Lys Lys Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val Gln Ile His Ser

180 185 190

Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ile Ser Asn Asn

195 200 205

Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe Thr

210 215 220

Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Val Gly Ala Glu Arg Thr

225 230 235 240

Ser Ile Arg Phe Ser Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Thr Met Ser Gly Gly

245 250 255

Glu Asn Pro Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Ile Gly Glu Leu

260 265 270

Glu Lys Arg Ala Arg Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Ile Asp Leu Val

275 280 285

Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Phe Leu Pro Glu Phe Glu Lys Trp Phe

290 295 300

Lys Glu Gly Tnr Asn Glu Phe Ile Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro Val

305 310 315 320

Leu Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Pro Asp Gln Ala Thr Leu Asp

325 330 335

Ser Lys Lys Pro Asn Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Ser Phe Ile Ala

340 345 350

Asn Pro Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn Lys

355 360 365

Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Tyr Thr Phe Thr Lys Glu Gly Tyr Thr Asp

370 375 380

Tyr Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val Ala Lys Gly Tyr Lys Lys Glu Glu

385 390 395 400

Lys Lys Tyr

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>3

Pro Leu Gly Asp Thr Asn Ile Phe Lys Pro Ile Lys

1 5 10

<210>4

<211>50

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>4

His Arg Val Val Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro

1 5 10 15

Gly Asn Ile Pro Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg

20 25 30

Ser Gln Tyr Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser

35 40 45

Val Gln

50

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>5

Glu Gln Leu Ala Glu Trp Lys Lys

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>6

Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Asn Lys

1 5

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(15)..(15)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>Xaa是未知的

<400>7

Ser Phe Val Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Xaa Pro

1 5 10 15

Glu Val

<210>8

<211>19

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>8

Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Phe Asp Asp Leu Tyr Met Gly Glu

1 5 10 15

Glu Glu Lys

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>9

Ala Asn Asn Pro Gln His Gly Ile Thr Lys

1 5 10

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>10

Glu Tyr Val Asp Ala Ala Lys

1 5

<210>11

<211>50

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(43)..(43)

<223>Xaa是未知的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(45)..(45)

<223>Xaa是未知的

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(47)..(48)

<223>Xaa是未知的

<400>11

Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val Gln Ile His Ser Ala Asn Gly

1 5 10 15

Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ile Ser Asn Asn Arg Thr Asp

20 25 30

Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Ile Asn Arg Ala Xaa Phe Xaa Leu Xaa Xaa

35 40 45

Val Asp

50

<210>12

<211>22

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>12

Arg Leu Ala Phe Ile Asp Leu Val Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Phe

1 5 10 15

Leu Pro Glu Phe Glu Lys

20

<210>13

<211>12

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>13

Glu Gly Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Ser Ile Trp Lys

1 5 10

<210>14

<211>21

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>14

Gly Pro Val Leu Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Pro Asp Gln Ala

1 5 10 15

Thr Leu Asp Ser Lys

20

<210>15

<211>24

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>15

Leu Pro Asn Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Ser Phe Ile Ala Asn Pro

1 5 10 15

Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Lys

20

<210>16

<211>6

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>16

Gly Leu Pro Leu Asn Lys

1 5

<210>17

<211>11

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>17

Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Tyr Thr Phe Thr Lys

1 5 10

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>18

Glu Gly Tyr Thr Asp Tyr Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val Ala Lys

1 5 10 15

<210>19

<211>9

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>19

Gly Asp Thr Asn Ile Phe Lys Pro Ile

1 5

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>reverse sequence of a partial amino acid sequence of enone

reductase

<400>20

Gly Glu Lys Thr Phe Thr Tyr Phe Thr

1 5

<210>21

<211>1058

<212>DNA

<213>乳酒假丝酵母

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1056)

<400>21

cac aga gta gtc atg cca gca ttg act aga atg aga gcc att gca cca 48

His Arg Val Val Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro

1 5 10 15

gga aac atc cca aac act gaa tgg gcc gag gaa tac tac aga caa cgt 96

Gly Asn Ile Pro Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg

20 25 30

tct caa tac cct ggt acc ctt att atc acg gaa ggt act ttc cct tct 144

Ser Gln Tyr Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser

35 40 45

gcg caa tca ggt ggt tac cca aat gtg cca ggt atc tgg tcc aaa gag 192

Ala Gln Ser Gly Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu

50 55 60

caa ttg gct gaa tgg aaa aag atc ttc aat gca atc cat gag aac aaa 240

Gln Leu Ala Glu Trp Lys Lys Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Asn Lys

65 70 75 80

tcg ttc gtg tgg gtg caa ttg tgg gtt cta ggt aga caa gca tgg cca 288

Ser Phe Val Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Trp Pro

85 90 95

gaa gtg ttg aag aag gaa ggt ttg cgt tac gat agt gct acc gat gac 336

Glu Val Leu Lys Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asp

100 105 110

ttg tac atg ggt gaa gaa gaa aaa gag cgt gcc tta aag gct aac aac 384

Leu Tyr Met Gly Glu Glu Glu Lys Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asn Asn

115 120 125

cca cag cac ggt atc acc aag gaa gaa atc aag cag tac atc aag gag 432

Pro Gln His Gly Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu

130 135 140

tac gtg gat gct gcc aag aaa gcc atc gat gca ggt gca gac ggt gtg 480

Tyr Val Asp Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val

145 150 155 160

caa atc cat tct gcc aac ggt tac ttg ttg aac cag ttt ttg gac cct 528

Gln Ile His Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro

165 170 115

att tct aac aac aga acc gac gag tac ggt gga tcg atc gag aac cgt 576

Ile Ser Asn Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg

180 185 190

gcg aga ttc act ttg gaa gtg gtt gat gcc gtt gta gat gca gtt ggt 624

Ala Arg Phe Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Val Gly

195 200 205

gcc gaa aga acc tcc atc aga ttc tct cct tac ggt act ttt ggt acc 672

Ala Glu Arg Thr Ser Ile Arg Phe Ser Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Thr

210 215 220

atg tcc ggt ggt gag aac cct ggc atc gtt gcc caa tat gca tac gtc 720

Met Ser Gly Gly Glu Asn Pro Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val

225 230 235 240

att ggt gag ttg gaa aag aga gct aga gct ggc aag aga ttg gcc ttc 768

Ile Gly Glu Leu Glu Lys Arg Ala Arg Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe

245 250 255

atc gat ttg gtc gag cct cgt gtg acc gac cca ttc cta cca gaa ttc 816

Ile Asp Leu Val Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Phe Leu Pro Glu Phe

260 265 270

gag aag tgg ttc aag gaa ggt acc aac gaa ttc atc tac tct atc tgg 864

Glu Lys Trp Phe Lys Glu Gly Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Ser Ile Trp

275 280 285

aag ggt cca gtt ctc aga gtt ggt aac tat gct ttg gac cca gat caa 912

Lys Gly Pro Val Leu Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Pro Asp Gln

290 295 300

gct act atc gac tct aag aag cct aac acc ttg atc ggt tac ggt aga 960

Ala Thr Ile Asp Ser Lys Lys Pro Asn Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg

305 310 315 320

tcc ttt att gcc aac cca gac ttg gtg tac cgt ttg gaa aag ggt ttg 1008

Ser Phe Ile Ala Asn Pro Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Lys Gly Leu

325 330 335

cca ttg aac aag tat gat aga aac acc ttc tac acc ttc acc aaa gag 1056

Pro Leu Asn Lys Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Tyr Thr Phe Thr Lys Glu

340 345 350

gg 1058

<210>22

<211>352

<212>PRT

<213>乳酒假丝酵母

<400>22

His Arg Val Val Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro

1 5 10 15

Gly Asn Ile Pro Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg

20 25 30

Ser Gln Tyr Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser

35 40 45

Ala Gln Ser Gly Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu

50 55 60

Gln Leu Ala Glu Trp Lys Lys Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Asn Lys

65 70 75 80

Ser Phe Val Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Trp Pro

85 90 95

Glu Val Leu Lys Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asp

100 105 110

Leu Tyr Met Gly Glu Glu Glu Lys Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asn Asn

115 120 125

Pro Gln His Gly Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu

130 135 140

Tyr Val Asp Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val

145 150 155 160

Gln Ile His Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro

165 170 175

Ile Ser Asn Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg

180 185 190

Ala Arg Phe Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Val Gly

195 200 205

Ala Glu Arg Thr Ser Ile Arg Phe Ser Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Thr

210 215 220

Met Ser Gly Gly Glu Asn Pro Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val

225 230 235 240

Ile Gly Glu Leu Glu Lys Arg Ala Arg Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe

245 250 255

Ile Asp Leu Val Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Phe Leu Pro Glu Phe

260 265 270

Glu Lys Trp Phe Lys Glu Gly Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Ser Ile Trp

275 280 285

Lys Gly Pro Val Leu Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Pro Asp Gln

290 295 300

Ala Thr Ile Asp Ser Lys Lys Pro Asn Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg

305 310 315 320

Ser Phe Ile Ala Asn Pro Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Leu Asn Lys Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Tyr Thr Phe Thr Lys Glu

340 345 350

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IA1(上游区的反义引物)

<400>23

attcctcggc ccattcagtg ttggg 25

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IS1(下游区的有义引物)

<400>24

ggtgtaccgt ttggaaaagg gtttgc 26

<210>25

<211>1796

<212>DNA

<213>乳酒假丝酵母

<400>25

tatatatata tatatgtata tatttaggtt aatactgagt atttgactta gaataaagaa 60

ggctaatatt ggtagtagta gtggtagcag ttagagcatc tgcagcaccg agacctaact 120

aattaattat atcaacaaac tgtcgagatg tcgtacatga actttgaccc taagccattg 180

ggagacacca atatcttcaa gccaatcaag atcggtaaca atgagctaaa acacagagta 240

gtcatgccag cattgactag aatgagagcc attgcaccag gaaacatccc aaacactgaa 300

tgggccgagg aatactacag acaacgttct caataccctg gtacccttat tatcacggaa 360

ggtactttcc cttctgcgca atcaggtggt tacccaaatg tgccaggtat ctggtccaaa 420

gagcaattgg ctgaatggaa aaagatcttc aatgcaatcc atgagaacaa atcgttcgtg 480

tgggtgcaat tgtgggttct aggtagacaa gcatggccag aagtgttgaa gaaggaaggt 540

ttgcgttacg atagtgctac cgatgacttg tacatgggtg aagaagaaaa agagcgtgcc 600

ttaaaggcta acaacccaca gcacggtatc accaaggaag aaatcaagca gtacatcaag 660

gagtacgtgg atgctgccaa gaaagccatc gatgcaggtg cagacggtgt gcaaatccat 720

tctgccaacg gttacttgtt gaaccagttt ttggacccta tttctaacaa cagaaccgac 780

gagtacggtg gatcgatcga gaaccgtgcg agattcactt tggaagtggt tgatgccgtt 840

gtagatgcag ttggtgccga aagaacctcc atcagattct ctccttacgg tacttttggt 900

accatgtccg gtggtgagaa ccctggcatc gttgcccaat atgcatacgt catrggtgag 960

ttggaaaaga gagctagagc tggcaagaga ttggccttca tcgatttggt cgagcctcgt 1020

gtgaccgacc cattcctacc agaattcgag aagtggttca aggaaggtac caacgaattc 1080

atctactcta tctggaaggg tccagttctc agagttggta actatgcttt ggacccagat 1140

caagctacta tcgactctaa gaagcctaac accttgatcg gttacggtag atcctttatt 1200

gccaacccag acttggtgta ccgtttggaa aagggtttgc cattgaacaa gtatgataga 1260

aacaccttct acaccttcac caaagaaggt tacaccgatt acccaagcta cgaggaatcc 1320

gtcgcaaagg gttacaagaa agaggaaaag aagtactaag cttgaactga taactagcca 1380

ggaccagaat ctgtcatcct ctctactttc taattaattt ttatgtatga tggatgactt 1440

taatattata ttattatata atacatatgc ctaaactaac tactacactt gggaaattgg 1500

tggcagatga ggggcctttg accttcaatg tttgtatgta agtaatgatt caaaagattc 1560

tcctctatag ttggttagtt actactaaaa gaaaccttca atataaaaca atgatcgaga 1620

atacattatt aaattaacct atgaatttat aaaataaaag agataaaata aaattaaaaa 1680

ctaccattaa gtctttgtgc gaaatgagta accttatatt aataaaagat gtgaagtgtg 1740

gtgtacgtgt gcgtgtacgt gcgtgtgcaa aatttgtgtg tgtttaagtg taaaat 1796

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>有义引物

<400>26

gagcatctgc agcaccgaga 20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物

<400>27

gagaggatga cagattctgg 20

<210>28

<211>1310

<212>DNA

<213>乳酒假丝酵母

<400>28

gagcatctgc agcaccgaga cctaactaat taattatatc aacaaactgt cgagatgtcg 60

tacatgaact ttgaccctaa gccattggga gacaccaata tcttcaagcc aatcaagatc 120

ggtaacaatg agctaaaaca cagagtagtc atgccagcat tgactagaat gagagccatt 180

gcaccaggaa acatcccaaa cactgaatgg gccgaggaat actacagaca acgttctcaa 240

taccctggta cccttattat cacggaaggt actttccctt ctgcgcaatc aggtggttac 300

ccaaatgtgc caggtatctg gtccaaagag caattggctg aatggaaaaa gatcttcaat 360

gcaatccatg agaacaaatc gttcgtgtgg gtgcaattgt gggttctagg tagacaagca 420

tggccagaag tgttgaagaa ggaaggtttg cgttacgata gtgctaccga tgacttgtac 480

atgggtgaag aagaaaaaga gcgtgcctta aaggctaaca acccacagca cggtatcacc 540

aaggaagaaa tcaagcagta catcaaggag tacgtggatg ctgccaagaa agccatcgat 600

gcaggtgcag acggtgtgca aatccattct gccaacggtt acttgttgaa ccagtttttg 660

gaccctattt ctaacaacag aaccgacgag tacggtggat cgatcgagaa ccgtgcgaga 720

ttcactttgg aagtggtcga tgccgttgtc gatgcagttg gtgccgaaag aacctccatc 780

agattctctc catacggtac ttttggtacc atgtccggtg gtgagaaccc tggcatcgtt 840

gctcaatatg catacgtcat tggtgagttg gaaaagagag ctagagctgg caagagattg 900

gcgttcatcg atttggtcga gcctcgtgtg accgacccat tcctaccaga attcgagaag 960

tggttcaagg aaggtaccaa cgaattcatc tactctatct ggaagggtcc agttctcaga 1020

gttggtaact atgctttgga cccagatcaa gccactctcg actctaagaa gcctaacact 1080

ttgatcggtt acggtagatc cttcatcgcc aacccagact tggtgtaccg tttggaaaag 1140

ggtttgccat tgaacaagta tgatagaaac accttttaca cattcactaa ggaaggttac 1200

accgattacc caagctacga agaatccgtc gcaaagggtt acaagaaaga ggaaaagaag 1260

tactaagctt gaactgataa ctagccagga ccagaatctg tcatcctctc 1310

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物ExS

<400>29

caccatgt cgtacatgaact ttgac 25

<210>30

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物ExA

<400>30

ttagtacttc ttttcctctt tcttgtaac 29

<210>31

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并引物，编码SEQ ID NO：19

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>I

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(9)..(9)

<223>I

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>n是a或c或g或t

<400>31

ggagayacaa ayathttyaa rccnat 26

<210>32

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并引物，编码SEQ ID NO：20

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>n是a或c或g或t

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(15)..(15)

<223>I

<220>

<221>经修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>I

<400>32

ccytcyttng traaagtrta raaagt 26

Claims

1.一种分离的DNA，其核苷酸序列编码具有烯酮还原酶活性的酶，其中所述酶的特征在于以下理化特性：

(a)分子量：61,300±5,000Da，其利用凝胶过滤测定，由一个亚基组成；

(b)辅助因子：NADPH和NADH；

(c)底物特异性：作用于α，β-不饱和酮；

(d)最适宜的温度：55-60℃，pH 7.4；和

(e)最适pH值：pH 4.5-8.5，

并且其中所述核苷酸序列选自如下构成的组：

(i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；和

(ii)编码烯酮还原酶的核苷酸序列，该烯酮还原酶由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的分离的DNA，其中所述核苷酸序列是编码SEQID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

3.包含权利要求1的DNA的载体或质粒。

4.用权利要求1的DNA或权利要求3的载体或质粒转化或转染的宿主细胞。

5.左旋二酮的生产方法，包括在适合于左旋二酮的生产的条件下用权利要求4的宿主细胞或其无细胞抽提物接触酮基异佛尔酮。

6.根据权利要求5的方法，其中适合于左旋二酮的生产的条件是pH值从4.0到9.0、温度范围从10到60℃，接触15分钟到72小时

7.根据权利要求6的方法，其中适合于左旋二酮的生产的条件是pH值从5.0到8.0、温度范围从20到60℃，接触30分钟到48小时。