CN100572537C - 水稻矮秆基因 - Google Patents

Abstract

水稻矮秆基因，涉及一种水稻基因，尤其是涉及一种通过T-DNA***突变的方法获得的水稻矮秆基因。提供一种通过T-DNA***突变的方法获得的osDw基因及其克隆方法；osDw基因RNAi表达载体与构建方法；osDw基因的遗传转化方法及其在遗传转化中的应用。基因全长为2720个碱基，其中第33～35的ATG为起始密码子，第2253～2255的TGA序列为终止密码子。克隆方法为根据blast分析结果以NCBI上公布的核酸序列为基础，采用PCR方法扩增出2.7kb核酸片断；回收核酸片断，接到T载体上后测序确证。具有控制水稻株高功能。可根据其序列，构建RNAi载体，通过转基因方法获得矮秆植株。

Description

水稻矮秆基因

技术领域

本发明涉及一种水稻基因，尤其是涉及一种通过T-DNA***突变的方法获得的水稻矮秆(Oryza sativa Dwarf，简写为osDw)基因。

背景技术

随着水稻基因组测序计划的完成以及饱和物理图谱的建立(Feng Q，Zhang Y，Hao P，et al.Sequence and analysis of rice chomosome 4.Nature.2002 21；420(6913)：316-320)，其功能基因组的研究目前已成为热点之一。有关功能基因的克隆有诸多方法，其中***标签法是克隆植物功能基因的有效方法之一，如果T-DNA***到调控植物生长发育的功能基因中，就可能引起功能基因的失活，从而产生生理或者表型突变。利用T-DNA***突变体中的T-DNA标签，采用PCR或者质粒拯救法克隆T-DNA的旁邻序列后，就可以此序列为探针，从基因组或cDNA文库中克隆基因全长，并进行核酸和蛋白序列的分析和功能预测，然后鉴定该基因在水稻的生长发育中的功能。关于利用标签法克隆植物功能基因的研究，目前国际上已有实验室建立了模式植物拟南芥的***饱和突变体库，并且利用突变体库克隆了数十个调控生长、发育以及抗性的基因(Alonso JM，Stepanova AN，Leisse TJ，et al.Genomewide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.Science.2003.301：653-657；Liu PP，Koizuka N，Homrichhausen TM，et al.Large-scalescreening of Arabidopsis enhancer-trap lines for seed germination-associated genes.Plant J.2005；41(6)：936-44)。有关利用标签法克隆水稻功能基因的研究，荷兰国际植物研究公司、韩国Pohang科技大学和日本农业资源研究所以及我国科学院、华中农业大学等单位已开展了有关此方面的研究，已获得大量的***突变体(An S，Park S，Jeong DH，Lee DY，et al.Generation and analysi s of end sequence database for T-DNA tagginglines in rice.Plant Physiol.2003；133(4)：2040-2047；Hiei Y，Ohta S，Komari T，etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA Plant J.19946(2)：271-282：Wu C，Li X，Yuan W，et al Development of enhancer trap lines for functional analysisof the rice genome Plant J.2003；35(3)：418-427)。但是，现阶段有关利用***突变法克隆基因的研究报道不多。

目前验证和鉴定基因功能主要通过功能互补实验和基因敲除的方法，其中利用RNAi技术是进行功能基因鉴定最行之有效的方法之一，其主要优点有：1、RNAi在确定基因的功能时具有靶向性，在一个沉默载体中***部分基因序列就可以确定某一基因的功能，不需要消耗大量的劳动力进行群体筛选工作。2、RNAi能用来选择性地沉默某一基因家族中的单个基因或者沉默一个家族中的许多基因。3、RNAi能够用来确定胚胎致死基因的功能。

RNAi是由dsRNA介导的特异性基因沉默现象，是1988年首次在植物和线虫中(C.elegans)报道(Fraser AG，Kamath RS，Zipperlen P et al.Functional genomicanalysis of C.elegans chromosome I by systematic RNA interference.Nature.2000408：325-330；Gonczy P，Echeverri C，Oegema K，et al.Functional genomic analysisof cell division in C.elegans using RNAi of genes on chromosome III.Nature.2000408：331-336)。其大致过程为：外源或者内源转录生成的dsRNA被一种RNase III类的核酸酶Dieer切割成21～25nt的干扰性的小RNA，siRNA进一步与其他多种蛋白成分结合形成RNA诱导的沉默复合体，介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合并引起同源性靶mRNA分子的切割效应。

发夹RNAi构件是被认为是达到持续高水平沉默效率最好的构件，在RNAi载体中，一个内含子位于正义和反义编码序列之间，然后在转录加工时拼接而产生dsRNA。有研究发现，含内含子的发夹RNA比不含内含子的发夹RNA介导的基因沉默更有效果(Lawrence RJ，Pikaard CS.Transgene-induced RNA interference：a strategy for overcoming generedundancy in polyploids to generate loss-of-function  mutations.Plant J.2003；36(1)：114-121；Wesley SV，Helliwell CA，Smith NA，et al.Construct design forefficient，effective and high-thoughput gene silencing in plants.Plant J.2001；27(6)：581-590)。

目前利用RNAi技术，已研究了GAMyb，SLN1，PKABA1等基因在GA诱导的大麦糊粉层a-淀粉酶中的作用(Zentella R，Yamauchi D，Ho TH.Molecular dissection of thegibberellin/abscisic acid signaling pathways by transiently expressed RNAinterference in barley aleurone cells.Plant Cell.2002；14(9)：2289-2301)：鉴定AGAMOUS(AG)，CLAVATA3，APETALA1和PERIANTHIA基因在拟南芥花器官发育中的作用(Chuang CF，Meyerowitz EM.Specific and heritable genetic interference bydouble-stranded RNA in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci U S A.200025：97(9)：4985-4990)。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种通过T-DNA***突变的方法获得的osDw基因及其克隆方法。

本发明的另一目的在于提供osDw基因RNAi表达载体与构建方法。

本发明的另一目的在于osDw基因的遗传转化方法及其osDw基因在水稻遗传转化中的应用。

本发明所说的osDw基因序列(包含内含子)为：

acataagcta gctccccata ctctcacacc ccatgtcttc tggaggagga ggaggaggag     60

gaggagatcg ccatggcccc taccaccagc acgggcacct cggccgcggc gaaggcgctg    120

attacgtgta cagcagcagc gacatggaga gcttcttctt cagccaaccc gggggcgtcg    180

gcatcggcgg gggtggtggt ggcgtcgtcg gcgccggcgg tgccgacgag atcatgccgt    240

actccagcat cacggactac ctgcaggggt tattggaccc ctccgggcta gctcggcacc    300

tcgacgtggc gtgcccgtcg tctcaggaca cggtggtcaa gcaggagctg tcggtggatg    360

tgacgagcca cgacagccag ggcaccggcg gcgtcgccgg agaaggcgtc gcgcaggcca    420

cgccgaactc gtcggcgtcc ttctcgtcca gcgacggaga ggcggagggc ggcaaatcgt    480

cacgccggtg caagaagggt caggcgaagg cggaggagga ggacgacaag gatgaggagg    540

atggagagaa ctccaagaaa ccgtatgtta aatttccatt gattctactc tatactttgt    600

ctgattcttg tcttgatttc ttgcttgatt aattcttttt tgatgcgtgt cttgagatgg    660

ggatactttc ttggggctag atctggttgg tcatactgtt gcggagttgc aaaatttgac    720

ctgaaatttt ctttcgttta tgctttctct ctactgcatg catggtgtga acattagggt    780

ttgctagaat tttggttcct tagggttctt tttagtagat ccgtctatcc tcttgttccc    840

cttttcttct gattccgttt tgacccaatt tccaatatga tctttcagac gatggggcta    900

ctactattcg atttaattta atagacaacc aacctatgct ccataataga tcttgcgtag    960

aatgaatcaa ttttacgagt tatagcttca atttttgact tgctaggtct ttgaagatta   1020

tattatgatt tcccctttta gaaatgattc aaattaagat atattttcgt atcaccacca   1080

accacctaaa tctacaatag ttcctcagta cttttgcaaa attaacgctg atcttgcccc   1140

ataacatgca atccaacaga tatctagcta gctagctaac ttattagacc ctaattaata   1200

ctatatatca aaataacaac tatttctagc aaaacctggt gctaatctaa catgaaatag   1260

ctagctattc ccatagtcca ccatgatcct acctatctag caagctagtt agctagtttg   1320

attgttggtg ctctgaaaaa gcccaaacta attaataatt aggcctgatt gagcttgtca    1380

ccgcagaaat atcaactgat cttctgaatc catatcatct ctctgtttct agctaatcca    1440

cctgacctta tttttgatat tttgtaccat gcatctacac aggaacaagc ccaagaagaa    1500

agctgagaag aggcagcggc agcctcgcgt ggcgttcctc accaagagcg aggttgatca    1560

cctcgaggac ggctaccggt ggcgcaagta cggccagaag gcagtcaaga acagcccata    1620

cccgaggtac acatctatat acatgtacaa accttaattt cacccagttg ttgtagcaca    1680

tacatatatc gtagtatacc atgttactgt gccatacaat tgcatggcac gatggtgttc    1740

aagtactcca atttcaaaat gcaattcaat tcgaattcga atattgcagg agctactacc    1800

ggtgcacgac gcccaagtgc ggtgtgaaga agcgggtgga gcggtcgtac caggacccct    1860

ccacggtgat caccacgtac gaagggcagc acacgcacca cagcccggcg agcctccgcg    1920

gcggcggcgg cggcgtcggc atcgtcggag ggcaccacca ccaccacctc ttcatgcccg    1980

gcgtgcatgg cctgccgccg tcgcacctca tgccggcggg gttccaccct gagctgatgg    2040

gcctcatgca ccaccacccg gccatggccg ccgccgccgc aaaccctagc atgtacttcc    2100

cgggcgtagc tgcttctgct ccgccgcctc ctgctgtggc tggcggcggt gcaatgccgc    2160

ccaacgatca tcctcctctt cagcagcatc acttcactga ctacgccctg ctgcaagacc    2220

ttttcccttc cacaatgccc agcagcaacc catgatgatg actgatctaa ctgattctgc    2280

acaaatatat actactcaat atttaactag cacccggaat ttatcaagat gcttttcaaa    2340

cattggagtc gttgcgccaa aaatgtgatg gctagggagt gcttgatgat cagcttggtc    2400

ttggtgagaa tatataattg ttattaatta attgattttc tgcaagcttt tcatcttgaa    2460

cgtaacttgt gtgtgttgtg cacttcatgc ttttttctct cttccatttg tcaacatttc    2520

cctggttgca aattgaacgg atcagtagag atggaagcta caactttata actagaacgg    2580

ctgcattcca cttgattctt cagcatagcc ctttactgtt ctgcacctct agacttattg    2640

tacatgcatg tactagtgta tatcatgtgt acctcattga ctcattttcg gagagagcaa    2700

attaattaat atttcgtctc

基因全长为2720个碱基，其中第33～35的ATG为起始密码子，第2253～2255的TGA序列为终止密码子。

本发明所说osDw基因全长克隆方法为：

1)根据blast分析结果以NCBI上公布的核酸序列为基础，采用PCR的方法扩增出2.7kb的核酸片断；

2)回收上述核酸片断，连接到T载体上后，送交博亚公司测序，确证此核酸序列即为osDw基因。

本发明所说的osDw基因RNAi表达载体是指包含osDw基因的3’端416bp的核苷酸序列，将此416bp核酸片断分别正向和反向连接waxy内含子的两端，其核苷酸序列如下：

gaagaagcgg gtggagcggt cgtaccagga cccctccacg gtgatcacca cgtacgaagg      60

gcagcacacg caccacagcc cggcgagcct ccgcggcggc ggcggcggcg ttggcatcgt     120

cggagggcac caccaccacc acctcttcat gcccggcgtg cacggcctgc cgccgtcgca     180

cctcatgccg gcggggttcc accctgagct gatgggcctc atgcaccacc acccggccat     240

ggccgccgcc gcaaacccta gcatgtactt cccgggcgta gctgcttctg ctccgccgcc     300

tcctgctgtg gctggcggcg gtgcaatgcc gcccaacgat catcctcctc ttcagcagca     360

tcacttcact gactacgccc tgctgcaaga ccttttccct tccacaatgc ccagcaggat     420

ccaaccttac gtacgcgtgc acctaggaag gtatacatat atgtttataa ttctttgttt     480

cccctcttat tcagatcgat cacatgcatc tttcattgct cgtttttcct tacaagtagt     540

ctcatacatg ctaatttctg taaggtgttg ggctggaaat taattaatta attaattgac     600

ttgccaagat ccatatatat gtcctgatat taaatcttcg ttcgttatgt ttggttaggc     660

tgatcaatgt tattctagag gctagagaaa cacacccagg ggttttccaa ctagctccac     720

aagatggtgg gctagctgac ctagatttga agtctcactc cttataatta ttttatatta     780

gatcattttc taatattcgt gtcttttttt attctagagt ctagatcttg tgttcaactc     840

tcgttaaatc atgtctctcg ccactggaga aacagatcag gagggtttat tttgggtata     900

ggtcaaagct aagattgaaa ttcacaaata gtaaaatcgg aatccaacca attttagtan     960

ccgagtttgg tccaaaggca aaatggtata tagctagatt attgtttctg ctgggcattg    1020

tggaagggaa aaggtcttgc agcagggcgt agtcagtgaa gtgatgctgc tgaagaggag    1080

gatgatcgtt gggcggcatt gcaccgccgc cagccacagc aggaggcggc ggagcagaag    1140

cagctacgcc cgggaagtac atgctagggt ttgcggcggc ggccatggcc gggtggtggt    1200

gcatgaggcc catcagctca gggtggaacc ccgccggcat gaggtgcgac ggcggcaggc    1260

cgtgcacgcc gggcatgaag aggtggtggt ggtggtgccc tccgacgatg ccaacgccgc    1320

cgccgccgcc gcggaggctc gccgggctgt ggtgcgtgtg ctgcccttcg tacgtggtga    1380

tcaccgtgga ggggtcctgg tacgaccgct ccacccgctt cttc                     1424

其中1～416为osDw基因的正义序列，417～1007为waxy内含子序列，1008～1424为osDw的反义序列。

本发明所说osDw基因RNAi载体的构建方法为：

1)按osDw基因的3’端416bp核酸序列，合成两对引物，并在两对引物中分别引入Kpn 1和BamH I以及Sac I和SpeI酶切位点；然后PCR扩增得到预期核酸片断；

2)用Kpn 1和BamH I酶切osDw基因的3’端416bp的PCR产物以及ds1301，并将酶切后的核酸片断连接到ds1301，转化大肠秆菌感受态细胞；

3)经PCR及酶切鉴定得阳性克隆，并命名为ds1301-oxDwsen；

4)用Sac I和Spe I酶切416bp核酸序列，并与ds1301-oxDwsen连接；

5)经PCR及酶切鉴定得到阳性克隆，并命名为ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen；

6)测序验证结果；

7)抽提ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen质粒；

8)取1微克ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen质粒DNA转化农秆菌EHA105；

9)经PCR及酶切鉴定得阳性克隆，甘油保存，备用。

本发明所说的osDw基因遗传转化方法为：

1)取水稻胚，表面消毒，清洗；

2)剥出水稻幼胚，接种于诱导培养基中，暗培养条件下诱导愈伤组织；

3)吸取农秆菌菌液于YEB中培养；

4)将农秆菌菌液离心，然后用AA液体培养基悬浮；

5)挑取愈伤组织，浸泡在AA液体共培养基中；

6)将愈伤组织块从共培养基中夹出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入附加乙酰丁香酮(AS)的共培养基中培养；

7)将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养；

8)将再生小苗移栽到营养土中。

在步骤1)中，将10％的次氯酸钠表面消毒；无菌水清洗3-5遍，每次2-3min。

在步骤2)中，用解剖针剥出幼胚，接种于诱导培养基(MS+2mg/L 2，4-D)中，暗培养条件下诱导愈伤组织，2周后继代一次。

在步骤3)中，吸取0.01ml保存的菌液于10ml YEB(含Kan 50μg/mL)中，28℃振荡32h。

在步骤4)中，将农秆菌菌液在1,500转速的条件下离心5分钟，然后用AA液体培养基悬浮。

在步骤5)中，挑取愈伤组织，浸泡在AA液体共培养基中20min。

本发明具有以下优点：

1、本发明克隆的水稻osDw基因是一种新的具有控制水稻株高功能基因。

2、可以根据osDw基因的序列，构建RNAi载体，通过转基因方法获得矮秆植株。

3、构建RNAi载体时，在osDw基因的一段(例如3’端416bp核酸序列)正向和反向序列之间***内含子序列可以更有利于诱导基因沉默。

附图说明

图1为本发明的转osDWsen-waxy-osDWantisen基因的再生小苗。

图2为本发明的部分转化植株的PCR扩增结果。在图2中，1，12-3；2，5-2；3，21-1；4，21-2；5，9-1；6，9-2；7，2-3；8，8-1；9，2-3；10，2-1；ck阴性对照；M.DL 2000marker。

图3为本发明的转化植株39-1(右图)和对照植株(左图)的形态比较。

图4为本发明的转化植株(黑)和对照植株(白)的株高差异。未抽穗株高测量从尖叶顶部到基部，已抽穗株高测量从穗顶部到基部，纵坐标为株高(CM)。

图5为本发明的抗性愈伤。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明：

实施例1

以水稻品种日本晴的基因组DNA为模板，以NCBI上公布的核酸序列为基础，设计两对引物，进行PCR扩增。回收扩增产物，并取8μl回收产物与1μl的T-载体在16℃的条件下连接过夜，连接产物转化大肠秆菌感受态细胞，挑选重组子，进行PCR和酶切鉴定。

挑取鉴定呈阳性的重组子，送交博亚公司测序。

实施例2

选取osDw基因的3端416bp核酸序列，合成两对引物，并在引物中分别引入Kpn 1和BamH I以及Sac I和Spe I酶切位点。然后以基因组DNA位模板，进行PCR扩增，PCR的扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火1min，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸5min。回收PCR产物，并分别用Kpn 1和BamH I双酶切以及Sac I和SpeI双酶切，回收酶切产物。将ds1301用Kpn1和BamH I双酶切，回收酶切产物。取1μl T4连接酶Buffer，7μl Kpn1和BamH I双酶切的PCR产物，1μL Kpn 1和BamH I双酶ds1301，10U T4连接酶，在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠秆菌感受态细胞，挑选重组子，进行PCR和酶切鉴定后，获得ds1301-osDwsen-waxy-nos中间载体。

挑取ds1301-osDwsen-waxy-nos阳性重组子，在LB培养基中震荡培养过夜，抽提质粒，并用Sac I和SpeI双酶切，回收酶切产物，待用。取1μl T4连接酶Buffer，7μl的经Sac I和Spe I双酶切的PCR产物，1μl的载体酶切产物，10U T4连接酶，在10μl的体系下连接过夜。连接产物转化大肠秆菌感受态细胞，挑选重组子，进行PCR、酶切鉴定以及测序验证后，获得ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen-nos RNAi载体。

实施例3

共培养基的制备；挑取-20℃保存的甘油菌于1.5ml LB(含Kan 50μg/ml)中，28℃振荡32h后，吸取150μl农秆菌液于10ml LB(含Kan 50μg/mL)中，28℃培养24h后，离心，收集菌体，用等体积的用AA液体培养基悬浮菌体，并向菌体中加入乙酰丁香酮(AS)，使其浓度达到100μmol/L。

实施例4

取日本晴幼胚，用10％的次氯酸钠表面消毒45min后；用无菌水清洗3-5遍，每次2-3min；用解剖针剥出幼胚，接种于MS+2，4-D 2mg/L的诱导培养基中，在25-26℃，黑暗条件下诱导愈伤组织，15天后将愈伤组织转移至继代培养基中继代一次。

取新鲜的愈伤组织，浸泡在菌液中20min后，用镊子夹出愈伤组织，放在含有多层滤纸的培养皿中，吸干多余的菌液。然后放入MS+2，4-D 2mg/L+100μmol/L AS的共培养基上暗培养3天。

用镊子夹取共培养3天后的愈伤组织，放入MS+2，4-D 2mg/L+Cb 500mg/L+Hyg100mg/L的筛选培养基上进行筛选，大部分愈伤在10天内逐渐变褐，10天之后一部分褐化的组织上先后长出乳白色，略透明，松散，生长相对旺盛的抗性愈伤。

将抗性愈伤在MS+ABA 2mg/L+6-BA3mg/L+NAA 1mg/L+Cb 250mg/L+Hyg 25mg/L的预分化培养基中预分化1周后，抗性愈伤组织中有绿色的小芽点出现，将这些带绿点的愈伤组织转移到MS+6-BA 3mg/L+NAA 1mg/L+Sorbitol 13g/L+Cb 250mg/L+Hyg 25mg/L的分化培养基上培养后，绿色小点继续分化，并相继成苗。从绿点到分化成苗所需要的时间为3-6周不等。

实施例5

将分化后的小苗移栽到土壤中，待成活后，剪取叶片，进行PCR鉴定，标记PCR鉴定呈阳性的植株，在抽穗时，测量单株的株高，并与转化空载体的植株比较。

实施例6

与实施例2类似，基区别在于选取osDw基因的200bp核酸序列，按实施例2的方法构建RNAi载体，甘油保存，备用。

实施例7

与实施例2类似，基区别在于选取osDw基因的800bp核酸序列，按实施例2的方法构建RNAi载体，甘油保存，备用。

实施例8

与实施例2类似，基区别在于选取osDw基因的800bp核酸序列，按实施例2的方法构建RNAi载体，甘油保存，备用。

实施例9

与实施例2类似，基区别在于以osDw基因的全长核酸序列，按实施例2的方法构建RNAi载体，甘油保存，备用。

实施例10

取日本晴幼胚，10％的次氯酸钠表面消毒45min；无菌水清洗3遍，每次3min。用解剖针剥出幼胚，接种诱导培养基中，25℃，暗培养条件下诱导愈伤组织，2周后继代一次。吸取-20℃保存的菌液于1.5ml YEB(含Kan 50μg/mL)中，28℃振荡32h。吸取150μl农秆菌新鲜菌液于10ml YEB(含Kan 50μg/mL)中，28℃培养24h。将农秆菌菌液在1,500rpm的条件下离心5min，然后用AA液体培养基悬浮，并稀释成OD 0.3～0.6的浓度。用镊子挑取愈伤组织，浸泡在菌液中20min。用镊子将愈伤组织块从菌液中夹出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入附加乙酰丁香酮(AS)的AA固体共培养基中。共培养2～3天后，将愈伤组织块转移到筛选培养基上，15天后继代一次，共2次。挑选生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，在25℃，12h的光照条件下预分化2周。将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养，将再生小苗移栽到营养土中。

序列表

osDw基因序列(包含内含子)SEQ ID：1为：

acataagcta gctccccata ctctcacacc ccatgtcttc tggaggagga ggaggaggag      60

gaggagatcg ccatggcccc taccaccagc acgggcacct cggccgcggc gaaggcgctg     120

attacgtgta cagcagcagc gacatggaga gcttcttctt cagccaaccc gggggcgtcg     180

gcatcggcgg gggtggtggt ggcgtcgtcg gcgccggcgg tgccgacgag atcatgccgt     240

actccagcat cacggactac ctgcaggggt tattggaccc ctccgggcta gctcggcacc     300

tcgacgtggc gtgcccgtcg tctcaggaca cggtggtcaa gcaggagctg tcggtggatg     360

tgacgagcca cgacagccag ggcaccggcg gcgtcgccgg agaaggcgtc gcgcaggcca     420

cgccgaactc gtcggcgtcc ttctcgtcca gcgacggaga ggcggagggc ggcaaatcgt     480

cacgccggtg caagaagggt caggcgaagg cggaggagga ggacgacaag gatgaggagg     540

atggagagaa ctccaagaaa ccgtatgtta aatttccatt gattctactc tatactttgt     600

ctgattcttg tcttgatttc ttgcttgatt aattcttttt tgatgcgtgt cttgagatgg     660

ggatactttc ttggggctag atctggttgg tcatactgtt gcggagttgc aaaatttgac     720

ctgaaatttt ctttcgttta tgctttctct ctactgcatg catggtgtga acattagggt     780

ttgctagaat tttggttcct tagggttctt tttagtagat ccgtctatcc tcttgttccc     840

cttttcttct gattccgttt tgacccaatt tccaatatga tctttcagac gatggggcta     900

ctactattcg atttaattta atagacaacc aacctatgct ccataataga tcttgcgtag     960

aatgaatcaa ttttacgagt tatagcttca atttttgact tgctaggtct ttgaagatta    1020

tattatgatt tcccctttta gaaatgattc aaattaagat atattttcgt atcaccacca    1080

accacctaaa tctacaatag ttcctcagta cttttgcaaa attaacgctg atcttgcccc    1140

ataacatgca atccaacaga tatctagcta gctagctaac ttattagacc ctaattaata    1200

ctatatatca aaataacaac tatttctagc aaaacctggt gctaatctaa catgaaatag    1260

ctagctattc ccatagtcca ccatgatcct acctatctag caagctagtt agctagtttg    1320

attgttggtg ctctgaaaaa gcccaaacta attaataatt aggcctgatt gagcttgtca    1380

ccgcagaaat atcaactgat cttctgaatc catatcatct ctctgtttct agctaatcca    1440

cctgacctta tttttgatat tttgtaccat gcatctacac aggaacaagc ccaagaagaa    1500

agctgagaag aggcagcggc agcctcgcgt ggcgttcctc accaagagcg aggttgatca  1560

cctcgaggac ggctaccggt ggcgcaagta cggccagaag gcagtcaaga acagcccata  1620

cccgaggtac acatctatat acatgtacaa accttaattt cacccagttg ttgtagcaca  1680

tacatatatc gtagtatacc atgttactgt gccatacaat tgcatggcac gatggtgttc  1740

aagtactcca atttcaaaat gcaattcaat tcgaattcga atattgcagg agctactacc  1800

ggtgcacgac gcccaagtgc ggtgtgaaga agcgggtgga gcggtcgtac caggacccct  1860

ccacggtgat caccacgtac gaagggcagc acacgcacca cagcccggcg agcctccgcg  1920

gcggcggcgg cggcgtcggc atcgtcggag ggcaccacca ccaccacctc ttcatgcccg  1980

gcgtgcatgg cctgccgccg tcgcacctca tgccggcggg gttccaccct gagctgatgg  2040

gcctcatgca ccaccacccg gccatggccg ccgccgccgc aaaccctagc atgtacttcc  2100

cgggcgtagc tgcttctgct ccgccgcctc ctgctgtggc tggcggcggt gcaatgccgc  2160

ccaacgatca tcctcctctt cagcagcatc acttcactga ctacgccctg ctgcaagacc  2220

ttttcccttc cacaatgccc agcagcaacc catgatgatg actgatctaa ctgattctgc  2280

acaaatatat actactcaat atttaactag cacccggaat ttatcaagat gcttttcaaa  2340

cattggagtc gttgcgccaa aaatgtgatg gctagggagt gcttgatgat cagcttggtc  2400

ttggtgagaa tatataattg ttattaatta attgattttc tgcaagcttt tcatcttgaa  2460

cgtaacttgt gtgtgttgtg cacttcatgc ttttttctct cttccatttg tcaacatttc  2520

cctggttgca aattgaacgg atcagtagag atggaagcta caactttata actagaacgg  2580

ctgcattcca cttgattctt cagcatagcc ctttactgtt ctgcacctct agacttattg  2640

tacatgcatg tactagtgta tatcatgtgt acctcattga ctcattttcg gagagagcaa  2700

attaattaat atttcgtctc

核苷酸序列SEQ ID：2为：

gaagaagcgg gtggagcggt cgtaccagga cccctccacg gtgatcacca cgtacgaagg    60

gcagcacacg caccacagcc cggcgagcct ccgcggcggc ggcggcggcg ttggcatcgt   120

cggagggcac caccaccacc acctcttcat gcccggcgtg cacggcctgc cgccgtcgca   180

cctcatgccg gcggggttcc accctgagct gatgggcctc atgcaccacc acccggccat   240

ggccgccgcc gcaaacccta gcatgtactt cccgggcgta gctgcttctg ctccgccgcc   300

tcctgctgtg gctggcggcg gtgcaatgcc gcccaacgat catcctcctc ttcagcagca     360

tcacttcact gactacgccc tgctgcaaga ccttttccct tccacaatgc ccagcaggat     420

ccaaccttac gtacgcgtgc acctaggaag gtatacatat atgtttataa ttctttgttt     480

cccctcttat tcagatcgat cacatgcatc tttcattgct cgtttttcct tacaagtagt     540

ctcatacatg ctaatttctg taaggtgttg ggctggaaat taattaatta attaattgac     600

ttgccaagat ccatatatat gtcctgatat taaatcttcg ttcgttatgt ttggttaggc     660

tgatcaatgt tattctagag gctagagaaa cacacccagg ggttttccaa ctagctccac     720

aagatggtgg gctagctgac ctagatttga agtctcactc cttataatta ttttatatta     780

gatcattttc taatattcgt gtcttttttt attctagagt ctagatcttg tgttcaactc     840

tcgttaaatc atgtctctcg ccactggaga aacagatcag gagggtttat tttgggtata     900

ggtcaaagct aagattgaaa ttcacaaata gtaaaatcgg aatccaacca attttagtan     960

ccgagtttgg tccaaaggca aaatggtata tagctagatt attgtttctg ctgggcattg    1020

tggaagggaa aaggtcttgc agcagggcgt agtcagtgaa gtgatgctgc tgaagaggag    1080

gatgatcgtt gggcggcatt gcaccgccgc cagccacagc aggaggcggc ggagcagaag    1140

cagctacgcc cgggaagtac atgctagggt ttgcggcggc ggccatggcc gggtggtggt    1200

gcatgaggcc catcagctca gggtggaacc ccgccggcat gaggtgcgac ggcggcaggc    1260

cgtgcacgcc gggcatgaag aggtggtggt ggtggtgccc tccgacgatg ccaacgccgc    1320

cgccgccgcc gcggaggctc gccgggctgt ggtgcgtgtg ctgcccttcg tacgtggtga    1380

tcaccgtgga ggggtcctgg tacgaccgct ccacccgctt cttc                     1424

Claims (2)

1、一种水稻矮秆基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID：1所示：

acataagcta gctccccata ctctcacacc ccatgtcttc tggaggagga ggaggaggag      60

gaggagatcg ccatggcccc taccaccagc acgggcacct cggccgcggc gaaggcgctg     120

attacgtgta cagcagcagc gacatggaga gcttcttctt cagccaaccc gggggcgtcg     180

gcatcggcgg gggtggtggt ggcgtcgtcg gcgccggcgg tgccgacgag atcatgccgt     240

actccagcat cacggactac ctgcaggggt tattggaccc ctccgggcta gctcggcacc     300

tcgacgtggc gtgcccgtcg tctcaggaca cggtggtcaa gcaggagctg tcggtggatg     360

tgacgagcca cgacagccag ggcaccggcg gcgtcgccgg agaaggcgtc gcgcaggcca     420

cgccgaactc gtcggcgtcc ttctcgtcca gcgacggaga ggcggagggc ggcaaatcgt     480

cacgccggtg caagaagggt caggcgaagg cggaggagga ggacgacaag gatgaggagg     540

atggagagaa ctccaagaaa ccgtatgtta aatttccatt gattctactc tatactttgt     600

ctgattcttg tcttgatttc ttgcttgatt aattcttttt tgatgcgtgt cttgagatgg     660

ggatactttc ttggggctag atctggttgg tcatactgtt gcggagttgc aaaatttgac     720

ctgaaatttt ctttcgttta tgctttctct ctactgcatg catggtgtga acattagggt     780

ttgctagaat tttggttcct tagggttctt tttagtagat ccgtctatcc tcttgttccc     840

cttttcttct gattccgttt tgacccaatt tccaatatga tctttcagac gatggggcta     900

ctactattcg atttaattta atagacaacc aacctatgct ccataataga tcttgcgtag     960

aatgaatcaa ttttacgagt tatagcttca atttttgact tgctaggtct ttgaagatta    1020

tattatgatt tcccctttta gaaatgattc aaattaagat atattttcgt atcaccacca    1080

accacctaaa tctacaatag ttcctcagta cttttgcaaa attaacgctg atcttgcccc    1140

ataacatgca atccaacaga tatctagcta gctagctaac ttattagacc ctaattaata    1200

ctatatatca aaataacaac tatttctagc aaaacctggt gctaatctaa catgaaatag    1260

ctagctattc ccatagtcca ccatgatcct acctatctag caagctagtt agctagtttg    1320

attgttggtg ctctgaaaaa gcccaaacta attaataatt aggcctgatt gagcttgtca    1380

ccgcagaaat atcaactgat cttctgaatc catatcatct ctctgtttct agctaatcca    1440

cctgacctta tttttgatat tttgtaccat gcatctacac aggaacaagc ccaagaagaa    1500

agctgagaag aggcagcggc agcctcgcgt ggcgttcctc accaagagcg aggttgatca    1560

cctcgaggac ggctaccggt ggcgcaagta cggccagaag gcagtcaaga acagcccata    1620

cccgaggtac acatctatat acatgtacaa accttaattt cacccagttg ttgtagcaca  1680

tacatatatc gtagtatacc atgttactgt gccatacaat tgcatggcac gatggtgttc  1740

aagtactcca atttcaaaat gcaattcaat tcgaattcga atattgcagg agctactacc  1800

ggtgcacgac gcccaagtgc ggtgtgaaga agcgggtgga gcggtcgtac caggacccct  1860

ccacggtgat caccacgtac gaagggcagc acacgcacca cagcccggcg agcctccgcg  1920

gcggcggcgg cggcgtcggc atcgtcggag ggcaccacca ccaccacctc ttcatgcccg  1980

gcgtgcatgg cctgccgccg tcgcacctca tgccggcggg gttccaccct gagctgatgg  2040

gcctcatgca ccaccacccg gccatggccg ccgccgccgc aaaccctagc atgtacttcc  2100

cgggcgtagc tgcttctgct ccgccgcctc ctgctgtggc tggcggcggt gcaatgccgc  2160

ccaacgatca tcctcctctt cagcagcatc acttcactga ctacgccctg ctgcaagacc  2220

ttttcccttc cacaatgccc agcagcaacc catgatgatg actgatctaa ctgattctgc  2280

acaaatatat actactcaat atttaactag cacccggaat ttatcaagat gcttttcaaa  2340

cattggagtc gttgcgccaa aaatgtgatg gctagggagt gcttgatgat cagcttggtc  2400

ttggtgagaa tatataattg ttattaatta attgattttc tgcaagcttt tcatcttgaa  2460

cgtaacttgt gtgtgttgtg cacttcatgc ttttttctct cttccatttg tcaacatttc  2520

cctggttgca aattgaacgg atcagtagag atggaagcta caactttata actagaacgg  2580

ctgcattcca cttgattctt cagcatagcc ctttactgtt ctgcacctct agacttattg  2640

tacatgcatg tactagtgta tatcatgtgt acctcattga ctcattttcg gagagagcaa  2700

attaattaat atttcgtctc

基因全长为2720个碱基，其中第33～35的ATG为起始密码子，第2253～2255的TGA序列为终止密码子。

2、如权利要求1所述水稻矮秆基因在水稻遗传转化中的应用。

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