CN100564393C - 含有外消旋化的氨基酸的多肽之分离 - Google Patents

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Abstract

通过离子交换色谱纯化外消旋化多肽的方法。

Description

含有外消旋化的氨基酸的多肽之分离
发明领域
本发明涉及蛋白质纯化领域。更具体地说，本发明涉及一种分离其中氨基酸外消旋化的多肽之方法。
发明背景
多肽日益被用作属于所有主要治疗范围内的疾病的治疗药物。通过慢性胰岛素施用治疗糖尿病已经实施了80年以上，而且多肽在生长障碍和癌方面的治疗应用也实践了很多年。
大规模生产对治疗应用来说纯度足够高之多肽的经济方法对于其它基于多肽的疗法达到大规模的商品化和对于现有疗法被更广泛地应用来说具有关键性的作用。
治疗用多肽需要高度纯化以有效并避免在对患者施用时引起不利事件。在多肽合成和纯化中的一系列加工步骤已知引起目标多肽中一个或多个氨基酸残基的外消旋化。通常，这些条件为极端的pH和高温，如pH值高于pH12(Sender off等人，J.Pha rm.Sci.87，183-189(1998))。具有消旋化氨基酸残基的多肽变体能够经历现有技术中分析方法的分离和鉴定。这些变体是治疗用途的多肽中不希望的，因为对其毒性的担忧以及因为其可能与期望的多肽具有不同的活性。但是，在制备型规模中，即在工业制备中，分离这些非常相近的多肽是一个严峻的挑战。
从混合物中纯化多肽的步骤在整个治疗性多肽的制备过程中常常需要使用数次。离子交换色谱经常在早期和粗分离步骤中应用，而反相高压液相色谱(RP-HPLC)对于相关多肽在终纯化步骤中的工业化高分辨力分离是优选的方法。业已证明RP-HPLC对于许多多肽的大规模纯化是适合的，但是所述方法相对比较昂贵且容积有限。
我们出人意料的发现了一种离子交换方法，其能够分离当发生氨基酸残基外消旋化时得到的。所述方法适于大规模操作，且提供了具有高容积的、经济的纯化步骤。
附图简述
图1.分离的AU280对时间(分钟)的色谱图。峰1是D-his变体，D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，峰2是Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)。
图2.分离的AU280对时间(分钟)的色谱图。D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)均在主峰洗脱。D-His变体主要集中在主峰的前导侧，可以低损失率通过分级分离或峰切割被分离。
图3.分离的AU215对时间(分钟)的色谱图。峰1含有胰高血糖素延长蛋白-4的L-His变体，峰2含有胰高血糖素延长蛋白-4的D-His变体
定义
下面是本详述中使用的术语的详细定义。
如此处使用的术语“缓冲剂”指的是降低色谱溶剂的pH随着时间变化的倾向的化合物，否则就会发生pH变化。缓冲剂包括但不限于如下化合物，例如乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸钠、双甘氨肽、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、磷酸钠、硼酸盐、TRIS(Tris-羟甲基-氨基甲烷)、乙醇胺或它们的混合物。
如此处使用的术语“有机改性剂”是指加入到色谱溶剂中的有机物。所述有机改性剂可以是单羟基醇类、多羟基醇类以及腈类和酮类。所述有机改性剂的非限制性实例为甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、叔丁醇、己二醇(4-甲基-2，4-戊二醇)、新戊醇(2，2-二甲基-1，3-丙二醇)、乙腈、丙酮和尿素。
如此处使用的术语“多肽”是指由至少5个通过肽键连接的组分氨基酸构成的化合物。所述组分氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸的组，其可为不由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成性氨基酸。不由遗传密码编码的天然氨基酸是例如羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成性氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸，即：由遗传密码编码的氨基酸之D-异构体，如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)和β-丙氨酸。多肽可包括单一肽链，或其可包括一条以上的肽链，如人胰岛素，其中两条肽链由二硫键连接。
如此处使用的术语“胰高血糖素样肽”指的是胰高血糖素延长蛋白(exendin)和除了胰高血糖素之外的来自前胰高血糖素原基因的同源肽，即胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)和oxynthomodulin(OXM)以及它们的类似物和衍生物。衍生自前胰高血糖素原基因的肽是胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和oxyntomodulin(OXM)。毒蜥(Gila monster)中发现的胰高血糖素延长蛋白与GLP-1同源，也有促胰岛素的作用。胰高血糖素延长蛋白的实例是胰高血糖素延长蛋白-4和胰高血糖素延长蛋白-3。胰高血糖素样肽具有下面的序列(SEQ ID Nos 1-6)：
    1    5    10    15    20    25    30    35
胰高血糖素  HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNT
GLP-1    HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G
GLP-2    HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITD
胰高血糖素延长蛋白-4HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS-NH2
胰高血糖素延长蛋白-3HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS-NH2
OXM    HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA
如此处使用的与肽相关的术语“类似物”指的是修饰的肽，其中所述肽的一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基替代，和/或其中一个或多个氨基酸残基从所述肽上被删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基从所述肽上被删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加到所述肽上。氨基酸残基这样的添加或删除能够发生在肽的N末端和/或肽的C末端。常常使用两个不同的简单***来描述类似物：例如Arg34-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(7-37)指一种GLP-1类似物，其中在位置34的天然发生的赖氨酸被精氨酸替代(根据IUPAC-IUB命名法使用氨基酸的标准单个字母缩写)。
如此处使用的与亲本肽相关的术语“衍生物”指的是化学修饰的亲本蛋白质或其类似物，其中至少一个取代基不在亲本蛋白质或其类似物中，即被共价修饰的母亲本蛋白质。一般的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基基团、酰基基团、酯、聚乙二醇化等等。GLP-1(7-37)衍生物的实例是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-37).
如此处使用的与肽相关的术语“它的片段”指的是具有亲本肽氨基酸的至少20％的任何肽的片段。因而，对于人血清白蛋白，片段将包含至少117个氨基酸因为人血清白蛋白具有585个氨基酸。在一个实施方案中，所述片段具有至少35％的亲本肽氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段具有至少50％的亲本肽氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段具有至少75％的亲本肽氨基酸。
如此处使用的与肽相关的术语“变体”指的是修饰肽，所述修饰肽是亲本肽类似物、亲本肽衍生物或亲本肽类似物的衍生物。
如此处使用的术语“GLP-1肽”指的是GLP-1(7-37)、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
如此处使用的术语“GLP-2肽”指的是GLP-2(1-33)、GLP-2类似物、GLP-2衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
如此处使用的术语“胰高血糖素延长蛋白-4肽”指的是胰高血糖素延长蛋白(1-39)、胰高血糖素延长蛋白-4类似物、胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物。
如此处使用的术语“稳定的胰高血糖素延长蛋白-4化合物”指的是化学修饰的胰高血糖素样延长蛋白-4(1-39)，即如下面的方法测定地在人中呈现了至少10个小时的体内血浆清除半衰期的类似物或衍生物。人胰高血糖素延长蛋白-4的血浆清除半衰期的测定方法是：化合物溶解于等张缓冲液pH 7.4、PBS或任何其它合适的缓冲液。外周注射给予，优选地在腹腔或臀上部。为了活性化合物的测定频繁间隔采集血样，持续时间足够覆盖最终清除部分(例如，剂量前、剂量后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小时)。如Wilken等人，Diabetologia 43(51)：A143，2000中描述地进行活性化合物浓度的测定。使用市售软件WinNonlin 2.1版(Pharsight，Cary，NC，USA)，通过非室性方法的使用对每个个体研究对象从浓度-时间数据计算衍生的药代动力学参数。利用浓度-时间曲线的末端对数线性部分评估末端清除速率常数，所述常数用于计算清除半寿期。
如此处使用的术语“DDP-IV保护的胰高血糖素样肽”指的是化学修饰使得所述肽，与所述肽的天然形式相比对血浆肽酶二肽基氨基肽酶-4(DPP-IV)更有抗性的胰高血糖素样肽。
如此处使用的术语“免疫调节的胰高血糖素延长蛋白-4化合笏”指的是作为胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的类似物或衍生物的胰高血糖素延长蛋白-4肽，在人类中，与胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)相比，具有降低的免疫反应。评价免疫反应的方法是测量患者治疗4周后应答胰高血糖素延长蛋白-4经合物的抗体浓度。
如此处所用的术语“胰岛素肽”是指一种肽，可以是人胰岛素或化学修饰的人胰岛素，如其类似物或衍生物。
如此处所用的术语“人胰岛素”是指人激素，其结构和性质均周知。人胰岛素具有两条通过在半胱氨酸残基之间的二硫键连接的肽链，即A-链和B-链。A-链为21个氨基酸的肽，B-链为30个氨基酸的肽，两个链通过3个二硫桥连接：一个位于A-链上位置6和位置11的半胱氨酸之间，第二个位于A-链的位置7的半胱氨酸和B-链的位置7的半胱氨酸之间，第三个位于A-链的位置20的半胱氨酸和B-链的位置19的半胱氨酸之间。
如此处使用的术语“多肽产物”指的是纯化的肽产物，它将用于药物组合物的生产。因而，通常获得作为来自最终纯化、干燥或整理步骤的产物的多肽产物。所述产物可以是晶体、沉淀物、溶液或悬浮液。多肽产物作为药物即活性药物成分在本领域也是已知的。
如此处使用的术语“等电点”指的是例如多肽的大分子总静电荷是零时的pH值。多肽中可以有许多带电基团，在等电点所有这些电荷的总和是零。在高于等电点的pH时，多肽的总静电荷是负的，而在低于等电点的pH值时，多肽的总静电荷是正的。
如此处使用的术语“药物可接受的”指的是适合通常的药物应用，即在患者不会引起副作用等等。
如此处使用的术语“赋形剂”指的是通常加入到药物组合物中的化学物质，例如缓冲剂、张力剂、防腐剂等等。
如此处使用的术语“有效量”指的是与不治疗相比对病人的治疗足够有效的剂量。
如此处使用的术语“药物组合物”指的是包含活性化合物或其盐以及药物赋形剂例如缓冲剂、防腐剂和可选地张力调节剂和/或稳定剂的产品。因而，药物组合物作为药物制剂在本领域也是已知的。
如此处使用的术语“疾病的治疗”指的是发生了疾病、病变或紊乱的患者的处理和照顾。治疗的目的是与疾病、病变或紊乱搏斗。治疗包括活性化合物的给予以消除或控制疾病、病变或紊乱以及减轻与疾病、病变或紊乱关联的症状或并发症。
发明详述
在第一方面，本发明涉及一种用于分离具有单氨基酸外消旋化的两种形式的多肽之方法，特征在于是离子交换色谱方法，包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下外消旋化的氨基酸残基之pKa不超过约2pH单位。
在另一方面，本发明涉及一种用于分离具有单氨基酸外消旋化的两种形式的多肽之方法，特征在于是离子交换色谱方法，包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下外消旋化的氨基酸残基之pKa不超过约1pH单位。
在另一方面，本发明涉及一种用于分离具有单氨基酸外消旋化的两种形式的多肽之方法，特征在于是离子交换色谱方法，包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下外消旋化的氨基酸残基之pKa不超过1pH单位。
在另一方面，本发明涉及一种用于分离两种多肽A(X)和A(X*)的方法，其中
X是L-氨基酸，
A(X)是含有氨基酸X的多肽，
X*是X的D-异构体，
A(X*)是含有氨基酸X*否则与A(X)相同的多肽，
所述方法特征在于是离子交换色谱方法，包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下X之pKa不超过2pH单位。
在另一方面，本发明涉及一种用于分离具有单氨基酸外消旋化的两种多肽A(X)和A(X*)的方法，其中
X是L-氨基酸，
A(X)是含有氨基酸X的多肽，
X*是X的D-异构体，
A(X*)是含有氨基酸X*否则与A(X)相同的多肽，
所述方法特征在于是离子交换色谱方法，所述方法包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下X之pKa不超过约1pH单位。
通过等度、分步、不对称或线性增加的洗脱液之盐浓度，或其组合，洗脱并分离靶多肽和含有外消旋化的氨基酸残基的杂质。X的pKa可以通过示于氨基酸残基之pKa值的表格评估(参见例如，CreightonT.E.“Proteins.Structures and Molecular Properties”，第6页，第二版，W.H.Freeman and Company，N.Y(1993))。也可以通过本领域已知的计算机辅助算法评估X的pKa，其中考虑了邻近氨基酸残基对X之pKa的影响。另一种确定X的pKa的可能是进行蛋白质的NMR研究，其中掺入了X。已知pKa值可以通过溶液的组成成分来影响，例如，有机改性剂的存在可改变氨基酸残基的pKa。
离子交换色谱是广泛应用的分离方法，其中分离的实现是基于溶质分子所带的电荷。离子交换色谱中，主要的分离原理是固定相与待分离的可溶性分子之间的离子相互作用。
在离子交换色谱的正常模型中，完整的循环(cyclus)包括
a)用平衡缓冲液平衡以使柱处于可用于循环的状态，
b)将含有产物的样品上柱，
c)任选的洗涤步骤，其中洗涤带有结合产物的色谱固定相，
d)洗脱，其中增加的盐浓度引起产物对色谱固定相之亲和性降低，产物离开柱子进入色谱柱洗脱液，且
e)任选的再生，其中试图利用再生溶液将剩余的杂质从色谱固定相中剥离。
在洗脱步骤(d)中，不同多肽的分离是通过将柱洗脱液收集到一系列样品池中获得的。通过所述样品池的正确收集，例如，通过测量AU280(即在280nm的吸收值)或导电性，这些样品池中各个主要含有一定的多肽。因此，通过收集这些样品池或主要含有期望的多肽的洗脱液实现分离。
平衡溶液和上柱样品可以含有或不含有有机改性剂。有机改性剂可以是但不限于任一单羟基脂肪醇(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)或多羟基醇，如己二醇或新戊醇。对于任一色谱纯化级分的盐成分可以是任何盐，包括但不限于：NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵等。任何可使用的缓冲液组分包括但不限于：柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、铵盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、tris-羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸缓冲液等。可应用广泛的色谱离子交换树脂，包括但不限于Mono Q(Amersham Biosciences)、Source 15Q或30Q(AmershamBiosciences)，Poros 20HQ或50HQ(Perspective Biosystems)、Toyopearl Q650S(Toso Haas)等等。
在本发明的一个实施方案中，所述方法用于在制备型规模中分离所述多肽。
在本发明的另一实施方案中，洗脱在与用于结合的pH基本上相同的pH下进行。但是，可以在结合至(即：样品上样于)柱的pH处进行，所述pH不同于洗脱所用的pH。在不同于用于洗脱的pH处进行结合因此意味着在柱上进行pH调节。
在本发明的另一实施方案中，多肽的洗脱是在与洗脱条件下X之pKa不超过约0.75pH单位的pH处进行的。在本发明的另一实施方案中，多肽的洗脱是在与洗脱条件下X之pKa不超过约1.0pH单位的pH处进行的。在本发明的另一实施方案中，多肽的洗脱是在与洗脱条件下X之pKa不超过约0.5pH单位的pH处进行的。在本发明的另一实施方案中，多肽的洗脱是在与洗脱条件下X之pKa不超过约0.25pH单位的pH处进行的。
在本发明的另一实施方案中，多肽的洗脱是在高于所述多肽之等电点的pH处进行。在本发明的另一实施方案中，多肽的洗脱是在低于所述多肽之等电点的pH处进行。
在本发明的另一实施方案中，多肽具有低于约10kDa的分子量。
在本发明的另一实施方案中，多肽具有低于约8kDa的分子量。
在本发明的另一实施方案中，多肽具有约1kDa至约10kDa的分子量。
在本发明的另一实施方案中，洗脱液含有有机改性剂。
在本发明的另一实施方案中，洗脱液含有浓度足以保持所述多肽为可溶的有机改性剂。
在本发明的另一实施方案中，所述有机改性剂为乙醇。
在本发明的另一实施方案中，所述有机改性剂为2-丙醇。
在本发明的另一实施方案中，所述有机改性剂为乙腈。
在本发明的另一实施方案中，所述有机改性剂选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
在本发明的另一实施方案中，所述有机改性剂是新戊醇。
在本发明的另一实施方案中，所述有机改性剂的浓度从约10％至约80％，如从约20％至约70％，或从约30％约65％。
在本发明的另一实施方案中，其中所述盐选自氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化钾、硫酸钾和乙酸钾。
在本发明的另一实施方案中，其中X是N-末端或C-末端氨基酸残基。
在本发明的另一实施方案中，X是L-组氨酸。
在本发明的另一实施方案中，X是组氨酸的氨基酸类似物。
在本发明的另一实施方案中，X是选自脱酰胺组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸、同型组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-甲基组氨酸。
在本发明的另一实施方案中，X是氨基酸残基的N-末端。
在本发明的另一实施方案中，X是L-苯丙氨酸。
在本发明的另一实施方案中，X是L-赖氨酸
在本发明的另一实施方案中，X是L-精氨酸。
在本发明的另一实施方案中，X是L-天冬氨酸。
在本发明的另一实施方案中，X是L-天冬酰胺。
在本发明的另一实施方案中，X是L-谷氨酸。
在本发明的另一实施方案中，X是L-谷氨酰胺。
在本发明的另一实施方案中，X是L-γ-羧基谷氨酸。
在本发明的另一实施方案中，所述多肽是胰高血糖素样肽。
在本发明的另一实施方案中，所述多肽是胰高血糖素、胰高血糖素类似物、胰高血糖素的衍生物或胰高血糖素类似物的衍生物。
在本发明的另一实施方案中，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
在本发明的另一实施方案中，GLP-1类似物选自Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8His22-GLP-1(7-37)，Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)，其类似物和所述任一项的衍生物。
在本发明的另一实施方案中，其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有赖氨酸残基，如一个赖氨酸，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
在本发明的另一实施方案中，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子，优选地8至24个碳原子，例如12至18个碳原子。
在本发明的另一实施方案中，其中所述间隔基是存在的，选自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基(aminobutyroyl)的氨基酸。
在本发明的另一实施方案中，其中所述胰高血糖素样肽是DPPIV保护的胰高血糖素样肽。
在本发明的另一实施方案中，其中所述胰高血糖素样肽是血浆稳定的胰高血糖素样肽。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是GLP-1类似物的衍生物，其为Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是GLP-1肽，其具有22至40个氨基酸残基，优选地26至36个氨基酸残基，甚至更加优选地29至33个氨基酸残基。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是GLP-2、GLP-2类似物、GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
在本发明的另一实施方案中，所述GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有赖氨酸残基，如一个赖氨酸，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
在本发明的另一实施方案中，所述亲脂取代基具有8至40个碳原子，优选地8至24个碳原子，例如12至18个碳原子。
在本发明的另一实施方案中，所述间隔基是存在的，选自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽具有27至39个氨基酸残基，优选地29至37个氨基酸残基，甚至更加优选地31至35个氨基酸残基。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是Lys17Arg30-GLP-2(1-33)或Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
在本发明的一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4、胰高血糖素延长蛋白-4类似物、胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物是酰化的肽或聚乙二醇化的肽。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是稳定的胰高血糖素延长蛋白-4化合物。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是DPP-IV保护的胰高血糖素延长蛋白-4化合物。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是免疫调节的胰高血糖素延长蛋白-4化合物。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物具有赖氨酸残基，如一个赖氨酸，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
在本发明的另一实施方案中，所述亲脂取代基具有8至40个碳原子，优选地从8至24个碳原子，例如12至18个碳原子。
在本发明的另一实施方案中，所述间隔基是存在的，选自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
在本发明的另一实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4肽，其具有30至48个氨基酸残基，33至45个氨基酸残基，优选地35至43个氨基酸残基，甚至更优选的37至41个氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，GLP-2肽选自：K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K 30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K 30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D8K/K30R/D 33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/Q28K/K30R/D 33E-GLP-2(1-33)；及其衍生物。
在本发明的一个实施方案中，GLP-2衍生物选自：
S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十三烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十五烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(壬烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十三烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十九烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(二十烷酰基氨基)丁酰基))-GLP-2(1-33)；
A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
Q28K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K 30R-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙酰基)/K 30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十三烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十五烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(壬烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十三烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十九烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(二十烷酰基氨基)丁酰基))/K30R-GLP-2(1-33)；
A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
Q28K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D3E/S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十三烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十五烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十九烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(辛烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(壬烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十三烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十九烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(二十烷酰基氨基)丁酰基))/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D21K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；以及
D3E/Q28K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33).
制备GLP-2、其类似物以及GLP-2衍生物的方法可参见例如WO99/43361和WO 00/55119。
本发明进一步的实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的促胰岛素类似物，例如Ser2Asp3-胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)，其中位置2和3的氨基酸残基分别被丝氨酸和天冬氨酸替代(这个特别的类似物作为胰高血糖素延长蛋白-3在本领域也是已知的)。
本发明进一步的实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4衍生物，其中引入的取代基选自酰胺、碳水化合物、烷基、酯和亲脂取代基。胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)促胰岛素衍生物及其类似物的实例是Tyr31-胰高血糖素延长蛋白-4(1-31)-酰胺。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是稳定的胰高血糖素延长蛋白-4化合物。本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是DPP-IV保护的胰高血糖素延长蛋白-4化合物。本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是免疫调节的胰高血糖素延长蛋白-4化合物。
例如WO 99/43708、WO 00/41546和WO 00/55119中能找到胰高血糖素延长蛋白-4、它的类似物以及胰高血糖素延长蛋白-4衍生物的制备方法。
通过肽合成能够生产亲本胰高血糖素样肽，例如使用Boc或Fmoc化学的固相肽合成或其它已经很好建立的技术。也能够通过包含如下的方法生产亲本胰高血糖素样化合物：培养含有编码所述多肽并能够在允许所述肽表达的条件下在合适的营养基中表达所述多肽的宿主细胞，之后从培养基中回收得到的肽。
用于培养细胞的培养基可以是适合生长宿主细胞的任何传统培养基，例如含有合适补充物的最低限度或复合培养基。适合的培养可以从商业供应商获得，或者根据发表的配方(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中)进行制备。然后可以通过传统程序从培养基中回收细胞产生的肽，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过例如硫酸铵的盐沉淀上清或滤液中的蛋白质样组分，根据所讨论的肽的类型通过各种色谱纯化，例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等等。
编码所述亲本肽的DNA序列合适地可以是基因组或cDNA来源，例如通过制备基因组或cDNA文库并且依照标准技术(见，例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)通过使用合成寡核苷酸探针的杂交筛选编码所有或部分所述肽DNA序列。用已经建立的标准方法，例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869描述的phosphoamidite方法或者Matthes等人，EMBO Journal 3(1984)，801-805描述的方法也合成性地制备编码所述肽的DNA序列。例如如US 4,683,202或Saiki等人，Science 239(1988)，487-491描述地也可以通过使用特异性引物的多聚酶链式反应制备所述DNA序列。
所述DNA序列可以***任何载体，这很方便地用于重组DNA程序，载体的选择将通常依赖它要引入的宿主细胞。因而，所述载体可以是自主复制的载体，即存在作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。或者，所述载体可以是一个载体，当它引入宿主细胞时，它整合进宿主细胞基因组并与它已经整合进入的染色体一起复制。
所述载体优选地是表达载体，其中编码所述肽的DNA序列可操作性地连接于所述DNA的转录需要的额外片段，例如启动子。所述启动子可以是所选宿主细胞中显示转录活性并且可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质之基因的任何DNA序列。指挥编码各种宿主细胞中本发明肽的DNA转录的合适启动子的实例在本领域是众所周知的，参考例如Sambrook等人，同上。
如果需要，编码所述肽的DNA序列可操作性地连接于合适的终止子、聚腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体进一步地可以包含使得载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。
所述载体还可包含选择性标记，例如其产物补足宿主细胞中缺陷的基因或者赋予例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的药物耐药性的基因。
为了将本发明的亲本肽导向宿主细胞的分泌途径，重组载体中可以提供分泌信号序列(也已知为先导序列、前原序列或前序列)。所述分泌信号序列结合于编码正确阅读框的肽的DNA序列。分泌信号序列通常在编码所述肽的DNA序列的5’位置。所述分泌信号通常相联于所述肽或者来自编码另一个分泌蛋白质的基因。
用于连接编码本发明肽的DNA序列、启动子和可选地终止子和/或分泌信号序列以及将它们***含有复制所需信息的合适载体中的步骤对于本领域技术人员各个都是众所周知的(参考，例如，Sambrook等，同上)。
带有DNA序列或重组载体引入的宿主细胞可以是能够生产本发明肽的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和更高级的真核细胞。众所周知并用于本领域的合适宿主细胞的实例是而不限于大肠杆菌、啤酒酵母或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
根据本发明含有纯化的胰高血糖素样肽的药物组合物一般含有多种药物赋形剂，例如防腐剂、等张剂和表面活性剂。药物组合物的制备对于技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：药学科学和实习，第19版，1995.
含有纯化的根据本发明的胰高血糖素样肽的药物组合物可以胃肠道外给予需要这样治疗的患者。胃肠道外给药可以通过注射器可选地笔样注射器进行皮下注射、肌肉内注射或者静脉注射。或者，给药可以例如通过输注泵的输注进行。
本发明进一步由下面的实例说明，然而这并不被解释为限制所保护的范围。在前面的叙述中和下面的实例中公开的特性分开地或它们任何联合在一起都是实现各种形式的本发明的材料。
实施例
实施例1
通过例如如WO 98/08871中描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过传统反相色谱法纯化发酵肉汤培养基中的Arg34GLP-1(7-37)，随后是在所述肽等电点pH即在pH 5.4沉淀。离心分离所述沉淀。在其它RP-LC纯化步骤和等电点沉淀后，如WO00/55119所述将Arg34GLP-1(7-37)肽酰化得到GLP-1衍生物Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)。
制备pH8.0的0.5g/L Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)的混合物。所述多肽的纯度约为90％(约5％D-His变体，D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，其中组氨酸位于位置7，即肽的N-末端被外消旋化为D-组氨酸残基，5％其它杂质)。利用阴离子交换色谱纯化混合物。
将0.005柱体积(CV)的混合物上样于用10CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的1mL Mono Q(AmershamBiosciences)阴离子交换柱。所述柱用3CV平衡溶液洗涤，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为20CV过程中从0-20mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，10CV过程中20-50mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为40CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例2
如实施例1所述制备2.0g/L(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8的混合物。
将0.6CV的混合物上样于用5CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的4.7mL Poros 20HQ(PerseptiveBiosystems)阴离子交换柱。所述柱用6CV平衡溶液洗涤，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为12CV过程中从0-50mM的NaCl，20mMTris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，20CV过程中50-80mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为90CV/h，温度为40℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例3
如实施例1所述制备0.5g/L Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8.0的混合物。
将0.1CV的混合物上样于用10CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的1mL Mono Q(Amersham Biosciences)阴离子交换柱。所述柱用3CV平衡溶液洗涤，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为20CV过程中从0-20mM的NaCl，20mM HEPES，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，10CV过程中20-50mM的NaCl，20mM HEPES，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为20CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例4
如实施例1所述制备0.5g/L Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8.0的混合物。
将0.1CV的混合物上样于用10CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的1mL Mono Q(Amersham Biosciences)阴离子交换柱。所述柱用3CV平衡溶液洗涤，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为20CV过程中从0-20mM的NaC l，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，10CV过程中20-50mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为80CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例5
如实施例1所述制备0.5g/L Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8.0的混合物。
将0.1CV的混合物上样于用10CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的1mL Mono Q(Amersham Biosciences)阴离子交换柱。所述柱用3CV平衡溶液洗涤，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为20CV过程中从0-20mM的乙酸钠，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，10CV过程中20-50mM的CH3COOH，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为40CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例6
如实施例1所述制备0.5g/L Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8.0的混合物。
将0.1CV的混合物上样于用10CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的1mL Mono Q(Amersham Biosciences)阴离子交换柱。所述柱用3CV平衡溶液洗涤，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为20CV过程中从0-10mM的Na2SO4，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，10CV过程中10-25mM的Na2SO4，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为40CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例7
如实施例1所述制备2.0g/L(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8的混合物。样品随后掺入约1/3的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)。
将0.015柱体积(CV)的混合物上样于用5CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的1mL Mono Q(AmershamBiosciences)阴离子交换柱。洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为12CV过程中从0-20mM的NaC l，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，8CV过程中20-50mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为48CV/h，温度为25℃。色谱图示于图1。
实施例8
如实施例1所述制备4.5g/L(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8的混合物。
将0.7CV的混合物上样于用6CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.0平衡的152mL Source 30Q(AmershamBiosciences)阴离子交换柱。用2CV平衡溶液洗涤柱，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为12CV过程中从0-23mM的NaCl，20mMTris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0，随后是第二个梯度，20CV过程中23-30mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.0。整个实验中的流速为20CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例9
如实施例1所述制备5.0g/L(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8的混合物。
将0.6CV的混合物上样于用5CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 7.5平衡的11.8mL Source 30Q(AmershamBiosciences)阴离子交换柱。用1CV平衡溶液洗涤柱，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为12CV过程中从0-20mM的NaCl，20mMTris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 7.5，随后是第二个梯度，20CV过程中20-40mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 7.5。整个实验中的流速为20CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-G lu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例10
如实施例1所述制备5.0g/L(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8的混合物。
将0.6CV的混合物上样于用5CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 7.0平衡的11.8mL Source 30Q(AmershamBiosciences)阴离子交换柱。用1CV平衡溶液洗涤柱，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为12CV过程中从0-15mM的NaCl，20mMTris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 7.0，随后是第二个梯度，20CV过程中15-40mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 7.0。整个实验中的流速为20CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例11
如实施例1所述制备5.0g/L(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)，pH 8的混合物。
将0.6CV的混合物上样于用5CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 8.5平衡的11.8mL Source 30Q(AmershamBiosciences)阴离子交换柱。用1CV平衡溶液洗涤柱，洗脱用两个线性盐梯度进行，第一个梯度为12CV过程中从0-20mM的NaCl，20mMTris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.5，随后是第二个梯度，20CV过程中20-40mM的NaCl，20mM Tris-羟甲基氨基甲烷，63％(w/w)乙醇，pH 8.5。整个实验中的流速为20CV/h，温度为25℃。
实验中，分级分离柱洗脱液，分别分析各个级分的D-His7Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)和Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37))含量。
数据显示肽的D-His变体在Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)之前洗脱，由此分离了肽的这两种形式。
实施例12
通过固相合成制备L-His1-胰高血糖素延长蛋白-4和D-His1-胰高血糖素延长蛋白-4。两者的混合物通过将所述肽溶于10mM Tris-羟甲基氨基甲烷，pH 9.2，至浓度为1g/L而制备。
将1CV的混合物上样于用10CV 10mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH7.0平衡的1mL Mono Q(Amersham Biosciences)阴离子交换柱。用1CV 10mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 7.0洗涤柱，洗脱在20CV过程中用10mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 7.0等度进行。整个实验中的流速为138CV/h，温度为25℃。
洗脱(图3)显示L-His形式的胰高血糖素延长蛋白-4的洗脱早于D-his形式的胰高血糖素延长蛋白-4，由此将所述肽的两种形式分离。
实施例13
通过类似于WO 98/08871中描述的关于GLP-1肽的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达L17K，K 30R-GLP2(1-33)。然后通过传统阴离子交换和反相色谱法纯化发酵肉汤培养基中的L17K，K30R-GLP2(1-33)，随后是在所述肽等电点pH即在pH4沉淀。离心分离所述沉淀。通过固相合成制备D-His-L17K，K 30R-GLP2(1-33)。
两者的混合物通过将所述肽溶于10mM Tris-羟甲基氨基甲烷，pH9.2，至浓度为1g/L而制备。
将1CV的混合物上样于用5CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 7.0平衡的1mL Mono Q(Amersham Biosciences)阴离子交换柱。用1CV 20mM Tris-羟甲基氨基甲烷、63％(w/w)乙醇，pH 7.0洗涤柱，洗脱用20CV过程中用从0-63mM的NaCl之Tris-羟甲基氨基甲烷溶液、63％(w/w)乙醇，pH 7.0的梯度进行。整个实验中的流速为138CV/h，温度为25℃。
洗脱(图3)显示D-His形式的L17K，K30R-GLP2(1-33)的洗脱早于L-his形式的L17K，K30R-GLP2(1-33)，由此将所述肽的两种形式分离。
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>含有外消旋化的氨基酸之多肽的分离
<130>6669.000-DK
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>29
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
            20                  25
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>3
<211>33
<212>PRT
<213>人
<400>3
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
            20                  25                  30
Asp
<210>4
<211>39
<212>PRT
<213>Glia monster
<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)
<223>位置39的丝氨酸被酰胺化
<400>4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
        35
<210>5
<211>39
<212>PRT
<213>Gila monster
<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)
<223>位置39的丝氨酸被酰胺化
<400>5
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
        35
<210>6
<211>37
<212>PRT
<213>人
<400>6
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr Lys Arg Asn
            20                  25                  30
Lys Asn Asn Ile Ala
        35
<210>7
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MOD_RES
<222>(44)..(44)
<223>位置44的赖氨酸被酰胺化
<400>7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys LysLys Lys
        35                  40
<210>8
<211>33
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>8
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
            20                  25                  30
Asp

Claims (58)

1.一种用于分离具有单氨基酸外消旋化的两种形式的多肽之方法，特征在于是一种离子交换色谱方法，包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下外消旋化的氨基酸残基之pKa不超过1pH单位，其中所述多肽是胰高血糖素样肽。
2.一种用于分离两种多肽A(X)和A(X*)的方法，其中
X是L-氨基酸，
A(X)是含有氨基酸X的多肽，
X*是X的D-异构体，
A(X*)是含有氨基酸X*否则与A(X)相同的多肽，
所述方法特征在于是一种离子交换色谱方法，包括在如下pH处通过增加盐浓度的洗脱，所述pH与在所述洗脱条件下X之Ka不超过1pH单位，其中所述多肽是胰高血糖素样肽。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法用于在制备型规模中分离所述多肽。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述洗脱在与用于结合的pH基本上相同的pH下进行。
5.根据权利要求1或2的方法，其中多肽的结合在与洗脱条件下的X之pKa不超过约0.5pH单位的pH处进行。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述洗脱是在高于所述多肽之等电点的pH处进行。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述多肽具有低于约10kDa的分子量。
8.根据权利要求1或2的方法，其中洗脱液含有有机改性剂。
9.根据权利要求8的方法，其中洗脱液含有浓度足以保持所述多肽为可溶的有机改性剂。
10.根据权利要求8的方法，其中所述有机改性剂为乙醇。
11.根据权利要求8的方法，其中所述有机改性剂为2-丙醇。
12.根据权利要求8的方法，其中所述有机改性剂为乙腈。
13.根据权利要求8的方法，其中所述有机改性剂选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
14.根据权利要求9-13任一项的方法，其中所述有机改性剂的浓度从约10％至约80％。
15.根据权利要求14的方法，其中所述有机改性剂的浓度从约20％至约70％。
16.根据权利要求15的方法，其中所述有机改性剂的浓度从约30％至约65％。
17.根据权利要求1或2的方法，其中所述盐选自氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化钾、硫酸钾和乙酸钾。
18.根据权利要求2的方法，其中X是N-末端或C-末端氨基酸残基。
19.根据权利要求18的方法，其中X是L-组氨酸。
20.根据权利要求18的方法，其中X选自脱氨基-组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸、同型组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-甲基组氨酸。
21.根据权利要求19或20的方法，其中X是N-末端氨基酸残基。
22.根据权利要求18的方法，其中X是L-苯丙氨酸。
23.根据权利要求1或2的方法，其中所述多肽是胰高血糖素。
24.根据权利要求1或2的方法，其中所述多肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物，
其中所述GLP-1类似物选自Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8His22-GLP-1(7-37)，Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)；且
其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
25.根据权利要求24的方法，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子。
26.根据权利要求25的方法，其中所述亲脂取代基具有8至24个碳原子。
27.根据权利要求26的方法，其中所述亲脂取代基具有12至18个碳原子。
28.根据权利要求24的方法，其中所述间隔基是存在的且选自氨基酸。
29.根据权利要求28的方法，其中所述间隔基是存在的且选自β-Ala、L-Glu和氨基丁酰基。
30.根据权利要求1或2的方法，其中所述胰高血糖素样肽是DPPIV保护的胰高血糖素样肽。
31.根据权利要求1或2的方法，其中所述胰高血糖素样肽是血浆稳定的胰高血糖素样肽。
32.根据权利要求24的方法，其中所述GLP-1类似物的衍生物是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
33.根据权利要求1或2的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有22至40个氨基酸残基。
34.根据权利要求33的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有26至36个氨基酸残基。
35.根据权利要求34的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有29至33个氨基酸残基。
36.根据权利要求1或2的方法，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-2、GLP-2类似物、GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物，
其中所述GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团；
且其中所述GLP-2类似物选自：K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
37.根据权利要求36的方法，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子。
38.根据权利要求37的方法，其中所述亲脂取代基具有8至24个碳原子。
39.根据权利要求38的方法，其中所述亲脂取代基具有12至18个碳原子。
40.根据权利要求36的方法，其中所述间隔基是存在的且选自氨基酸。
41.根据权利要求40的方法，其中所述间隔基是存在的且选自β-Ala、L-Glu和氨基丁酰基。
42.根据权利要求36的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有27至39个氨基酸残基。
43.根据权利要求42的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有29至37个氨基酸残基。
44.根据权利要求43的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有31至35个氨基酸残基。
45.根据权利要求36的方法，其中所述胰高血糖素样肽是Lys17Arg30-GLP-2(1-33)或Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)。
46.根据权利要求36的方法，其中所述胰高血糖素样肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
47.根据权利要求1或2的方法，其中所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4、胰高血糖素延长蛋白-4类似物、胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物，
其中所述类似物是胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的促胰岛素类似物；
且其中所述胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团；
或者其中所述胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物是酰化的或聚乙二醇化的。
48.根据权利要求47的方法，其中所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4。
49.根据权利要求47的方法，其中所述胰高血糖素样肽是ZP-10，即HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2。
50.根据权利要求47的方法，其中所述胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物是酰化的或聚乙二醇化的。
51.根据权利要求47的方法，其中所述胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
52.根据权利要求47的方法，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子。
53.根据权利要求52的方法，其中所述亲脂取代基具有8至24个碳原子。
54.根据权利要求53的方法，其中所述亲脂取代基具有12至18个碳原子。
55.根据权利要求47的方法，其中所述间隔基是存在的且选自氨基酸。
56.根据权利要求55的方法，其中所述间隔基是存在的且选自β-Ala、L-Glu和氨基丁酰基。
57.通过包括如下步骤的方法制备的多肽产物：
a)使用根据权利要求1-56任一项的方法纯化多肽，以及
b)分离所述多肽以产生所得多肽产物。
58.通过包括如下步骤的方法制备的药物组合物：
a)首先使用根据权利要求1-56任一项的方法纯化多肽或其前体
b)然后干燥所述多肽，以及
c)最后与药物可接受的赋形剂混合。
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