CN100523208C

CN100523208C - 发酵产生含硫精细化学品的方法(metY)

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Publication number: CN100523208C
Application number: CNB038204525A
Authority: CN
Inventors: B·克勒格尔; O·策尔德尔; C·克洛普罗格; H·施罗德; S·哈夫纳
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Priority date: 2002-08-26
Filing date: 2003-08-26
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2023-08-26
Also published as: BR0313758A; US20050260721A1; WO2004024933A2; EP1537225A2; US7381549B2; AU2003264109A1; WO2004024933A3; CN1756847A; DE10239082A1; JP2005537025A; KR20050034747A

Abstract

本发明涉及通过使用表达编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(metY)基因的核苷酸序列的细菌，发酵产生含硫精细化学品尤其是L-甲硫氨酸的方法。

Description

发酵产生含硫精细化学品的方法(metY)

描述

本发明涉及通过使用表达编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(metY)基因的核苷酸序列的细菌，发酵产生含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸的方法。

现有技术

含硫精细化学品如甲硫氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、生物素、硫胺素、硫辛酸通过天然代谢过程在细胞中产生并且用于许多工业领域，包括食品、动物饲料、化妆品和制药工业。这些统称为“含硫精细化学品”的物质包括有机酸、蛋白原性(proteinogenic)和非蛋白原性氨基酸、维生素和辅因子。通过培养细菌可以极其方便地大规模生产这些物质，已经开发这些细菌以产生并大量分泌在每种情况下所希望的物质。尤其适于该目的的生物是棒状细菌，它们是革兰氏阳性非病原性细菌。

公知通过棒状细菌，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的发酵生产氨基酸。由于非常重要，所以生产方法不断改进。方法改进可涉及测定相关的发酵技术方面如搅拌和氧供给，或者涉及营养培养基组分如发酵过程中的糖浓度，或者涉及得到产物的操作(work-up)，例如通过离子交换层析，或者涉及微生物自身的内在性能特性。

通过菌株选择已经开发了从含硫精细化学品产生各种所希望的化合物的许多突变菌株。通过应用诱变、选择和突变选择的方法，在特定分子的产生方面所述微生物的性能特性得到提高。然而，这是一种费时而且困难的方法。以这种方式获得了例如对下述抗代谢物具有抗性或者对于调节重要的代谢物为营养缺陷型的并产生含硫精细化学品如L-甲硫氨酸的菌株，所述抗代谢物如甲硫氨酸类似物α-甲基甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、n-乙酰基正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-heprenoitic acid、硒代蛋氨酸、甲硫氨酸亚砜胺(methioninesulfoximine)、methoxine、1-氨基环戊烷羧酸。

重组DNA技术的方法通过扩增单个氨基酸生物合成基因并研究其对氨基酸产生的影响数年来也已经被用于改良产生L-氨基酸的棒杆菌菌株。

WO-A-02/18613描述了谷氨酸棒杆菌中metY的核酸序列和氨基酸序列以及其用于产生L-赖氨酸的用途。

发明简述

本发明的一个目的是提供含硫精细化学品尤其是L-甲硫氨酸的改良的发酵生产的新方法。

我们已经发现通过提供一种含硫精细化学品的发酵生产方法实现了该目的，该方法包括在棒状细菌中表达编码具有metY活性的蛋白质的异源核苷酸序列。

本发明首先涉及用于发酵产生至少一种含硫精细化学品的方法，其包括下面的步骤：

a)发酵产生目的含硫精细化学品的棒状细菌培养物，该棒状细菌表达至少一种这种的异源核苷酸序列，该序列编码具有O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(metY)活性的蛋白质；

b)浓缩培养基或细菌细胞中的含硫精细化学品；和

c)分离含硫精细化学品，其优选含有L-甲硫氨酸。

上面的异源编码metY的核苷酸序列与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的编码metY的序列优选具有100％以下的同源性，如70％以上的同源性，诸如75、80、85、90或95％的同源性，或具有小于70％的同源性，如不超过60、50、40、30、20或10％的同源性。编码metY的序列优选来自下面表I生物中的任一种。

表I

白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)	ATCC 14779
白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)	ATCC 14779	结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)CDC1551	ATCC 25584
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)	ATCC 824	结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)CDC1551	ATCC 25584
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)	ATCC 824	嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)	ATCC21591
嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)	ATCC 12980	嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)	ATCC21591
嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)	ATCC 12980	微温绿菌(Chlorobium tepidum)	ATCC 49652
聚球藻属(Synechococcus)中的种	ATCC27104	微温绿菌(Chlorobium tepidum)	ATCC 49652
聚球藻属(Synechococcus)中的种	ATCC27104	构巢裸孢壳(Emericella nidulans)	ATCC 36104
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)	ATCC 25285	构巢裸孢壳(Emericella nidulans)	ATCC 36104
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)	ATCC 25285	乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)	ATCC 7962
支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)	ATCC 19395	乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)	ATCC 7962
支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)	ATCC 19395	铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)	ATCC 17933
欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)	ATCC 19718	铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)	ATCC 17933
欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)	ATCC 19718	苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)	ATCC 4399
海栖热袍菌(Thermotoga maritima)	ATCC 43589	苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)	ATCC 4399
海栖热袍菌(Thermotoga maritima)	ATCC 43589	变异链球菌(Streptococcus mutans)	ATCC 25175
洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)	ATCC 25416	变异链球菌(Streptococcus mutans)	ATCC 25175
洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)	ATCC 25416	耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)	ATCC 13939
荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)	ATCC 11166	耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)	ATCC 13939
荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)	ATCC 11166	多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)	ATCC 6530
艰难梭菌(Clostridium difficile)	ATCC 9689	多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)	ATCC 6530
艰难梭菌(Clostridium difficile)	ATCC 9689	空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)	ATCC 33560
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)	ATCC 6308	空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)	ATCC 33560
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)	ATCC 6308	酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)	ATCC 2704
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)	ATCC 8585	酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)	ATCC 2704
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)	ATCC 8585	白假丝酵母(Candida albicans)	ATCC 10231
粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)	ATCC 24969	白假丝酵母(Candida albicans)	ATCC 10231

ATCC：美国典型培养物保藏中心，美国Rockville，MD。

本发明使用的metY-编码序列优选含有根据SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53的编码序列或者与它们同源的编码具有metY活性蛋白质的核苷酸序列。

此外，本发明使用的metY-编码序列优选编码具有metY活性的蛋白质，所述蛋白质含有根据SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54的氨基酸序列或与它们同源的代表具有metY活性的蛋白质的氨基酸序列。

编码metY的序列优选为可以在棒状细菌中复制或者被稳定整合到染色体中的DNA或RNA。

根据一个优选的实施方案，本发明的方法通过下面的步骤实施：

a)使用质粒载体转化的细菌菌株，该质粒载体携带处于调节序列控制下的至少一份编码metY序列的拷贝，或者

b)使用这样的菌株，该菌株中编码metY的序列已经被整合到细菌染色体中。

此外，发酵优选过量表达编码metY的序列。

还希望发酵这样的细菌，其中目的含硫精细化学品的生物合成途径的至少另一基因已经被扩增；和/或其中至少一条代谢途径已经至少部分被关闭，其中所述该代谢途径降低目的含硫精细化学品的产生。

还希望发酵这样的细菌，其中额外地目的含硫精细化学品的生物合成途径的至少另一基因不被代谢的代谢物不利地影响。

因此，根据本发明方法的另一实施方案，发酵这样的棒状细菌，其中同时存在选自：

a)基因lysC，其编码天冬氨酸激酶，

b)基因asd，其编码天冬氨酸-半醛脱氢酶，

c)甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gap，

d)3-磷酸甘油酸激酶编码基因pgk，

e)丙酮酸羧化酶编码基因pyc，

f)磷酸丙糖异构酶编码基因tpi，

g)高丝氨酸O-乙酰转移酶编码基因metA，

h)γ胱硫醚合酶编码基因metB，

i)γ胱硫醚裂合酶编码基因metC，

j)丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA，

k)甲硫氨酸合酶编码基因metH，

l)亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，

m)磷酸丝氨酸氨基转移酶编码基因serC，

n)磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因serB，

o)丝氨酸乙酰转移酶编码基因cysE，

p)高丝氨酸脱氢酶编码基因hom

的至少一种基因被过量表达。

根据本发明方法的另一实施方案，发酵这样的棒杆菌，其中同时有选自上面的组a)到p)的基因的至少一种基因以某种方式突变使得相应蛋白质的活性与未突变蛋白质相比，被所代谢的代谢物影响程度较小(如果有)，并且尤其是精细化学品的发明性生产不被不利地影响。

根据本发明的方法的另一实施方案，发酵这样的棒杆菌，其中同时存在选自：

q)高丝氨酸激酶编码基因thrB，

r)苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，

s)苏氨酸合酶编码基因thrC，

t)内消旋-二氨基庚二酸D-脱氢酶编码基因ddh，

u)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pck，

v)葡萄糖-6-磷酸6-异构酶编码基因pgi，

w)丙酮酸氧化酶编码基因poxB，

x)二氢吡啶二羧酸合酶编码基因dapA，

y)二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因dapB；或

z)二氨基吡啶甲酸脱羧酶编码基因lysA

的至少一种基因被弱化，尤其通过降低相应基因的表达速率而被弱化。

根据本发明的另一实施方案，发酵这样的棒杆菌，其中同时存在至少一种选自上面组q)到z)的基因以某种方式突变使得相应蛋白质的酶活性被部分或完全降低。

在本发明的方法中，优选谷氨酸棒杆菌种的微生物。

本发明还涉及从发酵液产生含L-甲硫氨酸的动物饲料添加剂的方法，该方法包括下面的步骤：

a)在发酵培养基中培养和发酵产生L-甲硫氨酸的微生物；

b)从含L-甲硫氨酸的发酵液除去水；

c)除去发酵过程中形成的生物量重量的0到100％；和

d)干燥根据b)和/或c)所得发酵液，以得到所希望的粉剂或粒剂形式

的动物饲料添加剂。

本发明同样涉及第一次从上面的微生物分离的编码metY的序列，涉及由其编码的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，还分别涉及这些多核苷酸和蛋白质的功能同系物。

发明详述

a)一般术语

具有O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的蛋白质，也称作metY(EC4.2.99.10)，被描述为使用辅因子磷酸吡哆醛(pyrodoxal phosphate)能够将O-乙酰基高丝氨酸和硫化物转化成高半胱氨酸的蛋白质。技术人员能够区分O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的活性和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的活性，O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶在文献中也被称为metz。对于后一种酶，以O-琥珀酰高丝氨酸而不是O-乙酰高丝氨酸作为反应的底物。技术人员可以通过酶测定法检测mety的酶活性，该酶测定法的方案可以是：Shimizu H.Yamagata S.Masui R.Inoue Y.Shibata T.Yokoyama S.Kuramitsu S.Iwama T.Biochimica et Biophysica Acta.1549(1)：61-72，2001，Yamagata S.Isaji M.Nakamura K.Fujisaki S.Doi K.Bawden S.D’Andrea R.Applied Microbiology & Biotechnology.42(1)：92-9，1994。

在本发明的范围中，术语“含硫精细化学品”包括含有至少一个共价结合的硫原子并且可通过本发明的发酵方法得到的化合物。它们的非限制性实例为甲硫氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸，尤其是甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸。

在本发明的范围内，术语“L-甲硫氨酸”、“甲硫氨酸”、高半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸还包括相应的盐如甲硫氨酸盐酸盐或甲硫氨酸硫酸盐。

“多核苷酸”通常指多核糖核苷酸(RNA)和多脱氧核糖核苷酸(DNA)，其可以分别是未修饰的RNA和DNA，或者分别是修饰的RNA和DNA。

根据本发明，“多肽”指含有通过肽键连接的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。

术语“代谢的代谢物”指在生物体的代谢中发生的作为中间产物或者作为终产物并且，它们除了作为化学结构单元的性质，还可以对酶和对它们的催化活性具有调节作用的化合物。从文献中已知这些代谢的代谢物可以以抑制和刺激的方式作用于酶活性(Biochemistry，Stryer，Lubert，1995W.H.Freeman & Company，New York，纽约)。在文献中还描述了可能在生物体中产生酶，其中代谢的代谢物的影响已经被一些措施改变，这些措施为例如通过紫外辐射、电离辐射或诱变而突变基因组DNA，随后选择特定表型(Sahm H.，Eggeling L.，de Graaf AA.，Biological Chemistry381(9-10)：899-910，2000；Eikmanns BJ.，Eggeling L.，Sahm H.，Antonie vanLeeuwenhoek.，64：145-63，1993-94)。这些改变的特性也可以通过特定测量实现。技术人员公知可能以如此方法特异修饰编码蛋白质的DNA的酶基因中特定核苷酸从而由表达的DNA序列得到的蛋白质具有某些新的性质，例如，代谢的代谢物对未修饰的蛋白质的调节作用被改变。

酶的活性可以以某种方式被影响从而反应速率被减小或者对底物的亲和性被改变或者反应速率被改变。

术语“表达”和“扩增”或“过量表达”在本发明的上下文中描述了微生物中相应DNA编码的一种或多种酶的产生或细胞内活性增加。为此，例如，可将基因导入生物体以通过另一基因替换现有基因，增加该一种基因或几种基因的拷贝数，使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且适当时可以组合这些措施。

b)本发明的metY蛋白质

本发明同样包括上面的表I中具体公开生物的metY酶的“功能等同物”。

在本发明范围内，具体公开的多肽的“功能等同物”或类似物是与其不同的多肽，该多肽还具有所希望的生物学活性如底物特异性。

根据本发明，“功能等同物”指特定突变体，其在上面提到的序列位置的至少一个位置具有不同于特定提到的氨基酸的氨基酸，但是仍然具有上面提到的生物学活性之一。从而“功能等同物”还包括通过一个或多个氨基酸添加、替换、缺失和/或倒位可以得到的突变，所述修饰可能在该序列的任何位置发生，只要它们导致具有本发明特性的突变体。尤其当突变体和未修饰多肽的反应模式定性地匹配，即，例如相同的底物以不同速率被转化时，则存在功能等同物。

“功能等同物”自然也包括从其他生物可以得到的多肽，和天然存在的变体。例如，通过序列比较可以发现同源序列区，按照本发明的特定指导方针可以建立等同酶。

“功能等同物”同样包括本发明多肽的片段、优选单个结构域或序列基序，它们具有例如目的生物学功能。

“功能等同物”还包括融合蛋白质，其具有上面提到的多肽序列之一或者衍生自该序列的功能等同物以及在N-或C-末端功能性连接的与该序列功能不同的至少一种其他异源序列(即，融合蛋白部分的功能的可忽略功能损失)。这些异源序列的非限制性实例为，例如，信号肽、酶、免疫球蛋白、表面抗原、受体或受体配体。

根据本发明，“功能等同物”包括具体公开的蛋白质的同系物。这些同系物与具体公开的序列之一具有至少30％，或者约40％、50％，优选至少约60％、65％、70％或75％，尤其至少85％，如90％、95％或99％的同源性，该同源性通过Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448)的算法计算。

通过诱变，例如通过蛋白质的点突变或截短可以产生本发明的蛋白质或多肽的同系物。如此处所用的术语“同系物”涉及蛋白质的变体形式，其作为蛋白质活性的激动剂或拮抗剂。

通过筛选突变体组合文库如截短突变体组合文库，可以鉴定本发明蛋白质的同系物。可例如通过核酸水平的组合诱变，例如，通过合成的寡核苷酸混合物的酶促连接产生蛋白质变体的多样化文库。有多种方法可用于从简并寡核苷酸序列制备潜在同系物的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后合成的基因可以被连接到适宜的表达载体中。一组简并基因的使用使得可能在一种混合物中提供编码一组目的潜在蛋白质序列的全部序列。合成简并寡核苷酸的方法是技术人员公知的(例如，Narang，S.A.，(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，(1984)Science 198：1056；Ike等，(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。

此外，蛋白质密码子片段的文库可用于产生蛋白质片段的多样化群体，该群体用于筛选和随后选择本发明蛋白质的同系物。在一个实施方案中，可以如下产生编码序列片段的文库，这可通过用核酸酶在一定条件下处理编码序列的双链PCR片段，在该条件下切开发生仅仅约为每个分子一次，变性双链DNA，复性该DNA形成双链DNA，其可含有不同切口产物的有意/反义对，通过S1核酸酶处理重新形成的双链体除去单链部分并将所得片段文库连接到表达载体而实现。可通过该方法设计编码本发明蛋白质的N-末端、C-末端和内部片段的表达文库，这些片段具有不同大小。

在现有技术中公知一些技术用于从已经通过点突变或截短产生的组合文库筛选基因产物和筛选DNA文库以得到具有所选择特性的基因产物。这些技术可适于快速筛选通过本发明的同系物的组合诱变所产生的基因文库。用于筛选经历高通量分析的大基因文库的最经常使用的技术包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得载体文库转化适宜的细胞并在一定条件下表达组合基因，其中在该条件下对目的活性的检测方便了这样的载体的分离，该载体的基因编码的产物已经被检测。递归整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)—增加文库中功能突变体频率的一种技术—可以与筛选试验组合使用以鉴定同系物(Arkin und Yourvan(1992)PNAS89：7811-7815；Delgrave等(1993)，Protein Engineering6(3)：327-331。

c)本发明的多核苷酸

本发明还涉及编码上面的metY酶之一的核酸序列(单链和双链DNA和RNA如cDNA和mRNA)及其功能等同物，其也可以通过例如使用人工核苷酸类似物得到。

本发明涉及分离的核酸分子，其编码本发明的多肽或蛋白质或者其生物学活性部分，还涉及这样的核酸片段，该片段可用作例如用于鉴定或扩增本发明的编码核酸的杂交探针或引物。

此外，本发明的核酸分子可以含有基因编码区的3’和/或5’端的非翻译序列。

“分离的”核酸分子分离自存在于该核酸的天然来源的其他核酸分子并且还可以基本上无其他细胞物质或培养基(如果其通过重组技术制备)，或者无化学前体或其他化学品(如果其通过化学合成)。

本发明还包括与具体描述的核苷酸序列或其部分互补的核酸分子。

本发明的核苷酸序列使得可产生可用于鉴定和/或克隆其他细胞型或生物中的同源序列的探针和引物。这些探针和引物通常组成这样的核苷酸序列区，其在严格条件下与本发明核酸序列的有意链或者相应的反义链的至少约12、优选至少约25，如40、50或75个连续核苷酸杂交。

本发明的其他核酸序列来自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51或53并且通过添加、替换、***或缺失一个或多个核苷酸而与它们不同，但是仍然编码具有目的特性的多肽。这些可以是在至少约50％、55％、60％、65％、70％、80％或90％，优选在至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列位置中与上面的序列相同的多核苷酸。

本发明还包括通过与特定提到的序列比较，按照特定来源或宿主生物的密码子使用，含有“沉默”突变或被修饰的那些核酸序列，以及天然存在的变体如剪接变体或等位基因变体。本发明还涉及通过保守核苷酸替换(即，相关氨基酸被具有相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸替换)可以得到的序列。

本发明还涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。这些遗传多态性可以由于群体内个体间的天然变异而存在。这些天然变异通常导致基因的核苷酸序列中1到5％的变化。

本发明还包括与上面提到的编码序列杂交或者与它们互补的核酸序列。这些多核苷酸可以在筛选基因组或cDNA文库时发现，并且适宜时，通过PCR使用适宜的引物从它们扩增，然后，例如，用适宜的探针分离。另一可能性是用本发明的多核苷酸或载体转化适宜的微生物，繁殖该微生物从而增殖该多核苷酸，然后分离这些多核苷酸。另一可能性是通过化学途径合成本发明的多核苷酸。

能够“杂交”多核苷酸的性质指多核苷酸或寡核苷酸能够在严格条件下结合几乎互补的序列，而非互补序列在这些条件下没有非特异结合。为此，序列应该70-100％，优选90-100％互补，互补序列能够特异地相互结合的性质被例如用于RNA印迹技术或DNA印迹技术或者PCR或者RT-PCR(对于引物结合的情况)中。具有长为30个碱基对或更多碱基对的寡核苷酸通常用于该目的。严格条件指，例如，在RNA印迹技术中，使用50-70℃，优选60-65℃的洗涤溶液，例如，含有0.1％SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC；3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)用于洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸。在该情况下，如上面提到的，仅仅具有高度互补性的核酸保持相互结合。严格条件的设置是技术人员公知的并且在例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。

d)编码metY基因的分离

可以以本身公知的方法从上面表I的生物分离编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的metY基因。

为了分离上面表I的生物的metY基因或其他基因，首先在大肠杆菌(E.coli)中产生该生物的基因文库。基因文库的产生在一般已知的教科书和手册中详细描述。可以提及的实例是Winnacker：Gene und Klone，EineEinführung in die Gentechnologie(Verlag Chemie，Weinheim，德国，1990)的教科书，和Sambrook等：分子克隆实验指南(冷泉港，1989)。一种非常熟知的基因文库是大肠杆菌K-12菌株W3110的基因文库，其由Kohara等人(Cell50，495-508(1980))在λ载体中产生。

为了在大肠杆菌中产生来自表I中生物的基因文库，可以使用粘粒如粘粒载体SuperCos I(Wahl等人，1987，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，84：2160-2164)或者质粒如pBR322(BoliVal；Life Sciences，25，807-818(1979))或pUC9(Vieira等人，1982，Gene，19：259-268)。适宜的宿主尤其是限制性和重组缺陷的大肠杆菌菌株。该菌株的一个实例是菌株DH5αmcr，其已经由Grant等人(Proceedings of theNational Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)描述。用粘粒克隆的长DNA片段然后又可以亚克隆到适于测序的通用载体中并随后被测序，如在Sanger等人(proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，74：5463-5467，1977)中所描述的。

然后所得DNA序列可以使用公知的算法或序列分析程序研究，这些算法或序列分析程序为如Staden(Nucleic Acids Research 14，217-232(1986))的算法、Marck(Nucleic Acids Research 16，1829-1836(1988))的算法或者Butler(Methods of Biochemical Analysis 39，74-97(1998))的GCG程序。

发现了来自上面表I生物的编码metY的DNA序列。具体地，发现了根据SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53的DNA序列。此外，使用上述方法，从存在的所述DNA序列得到了相应蛋白质的氨基酸序列。SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54描述了metY基因产物的所得氨基酸序列。

由于遗传密码的简并性从根据SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53的序列得到的编码DNA序列也是本发明的主题。同样，本发明涉及与所述序列或从它们衍生的序列的部分杂交的DNA序列。

通过杂交鉴定DNA序列的教导可以由技术人员在例如来自Boehringer Mannheim GmbH的手册《滤膜杂交的DIG***用户指南》(Mannheim，德国，1993)和在Liebl等人(International Journal ofSystematic Bacteriology(1991)41：255-260)中发现。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA序列的教导尤其可以由技术人员在Gait编著的手册：Oligonucleotide synthesis：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，UK，1984)以及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)中找到。

还公知蛋白质的N-和/或C-末端的改变不实质性地损害其功能或者甚至可稳定所述功能。关于此的信息可以由技术人员尤其在Ben-Bassat等人(Journal of Bacteriology 169：751-757(1987))、O′Regan等人(Gene 77：237-251(1989)、Sahin-Toth等人(Protein Sciences 3：240-247(1994))、Hochuli等人(Biotechnology 6：1321-1325(1988))以及在遗传学和分子生物学的公知教科书中找到。

因此从SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54获得的氨基酸序列同样是本发明的部分。

e)根据本发明使用的宿主细胞

本发明还涉及作为宿主细胞的微生物，尤其是棒细菌，该微生物含有载体，尤其是穿梭载体或质粒载体，携带本发明定义的至少一种metY基因或者其中本发明的metY基因被表达或扩增。

这些微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇产生含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸。所述微生物优选为棒状细菌，尤其是棒杆菌属的细菌。对于棒杆菌属，必须提及的是谷氨酸棒杆菌，在文献中已知其能够产生L-氨基酸。

可以提及的棒状细菌的适宜菌株的实例是棒杆菌属的菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)种的菌株，如

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、

醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806、

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、

热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539、

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

或者短杆菌属(Brevibacterium)的菌株，如

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和

叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020；

后者从中衍生的菌株，如

谷氨酸棒杆菌KFCC10065、

谷氨酸棒杆菌ATCC21608，

其同样产生目的精细化学品或者其前体。

缩写KFCC指韩国培养物保藏联合会(Korean Federation of CultureCollection)，缩写ATCC指美国典型菌株培养物保藏中心，缩写FERM BP指日本工业科学和技术局的国立生命科学和人体技术研究所的保藏中心。

f)实施本发明的发酵

根据本发明，发现棒状细菌过量表达来自表I生物的metY基因后，以有利的方式产生含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸。

为了实现过量表达，技术人员可以采用单独的或联合的不同措施。从而可能增加适宜基因的拷贝数或者突变启动子和调节区或者位于结构基因上游的核糖体结合位点。掺入结构基因上游的表达盒以同样的方式作用。可诱导的启动子使得还可能在发酵性L-甲硫氨酸产生过程中增加表达。通过延长mRNA寿命的措施也可以提高表达。此外，通过防止酶蛋白质的降解也可以增强酶活性。基因或基因构建体可以或者以不同的拷贝数存在于质粒中或者被整合到染色体并在染色体中扩增。另一可能的备选方案是通过改变培养基组分和操纵培养实现相关基因的过量表达。

过量表达的教导可以由技术人员在Martin等人(Biontechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene102，93-98(1991))、欧洲专利0472869、美国专利4,601,893、Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991)、Remscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology60，126-132(1994)、LaBarre等人(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))、专利申请WO 96/15246、Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))、日本公开的说明书JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60：512-538(1996)以及遗传学和分子生物学的公知教科书中找到。

本发明因此还涉及含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体，还涉及含有至少一种那所述表达构建体的载体。本发明的这类构建体优选包括特定编码序列5’上游的启动子和3’下游的终止子序列和适当时包括其他调节元件，在每种情况下它们均可操作地连接到编码序列。“可操作地连接”指启动子、编码序列、终止子序列和适宜时其他调节元件的顺序排列从而每种调节元件可以在编码序列的表达中正确发挥其功能。可操作地连接的序列的实例为活化序列和增强子等。其他调节元件包括可选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列在例如Goeddel，基因表达技术：酶学方法185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中描述。

除了人工调节序列外，天然调节序列仍然可以存在于实际的结构基因的上游。遗传修饰可以在适宜时关闭该天然调节并且增加或减少该基因的表达。基因构建体也可以具有更简单的设计，即没有额外的调节信号被***结构基因的上游并且天然启动子与其调节没有被除去。取而代之的是，天然调节序列被突变从而调节不再发生并且基因表达被增强或减弱。基因构建体可以含有核酸序列的一份或多份拷贝。

有用的启动子的实例为来自谷氨酸棒杆菌启动子的ddh、amy、lysC、dapA、lysA，以及革兰氏阳性启动子SPO2，如在《枯草芽孢杆菌及其最接近的菌株》，Sonenshein，Abraham L.，Hoch，James A.，Losick，Richard；ASM Press，华盛顿哥伦比亚特区以及Patek M.Eikmanns BJ.，Patek J.，Sahm H.，Microbiology.142 1297-309，1996中所描述的，或者优选有利地用于革兰氏阴性细菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL启动子。还优选使用可诱导的启动子如光可诱导的启动子，尤其是温度可诱导的启动子如P_rP_L启动子。原则上可以使用具有调节序列的所有天然启动子。此外，还可以有利地使用合成的启动子。

所提及的调节序列旨在使得核酸序列的特异表达成为可能。根据宿主生物，这可以指例如基因仅仅在诱导后被表达或过量表达，或者其被立即表达和/或过量表达。

关于这一点，调节序列和因子可以优选对表达具有有益影响，并能从而增加或减少表达。从而，可能并有利地通过使用强转录信号如启动子和/或增强子增强转录水平上的调节元件。然而，除了这之外还可通过例如提高mRNA的稳定性增强翻译。

通过将适宜的启动子、适宜的SD序列融合到metA核苷酸序列和适宜的终止信号制备表达盒。为此，使用常规重组和克隆技术，如在CurrentProtocols in Molecular Biology，1993，John Wiley & Sons，Incorporated，New York，纽约；PCR Methods，Gelfand，David H.，Innis，Michael A.，Sninsky，John J.，1999，Academic Press，Incorporated，California，SanDiego；PCR Cloning Protocols，Methods in Molecular Biology Ser.，192卷，第二版，Humana Press，New Jersey；Totowa.T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)；以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中描述的那些技术。

通过将重组核酸构建体或基因构建体有利地***宿主特异的载体而实现在适宜的宿主生物中表达所述重组核酸构建体或基因构建体，其中所述载体使得可能在宿主中最优表达这些基因。载体是本领域技术人员熟知的并且可以在例如，“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，Hrsg，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。术语“载体”除了质粒，还指技术人员公知的所有其他载体，如噬菌体、转座子、IS元件、质粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或者随染色体复制。

通过例如利用游离型质粒过量表达本发明的metY基因而扩增这些基因。适宜的质粒为在棒状细菌中复制的那些质粒。许多公知的质粒载体如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology(1989)64：549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 102：93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 107：69-74(1991))是基于隐性质粒(cryptic plasmid)pHM1519、pBL1或pGA1。其他质粒载体如pCLiK5MCS或者基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMS MicrobiologyLetters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)的那些质粒可以以相同方式使用。

适宜的质粒载体还包括通过它们可以应用通过整合到染色体扩增基因的方法的那些质粒载体，如Remscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994))已经描述的用于复制和扩增hom-thrB操纵子的那些质粒载体。在该方法中，完整基因被克隆到质粒载体中，该质粒载体可以在宿主(一般为大肠杆菌)但是不能在谷氨酸棒杆菌中复制。适宜的载体为例如pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(

等人，Gene 145，69-73(1994))，Bernard等人，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人，1991，Journal of Bacteriology 173：4510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene 41：337-342)。含有待扩增基因的质粒载体然后通过转化被转移到目的谷氨酸棒杆菌菌株中。转化方法在例如Thierbach等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))和Tauch等人(FEMSMicrobiological Letters 123，343-347(1994))中描述。

酶的活性可以被相应基因中的突变影响从而使得酶反应的速率被部分或完全降低。这些突变的实例是技术人员公知的(Motoyama H.，Yano H.，Terasaki Y.，Anazawa H.，Applied & Environmental Microbiology.67：3064-70，2001，Eikmanns BJ.，Eggeling L.，Sahm H.，Antonie vanLeeuwenhoek.64：145-63，1993-94)。

此外，对于含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸的产生有利的是，除了表达和扩增本发明的metY基因，还扩增各自生物合成途径、半胱氨酸途径、天冬氨酸-半醛合成、糖酵解、回补、磷酸戊糖代谢、柠檬酸循环或者氨基酸输出的一种或多种酶。

从而，可以扩增一种或多种下面的基因以产生含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸：

-基因lysC，其编码天冬氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.281)，

-基因asd，其编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.282)，

-甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gap(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，

-3-磷酸甘油酸激酶编码基因pgk(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，

-丙酮酸羧化酶编码基因pyc(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，

-磷酸丙糖异构酶编码基因tpi(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，

-高丝氨酸O-乙酰转移酶编码基因metA(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.725)，

-γ胱硫醚合酶编码基因metB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3491)，

-γ胱硫醚裂合酶编码基因metC(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3061)，

-丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.1110)，

-甲硫氨酸合酶编码基因metH(EP 1 108 790 A2)，

-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.2379)，

-磷酸丝氨酸氨基转移酶编码基因serC(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.928)，

-磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因serB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.334，DNA-SEQ NO.467，DNA-SEQ NO.2767)，

-基因cysE，其编码丝氨酸乙酰转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.2818)，

-基因hom，其编码高丝氨酸脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1306)

从而，对在棒状细菌中产生含硫精细化学品尤其是L-甲硫氨酸有利的是同时突变至少一种下面的基因，从而相应蛋白质的活性与未突变的蛋白质的相比，受代谢的代谢物影响程度较小或不受影响：

-基因lysC，其编码天冬氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.281)，

-γ胱硫醚合酶编码基因metB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3491)，

-γ胱硫醚裂合酶编码基因metC(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3061)，

-甲硫氨酸合酶编码基因metH(EP 1 108 790 A2)，

-丝氨酸乙酰转移酶编码基因cysE(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2818)，

-基因hom，其编码高丝氨酸脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1306)

另外对产生含硫精细化学品尤其是L-甲硫氨酸有利的是，除了表达和扩增本发明的metY基因之一外，还弱化一种或多种下面的基因，尤其是减少它们的表达，或者将它们关闭：

-高丝氨酸激酶编码基因thrB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3453)，

-苏氨酸脱水酶编码基因ilvA(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2328)，

-苏氨酸合酶编码基因thrC(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3486)，

-内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶编码基因ddh(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3494)，

-磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pck(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3157)，

-葡萄糖-6-磷酸6-异构酶编码基因pgi(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.950)，

-丙酮酸氧化酶编码基因poxB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2873)，

-二氢吡啶二羧酸合酶编码基因dapA(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3476)，

-二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因dapB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3477)

-二氨基吡啶甲酸脱羧酶编码基因lysA(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3451)。

另外对含硫精细化学品尤其是L-甲硫氨酸的产生有利的是，除了在棒状细菌中表达和扩增本发明的metY基因之一外，同时突变至少一种下面的基因使得相应蛋白质的酶活性部分或完全降低：

-高丝氨酸激酶编码基因thrB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3453)，

-苏氨酸脱水酶编码基因ilvA(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2328)，

-苏氨酸合酶编码基因thrC(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3486)，

-丙酮酸氧化酶编码基因poxB(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2873)，

另外对含硫精细化学品尤其是L-甲硫氨酸的产生有利的是，除了表达和扩增本发明的一种metY基因，还消除不需要的副反应(Nakayama：微生物产物的过量产生中的“产氨基酸微生物的喂饲”，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，伦敦，UK，1982)。

根据本发明产生的微生物可以连续地或者分批地或者补料分批或者反复补料分批方法培养以产生含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸。公知的培养方法的概述可以在Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik1.Einführungin die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中找到。

所用的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的要求。美国细菌学协会(the American Society for Bacteriology)的教科书＂Manual of Methodsfür General Bacteriology＂包含各种微生物培养基的描述。

可以根据本发明使用的所述培养基通常含有一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

优选的碳源为糖如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源的实例为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉和纤维素。也可通过复杂化合物如糖蜜或其他糖精炼的副产物将糖加入培养基。还有利的是加入不同碳源的混合物。其他可能的碳源为油和脂肪如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油、甲醇和乙醇以及有机酸如乙酸和乳酸。

氮源通常为有机或无机氮化合物或含有所述化合物的物质。氮源的实例包括氨气或铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸和复杂氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏等。氮源可以单独地或者作为混合物使用。

可以包括在培养基的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。

无机含硫化合物如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物或者有机含硫化合物如硫醇类也可用作产生含硫精细化学品尤其是甲硫氨酸的硫源。

磷酸、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作磷源。

可向培养基中加入螯合剂以保持溶液中的金属离子。尤其适宜的螯合剂包括二羟基酚类如儿茶酚或原儿茶酸以及有机酸如柠檬酸。

根据本发明使用的发酵培养基通常还含有其他生长因子如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐经常来自复杂的培养基组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。还可向培养基中加入适宜的前体。培养基的精确组分很大程度上取决于特定实验并且对于每种特定情况单独决定。优化培养基的信息可以在教科书＂Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach＂(编者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)53-73页，ISBN 0 19 9635773)中发现。还可以从供应商得到生长培养基，例如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。

所有培养基组分通过热(1.5巴下20分钟，121℃)或通过无菌过滤除菌。各组分可以一起或者，如果需要，分开灭菌。所有培养基组分可以在培养开始时存在或者根据需要连续或者分批加入。

培养温度通常为15℃到45℃，优选25℃到40℃，并且可以保持恒定或者在实验过程中改变。培养基的pH应该为5到8.5，优选约7.0。培养的pH可以在培养中通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸控制。通过使用防沫剂如脂肪酸聚乙二醇酯控制起泡沫。为了保持质粒的稳定，可向培养基加入具有选择作用的适宜物质，例如抗生素。通过将氧气或者含氧的气体混合物如空气导入培养基可以保持需氧条件。培养温度通常为20℃到45℃。连续培养直到目的产物达到最大量。该目标通常在10到160小时内实现。

以这种方法得到的发酵液，尤其是含有L-甲硫氨酸的培养基，通常含有按重量计7.5到25％的干生物量。

另一额外的益处是至少在末尾，但是优选在至少30％的发酵期间实施限糖发酵。这表示在该时间内发酵培养基中可利用糖的浓度保持在或者减小到≥0到3g/l。

然后进一步处理发酵液。生物量可以根据需要通过分离方法如离心、过滤、倒出或这些方法的组合从发酵液完全或部分除去或者完全保留在所述发酵液中。

随后，使用公知的方法如利用旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、反向渗透或者通过纳过滤(nanofiltration)增稠或者浓缩发酵液。该浓缩的发酵液然后可以通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾粒化或其他方法处理。

然而，还可进一步纯化含硫精细化学品，尤其是L-甲硫氨酸。为此，含产物的发酵液，在除去生物量后，使用适宜的树脂进行层析，目的产物或者杂质完全或部分保留在层析树脂上。如果需要，可以使用相同的或者不同的层析树脂重复这些层析步骤。技术人员熟悉适宜的层析树脂的选择和它们最有效的应用。纯化的产物可以通过过滤或者超滤浓缩并保持在某一温度下，在该温度下产物的稳定性最大。

通过本领域技术可以确定所分离的一种或几种化合物的身份和纯度。这些技术包括高效液相层析(HPLC)、光谱方法、染色方法、薄层层析、NIRS、酶测定法或微生物学测定法。这些分析方法在Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya 11 27-32；和Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70.Ulmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1996)Bd.A27，VCH：Weinheim，89-90页，521-540页，540-547页，559-566页，575-581和581-587页；Michal，G.，(1999)Biochemical Pathways：An Atlas ofBiochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等人(1987)，在Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，17卷的HPLC在生物化学中的应用中概述。

下面的非限制性实施例和附图更详细时描述本发明：

图1显示了质粒pClysC的质粒图；

图2质粒pCISlysCthr311ile的质粒图；

图3质粒pCPhsdhmetY_Mt的质粒图；

限制性切割位点及它们各自的位置(在括号中)在质粒图中显示。必需的序列片段以粗体印刷。KanR指卡那霉素抗性基因；ask指天冬氨酸激酶基因。

实施例1：pCLiK5MCS的构建

首先，使用寡核苷酸p1.3(SEQ ID NO：55)和p2.3(SEQ ID NO：56)，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增载体pBR322的氨苄青霉素抗性和复制起点。

p1.3(SEQ ID NO：55)

5‘-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3‘

p2.3(SEQ ID NO：56)

5‘-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3‘

寡核苷酸p1.3(SEQ ID NO：55)除了含有与pBR322互补的序列，还含有5’-3’方向限制性核酸酶SmaI、BamHI、NheI和AscI的切割位点，寡核苷酸p2.3(SEQ ID NO：56)含有5’-3’方向限制性核酸内切酶XbaI、XhoI、NotI和DraI的切割位点。根据标准方法如Innis等(PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，Academic Press(1990))使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)实施PCR反应。得到的大小约2.1kb的DNA片段用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明纯化。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明将DNA片段的钝端相互连接并根据标准方法，如Sambrook等人(分子克隆实验指南，冷泉港实验室，(1989))中描述方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过将细胞涂在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板选择携带质粒的细胞。

使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书分离单个克隆的质粒DNA并将它们通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒称为pCLiK1。

以质粒pWLT1(Liebl等，1992)作为PCR反应的模板开始，使用寡核苷酸neo1(SEQ ID NO：57)和neo2(SEQ ID NO：58)扩增卡那霉素抗性盒。

neo1(SEQ ID NO：57)：

5‘-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3‘

neo2(SEQ ID NO：58)：

5‘-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3‘

寡核苷酸neo1除了含有与pWLT1互补的序列外，还含有5’-3’方向限制性内切酶XbaI、SmaI、BamHI、NheI的切割位点，寡核苷酸neo2(SEQID NO：58)含有5’-3’方向限制性核酸内切酶AscI和NheI的切割位点。使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)根据标准方法如Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990))的方法实施PCR反应。得到的约1.3kb大小的DNA片段用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。DNA片段用限制性内切酶XbaI和AscI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割并且，之后，再次用用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。载体pCLiK1也用限制性内切酶XbaI和AscI切割并使用碱性磷酸酶(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书去磷酸。在0.8％强度的琼脂糖凝胶中电泳后，线性化载体(约2.1kb)使用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离。该载体片段使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明用切割的PCR片段连接并将根据标准方法，如Sambrook等(分子克隆实验指南，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过涂在含有氨苄青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板上选择携带质粒的细胞。

使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书分离单个克隆的质粒DNA并将它们通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒称为pCLiK2。

载体pCLiK2用限制性内切酶DraI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割。在0.8％强度的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离约2.3kb载体片段。该载体片段使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明重新连接并将根据标准方法，如Sambrook等(分子克隆实验指南，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过涂在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板上选择携带质粒的细胞。

使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书分离单个克隆的质粒DNA并将它们通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒称为pCLiK3。

以质粒pWLQ2(Liebl等，1992)作为PCR反应的模板开始，使用寡核苷酸cg1(SEQ ID NO：59)和cg2(SEQ ID NO：60)扩增复制起点pHM1519。

cg1(SEQ ID NO：59)：

5‘-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3‘

cg2(SEQ ID NO：60)：

5‘-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3‘

寡核苷酸cg1(SEQ ID NO：59)和cg2(SEQ ID NO：60)除了包含与pWLQ2互补的序列外，还含有限制性内切酶NotI的切割位点。使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)根据标准方法如Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and ApPlications，Academic Press(1990))的方法实施PCR反应。得到DNA片段大小约2.7kb并用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。DNA片段用限制性内切酶NotI(NewEngland Biolabs，Beverly，USA)切割，并且之后再次用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。载体pCLiK3也用限制性内切酶NotI切割并使用碱性磷酸酶(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书去磷酸。在0.8％强度的琼脂糖凝胶中电泳后，线性化载体(约2.3kb)使用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离。该载体片段使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明用切割的PCR片段连接并根据标准方法，如Sambrook等(分子克隆实验指南，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过涂在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板上选择携带质粒的细胞。

使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书分离单个克隆的质粒DNA并将它们通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒称为pCLiK5。

通过组合两种合成的基本互补的寡核苷酸HS445((SEQ ID NO：61)和HS446(SEQ ID NO：62))通过多克隆位点(MCS)延伸PCLik5，HS445和HS446含有限制性内切酶SwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaI和SmaI的切割位点，延伸后通过将它们一起加热到95℃，然后缓慢冷却得到双链DNA片段。

HS445(SEQ ID NO：61)：

5‘-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3‘

HS446(SEQ ID NO：62)：

5‘-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3‘

载体pCLiK5用限制性内切酶XhoI和BamHI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割并用碱性磷酸酶(I(Roche Diagnostics，Mannheim))根据生产商的使用说明书去磷酸。在0.8％强度的琼脂糖凝胶中电泳后，线性化载体(约5.0kb)使用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离。该载体片段使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明用合成的双链DNA片段连接，并根据如Sambrook等(分子克隆实验指南，冷泉港，(1989))中描述的标准方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过涂在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板上选择携带质粒的细胞。

使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书分离单个克隆的质粒DNA并将它们通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒称为pCLiK5MCS。

根据Sanger等人(1977)所述(Proceedings of the National Academy ofSciences USA 74：5463-5467)实施测序反应。分段进行测序反应并通过ABIPrism 377(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)分析。

所得质粒pCLiK5MCS如SEQ ID NO：65所示。

实施例2：pCLiK5MCS integrativ sacB的构建

以质粒pK19mob(

等人，Gene 145，69-73(1994))作为模板开始PCR反应，使用寡核苷酸BK1732和BK1733扩增枯草芽孢杆菌sacB基因(编码果聚糖蔗糖酶)。

BK1732(SEQ ID NO：63)：

5‘-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3‘

BK1733(SEQ ID NO：64)：

5‘-AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3‘

寡核苷酸BK1732和BK1733除了含有与pEK19mobsac互补的序列外，还含有限制性内切酶NotI的切割位点。使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)根据标准方法如Innis等(PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press(1990))的方法实施PCR反应。得到大小约1.9kb的DNA片段用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。DNA片段用限制性内切酶NotI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割并且，之后再次用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。

载体pCLiK5MCS(根据实施例1制备)也用限制性内切酶NotI切割并使用碱性磷酸酶(I(Roche Diagnostics，Mannheim))根据生产商的使用说明书去磷酸。在0.8％强度的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离约2.4kb大小的载体。该载体片段使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明与切割的PCR片段连接并根据标准方法，如Sambrook等(分子克隆实验指南，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过涂在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板上选择携带质粒的细胞。

使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书分离单个克隆的质粒DNA并将它们通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒称为pCLiK5MCS integrativ sacB。

所得质粒pCLiK5MCS integrativ sacB如SEQ ID NO：66所示。

可以类似方式制备适于metY基因的发明性表达或过量产生的其他载体。

实施例3：从谷氨酸棒杆菌菌株LU1479分离lysC基因

菌株构建的第一步计划为谷氨酸棒杆菌ATCC13032(以下称为LU1479)中编码天冬氨酸激酶的lysC野生型基因的等位基因替换。计划在lysC基因中实施核苷酸替换从而在所得蛋白质中，311位的氨基酸Thr改变为氨基酸Ile。

以LU1479染色体DNA作为模板开始PCR，用寡核苷酸引物SEQ IDNO：67和SEQ ID NO：68lysC，利用Pfu-Turbo PCR***(Stratagene USA)按照生产商的使用说明书实施扩增。如Tauch等人(1995)Plasmid33：168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140：1817-1828描述的制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。所扩增片段的5’端侧翼位为SalI限制性切割，其3’端侧翼位为MluI限制性切割。克隆步骤前，扩增的片段用这两种限制酶消化并用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)纯化。

SEQ ID NO：67

5‘-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3‘

SEQ ID NO：68

5‘-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3‘

所得多核苷酸通过SalI和MluI切割被克隆到pCLIK5MCS integrativSacB(此后称为pCIS；实施例2的SEQ ID NO：66)并被转化到大肠杆菌XL-1blue中。通过涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板实现对携带质粒的细胞的选择。分离质粒并通过测序验证预期的核苷酸序列。通过Quiagen的方法并使用来自Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academyof Sciences USA 74：5463-5467描述的实施测序反应。通过ABI Prism 377(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)分离测序反应物并对其评定。所得质粒pCIS lysC如SEQ ID NO：69所示。相应的质粒图在图1中显示。

序列SEQ ID NO：69包括下面的必需部分-区域：

基因座 pCIS\lysC 5860bp DNA 环状

特征定位/定义(Qualifiers)

CDS¹⁾ 155..1420

/vntifkey＝＂4＂

/label＝lysC

CDS 互补的²⁾(3935..5356)

/vntifkey＝＂4＂

/label＝sacB\(枯草芽孢杆菌)

启动子互补的(5357..5819)

/vntifkey＝＂30＂

/label＝启动子\sacB

C_region 互补的(3913..3934)

/vntifkey＝＂2＂

/Iabel＝sacB\下游区

CDS 1974..2765

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Kan\R

CDS 互补的(3032..3892)

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Ori\-EC\(pMB)

¹⁾编码序列

²⁾在互补链上

实施例4：谷氨酸棒杆菌lysC基因的诱变

使用QuickChange试剂盒(Stratagene/USA)按照生产商的使用说明书实施谷氨酸棒杆菌lysC基因(实施例3)的位点专一诱变。在质粒pCIS lysC，SEQ ID NO：69中实施诱变。利用Quickchange方法(Stratagene)合成了下面的寡核苷酸引物，其用于将thr311变为311ile。

SEQ ID NO：70

5‘-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG—3‘

SEQ ID NO：71

5‘-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG—3‘

Quickchange反应中这些寡核苷酸引物的使用导致lysC基因中932位核苷酸的替换(用T代替C)(参考SEQ ID NO：72)和相应酶中311位中氨基酸的替换(Thr→Ile)(参考SEQ ID NO：73)。LysC基因中所得氨基酸替换Thr311Ile通过转化到大肠杆菌XL1-blue和质粒制备后测序来检验。该质粒被命名为pCIS lysC thr311ile并且如SEQ ID NO：74所示。相应的质粒图在图2中显示。

序列SEQ ID NO：74包括下面的必需部分区域：

基因座 pCIS\lysC\thr311ile 5860bp DNA环状

特征定位/定义

CDS¹⁾ 155..1420

/vntifkey＝＂4＂

/label＝lysC

CDS 互补的²⁾(3935..5356)

/vntifkey＝＂4＂

/label＝sacB\(枯草芽孢杆菌)

启动子互补的(5357..5819)

/vntifkey＝＂30＂

/label＝启动子\sacB

C_region 互补的(3913..3934)

/vntifkey＝＂2＂

/label＝sacB\下游区

CDS 1974..2765

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Kan\R

CDS 互补的(3032..3892)

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Ori\-EC\(pMB)

¹⁾编码区

²⁾在互补链上

通过如Liebl，等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53：299-303描述的电穿孔法将质粒pCIS lysC thr311ile转化到谷氨酸棒杆菌LU1479中。方案的修改在DE-A-10046870中描述。使用标准方法如Sambrook等人((1989)，分子克隆实验指南，冷泉港)中描述的DNA印迹和杂交检查单个转化体的lysC基因座的染色体排列。从而确保转化体为具有通过同源重组整合在lysC基因座的被转化质粒的转化体。这些菌落在没有抗生素的培养基中生长过夜后，将细胞涂布在蔗糖-CM琼脂培养基(10％蔗糖)的平板上并在30℃孵育24小时。

因为存在于载体pCIS lysC thr311ile中的sacB基因将蔗糖转化成毒性产物，所以仅仅那些通过另一同源重组步骤将野生型lysC基因和突变的基因lysC thr311ile之间的sacB基因缺失的菌落能够生长。同源重组过程中，野生型基因或者突变基因与sacB基因一起可以被缺失。如果sacB基因与野生型基因一起被除去，则产生突变的转化体。

挑选生长菌落并检查卡那霉素敏感表型。缺失SacB基因的克隆必须同时表现出卡那霉素-敏感的生长行为。在摇瓶中研究这种Kan-敏感克隆的赖氨酸产量(见实施例6)。生长未处理的菌株LU1479用于比较目的。选择赖氨酸产量比对照增加的克隆，得到染色体DNA，并通过PCR反应扩增lysC基因的相应区域并测序。具有增加的赖氨酸合成和具有lysC中932位经证实突变的这种克隆之一称为LU1479 lysC 311ile。

实施例5：乙硫氨酸抗性谷氨酸棒杆菌菌株的产生

在第二个菌株构建步骤，处理所得菌株LU1479 lysC 311ile(实施例4)以诱导对乙硫氨酸的抗性(Kase，H.Nakayama K.Agr.Biol.Chem.39，153-106，1975)，通过谷氨酸棒杆菌的甲硫氨酸类似物抗性突变株产生L-甲硫氨酸)：BHI培养基(Difco)中的过夜培养物用柠檬酸盐缓冲液(50mMpH5.5)洗涤并在30℃用N-甲基亚硝基胍(50mM柠檬酸盐pH5.5中10mg/ml)处理20分钟。用化学诱变剂N-甲基亚硝基胍处理后，洗涤(柠檬酸盐缓冲液50mM pH5.5)细胞并将其涂布在含有下面组分的培养基平板上，在500ml中含有：10g(NH₄)₂SO₄、0.5g KH₂PO₄、0.5g K₂HPO₄、0.125gMgSO₄·7H₂O、21g MOPS、50mg CaCl₂、15mg原儿茶酸(proteocatechuate)、0.5mg生物素、1mg硫胺素、5g/l D，L-乙硫氨酸(SigmaChemicals Deutschland)，pH7.0。此外，培养基含有0.5ml微量盐溶液，其由10g/l FeSO₄·7H₂O、1g/l MnSO₄·H₂O、0.1g/lZnSO₄·7H₂O、0.02g/lCuSO₄、0.002g/l NiCl₂·6H₂O组成，所有盐溶于0.1M HCl中。所完成的培养基通过过滤除菌，并且加入40ml无菌50％葡萄糖溶液后，加入液体无菌琼脂，其终浓度为1.5％琼脂，并将混合物倒入培养皿中。

将已经经历诱变处理的细胞应用于含有上述培养基的平板并在30℃孵育3-7天。分离所得克隆，单个克隆在选择培养基上分离至少一次然后在装有培养基II(见实施例6)的摇瓶中分析它们的甲硫氨酸产量。

实施例6：使用菌株LU1479 lysC 311ile ET-16制备甲硫氨酸

实施例5中产生的菌株在含有CM培养基的琼脂板上于30℃生长2天。

CM琼脂：

10.0g/lD-葡萄糖、2.5g/l NaCl、2.0g/l尿素、10.0g/l细菌培养用蛋白胨(Difco)、5.0g/l酵母提取物(Difco)、5.0g/l牛肉膏(Difco)、22.0g/l琼脂(Difco)，高压灭菌(20分钟，121℃)

细胞随后从平板刮下并重悬在盐水中。对于主培养，向100ml锥形烧瓶中的10ml培养基II和0.5g高压灭菌的CaCO₃(Riedel de Haen)接种细胞悬浮物至OD 600nm为1.5并在有轨摇床上以200转/分钟在30℃下孵育72小时。

培养基II：

40g/l 蔗糖

60g/l 糖蜜(基于100％糖含量)

10g/l (NH₄)₂SO₄

0.4g/l MgSO₄·7H₂O

0.6g/l KH₂PO₄

0.3mg/l 硫胺素·HCl

1mg/l 生物素(来自用NH₄OH调节至pH8.0的1mg/ml过滤除菌的母液)

2mg/l FeSO₄

2mg/l MnSO₄

用NH₄OH建立7.8的pH并将混合物高压灭菌(121℃，20分钟)。此外，加入来自母液(200μg/ml，过滤除菌的)的维生素B12(羟钴胺素，SigmaChemicals)至终浓度100μg/l。

使用Agilent氨基酸确定方法在Agilent 1100 Series LC System HPLC上确定培养液中形成的甲硫氨酸以及其他氨基酸。用正-邻苯二醛(ortho-phtalaldehyde)柱前衍生使得可以确定所形成的氨基酸量。氨基酸混合物在柱上分离。氨基酸混合物在Hypersil AA柱(Agilent)上分离。

分离甲硫氨酸产量比原始菌株LU1479 lysC 311ile的产量高至少2倍的克隆。一个这种克隆用于进一步的实验中，并命名为LU1479 lysC 31ileET-16。

实施例7：从结核分枝杆菌克隆metY并克隆到质粒pC PhsdhmetY_Mt中

结核分枝杆菌的染色体DNA来自菌株ATCC 25584，该菌株获自美国典型菌株培养物保藏中心(ATCC，Atlanta-USA)。通过Tauch等人(1995)Plasmid 33：168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140：1817-1828描述的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。

使用寡核苷酸引物SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76、谷氨酸棒杆菌染色体DNA作为模板和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，通过聚合酶链式反应(PCR)，按照标准方法如Innis等人(1990)(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)所述从高丝氨酸脱氢酶(HsDH)的5’非编码区(启动子区)扩增了约180个碱基对的DNA片段。扩增的片段在其5’端侧翼为BamHI限制性切割位点，其3’端侧翼为与结核分枝杆菌的metY同源的区域并且已通过寡核苷酸引物导入。

SEQ ID NO：75

5‘-GAGAGGATCCGGAAGGTGAATCGAATTTCGG—3‘

和

SEQ ID NO：76

5‘-CTATTGCTGTCGGCGCTCATGATTCTCCAAAAATAATCGC—3‘

所得DNA片段用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)按照生产商的使用说明书纯化。

从作为PCR反应模板的来自结核分枝杆菌染色体DNA开始，通过富含GC的PCR***(Roche Diagnostics，Mannheim)按照生产商的使用说明，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78扩增metY。被扩增的片段在其3’端侧翼为Xbal限制性切割位点，其已通过寡核苷酸引物导入。

SEQ ID NO：77

5‘-ATGAGCGCCGACAGCAATAG—3‘

和

SEQ ID NO：78

5‘-GAACTCTAGATCAGAACGCCGCCACGGAC—3‘

所得约1.4kb DNA片段用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)按照生产商的使用说明书纯化。

在进一步的PCR反应中，上面所得两种片段联合用作模板。由于存在与metY片段同源并已经通过寡核苷酸引物SEQ ID NO：76导入的区域，这两种片段在PCR反应中相互退火并被所用聚合酶延伸到连续的DNA链。修改了标准方法，其中将所用的寡核苷酸引物SEQ ID NO：75和SEQID NO：78仅在第二个循环开始时加至反应物。

扩增的DNA片段大小约为1.6kb，该DNA片段用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒按照生产商的使用说明纯化。此后，将其用限制酶BamHI和Xbal(Roche Diagnostics，Mannheim)切割并通过凝胶电泳分离。使用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)从琼脂糖分离约1.6kb DNA片段。

载体pClik5MCS SEQ ID NO：65，此后称为pC，用限制酶BamHI和Xbal(Roche Diagnostics，Mannheim)切割，并且，通过电泳分离后，用GFX^TMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒分离5kb片段。

利用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)按照生产商的使用说明书将载体片段与被切割并分离的PCR片段连接，使用如Sambrook等人(分子克隆实验指南，冷泉港，(1989))描述的标准方法将连接反应物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中。通过涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1：190)板上实现含有质粒的细胞的选择。

使用Quiagen的方法和来自Quiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences USA74：5463-5467描述的实施测序反应。通过ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)分离和评价测序反应物。

所得质粒pC Phsdh metY_Mt(结核分枝杆菌)如SEQ ID NO：79所列。相应的质粒图在图3中显示。

SEQ ID NO：79含有下面的必需部分-区域：

基因座 pC\Phsdh\metY_Mt 6591bp DNA 环状

2003年7月21日

特征定位/定义

CDS 156..1505

/vntifkey＝＂4＂

/label＝metY\aus\M\结核分枝杆菌

CDS 1855..2646

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Kan\R

CDS 4927..6048

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Rep\蛋白质

CDS 3919..4593

/vntifkey＝＂4＂

/label＝ORF\1

CDS 互补的(2913..3773)

/vntifkey＝＂4＂

/label＝Ori\-EC\(pMB)

实施例8：用质粒pC Phsdh metY_Mt转化菌株LU1479lysC 311ileET-16

通过上述方法(Liebl，等人(1989)FEMS Microbiology Letters53：299-303)用质粒pC Phsdh metY_Mt转化菌株LU1479 lysC 311ileET-16。将转化混合物涂布到额外含有20mg/l卡那霉素的CM板上以得到对含有质粒的细胞的选择。挑选所得卡那霉素-抗性克隆并分离单个克隆。在摇瓶实验中研究克隆的甲硫氨酸产量(见实施例6)。菌株LU1479 lysC311ile ET-16pC Phsdh metY_Mt与LU1479 lysC 311ile ET-16相比产生明显更多的甲硫氨酸。

序列表

<110>巴斯福股份公司

<120>发酵产生含硫精细化学品的方法(metY)

<130>M/43128

<160>66

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>1317

<212>DNA

<213>白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1317)

<223>

<400>1

<210>2

<211>438

<212>PRT

<213>白喉棒杆菌

<400>2

<210>3

<211>1350

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1350)

<223>

<400>3

<210>4

<211>449

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>4

<210>5

<211>1284

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1284)

<223>

<400>5

<210>6

<211>427

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>6

<210>7

<211>1293

<212>DNA

<213>嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1293)

<223>

<400>7

<210>8

<211>430

<212>PRT

<213>嗜碱芽孢杆菌

<400>8

<210>9

<211>1203

<212>DNA

<213>嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1203)

<223>

<400>9

<210>10

<211>400

<212>PRT

<213>嗜热脂肪芽孢杆菌

<400>10

<210>11

<211>1290

<212>DNA

<213>微温绿菌(Chlorobium tepidum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1290)

<223>

<400>11

<210>12

<211>429

<212>PRT

<213>微温绿菌

<400>12

<210>13

<211>1281

<212>DNA

<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1281)

<223>

<400>13

<210>14

<211>426

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌

<400>14

<210>15

<211>1173

<212>DNA

<213>聚球藻属(Synechococcus)中的种

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1173)

<223>

<400>15

<210>16

<211>390

<212>PRT

<213>聚球藻属中的种

<400>16

<210>17

<211>1314

<212>DNA

<213>构巢裸孢壳(Emericella nidulans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1314)

<223>

<400>17

<210>18

<211>437

<212>PRT

<213>构巢裸孢壳

<400>18

<210>19

<211>1287

<212>DNA

<213>脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1287)

<223>

<400>19

<210>20

<211>428

<212>PRT

<213>脆弱拟杆菌

<400>20

<210>21

<211>1278

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1278)

<223>

<400>21

<210>22

<211>425

<212>PRT

<213>铜绿假单胞菌

<400>22

<210>23

<211>1296

<212>DNA

<213>支气管炎博德特氏菌(Bordete1la bronchisept ica)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1296)

<223>

<400>23

<210>24

<211>431

<212>PRT

<213>支气管炎博德特氏菌

<400>24

<210>25

<211>1269

<212>DNA

<213>欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1269)

<223>

<400>25

<210>26

<211>422

<212>PRT

<213>欧洲亚硝化单胞菌

<400>26

<210>27

<211>1281

<212>DNA

<213>苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1281)

<223>

<400>27

<210>28

<211>426

<212>PRT

<213>苜蓿中华根瘤菌

<400>28

<210>29

<211>1293

<212>DNA

<213>海栖热袍菌(Thermotoga maritima)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1293)

<223>

<400>29

<210>30

<211>430

<212>PRT

<213>海栖热袍菌

<400>30

<210>31

<211>1314

<212>DNA

<213>变异链球菌(streptococcus mutans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1314)

<223>

<400>31

<210>32

<211>437

<212>PRT

<213>变异链球菌

<400>32

<210>33

<211>1431

<212>DNA

<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1431)

<223>

<400>33

<210>34

<211>476

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德氏菌

<400>34

<210>35

<211>1722

<212>DNA

<213>耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1722)

<223>

<400>35

<210>36

<211>573

<212>PRT

<213>耐辐射奇异球菌

<400>36

<210>37

<211>1284

<212>DNA

<213>荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1284)

<223>

<400>37

<210>38

<211>427

<212>PRT

<213>荚膜红细菌

<400>38

<210>39

<211>1269

<212>DNA

<213>多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1269)

<223>

<400>39

<210>40

<211>422

<212>PRT

<213>多杀巴斯德氏菌

<400>40

<210>41

<211>1266

<212>DNA

<213>艰难梭菌(Clostridium difficile)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1266)

<223>

<400>41

<210>42

<211>421

<212>PRT

<213>艰难梭菌

<400>42

<210>43

<211>1272

<212>DNA

<213>空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1272)

<223>

<400>43

<210>44

<211>423

<212>PRT

<213>空肠弯曲杆菌

<400>44

<210>45

<211>1041

<212>DNA

<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1041)

<223>

<400>45

<210>46

<211>346

<212>PRT

<213>肺炎链球菌

<400>46

<210>47

<211>1335

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1335)

<223>

<400>47

<210>48

<211>444

<212>PRT

<213>酿酒酵母

<400>48

<210>49

<211>1335

<212>DNA

<213>乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1335)

<223>

<400>49

<210>50

<211>444

<212>PRT

<213>乳酸克鲁维酵母

<400>50

<210>51

<211>1323

<212>DNA

<213>白假丝酵母(Candida albicans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1323)

<223>

<400>51

<210>52

<211>440

<212>PRT

<213>白假丝酵母

<400>52

<210>53

<211>1290

<212>DNA

<213>粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1290)

<223>

<400>53

<210>54

<211>429

<212>PRT

<213>粟酒裂殖酵母

<400>54

<210>55

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>55

<210>56

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>56

<210>57

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>57

<210>58

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>58

<210>59

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>59

<210>60

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>60

<210>61

<211>140

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>61

<210>62

<211>140

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>62

<210>63

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>63

<210>64

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>64

<210>65

<211>5091

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>65

<210>66

<211>4323

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>66

<210>67

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>67

<210>68

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>68

<210>69

<211>5860

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>69

<210>70

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>70

<210>71

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>71

<210>72

<211>1266

<212>DNA

<213>LysC突变体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1266)

<223>

<400>72

<210>73

<211>421

<212>PRT

<213>LysC突变体

<400>73

<210>74

<211>5860

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>74

<210>75

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>75

<210>76

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>76

<210>77

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>77

<210>78

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>78

<210>79

<211>6591

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒

<400>79

Claims

1.发酵产生L-甲硫氨酸的方法，该方法包括下面的步骤：

a)发酵产生L-甲硫氨酸的棒状细菌培养物，其中所述棒状细菌表达至少一种这样的异源核苷酸序列，该序列编码具有O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(metY)活性的蛋白质，其中编码异源metY的核苷酸序列与来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的metY编码序列的同源性为30％至小于70％；

b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-甲硫氨酸；和

c)分离L-甲硫氨酸。

2.权利要求1所述的方法，其中metY编码序列来自任一下列生物体：

白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae) ATCC 14779 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)CDC1551 ATCC 25584 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824 嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans) ATCC21591 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus) ATCC 12980 微温绿菌(Chlorobium tepidum) ATCC 49652 聚球藻属(Synechococcus)物种 ATCC 27104 构巢裸孢壳(Emericella nidulans) ATCC 36104 脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis) ATCC 25285 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) ATCC 7962 支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica) ATCC 19395 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 17933 欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea) ATCC 19718 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) ATCC 4399

海栖热袍菌(Thermotoga maritima) ATCC 43589 变异链球菌(Streptococcus mutans) ATCC 25175 洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia) ATCC 25416 耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans) ATCC 13939 荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) ATCC 11166 多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) ATCC 6530 艰难梭菌(Clostridium difficile) ATCC 9689 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) ATCC 33560 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) ATCC 6308 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 2704 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) ATCC 8585 白假丝酵母(Candida albicans) ATCC 10231 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) ATCC 24969

3.权利要求1所述的方法，其中metY编码序列包含根据SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53的编码序列；或者包含与它们的同源性为至少80％的核苷酸序列，其编码具有metY活性的蛋白质。

4.权利要求2所述的方法，其中metY编码序列包含根据SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53的编码序列；或者包含与它们的同源性为至少80％的核苷酸序列，其编码具有metY活性的蛋白质。

5.权利要求1所述的方法，其中metY编码序列编码具有metY活性的蛋白质，所述蛋白质包含根据SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54的氨基酸序列；或包含与它们的同源性为至少70％的氨基酸序列，其代表具有metY活性的蛋白质。

6.权利要求2所述的方法，其中metY编码序列编码具有metY活性的蛋白质，所述蛋白质包含根据SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54的氨基酸序列；或包含与它们的同源性为至少70％的氨基酸序列，其代表具有metY活性的蛋白质。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中

a)使用经这样的质粒载体转化的细菌菌株，其中所述质粒载体携带处于调节序列控制下的至少一个拷贝的metY编码序列，或者

b)使用其中metY编码序列已经被整合入该细菌染色体中的菌株。

8.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中编码metY的序列被过量表达。

9.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中发酵这样的细菌，该细菌中对选自：

a)基因lysC，其编码天冬氨酸激酶，

b)甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gap，

c)3-磷酸甘油酸激酶编码基因pgk，

d)丙酮酸羧化酶编码基因pyc，

e)磷酸丙糖异构酶编码基因tpi，

f)高丝氨酸O-乙酰转移酶编码基因metA，

g)γ胱硫醚合酶编码基因metB，

h)γ胱硫醚裂合酶编码基因metC，

i)丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA，

j)亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，

k)依赖维生素B12的甲硫氨酸合酶编码基因metH，

l)磷酸丝氨酸氨基转移酶编码基因serC，

m)磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因serB，

n)丝氨酸乙酰转移酶编码基因cysE，和

o)高丝氨酸脱氢酶编码基因hom

的至少一种基因额外以某种方式过量表达或者突变，从而使得相应蛋白质的活性与未突变的蛋白质相比，受代谢的代谢物影响程度如果有的话较小。

10.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中发酵这样的棒状细菌，该细菌中同时对选自：

a)高丝氨酸激酶编码基因thrB，

b)苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，

c)苏氨酸合酶编码基因thrC，

d)内消旋-二氨基庚二酸D-脱氢酶编码基因ddh，

e)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pck，

f)葡萄糖-6-磷酸6-异构酶编码基因pgi，

g)丙酮酸氧化酶编码基因poxB，

h)二氢吡啶二羧酸合酶编码基因dapA，

i)二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因dapB；和

j)二氨基吡啶甲酸脱羧酶编码基因

的至少一种基因通过改变表达速率或者通过导入特定的突变而被弱化。

11.从发酵液产生含L-甲硫氨酸的动物饲料添加剂的方法，该方法包括下面的步骤：

a)在发酵培养基中培养并发酵权利要求1-6中任一项所定义的产生L-甲硫氨酸的微生物；

b)从含L-甲硫氨酸的发酵液除去水；

c)除去发酵过程中形成的生物量0到100wt％；和

d)干燥根据b)和/或c)所得发酵液，以得到目的粉剂或粒剂形式的动物饲料添加剂。