CN100503827C - 一种乙型肝炎病毒疫苗增效蛋白及其基因 - Google Patents

一种乙型肝炎病毒疫苗增效蛋白及其基因 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乙型肝炎病毒疫苗增效蛋白及其基因，以及利用基因工程原理表达该蛋白的方法和应用。该蛋白的cDNA是从人肝cDNA表达库中筛选获得，对其进行序列分析后用基因工程方法克隆至原核细胞、真核(动物、植物)细胞表达由该cDNA编码的蛋白，例如将该cDNA克隆至原核表达载体并在大肠杆菌中表达纯化获得重组蛋白。该蛋白与乙型肝炎病毒疫苗联用可显著提高疫苗的免疫效果，增强乙肝病毒感染者的免疫力，增加其抗体滴度。本发明的蛋白可以用于乙肝疫苗的佐剂。

Description

一种乙型肝炎病毒疫苗增效蛋白及其基因
技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎病毒疫苗增效蛋白及其基因，以及利用基因工程原理表达该蛋白的方法和应用。
背景技术
乙型肝炎是当前威胁人类健康的一种比较严重的传染病，在我国发病率高、危害性大。接种乙肝疫苗是预防感染乙型肝炎和降低乙肝病毒携带率的最有效的措施。但是乙肝疫苗的免疫效果在人群当中的个体差异很大，常规注射三针以后很多人体内并不能产生足够的抗体以抵抗乙肝病毒的感染和乙肝发病。因此，寻找能够有效增强乙肝疫苗免疫原性的分子是解决该问题的一个重要途径。
采用基因工程原理，应用原核(如大肠杆菌)表达***或真核(如酵母、哺乳动物细胞等)表达***克隆表达某种蛋白是获取大量该蛋白的最为有效的方法。从cDNA表达库中筛选得到的某个基因经基因工程克隆表达纯化后，可以获得由该基因编码的蛋白，将其与乙肝疫苗一同免疫动物，再用ELISA方法测定动物体内抗乙肝表面抗原的抗体效价，可以很方便地观察到该蛋白是否能够增强乙肝疫苗的免疫效果，从而推断该蛋白在乙肝疫苗领域是否具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒疫苗的增效蛋白及编码该蛋白的基因，并提供表达该蛋白的方法和应用。
本发明提供的乙型肝炎病毒疫苗的增效蛋白及编码该蛋白基因，其基因序列和氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2。
本发明从人肝cDNA表达库中筛选到上述蛋白基因。再利用基因工程技术表达该蛋白。具体步骤如下：
编码该蛋白的cDNA及该蛋白的获得：以乙型肝炎病毒表面抗原为筛选分子，利用印迹免疫筛选的方法对人肝cDNA表达库进行筛选，得到一株阳性的cDNA克隆。对该cDNA进行测序分析，结果显示该cDNA具有独立的开放阅读框架(ORF)，整个ORF大小为1035bp。进一步的实验证明其编码的蛋白确实对乙肝表面抗原有特异性。
将该cDNA的N端引入6×his purification tag和肠激酶酶切位点DDDDK，并克隆到pBV220原核表达载体中，在大肠杆菌中进行温度诱导表达，收集并裂解大肠杆菌，提取包涵体，经粗纯后再用Ni-NTA agarose进行亲和层析纯化，经透析复性最终得到目的蛋白。
该蛋白对乙肝疫苗免疫效果的影响：将实验动物分为试验组和对照组。以小鼠为例，按常规方法用乙肝疫苗免疫小鼠，皮下注射，并于初次免疫的第10天、17天各加强免疫一次，共计免疫三次。试验组每3天皮下注射该蛋白，对照组不注射。在初次免疫后的第20天从小鼠尾静脉取血，分离血清。用ELISA方法测定小鼠体内抗乙肝表面抗原抗体的滴度。SPSS软件分析试验组和对照组的差异。结果发现该蛋白可以明显增强小鼠体内抗体的滴度，即该蛋白可以增强乙肝疫苗的免疫效果。
由此可见，利用该蛋白可以增强乙型肝炎病毒疫苗的免疫原性、增加抗乙肝表面抗原抗体滴度这个特点，可将其作为一种乙肝疫苗的增效分子即佐剂而应用于乙肝疫苗领域，一方面可以将该蛋白与乙肝疫苗联用，既能增强乙肝疫苗的免疫效果，又可以减少乙肝疫苗的注射剂量和次数；另一方面利用该蛋白对乙肝表面抗原的特异性及其可促进体内抗乙肝表面抗原抗体产生的特性，可将其用于乙型肝炎病毒携带者和乙肝病人治疗的增效剂以及治疗型乙肝疫苗的开发研究等领域。
附图说明
图1该蛋白对Balb/c小鼠抗HBsAg抗体效价的影响I。
图2该蛋白对Balb/c小鼠抗HBsAg抗体效价的影响II，以未经处理的同龄Balb/c小鼠血清为阴性对照，设高于阴性对照OD495值10倍(0.13)以上的为阳性值，通过OD值和血清稀释倍数对数值的一元回归方程的计算各组小鼠的抗HBsAg抗体效价，试验组小鼠(n＝5)的HBsAg抗体效价为9.24×104，对照组小鼠(n＝5)的HBsAg抗体效价为2.68×104，Independent-Sample T test，P<0.04，有统计学意义，因此认为该蛋白可以上调小鼠HBsAg抗体的效价。
具体实施方式
该蛋白基因的获得：用完整的乙肝表面抗原作为筛选分子，利用印迹免疫筛选的方法对人肝cDNA表达库进行筛选，筛选一定数量的克隆以后，最终得到一株阳性的cDNA克隆。对该cDNA进行测序分析，发现该cDNA具有独立的开放阅读框架(ORF)，整个ORF大小为1035bp(SEQ.ID.NO.1)，其编码的蛋白氨基酸序列为SE.Q.ID.NO.2。
基因工程表达和纯化该蛋白：将该基因克隆到真核或原核表达载体***进行表达和纯化。例如，在该cDNA的N端引入6×his purification tag和肠激酶酶切位点DDDDK，6×his purification tag有利于目的融合蛋白的亲和纯化，肠激酶酶切位点可以使纯化的融合蛋白在肠激酶的作用下切除掉6×his tag和DDDDK。将这一完整的DNA克隆到pBV220原核表达载体中，转化大肠杆菌，筛选阳性转化子。挑取阳性单克隆于液体培养基中培养并进行温度诱导发酵：首先在37℃，250rpm培养转化的大肠杆菌至OD600＝0.5～0.6，然后迅速升温至42℃开始诱导发酵5小时。发酵结束后离心收集菌体，裂解菌体以提取包涵体，包涵体粗纯后用Ni-NTA agarose柱亲和纯化，经透析复性后最终得到目的蛋白。用Western和ELISA实验验证所获得的蛋白正是所需要的目的蛋白。
该蛋白对乙肝疫苗免疫效果的影响评价：以小鼠为例，选取7周龄Balb/c小鼠，雌雄各半，分为实验和对照两组。按常规方法用乙肝疫苗免疫小鼠，皮下注射，免疫方案如下：
Figure C200610024756D00051
于初次免疫后的第20天从小鼠尾静脉取血，分离血清。ELISA法测定小鼠体内抗乙肝表面抗原抗体的滴度：将分离到的血清进行倍比稀释，用乙肝表面抗原包被ELISA板，稀释的血清作为一抗，HRP标记的抗小鼠IgG抗体作为二抗。显色后测OD495值。用SPSS软件分析试验组和对照组的差异。
结果(见图1，图2)发现，用乙肝疫苗免疫小鼠，试验组小鼠在初次免疫20天后抗乙肝表面抗原抗体的效价为9.24×104，明显高于对照组的抗体效价(2.68×104)，说明该蛋白具有上调小鼠体内抗乙肝表面抗原抗体的能力，可以增强乙肝疫苗的免疫效果。
具体应用：传统乙肝疫苗的免疫效果在人群当中的个体差异很大，常规注射三针以后很多人体内并不能产生足够的抗体以抵抗乙肝病毒的感染和乙肝发病。本发明提供的这种乙肝疫苗增效蛋白能够明显增强乙肝疫苗的免疫效果，因此，可将其用于乙肝疫苗佐剂的开发。在注射乙肝疫苗的同时，注射一定量的该蛋白，能够增强乙肝疫苗的免疫原性，增加体内抗乙肝表面抗原抗体的效价，从而提高疫苗的免疫效率，并减少乙肝疫苗用量和注射次数。
此外，该蛋白具有对乙肝表面抗原的特异性，并能够促进体内抗乙肝表面抗原抗体的产生。因此，对于乙型肝炎病毒携带者和乙肝病人的治疗，该蛋白可以作为一种增效剂应用于该领域，同时，对治疗性乙肝疫苗的开发研究也具有一定的应用价值。
序列表：
SEQ.ID.NO.1：
SEQ.ID.NO.2：
Figure C200610024756D00072

Claims (1)

1、一种氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2的蛋白作为乙型肝炎疫苗佐剂的应用。
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