CN100444838C - 利用抑制剂制备治疗与rtk机能亢进相关的紊乱的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用抑制剂治疗和/或预防由于受体酪氨酸激酶活性增高而导致的疾病,尤其是癌症。该应用特别涉及抑制或减少受体酪氨酸激酶(RTK)的过表达和/或改变了的活性。受体酪氨酸激酶活性的这种变化可通过FGFR-4的突变激发,该突变特别地是FGFR-4跨膜结构域中的点突变,导致由亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。本发明进一步涉及抗FGFR-4的抑制剂用于治疗和/或预防癌症的用途。本发明还涉及引起其在细胞内过表达和/或活性改变的突变FGFR-4。最后,本发明涉及突变FGFR-4分子的DNA和RNA序列、含上述抑制剂的药物组合物,以及诊断和筛选方法。
Description
技术领域
本发明涉及利用抑制剂治疗和/或预防由于受体酪氨酸激酶活性增高而导致的疾病,尤其是癌症。这一应用特别针对于抑制或降低受体酪氨酸激酶(RTK)的过表达和/或其改变的活性。具体地说,受体酪氨酸激酶活性的这种改变通过FGFR-4的突变激发,其中该突变特别地是FGFR-4跨膜结构域中的点突变,导致疏水性氨基酸替换为亲水性氨基酸。本发明进一步涉及FGFR激酶抑制剂的应用,尤其是用于治疗和/或预防癌症。此外,本发明涉及导致其在细胞内过表达和/或活性改变的突变FGFR-4。最后,本发明涉及突变FGFR-4分子的DNA和RNA序列。另外,本发明涉及含上述抑制剂的药物组合物及诊断和筛选方法。
背景技术
细胞生长是取决于生物体特殊需要的细微调控过程。在年轻的生物体内,细胞***速度超过细胞死亡速度,导致机体大小的增长。在成体内,新细胞的形成和细胞死亡是平衡的,因此出现“稳定期”。然而,在很少一些情况下,细胞增殖的调控损坏,尽管在生物体内无需更多的此类细胞,细胞仍开始生长和***。该不受控制的细胞生长是癌症的起因。能引起不受控细胞生长、有时与转移形成相关的因子通常是化学性的,但有时也可是物理性的,如放射性辐射。引起癌症的另一原因是某些生物体内的遗传异常或突变,它们迟早会导致细胞的退化。
迄今为止,仍未可能满意地阐明调控正常生长和分化(例如乳腺)的过程。除激素调节外,还有局部产生的干预乳腺细胞发育之不同生长因子的网状***复合体。乳腺细胞中癌症发生的准确原因是不同的,因而也是不清楚和未知的,其它细胞的情况也是如此。癌基因和肿瘤抑制基因的变化似乎在乳腺癌发生中起重要作用。此外,遗传性改变的细胞中的调节因子引起的刺激增强可导致细胞生长的增加。
目前,癌症治疗基本上有两种方法。一种是通过外科手术将癌细胞从发病生物体内成功地完全去除,另一种是尝试使退化细胞在生物体内变得无害,例如通过施用药物(化学疗法)或物理治疗方法,如放射治疗。
在化学疗法中,药物经常以干预DNA代谢并损伤快速生长细胞的形式使用,该细胞有更强的DNA代谢能力,比缓慢***或根本不***的细胞要强。不过,许多化学治疗药物的严重缺点是所用活性物质的特异性低,其结果是健康细胞在化疗过程中也被损伤。活性物质的这种低特异性还要求其剂量在杀死癌细胞的同时必须尽可能的少地损伤健康细胞。这经常是不可能的,由于癌细胞不断进一步蔓延,在最后阶段引起重要功能衰竭而使癌症病人死亡。
推测某些生长因子受体的过表达和/或活性改变可加强许多肿瘤,包括乳腺癌的生长。例如,已知乳腺癌中EGFR,即表皮因子受体或ERB B-2受体的过表达与预后差相关。FGF(历史上称为成纤维细胞生长因子)蛋白质也可能与乳腺癌或其它癌症的发展有关;不过这方面的结果比较矛盾或者不太确定。
FGF组成调节因子肽的一大家族,迄今为止其中9个成员是已知的。其中8个已在人体内得到很好的鉴定(Basilico和Moscatelli,1992;Coulier等,1993)。FGF通过高亲和性的酪氨酸激酶受体起作用,所述受体由至少4个不同基因编码。此外,FGF是多功能的调节肽,它不仅可影响肿瘤发生,还可能在心血管疾病、组织损伤后的重建、神经生物学和胚胎发育中起主要作用。酸性和碱性FGF(aFGF和bFGF)是此家族中最早且最为全面地表征了的成员。例如,在体内,FGF与胚胎发生中的中胚层诱导有关(Slack等,1987;Kimelman等,1988),还与血管发生有关(Thomas等,1985;Thompson等,1989;Folkmann和Klagsbrun,1987)。
已鉴定出了编码相应受体(FGFR)的4个类似基因。这些基因编码结构相关蛋白质,该蛋白质含由3个免疫球蛋白环和一酸性部分组成的胞外结构域、疏水跨膜结构域和胞内结构域,具酪氨酸激酶活性。这些基因中的两个,FGFR-1和FGFR-2具有不同剪接引起的多种转录物(Givol和Yayon,1992和Johnson和Williams,1993)。这些基因的剪接变体不同在于受体胞外区域中免疫球蛋白样结构域的数目和第三个免疫球蛋白后半部分的序列差异,它们可能是由于外显子不同引起。此外,还可能出现跨膜和近膜区的缩短或缺失,产生分泌型或激酶失活型的蛋白质产物。
对于FGFR-3,有可能找到不同转录物和相应同种形,但对于FGFR-4则只有单独的一种已知蛋白质产物。因为有大量的FGFR基因和转录物,而许多蛋白质产物缺乏对给定FGF的特异性,所以测定具体配体对具体受体的作用是困难的。因此,确定特定FGF受体和具体疾病间的相关性就有很大的困难,更不用说具体受体特殊作用机制与疾病的相关性了。因而,利用FGFR有效治疗疾病,尤其是复杂疾病如癌症是不容易的。
发明内容
因而本发明的一个目的是描述一种治疗和/或预防体细胞紊乱,尤其是癌症的可能方法,在所说的紊乱发展过程中涉及受体酪氨酸激酶(RTK)。特别是,本发明的一目的是抑制和/或降低例如受体酪氨酸激酶的过表达和/或固有活性的改变。
本发明的另一目的是抑制和/或降低突变FGFR-4之受体酪氨酸激酶的变化活性。
本发明的另一目的是描述涉及癌发生和/或转移形成的另一种RTK。另外,本发明的目的是描述该RTK的DNA序列或相应RNA序列。
本发明的另一目的是描述改善的诊断或差别诊断和筛选的方法。
最后,本发明的一目的是描述尤其可治疗癌症的药物组合物。
通过独立权利要求的对象可达到这些目的。该独立的权利要求显示了本发明的优选方面。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,本文详述了所用术语。
“抑制剂”理解为可抑制RTK或降低其活性的任何物质。它可以是直接针对RTK的低分子量物质、激酶失活受体或抗受体抗体。
激酶失活受体”理解为不再具任何酪氨酸激酶活性的任何受体。
“受体酪氨酸激酶”理解为具酪氨酸激酶活性的任何受体。该术语包括具酪氨酸激酶活性的生长因子受体和HER2或met受体。
“RTK-机能亢进”理解为过表达(见下文)和/或改变了的活性(见下文)。
“缺陷信号转移活性”指突变受体不再能将胞外生长信号或另一信号转变成胞内信号,即此缺陷信号的产生不再依赖于配体,例如生长因子的存在。
“生长因子”是指由正常和/或转化的哺乳动物细胞分泌并在细胞生长的调控,特别是细胞增殖的刺激和其生活力的维持中起重要作用的任何促有丝***化学物质,通常是多肽。术语“生长因子”包括例如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和神经生长因子(NGF)及FGF,即成纤维细胞生长因子。
“突变的受体酪氨酸激酶”理解为与野生型受体相比包含结构的改变,以致受体具有不同于野生型受体之可调控的酪氨酸激酶活性的受体酪氨酸激酶。一类突变导致RTK的改变了的活性。
“野生型生长因子受体”或“野生型”受体理解为天然存在的生长因子受体或带非突变氨基酸序列的受体。“野生型”对应于种群中最为常见的受体变体。
生长因子受体或受体的“胞外结构域”应理解为通常从细胞中伸出至细胞外环境的受体部分。胞外结构域包括例如与生长因子或另一分子(配体)进行结合的受体部分。
生长因子受体或受体的跨膜区”理解为受体的疏水部分,它通常位于表达受体之细胞的细胞膜内。
生长因子受体或受体的“酪氨酸激酶结构域”或“胞质结构域”理解为通常位于细胞内并导致酪氨酸残基发生转磷酸化作用的受体部分。
有效量”是能达到预期治疗效果的本发明组合物的量。
“成纤维细胞生长因子(FGF)”是可影响细胞,尤其是成纤维细胞的生长和其他特性的促有丝***多肽。
”过表达”指与野生型相比,细胞的RTK蛋白质产量增加。这可由例如RTK基因的基因扩增引起,导致过度的、不受控制的细胞***活性。
“改变了的活性”是指由生长因子受体介导的信号转移途径的持久活性。因此,具有改变了的RTK时,激酶活性在无配体时还存在。
按照本发明,突变FGFR-4可导致细胞内相应受体酪氨酸激酶的过表达和/或改变了的活性,从而导致癌症。
生长因子受体在人癌细胞的发展和增殖中起决定性的作用。在健康细胞里,生长因子受体参与控制细胞生长、分化、细胞迁移等。细胞***的真正信号是生长因子,它的形成取决于生物体的需求。受体承担信号转移功能,即它涉及将细胞外生长信号转换成细胞内的细胞***活性。对于许多生长因子受体,在生长因子与胞外结构域结合后,它们转移磷酸基至蛋白质中的酪氨酸残基上的能力起决定性的作用。这些受体也称为受体酪氨酸激酶。受体酪氨酸激酶的综述可见于Yarden Y和UllrichA,Rev.Biochem.1988,57,443-78。这些生长因子受体在与生长因子结合后的二聚化是信号转移过程中进一步的重要事件。由具酪氨酸激酶活性的生长因子受体介导的将细胞外信号转换成细胞内信号的过程可分成以下5个步骤:
1.生长因子(也称配体)与受体的细胞外结构域结合,诱发构象改变;这引起
2.具改变构象的受体的二聚化;及
3.同时诱导激酶活性;
4.受体二聚体中酪氨酸残基的转磷酸作用,再次产生和稳定了活化的受体构象;和
5.多肽底物的磷酸化作用及与细胞因子的相互作用。
例如由于受体过表达或活性改变而引起的该信号转移链不受控的机能亢进可与其他因素一起导致相关细胞的***活性增高,在极端例子中产生退化的癌细胞。有关生长因子受体及其从细胞外转移信号至细胞内环境的功能和对癌发生中异常表达受体的可能影响的综述可见UllrichA和Schlessinger J(1990)细胞61,203-212。
现已令人惊奇地发现,在上述5个阶段的信号转移链中,突变FGFR-4导致信号转移活性的提高,在此发展过程中特别地涉及突变RTK的改变了的活性。
因此,按照本发明的权利要求1,利用至少一种受体酪氨酸激酶抑制剂治疗和/或预防RTK机能亢进诱发的紊乱,特别是癌症。而且,按本发明,由于信号转移增加而使组织过度增殖和/或组织侵入力提高引起的疾病或体细胞紊乱也可被消除或减轻。
对于抑制剂及低分子量物质,例如可使用至少一种激酶失活受体。通过使用如激酶失活受体之类的抑制剂,受体酪氨酸激酶之改变了的活性可被抑制和/或降低。正如前面已提到的,生长因子受体的过表达和/或改变了的活性是引起癌症或其发展中的重要因素。例如已知乳腺癌中EGFR或Erb B-2受体的过表达与预后差相关(见上文)。因此抑制这种过表达和/或改变了的活性是癌症治疗和/或预防中重要的部分。在胚胎发生中,FGFR-4被组织特异性关闭。然而,它存在于30%的乳腺癌病人中;在健康个体的组织中则检测不到。使用受体酪氨酸激酶的抑制剂可导致降低或完全抑制过表达和/或改变了的活性。同样地,使用激酶失活受体可导致降低和/或完全抑制受体酪氨酸激酶活性,因为杂二聚体的激酶功能不再能转移信号。激酶失活受体的作用基于的是形成了非功能性杂二聚体(稀释效果)。信号转移的缺乏导致不会传递过表达和/或改变了的活性信号,其结果是阻止了信号转变成细胞的生物学反应。因此,通过受体酪氨酸激酶的抑制或通过这些激酶失活受体,有可能有效和积极地介入癌症的治疗和/或预防。
已令人惊讶地发现,FGFR-4突变还出现于健康人种系中。推测种系突变会导致遗传性的易患病体质,致使病人易患多种疾病。关于癌发生,推测肿瘤组织中突变受体的表达提高与癌生成相关。种系突变还被认为是以下疾病的诱因:动脉硬化症、白血病、淋巴瘤、肝细胞癌和胆管癌。
因此,本发明提供了一种新的遗传标记,它在多种疾病及其易感性的诊断和早期识别中极其有用。
因而本发明还涉及待检材料中编码FGFR-4之核酸的检测方法,从而特别检测受体编码核酸的突变。这可通过与寡核苷酸探针杂交进行,该方法可特异指示突变,尤其是点突变的存在与否。在此利用了例如突变核酸和寡核苷酸之间的“错配”;若错配存在,杂交就不会发生从而无信号。或者,还可用特异FGFR-4PCR引物扩增核酸,随后用适当的限制性核酸内切酶切割来检测突变。若突变影响到限制性核酸内切酶的识别序列,以致突变的识别序列不再被限制性核酸内切酶识别为切割位点,这就产生了与非突变野生型不同的限制片段。用PCR方法可特异检测限制片段,从而例如在已提到的情况中,突变体存在的限制片段较野生型的大。或者,突变还可导致新限制性切割位点的产生,其结果是在用恰当酶切割后,”野生型片段”在突变体里更小。以X57205收录于EMBL GeneBank/DDBJ序列的FGFR-4内跨膜结构域中第388位的突变,导致野生型中的甘氨酸替换为突变体中的精氨酸,这一突变与限制性核酸内切酶BstNI的识别序列GGWCC有关。结果形成80和29bp的两个新限制片段,可通过限制酶分析被特别检测。
本发明进一步显示RTK的过表达、特别是改变了的活性会导致侵入性增加,即加强了转移的形成。既然转移形成是癌症的一个主要问题,这表明抑制或降低过表达和/或改变了的活性可有效抗癌,从而尤其可以抑制转移形成。
可能的抑制剂例如可见于Mohammadi等(1997)。
优选按本发明干预由FGFR-4突变引起的受体酪氨酸激酶过表达和/或改变了的活性。此突变可以是一个或多个点突变。尤其是此突变可发生在FGFR-4的跨膜结构域中,其结果是亲水性氨基酸替换了疏水性氨基酸。
已知FGFR-3中导致亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸的点突变与某些疾病相关。例如,在软骨发育不全病人中,已发现由于跨膜结构域中的点突变导致成纤维细胞生长因子受体3的活性改变。软骨发育不全是侏儒症最通常出现的遗传形式,是一种常染色体显性疾病,本质上基于的是某些骨成熟过程的缺陷。软骨发育不全可由FGFR-3跨膜结构域中一个精氨酸取代甘氨酸引起。还显示FGFR-3中的精氨酸突变激活了二聚体受体的激酶功能。精氨酸点突变还导致FGFR-3本身的酪氨酸激酶活性的不依赖于配体的刺激作用,并使得受体上改变的磷酸酪氨酸水平大大提高。这些结果表明,软骨发育不全的分子基础是FGFR-3不受调控的信号转移。
FGFR-3跨膜结构域中的另一突变是丙氨酸替换为谷氨酰胺。此氨基酸替换导致另一种疾病,即具黑棘皮症的Crouzon’s病。
按照本发明,FGFR-4中的突变,尤其是跨膜结构域中亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸的点突变与癌症产生和不良预后有关,因此,受体酪氨酸激酶的抑制或激酶失活受体的应用适于癌症的治疗和/或预防,其中由于突变,受体酪氨酸激酶被过表达或以改变的方式起活性作用。
特别是,对于第388位精氨酸替换甘氨酸的点突变,其结果之一是受体酪氨酸激酶以改变的方式起活性作用,且这纯合或杂合地导致无需配体刺激的信号转移,从而可引起不受控的细胞生长。在最坏的情况下,此不受控细胞生长导致癌症。跨膜结构域具如下序列(ID No.1):
RYTDIILYASGSLALAVLLLLARLY,
而未突变结构域具以下序列(ID No.2):
RYTDIILYASGSLALAVLLLLAGLY.
不局限于一种理论,设想带前述点突变之一,尤其是第388位引起精氨酸替换甘氨酸之点突变的受体酪氨酸激酶的活化作用是以二聚体构象的受体的稳定性为基础的,此二聚体的存在是由于通过它们的相互作用可能改变跨膜结构域。配体非依赖性二聚体的形成加强导致受体酪氨酸激酶活性增高和细胞转化。点突变对引发癌症作用的其他可能性机制有,例如,突变作用于FGFR-4的信号转移,受体通过膜的迁移被阻止,受体自身或与其他FGFR的二聚化作用被打断,或受体的酪氨酸激酶活性受到影响。
按照本发明,可见56%来自St Petersburg的乳腺癌病人(活体切片检查研究)在第388位携带与精氨酸替换甘氨酸相关的突变。其中45%是杂合的,而11%是纯合的。此明显高的比例表明第388位点突变与乳腺癌发生之间存在联系。
在对德国乳腺癌病人的进一步研究中,只有43%的病人显示有第388位的点突变。从对癌症病人的正常组织和来自正常个体组织之DNA的研究中可推断该突变是种系突变。
此外,为了确定第388位点突变的比例,还研究了来自细胞系的基因组DNA和cDNA。以正常乳腺上皮细胞系为对照,所研究的细胞系来源于乳腺癌、鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和子宫癌。除正常乳腺上皮细胞系外,所有的细胞系中可发现在FGFR-4分子的第388位有很高百分比的点突变。因此上述抑制剂或激酶失活受体的使用尤其适于治疗癌症。成神经细胞瘤、子宫癌和胰腺癌的治疗,还有其他类型癌症的治疗,看上去尤其有希望。
特别优选的是使用抑制突变FGFR-4的抑制剂,尤其是抑制跨膜结构域中第388位甘氨酸突变为精氨酸的FGFR-4的抑制剂。
此外,本发明涉及导致细胞中受体过表达和/或活性改变的突变FGFR-4。优选地,此突变FGFR-4的特征在于其野生型的疏水性氨基酸被突变受体中的亲水性氨基酸取代。尤其优选的是该突变是点突变且发生在跨膜结构域中。还更优选的是,此点突变发生在第388位,优选甘氨酸被精氨酸置换。
迄今为止,专家们认为只存在一种FGFR-4,它是未突变的。突变FGFR-4是未知的。因此令人惊讶的是,按照本发明显示有突变FGFR-4的存在。特别是,按照本发明,可证实在突变,尤其是388位点突变与癌症发生之间存在联系。而且,健康人中的种系突变与遗传性易患病体质有关,对动脉硬化症特别如此。
本发明进一步涉及含突变FGFR-4编码序列的DNA分子。本发明还包括含编码突变FGFR-4之RNA序列的RNA分子。以上序列可用于癌症诊断。在此,所述序列可特异识别FGFR-4中的突变。FGFR-4中突变的存在与癌症治疗的不良预后相关。其原因可能是由于相应肿瘤的侵入性生长特性。
除此之外,本发明涉及用于乳腺癌差别诊断的方法,包括使病人的核酸与上述DNA和/或RNA之一接触,以获得指示突变FGFR-4是否存在的信号。最后,本发明涉及含上述抑制剂或激酶失活受体的药物组合物。除此之外,本发明还涉及鉴定酪氨酸激酶活性抑制剂的方法,其中包括使本发明受体与可能的抑制剂接触,并在存在和/或缺乏抑制剂的情况下测定酪氨酸激酶活性。
此外,突变存在与否的检测也可如上详述的通过PCR和随后的限制酶切割完成。
最后,其他的分子生物学诊断方法也是有可能的。
此外,本发明的一个目的是可与本发明的突变FGFR-4特异反应的抗体。特异”在本发明的意义上表示本发明抗体可与突变受体结合,但不与未突变受体结合。
以下通过附图和实施例对本发明进行了详述。
附图说明
图1显示FGFR-4免疫沉淀的SDS PAGE(用箭头标出了磷酸化FGF受体-4),
图2显示突变FGFR-4的聚丙烯酰胺凝胶电泳,
图3显示FGFR-4跨膜结构域的序列分析,
图4显示FGFR-4突变G388R与***转移形成状态之间的相互关系(n=病人数,p=P值)和
图5显示FGFR-4突变G388R与无复发生存时间之间的相互关系(n=病人数,p=P值)。
实施例
细胞培养.人细胞系MDA-MB-453、ZR 75-1、K562和SKBr3获自ATCC。个体供应来源见最后的表中。MDA-MB-453、K562和ZR 75-1培养于含10%胎牛血清(Sigma,Taufkirchen)的RPMT(Gibco,Eggenstein)中。SKBR3培养于含10%胎牛血清的McCoy’s 5a(Gibco,Eggenstein)中。所有的细胞培养液均含青霉素/链霉素(Sigma,Taufkirchen)。细胞在37℃培养于水蒸汽饱和的空气和8%二氧化碳中。
FGFR-4388Arg/wt的克隆。为了从K562和MDA-MB-453细胞中制备RNA,用异硫氰酸胍溶解3X107个细胞并通过氯化铯梯度超速离心纯化。按制造商说明书用逆转录酶(Boehringer,Mannheim)完成cDNA的合成,每个反应加10pmol随机寡核苷酸”。将0.5ul用于后来的PCR反应。
用PCR反应扩增FGFR-4388Arg和FGFR-4wt。所用引物如下:有义链-GCTCAGAGGGCGG GCGGGGGTGCCGGCCG;反义链-CCGCTCGAGTGCCTGCACAGCCTTGAGCCTTGC。
按制造商说明书使用如下PCR条件:1.5U/25ul Expand-聚合酶(Boehringer,Mannheim)和反应缓冲液:200uM dNTP;0.01%v/v TritonX100;10%v/v DMSO及有义和反义引物各0.2pmol。进行如下反应步骤:35个循环,94℃1分钟,64℃1分钟,72℃2.5分钟。MDA-MB-453cDNA用于FGFR-4388Arg的克隆,而K562cDNA用于FGFR-4wt的克隆。将PCR产物克隆入pcDNA3载体(Invitrogen)。为了进一步的试验,具G388R的FGFR-4和野生型FGFR-4都可用此方法获得。
F6FR-4跨膜结构域的扩增。所用引物如下:有义链-GACCGCAGCAGCGCCCGAGGCCAG;反义链-AGAGGGAAGAGGGAGAGCTTCTG。按制造商说明书使用如下PCR条件:1.5U/25μl Taq-聚合酶(Boehringer,Mannheim)和反应缓冲液:200μM dNTP;有义和反义引物各0.2pmol,来自肿瘤活组织标本和细胞系的0.5μlcDNA或基因组DNA;进行如下反应步骤:35个循环,94℃45秒,72℃45秒。
限制性酶消化分析。如上扩增来自基因组或cDNA的FGFR-4跨膜结构域。为通过限制酶消化检测活组织标本和细胞系是否有G1217A突变,PCR产物用5U/25μl BstN1(NEB,Schwalbach/Taunus)在60℃保温1小时。用20%聚丙烯酰胺凝胶分离限制性酶消化的DNA片段并EB染色。野生型受体的分析产生109、37和22bp大小的片段各一条(第4泳道)。另一方面,作为突变G1217A的结果,形成了另一BstN1的限制性切割位点。突变受体还显示80和29bp大小的片段,而109bp大小的片段则消失了(泳道1:纯合基因;泳道2和3:杂合基因)(见图2)。
用限制性消化进行基因组DNA的基因型分析。
用标准方法(分子生物学通用流程,John Wiley和Sons,Inc.,1995)从原发肿瘤的组织样品中分离基因组DNA。为了能对基因组DNA进行基因型分析,在PCR反应中用以下引物扩增FGFR-4基因中的跨膜区:5’-GACCGCAGCAGCGCCCGAGGCCAG-3’(bp 1129-1142),和5’-AGAGGGAAGAGGGAGAGCTTCTG-3’(bp 1275-1297).对于PCR反应,使用了Ready-to-go PCR Beats(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。PCR循环如下:95℃3分钟,94℃45秒,72℃45秒和72℃5分钟。总共进行35个循环。PCR产物用5U/25μl BstN1(NEB,Schwalbach/Taunus)在60℃保温1小时。用20%聚丙烯酰胺凝胶分离限制性酶消化的DNA片段并EB染色。388Arg等位基因有80和29bp大小的两条特征性带,388Gly等位基因只显示109bp大小的一条片段。各基因型分析均重复3次。
PCR产物的DNA测序。为了对FGFR-4跨膜结构域进行序列分析,将PCR产物克隆入Bluescript载体。为此,如上所述进行PCR反应。所用引物如下:有义链-GGGAATTCGACCGCAGCAGCGCCCGAGG;反义链-GCTCTAGAAGAGGGAAGAGGGAGAG。FGFR-4388Arg/wt克隆的PCR产物可在载体pcDNA3中直接测序。用链终止法进行质粒DNA的DNA测序。在T/-引物与质粒DNA退火后,用T/-DNA聚合酶(Pharmacia,Freiburg)进行测序反应。然后将测序反应产物分离于5%变性聚丙烯酰胺凝胶(7.5M尿素;1xTBE)上并在晾干后曝光于X-射线胶片上(见图3)。由此得到野生型和突变体的DNA序列。
免疫沉淀和蛋白质印迹分析。将2.2x106个细胞铺于10cm的平皿上并保温过夜。然后用无胎牛血清的培养液置换原培养液并再保温24小时。为了进行刺激,将细胞与50ng aFGF/ml保温10分钟,用冷PBS洗两次并冰置。细胞在4℃与300μl冷裂解缓冲液(1%w/w NP-40,1.25%w/v脱氧胆酸钠,0.1%w/v SDS,0.15M NaCl,0.01M磷酸钠,pH7.2,2mM EDTA,10mM氟化钠,1mM PMSF,20μg/ml抑酶肽,1mM原钒酸盐,10mM焦磷酸钠)一起保温15分钟,4℃离心(13000RPM)澄清细胞裂解物。为了测定蛋白质的量,按制造商说明书使用Micro-BCA Protein Assay(Pierce)进行。为了进行免疫沉淀,将细胞裂解产物调整成相等的蛋白质含量,然后与0.5μg抗FGFR-4(Santa Cruz)和蛋白A-Sepharose(PharmaciaFreiburg)在旋转摇床上4℃保温18个小时。用冷HNTG(20mM HEPESpH7.5,150mM NaCl,0.1%Triton X100,10%甘油,10mM焦磷酸钠)洗免疫复合物4次。为了样品制备,用50μl 3xSDS-Laemmli缓冲液处理免疫复合物并99℃保温5分钟。沉淀蛋白质于7.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离(见图1)。
为进行蛋白质印迹,将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素上。在室温与TBS-T/0.25%明胶(10mM Tris/HCl pH8.0,0.15M NaCl,0.05%Tween20)保温2小时以封闭膜上的非特异性蛋白质结合位点。与初级抗体4℃保温于晃动摇瓶中6小时。然后用TBS-T/0.25%明胶洗4次去除非特异结合抗体。二级抗体的结合在室温进行1小时。通过进一步的漂洗步骤去除非特异结合的二级抗体。用ECLTM试剂盒(Amersham,Braunschweig)按制造商说明书使免疫复合物显现。
统计方法。在统计软件MedCalc(MedCalc Software,Belgium)和EpiInfo 6.04b(CDC Atlanta,Georgia)的帮助下完成统计学计算。为了确定不同病人组基因型与临床数据之间的相互关系,计算优势率(oddsratio)、置信区间(CI)和统计显著性(P值)。由于388Arg纯合基因的病人数目较少,将其与388Arg杂合基因病人组合并进行统计计算。
肿瘤细胞系中FGFR-4的检测。表1显示了RTK表达与乳腺癌之间的相互关系。RTK的表达明显地更经常存在于乳腺癌来源细胞系中,而在正常乳腺上皮细胞的细胞系中则无可检测到的表达。
表1
乳腺癌细胞中FGFR-4的检测
图解:
-:无表达
+:表达
++:强表达
+++:很强表达
++++:极强表达
从表2中可见,明显地G388R突变还存在于其他癌类型细胞系中并与其相关。在健康上皮细胞系中检测不到该突变。
表2
多种其他肿瘤细胞系中的FGFR-4G388R突变
样品 基因组DNA cDNA
成胶质细胞瘤
U-138 -/- -/-
U-373 -/- -/-
U-172 -/- -/-
U-118 -/* -/*
SF-763 -/- -/-
U-1240 */* */*
T-98G (*)/- (*)/-
U-937 -/- -/-
成神经细胞瘤
SK-N-SH -/* -/*
SH-SY-SY -/* -/*
子宫癌
OAW-42 -/* -/*
PA-1 -/- -/-
Caov-3 -/- -/-
鳞状细胞癌
Hlac-78 -/- -/-
Hlac-79 -/- -/-
Scc-4 -/- -/-
Scc-10a -/- -/-
Scc-10b -/- -/-
Scc-17a -/- -/-
Scc-17b -/- -/-
Scc-22a */* */*
Scc-22b */* */*
HaCat -/- -/-
FaDu -/- -/-
正常乳腺上皮细胞系
HBL-100 -/- -/-
MCF-10A -/- -/-
图解:
-/-纯合型未突变
*/-杂合型突变
*/*纯合型突变
活组织检查中FGFR-4突变G388R的检测。表3在此显示在来自StPetersburg的61个被研究女乳腺癌病人中,56%携带G388R突变,其中45%为杂合基因的而11%为纯合基因的。在来自Munich的69个被研究女乳腺癌病人中,43%携带G388R突变,其中32%为杂合基因的而11%为纯合基因的。在来自St Petersburg和Munich的女病人中该突变的总百分比比率是不同的。这表明G388R突变是种系突变。
表3
活组织检查中FGFR-4突变G388R的检测
乳腺肿瘤样品
FGFR-4G388R突变与FGFR-4表达之间的相互关系。从下表4可见,明显地只有当表达和/或加强的表达存在时G388R突变(基因组DNA和cDNA)才存在。在正常乳腺上皮细胞系和未见RTK表达的乳腺癌细胞系中均检测不到该突变。
细胞系MDA-MB453的RTK表达尤其显著,其显示为纯合基因的G388R突变。
表4
FGFR-4-G 388R突变和FGFR-4表达检测间的相关性
图解:
-:无表达
+:表达
++:强表达
+++:很强表达
++++:极强表达
-/-:无突变
*/-:杂合型突变
*/*:纯合型突变
FGFR-4突变G388R的存在与***转移状态或无复发生存时间之间相互关系的研究。
表5显示了参加有关在乳腺癌肿瘤发生中G388R突变之作用研究的所有病人的临床参数。发现具G388R突变的病人的长期预后比无G388R突变病人更坏。
表5说明:(见下文)
Her2:Her2受体的表达水平;0=无表达至3=过表达
OPDAT:手术日期
M/R:转移形成/复发;0=无/1=有
Vers:死亡;0=否/1=是
UBERRE:无复发生存时间,以月计
Grade:肿瘤的分化级别;1=强分化/3=低分化
Stage:原发肿瘤的大小
E-Rec:***受体的表达;0=无表达至12=最高表达
GEN:FGFR-4的基因型;G=野生型等位基因;R=突变等位基因
BEDAT:最后观察日期
REZDAT:复发诊断日期
TODDAT:死亡日期
UBERLEB:总生存时间
Nod.:***中的转移;0=无/1=有
Men:终止活动时期
P-Rec:孕酮受体的表达:0=无表达至12=最高表达
从图4中可见,明显地在第一阶段治疗时已有***转移的病人中发现更大量的G388R突变。在具G388R突变的病人中,62.7%有***转移,而无G388R突变的病人中只有38.2%显示***转移。因为***转移状况是进一步辨别肿瘤预后更坏或更好的重要预后标志,所以从这些结果中可推断在85个被研究病人中G388R突变导致更严重的肿瘤发展。
从图5中可见,在被研究病人组中,具G388R突变病人比无G388R突变病人的无复发生存概率小得多。74.4%复发病人有388R基因型,只有25.6%具有388G基因型。这表明有G388R突变的病人复发更快,因此不能成功地治愈。
总之,可以认为FGFR-4突变G388R导致***中转移形成的危险提高2.7倍(OR=2.7;CI:1.02<OR<7.4),而肿瘤复发的危险增加了5.44倍(OR=5.44;CI:1.93<OR<7.4)。具突变FGFR-4等位基因(G388R)病人看上去易于肿瘤复发,因此疾病预后更差。
材料:
丙烯酰胺 Serva,Heidelberg
琼脂 Difco,Detroit
琼脂糖 BRL,Eggenstein
氨苄青霉素 Boehringer,Mannheim
抑酶肽 Sigma,Taufkirchen
N-N’-甲叉双丙烯酰胺 Roth,Karlsruhe
氯化铯 BRL,Eggenstein
脱氧核苷酸 Pharmacia,Freiburg
溴化乙锭 Sigma,Taufkirchen
明胶 Sigma,Taufkirchen
异硫氰酸胍 Fluka,Switzerland
HEPES Serva,Heidelberg
氟化钠 Sigma,Taufkirchen
PMSF Sigma,Taufkirchen
SDS Roth,Karlsruhe
Tris Riedel de Haen,Seelze
Trition X100 Serva,Heidelberg
Tween20 Sigma,Taufkirchen
所有在此未列物质均来自Sigma(Taufkirchen)、Serva(Heidelberg)、Riedel De Haen或Merck(Darmstadt)公司,且使用最高级别的纯度。
设备
DNA电泳仪 Workshop,MPI for Biochemistry,Martinsried
蛋白质电泳仪 Atto,Japan
冷冻离心机
Biofuge 17S Heraeus,Hanau
蛋白质转移仪 Semidry blot apparatus,Workshop,MPI for
Biochemistry,Martinsried
超净工作台 Biogard,The Baker Company,USA
细胞培养箱 Incubator B5060 EK/CO2,Heraeus,Hanau
细胞计数器 Coulter Counter,Coulter Electronics,Glasgow.
文献:
Basilico C和Moscatelli D:生长因子和癌基因的FGF家族。癌症研究进展(Advanc.Cancer Res.)59,115-164(1992)
Coulier F,De Lapeyriere O和Birnbaum D:FGF家族的复杂性:9个证据。Med./Sci.9,1113-1115(1993)。
Folkmann J和Klagsbrun M:科学235,442-447(1987)
Gival D和Yayon A:FGF受体的复杂性:结构多样性和功能特异性的遗传基础,FASEB J.6:3362-3369(1992)。
Johnson D E和Wi lliams L T:FGF受体多基因家族中的结构和功能多样性。癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)60:1-41(1993)。
Kimelman D,Avraham J A,Haaparanta T,Palisi T M和KirschnerM W:科学,242,1053-1058(1988)。
Mohammadi M等,科学776,955-959(1997)。
Slack J M W,Darlington G G,Heath J K和Godsave S F:自然326,197-200(1987)。
Thomas K A,Rios-Candelore M,Giminez-Gallego G,DiSalvo J,Bennett C,Rodkey J和Fitzpatrick S:美国国家科学院院报,82,6409-6413(1985)。
Thompson J A,Haudenschild C C,Anderson K D,DiPietro J M,Anderson W F和Maciag T(1989):美国国家科学院院报,86,7928-7932(1989)。
细胞系 来源 编号
U-138 ATTC HTB-16
U-373 ATTC HTB-17
U-172
U-118 ATTC HTB-15
SF-763 SUGEN
U-1240 SUGEN
T-98G SUGEN
U-937 ATCC CRL-1593
SK-N-SH ATCC HTB-11
SH-SY5Y F.J.Klinz
OAW-42 DKFZ
PA-1 ATCC CRL-1572
Caov-3 ATCC HTB-75
Hlac-78 Dr.Wustrow
Hlac-79 Dr.Wustrow
Scc-4 ATCC CRL-1624
Scc10a Dr.Wustrow
Scc10b Dr.Wustrow
Scc22a Dr.Wustrow
Scc22b Dr.Wustrow
Scc17a Dr.Wustrow
Scc17b Dr.Wustrow
FaDu Dr.Wustrow
HaCat
HBL100 ATCC HTB-124
MCF10A ATCC CRL-10317
SKBr-3 ATCC HTB-30
8T-549 ATCC HTB-122
MCF-7 ATCC HTB-22
BT483 ATCC HTB-121
T-47-D ATCC HTB-133
ZR-75-1 ATCC CRL-1500
MDA-MB-468 ATCC HTB-132
MDA-MB-453 ATCC HTB-131
MDA-MB-361 ATCC HTB-27
MDA-MB-415 ATCC HTB-128
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
K-562 ATCC CCL-243
序列表
<110>Max-Planck Society for the promotion of Science e.V.,Brerlin
<120>利用抑制剂治疗与RTK机能亢进相关的紊乱,尤其是癌症
<130>P29374-03166
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Vers.2.0
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Arg Tyr Thr Asp Ile Ile Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Tyr
20 25
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Arg Tyr Thr Asp Ile Ile Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Tyr
20 25
Claims (30)
1.在第388位具有突变的突变型FGFR-4的至少一种抑制剂在制备可用于治疗和/或预防受体酪氨酸激酶机能亢进所诱发紊乱的药物中的用途,其中所述第388位的突变是第388位的甘氨酸被精氨酸替换,而且其中所述紊乱与在第388位具有氨基酸突变的FGFR-4受体酪氨酸激酶相关。
2.按照权利要求1的用途,其中所述紊乱是癌症。
3.按照权利要求1的用途,其特征在于所述抑制剂是激酶失活受体。
4.按照权利要求1的用途,其特征在于所述受体的机能亢进是由突变型FGFR-4的过表达和/或改变了的活性引起的。
5.按照权利要求4的用途,其特征在于FGFR-4的过表达和/或改变了的活性是由FGFR-4突变引起的。
6.按照权利要求1的用途,其特征在于所述突变是种系突变。
7.按照权利要求1的用途,其特征在于所述紊乱是由于过度增殖和/或入侵造成的疾病。
8.按照权利要求7的用途,其中所述药物通过抑制转移形成而起作用。
9.按照权利要求2的用途,其中所述紊乱是乳腺癌。
10.按照权利要求2的用途,其中所述紊乱是鳞状细胞癌。
11.按照权利要求2的用途,其中所述紊乱是成胶质细胞瘤。
12.按照权利要求2的用途,其中所述紊乱是成神经细胞瘤。
13.按照权利要求2的用途,其中所述紊乱是子宫癌。
14.一种突变的FGFR-4,其在跨膜结构域中具有突变,其中所述突变是第388位的甘氨酸被精氨酸替换。
15.一种DNA分子,其含有编码按权利要求14的突变FGFR-4的序列。
16.一种RNA分子,其含有编码按权利要求14的突变FGFR-4的序列。
17.检测FGFR-4基因中是否存在突变的体外方法,其包括检测样品中FGFR-4蛋白质或其编码核酸第388位甘氨酸突变为精氨酸的突变的步骤。
18.按照权利要求17的方法,其中在检测步骤中使用了权利要求15或16的序列。
19.按照权利要求18的方法,其特征在于所述序列可特异检测FGFR-4中第388位的点突变。
20.按照权利要求17的方法,其特征在于将所述核酸与DNA和/或RNA接触,以便获得指示突变FGFR-4是否存在的信号,和/或扩增核酸并随后用识别序列被突变影响的限制酶切割,和/或将蛋白质与特异于该突变蛋白质的抗体接触。
21.按照权利要求17的方法,其包括对体外个体样品中扩增的FGFR-4核酸进行检测的步骤。
22.可用于治疗与在第388位具有氨基酸突变的FGFR-4受体酪氨酸激酶相关的疾病的药物组合物,其包含在第388位具有突变的突变型FGFR-4的至少一种抑制剂,其中所述突变是第388位的甘氨酸被精氨酸替换。
23.按照权利要求22的药物组合物,其特征在于所述抑制剂是激酶失活受体。
24.按照权利要求22的药物组合物,其特征在于所述抑制剂降低和/或抑制了突变型FGFR-4的过表达和/或改变了的活性。
25.按照权利要求24的药物组合物,其特征在于FGFR-4的过表达和/或改变了的活性是由FGFR-4突变引起的。
26.用于鉴定酪氨酸激酶活性抑制剂的筛选方法,其中包括将按权利要求14的突变型FGFR-4与可能的抑制剂接触,并测定在该抑制剂存在和/或缺乏情况下的酪氨酸激酶活性。
27.通过权利要求26的方法获得的酪氨酸激酶活性抑制剂在制备药物中的用途,其中所述药物用于治疗与在第388位具有氨基酸突变的FGFR-4受体酪氨酸激酶相关的疾病,其中所述突变是第388位的甘氨酸被精氨酸替换。
28.与按权利要求14的突变FGFR-4蛋白质可特异反应的抗体。
29.在第388位具有突变的突变型FGFR-4在筛选可用于治疗和/或预防与在第388位具有氨基酸突变的FGFR-4受体酪氨酸激酶相关的紊乱的物质中的用途,其中所述突变型FGFR-4第388位的所述突变是第388位的甘氨酸被精氨酸替换。
30.根据权利要求29的用途,其中所述物质是所述突变型FGFR-4的抑制剂或抗体。
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