CN100429308C - 具有产生c-13取代的奈马克丁活性的属于链霉菌属的菌株及利用其制备c-13取代的奈马克丁之方法 - Google Patents
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Abstract
本发明中,施行奈马克丁糖苷配基生物合成基因的组的重组用于获得C-13羟基奈马克丁,其可与糖基结合,制备了产生C-13羟基奈马克丁的生产菌株。此外,通过导入参与除虫菌素糖苷化和齐墩果糖生物合成的aveBI-BVIII基因,制备C-13糖基奈马克丁。如所述,通过使用分子遗传学技术制备的产生菌可有效获得C-13羟基奈马克丁和C-13糖基化的奈马克丁,且预期其生物活性可改善。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有产生C-13取代的奈马克丁(nemadectin)活性的属于链霉菌属的菌株及利用其制备C-13取代的奈马克丁之方法。更具体的,本发明涉及一种利用属于链霉菌属的微生物制备C-13羟基奈马克丁和C-13糖基奈马克丁的方法,其中所述微生物具有产生C-13取代的基奈马克丁的活性,且所述微生物菌株属于蓝灰链霉菌非生氰亚种(Streptomyces cyaneogriseus subspecies noncyanogenus)。
背景技术
许多具有苯并呋喃环结构的化合物具有出色的抗寄生虫活性和抗昆虫活性。其中,除虫菌素和密比霉素是目前实践中使用的。已知奈马克丁的四种成分α,β,γ和δ,其由蓝灰链霉菌非生氰亚种产生,具有苯并呋喃环,且其C-13位置无取代基,是如下式所示饱和的
奈马克丁α R1=H R2=CH(CH3)2
奈马克丁β R1=H R2=CH3
奈马克丁γ R1=CH3 R2=CH3
奈马克丁δ R1=CH3 R2=CH(CH3)2
奈马克丁之C-13位是饱和的原因在于参与奈马克丁糖苷配基部分形成的奈马克丁聚酮化合物合成酶(奈马克丁PKS)的模块7由结构KS-AT-DH-ER-KR-ACP组成。通过化学合成难以在饱和的C-13位置构建立体选择性修饰。虽然通过如下结构的除虫菌素中添加糖单元可预期增强抗昆虫活性和抗寄生虫活性,但是尚未通过化学合成产生衍生物。
如上述,虽然通过化学合成难以在C-13位上进行立体选择性导入羟基和奈马克丁羟基的糖苷化,通过大量研究,我们通过分子遗传学方法成功制备了C-13糖基化的奈马克丁产生微生物,有效获得了带有立体选择性糖苷化的奈马克丁。
本发明的完成是基于如下知识。本发明的一个目的是通过遗传技术提供属于链霉菌属的微生物,其具有C-13糖基奈马克丁产生活性。本发明的另一个目的是提供属于链霉菌属的微生物菌株,其具有C-13取代的奈马克丁产生活性,其能用于有效的获得带有立体选择性糖苷化的奈马克丁并有望改善其生物活性。
本发明的又一方面是提供一种制备C-13取代的奈马克丁的方法,包括将产生奈马克丁类似物的微生物之DNA引入属于链霉菌属的奈马克丁产生微生物中,累积C-13羟基奈马克丁和C-13糖基奈马克丁,并收集之。
发明公开
我们制备了C-13羟基奈马克丁产生微生物菌株,方法是通过修饰奈马克丁糖苷配基生物合成基因的组,以获得C-13羟基奈马克丁,其可被修饰用于通过化学合成添加糖,并产生带有奈克马丁PKS和除虫茵素聚酮化合物合成酶(除虫茵素PKS)的嵌合聚酮化合物合成酶(嵌合PKS)。此外,作为通过导入参与除虫菌素PKS的转录控制之aveR基因刺激除虫茵素PKS基因转录的结果,改善了C-13羟基奈马克丁产率。
本发明的茵株蓝灰链霉菌非生氰亚种(Streptomycescyaneogriseus subsp.noncyanogenus)ΔnemA4::vph attBTG1::aveA4-aveA3-aveE保藏在国际专利生物保藏单位国际生命科学和人体技术研究所(NIBH)AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566 日本,其是于2003年6月6日基于布达佩斯条约关于用于专利程序的微生物保藏之国际承认进行的,保藏号FERM BP-8395。
此外,我们制备了其中引入参与除虫菌素的糖苷化和齐墩果糖生物合成的aveBI-BVIII基因的组之微生物菌株,且制备了C-13糖基奈马克丁产生微生物。
本发明的菌株蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vphattBTG1::aveA4-aveA3-aveEattBR4::ave B1-BVIII保藏在国际专利生物保藏单位国际专利生物保藏单位国际生命科学和人体技术研究所。(NIBH)AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566日本,其是于2003年6月6日基于布达佩斯条约关于用于专利程序的微生物保藏之国际承认进行的,保藏号FERM BP-8394。
本发明涉及一种制备C-13糖基奈马克丁的方法,包括培养属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的微生物菌株,产生并累积C-13糖基奈马克丁,从培养物中分离C-13糖基奈马克丁。此外,本发明涉及属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的且具有产生C-13羟基奈马克丁和C-13糖基奈马克丁的能力的微生物菌株。
如上述,此前尚未见通过将产生奈马克丁类似化合物的微生物DNA引入属于链霉菌属的奈马克丁产生微生物,产生并累积C-13羟基奈马克丁和C-13糖基奈马克丁的报道。
因此,本发明提供了属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的且具有产生C-13糖基化的奈马克丁的能力的微生物菌株。
此外,本发明提供了属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的且具有产生C-13羟基奈马克丁的能力的微生物菌株。
此外,本发明提供了一种制备C-13羟基奈马克丁的方法,包括培养属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的且具有产生C-13羟基奈马克丁的能力的微生物菌株,在培养基中产生并累积C-13羟基奈马克丁,从培养物中分离C-13羟基奈马克丁。
此外,本发明提供了一种制备C-13糖基化的奈马克丁的方法,包括培养属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的且具有产生C-13糖基化的奈马克丁的能力的微生物菌株,在培养基中产生并累积C-13糖基化的奈马克丁,从培养物中分离C-13糖基化的奈马克丁。
此外,本发明提供一种属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的微生物菌株,其保留了除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)的除虫菌素糖苷配基生物合成基因的组,且具有产生C-13羟基奈马克丁的能力,以及一种制备微生物的方法。
此外,本发明提供一种属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的微生物菌株,其保留了除虫链霉菌的除虫菌素糖苷配基生物合成基因的组,且具有产生C-13糖基化的奈马克丁的能力,以及一种制备微生物的方法。
此外,本发明提供一种非奈马克丁产生微生物菌株,其属于蓝灰链霉菌非生氰亚种,且在编码奈马克丁糖苷配基生物合成基因nemA3-4操纵子KS10中的区域***紫霉素抗性基因(KS10***突变)。
此外,本发明提供一种属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的微生物菌株,其在KS10***突变体中保留了除虫链霉菌的除虫菌素糖苷配基生物合成基因aveA3-4,且具有形成带有NemA1-2和AVES3-4的嵌合PKS的能力。
此外,本发明提供一种微生物菌株,其属于蓝灰链霉菌非生氰亚种,且具有形成带有NemA1-2和AVES3-4的嵌合PKS的能力,其中所述微生物菌株保留了除虫链霉菌的除虫菌素生物合成基因的调控基因aveR。
此外,本发明提供一种微生物菌株,其属于蓝灰链霉菌非生氰亚种,且具有形成带有NemA1-2和AVES3-4的嵌合PKS的能力,其中所述微生物菌株保留了除虫链霉菌的除虫菌素生物合成基因的调控基因aveR,以及除虫菌素糖苷化和齐墩果糖生物合成基因aveBI-BVIII。
附图说明
图1是含有奈马克丁PKS模块10的KS区之3.0kb片段的限制性图谱。箭头显示转录的方向。
图2是奈马克丁KS 10区的SalI区vph***片段的限制性图谱。箭头显示转录方向。
图3是C-13羟基奈马克丁的1H-NMR谱
图4是C-13羟基奈马克丁的13H-NMR谱。
图5是C-13糖基奈马克丁的1H-NMR谱。
图6是C-13糖基奈马克丁是13H-NMR谱。
实施发明的最佳模式
本发明通过如下实施例具体加以阐述,但是本发明不局限于这些实施例的描述。
实施例1
获得蓝灰链霉菌非生氰亚种NRRL 15773,其中在奈马克丁PKS的KS区***紫霉素抗性基因(紫霉素磷酸转移酶:vph)。
(1)奈马克丁PKS编码DNA片段,KS 10的亚克隆
用限制性酶BamHI(TAKARA BIO INC.,日本)消化含有奈马克丁糖苷配基合成酶基因的粘粒DNA中的含有编码模块10中KS结构域(NEM-KS10)的DNA之粘粒DNA,用琼脂糖凝胶电泳。采用gene cleanII试剂盒(Bio101Inc.,US)分离并纯化含有KS10区域的3.0kb DNA片段。此外,用BamHI消化质粒pUC 19(TAKARA BIO INC.,日本),采用碱性磷酸酶去磷酸化(小牛肠)(TAKARA BIO INC.,日本)。采用Ligation High(TOYOBO CO.LTD.,Japan)通过在16℃下反应16小时连接含有NEM-KS10的3.0kb片段,以及pUC19的BamHI消化产物(每种约0.1μg)。
用10μl DNA连接产物和大肠杆菌DH5α(Nippon Gene K.K.,日本)感受态细胞接触进行转化。采用20ml LB琼脂培养基(含有氨苄青霉素50μg/ml(Wako Pure Chemicals Inc.,日本))选择转化菌株。事先涂布0.1mol/L异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)水溶液和2%的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal,Nacalai Tesque Inc.,日本)的二甲基甲酰胺(Nacalai Tesque Inc.,日本)溶液,每种50μl。由于含有重组质粒的转化子菌落缺乏β-半乳糖苷酶活性,其不能分解X-gal而显示白色(leucoform)。采用接种环收集白色菌落,接种入10mL LB培养基,37℃下振荡培养16小时,然后用碱法从细菌细胞中提取质粒并纯化。用限制性酶BamHI消化所得重组质粒的一部分,以确证获得质粒pUC 19::NEM-KS10,其中,3.0kb的DNA片段***了pUC 19。
(2)来自蓝灰链霉菌非生氰亚种NRRL 15773的BamHI DNA片段3.0kb的末端序列的确定
首先,制备用于循环测序的模板DNA。将由Expand Taq DNA聚合酶缓冲液(Roche Inc.,U.S.),dATP,dGTP,dCTP,dTTP,具有如SEQID NO:1所述5’-GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3’碱基序列的合成DNA以及具有如SEQ ID NO:2所述5’-TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGA-3’碱基序列的合成DNA组成的引物套加入实施例1-(1)获得的重组质粒pUC19::NEM-KS10,向其中加入Expand Taq DNA聚合酶(Roche Inc.U.S.),重复如下反应30个循环:96℃30sec,70℃3min。反应完成后,向其中加入内切核酸酶I(Amersham Pharmacia Biotech Inc.,U.S.)和碱性磷酸酶(Amersham Pharmacia Biotech Inc.,U.S.),37℃反应15分钟,然后在80℃处理10分钟用于使酶变性。在酶均变性后,DNA循环测序通过加入IR标记的引物(Aloka Co.Ltd.,Japan)和Thermo测序酶,用7-去氮杂-dGTP(Amersham Pharmacia Biotech Inc.,U.S.)荧光标记的引物循环测序试剂盒,使用上述DNA模板进行。反应完成后,加入反应终止剂并混合以制备样品溶液。
将样品溶液在90℃加热2分钟,冰冷却,然后进行序列电泳。使用DNA测序仪Model4000Series(LI-COR Inc.,U.S.)作为电泳装置。使用Image Analysis Ver.2.10的Base Image IR Software Ver.2.30在电泳后进行影像分析。基于上述获得的DNA片段的各个碱基序列,利用BLAST确定氨基酸序列。结果,发现了具有与除虫链霉菌aveA4在一端具有高同源性的一个序列,以及在另一端与除虫链霉菌还原酶具有高同源性的一个序列。基于所述碱基序列,证实了BamHI片段的奈马克丁PKS基因的转录方向(参见图1)。
(3)在NEM-KS10区***紫霉素抗性基因(紫霉素磷酸转移酶;vph)
用限制性酶BamHI消化质粒pUC19::NEM-KS10,通过琼脂糖凝胶电泳处理消化的混合物,分离并纯化含有KS10区的3.0kb的DNA。将通过消化pBluescript SK+(TOYOBO CO.LTD.,Japan)获得的0.1μg之约3.0kb的片段与含有NEM-KS10的BamHI消化片段(0.1μg)混合。用Ligation High(TOYOBO CO.LTD.,日本)16℃下反应16小时连接混合物。用10μl DNA连接产物和大肠杆菌DH5α的感受态细胞接触进行转化,以获得重组质粒pBluescript SK+::NEM-KS10,其为与pBluescript SK+和NEM-KS10片段连接的质粒。此外用限制性酶HindIII(TAKARA BIO INC.,日本)和SstI(GIBCO BRL Inc.,U.S.)消化pBluescript SK+::NEM-KS10,琼脂糖凝胶电泳,以获得含有NEM-KS10的DNA片段(约3.0kb)。用HindIII和SstI消化质粒pUC19以获得DNA片段(约2.7kb)。将各0.1μg的两种DNA片段混合,用Ligation High 16℃下反应16小时连接混合物。用10μl DNA连接产物转化大肠杆菌DH5α以获得质粒pUC19-Bgl::NEM-KS10,其为连接NEM-KS10片段至pUC19-Bgl(将BglII切割序列AGATCT***pUC19多克隆位点的EcoRI和HindIII的两个末端的外侧)的质粒。
用限制性酶EcoRI(TAKARA BIO INC.,日本)和PstI(TAKARABIO INC.,日本)消化质粒pUC19::vph获得vph,琼脂糖凝胶电泳,分离并纯化含有vph的DNA片段(1.7kb)。含有vph的EcoRI/PstIDNA片段(1.7kb)的平端的获得是通过使用BKL试剂盒(TAKARABIO INC.,日本)37℃反应15分钟获得的。用限制性酶SalI(TAKARABIO INC.,日本)消化pUC19-Bgl::NEM-KS10后,通过BKL试剂盒制备SalI切割位点的平端。带有平端的片段和上述带有平端的DNA片段(1.7kb)混合,采用Ligation High进行DNA连接。用10μl DNA连接产物转化大肠杆菌DH5α以获得重组质粒pUC19-Bgl::NEM-KS10-vph,其中vph被***KS10区(参见图2)。使用含有氨苄青霉素50μg/ml和结核放线菌素N 150μg/ml的LB培养基挑选转化子。
用限制性酶BglII(TAKARA BIO INC.,日本)消化pUC19-Bgl::NEM-KS10-vph后,利用琼脂糖凝胶电泳产物以分离并纯化含有KS10-vph区的DNA片段(4.7kb)。用限制性酶BamHI消化链霉菌载体质粒pGM160后,利用琼脂糖凝胶电泳产物以分离并纯化DNA片段(6.8kb)。此外,使用碱性磷酸酶(小牛肠)使DNA的5’去磷酸化。将pGM160的BamHI消化产物和含有NEM-KS10-vph区的DNA片段(4.7kb)各0.1μg混合,采用Ligation High连接DNA。采用10μl DNA连接产物转化大肠杆菌DH5α以获得重组质粒pGM160::NEM-KS10-vph。使用含有氨苄青霉素50μg/ml和结核放线菌素N 150μg/ml的LB培养基挑选转化子。使用pGM160::NEM-KS10-vph转化大肠杆菌GM2929hsdS::Tn10。使用含有氯霉素(Wako Pure Chemicals Inc.,日本)30μg/ml,氨苄青霉素50μg/ml和结核放线菌素N 150μg/ml的LB培养基挑选转化子。由大肠杆菌GM2929 hsdS::Tn1制备非甲基化质粒DNApGM160::NEM-KS10-vph。
(4)来自蓝灰链霉菌非生氰亚种NRRL 15773的原生质体制备
将冻干(于-30℃)的蓝灰链霉菌非生氰亚种孢子悬浮液50ml接种入YEME培养基(500ml Erlenmeyer烧瓶),其含有50ml 30%w/v蔗糖,0.5%w/v甘氨酸和5mM MgCl2,于30℃旋转摇床上振荡培养48小时。3000rpm离心10分钟收集细菌细胞。离心10分钟以洗涤细菌细胞。含有1mg/ml卵溶菌酶的P10培养液加入经洗涤的细菌细胞并悬浮,通过在30℃放置30分钟产生原生质体。与所加10ml P10培养液充分混合后,将原生质体悬浮液通过棉塞滤器,以除去溶菌酶消化的菌丝体。通过棉塞滤器的原生质体悬浮液于3000rpm离心10分钟以沉淀原生质体。除去上清并用10ml P10培养液充分悬浮后,通过3000rpm离心10分钟沉淀原生质体。再次向沉淀中加入P10培养液10ml,悬浮原生质体,通过离心洗涤原生质体。如此获得的经洗涤的原生质体悬浮在P10培养液(5ml)。将悬浮液(每个0.1ml)分装入灭菌的Eppendorf管中,于-80℃储存。
(5)紫霉素抗性基因(紫霉素磷酸转移酶;vph)导入染色体上奈马克丁PKS的KS10区域的基因重组体的制备
将获自实施例1-(3)的重组质粒pGM160::NEM-KS10-vph(约1μg)和获自实施例1-(4)的蓝灰链霉菌非生氰亚种原生质体(约5×108)倒入灭菌Eppendorf管中,立即加入25%聚乙二醇(MW1000)溶液(2.5%蔗糖,0.05%KH2PO4,0.1M CaCl2和50mM Tris-maleate,pH8.0)并混合,室温下放置1分钟。加入P10培养基450μl并充分混合,将其中每一100μl溶液置于R2YE琼脂培养基,与软琼脂培养基2.5ml一起涂布其上。在30℃孵育20小时后,覆盖含有硫链丝菌素(Sigma-Aldrich Co.,U.S.)200μg/ml的软琼脂培养基2.5ml。于30℃培养并获得抗硫链丝菌素的转化子。
生长于R2YE琼脂培养基表面的耐受硫链丝菌素的转化子无菌涂布。利用匀浆机切割菌丝体,将经切割的菌丝体涂布在YMS琼脂培养基。于37℃孵育培养基4天,生孢菌丝体在含有结核放线菌素N的YMS琼脂培养基上复种,作为母板。平板在30℃下培养两天,挑选结核放线菌素抗性菌落,然后将每一菌落涂布在YMS琼脂培养基上。于30℃孵育培养基5天,生孢菌丝体在含有20μg/ml硫链丝菌素的YMS琼脂培养基上复种,作为母板,在30℃培养平板2天。挑选耐受结核放线菌素且对硫链丝菌素敏感的菌株,通过Southern杂交证实在染色体上的奈马克丁PKS的KS10区***vph,并证实不产生奈马克丁。如此获得的每一菌株称为蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vph.
本发明的菌株蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vph于2003年6月6日保藏在国际专利生物保藏单位国立生命科学和人体技术研究所(NIBH)AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566日本,其是基于用于专利程序目的的国际承认的微生物保藏之布达佩斯条约,保藏号FERM BP-8393.
(6)获得来自除虫链霉菌的除虫菌素合成酶基因aveA3
用限制性酶EcoRI消化除虫链霉菌的染色体DNA,并用低熔点琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切出含有总aveA3-4的如SEQ ID NO:3所述的39912bp DNA片段。利用酚提取、酚-氯仿提取以及乙醇沉淀的方法分离并纯化凝胶。此外,用限制性酶EcoRI消化***染色体的载体质粒pTG1int-cos,琼脂糖凝胶电泳以分离并纯化5.2kb的DNA片段。利用碱性磷酸酶(小牛肠)将EcoRI消化的pTGling-cos在DNA的5’末端去磷酸化,将所得的约0.5μg产物与含有总aveA3-4的约2μg之39912bp的DNA片段连接,在25℃下反应10分钟,采用Ligation kitver.2(TAKARA BIO INC.,日本)溶液I和溶液II。
DNA连接后用乙醇沉淀,将DNA溶于2μl TE缓冲液中。将溶液加入ReadyToGo Lambda包装试剂盒(Amersham-Pharmacia Biotech,Inc.,U.S.)的包装提取物,加入23μl无菌水,室温静置2小时。向其中加入0.5ml噬菌体稀释缓冲液(SM缓冲液)和30μl氯仿,温和振摇混合。于13200rpm离心混合物30秒,将上清液转移入新的灭菌Eppendorf管中以获得λ噬菌体包装溶液。
(7)获得维持除虫菌素糖苷配基合成基因aveA3-4的大肠杆菌BL21recA缺陷菌株
利用实施例1-(6)获得的λ噬菌体包装溶液用宿主细胞大肠杆菌BL21recA缺陷菌株进行转导。用LB培养基于37℃振荡培养宿主细胞大肠杆菌BL21recA缺陷菌株去过夜,加入添加有0.4%麦芽糖的LB培养基以变成1%,37℃培养3小时。离心收集细胞,采用10mM硫酸镁溶液洗涤。离心进一步收集细菌细胞,悬浮于足量10mM硫酸镁溶液,以获得宿主细菌细胞溶液。宿主细菌细胞溶液与实施例1-(6)所获得的λ噬菌体包装溶液以1∶1的比例在Eppendorf管中混合,然后室温下放置30分钟。此后,加入LB培养基,30℃振荡培养1.5小时,将培养液涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA培养基上,30℃下培养过夜。在96孔测试板中培养卡那霉素抗性菌落作为文库,挑选维持粘粒DNA且与SEQ ID NO:4所述合成DNA杂交的克隆。根据常规碱法,从细菌细胞中纯化维持除虫菌素糖苷配基合成酶基因aveA3-4的重组DNA,所述细菌细胞利用含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基培养过夜。
实施例2
向奈马克丁PKS模块10vph导入除虫菌素生物合成基因aveA3-4
将实施例1-(5)中获得的奈马克丁PKS模块10vph***菌株孢子悬浮液接种入YEME培养基(500ml Erlenmeyer烧瓶),其含有50ml30%w/v蔗糖,0.5%w/v甘氨酸和5mM MgCl2,于30℃旋转摇床上振荡培养48小时。3000rpm离心10分钟收集菌丝体。加入20ml P10培养液并充分悬浮后,3000rpm离心悬浮液10分钟以洗涤菌丝体。含有1mg/ml卵溶菌酶的P10培养液加入经洗涤的菌丝体以悬浮,通过在30℃放置30分钟产生原生质体。与所加10ml P10培养液充分混合后,将原生质体悬浮液通过棉塞滤器,以除去溶菌酶消化的菌丝体。通过棉塞滤器的原生质体悬浮液于3000rpm离心10分钟以沉淀原生质体。除去上清并用10ml P10培养液充分悬浮后,通过3000rpm离心10分钟沉淀原生质体。再次向其中加入P10培养液10ml,悬浮原生质体,通过离心洗涤。所得经洗涤的原生质体悬浮在P10培养液(5ml)。将悬浮液(每个0.1ml)分装入灭菌的Eppendorf管中,于-80℃储存。
将实施例1-(7)获得的pTG1int-cos::aveA3-4(约1μg)加入上述原生质体中,立即加入25%聚乙二醇(MW1000)溶液(2.5%蔗糖,0.05%KH2PO4,0.1M CaCl2和50mM Tris-maleate,pH 8.0)500μl并混合,室温下放置1分钟。加入P10培养基450μl并充分混合后,将其中每一100μl溶液置于R2YE琼脂培养基,与软琼脂培养基2.5ml一起涂布其上。在30℃孵育20小时后,覆盖含有新霉素(Sigma-AldrichCo.,U.S.)100μg/ml的软琼脂培养基2.5ml。于30℃培养所述培养基5天,以获得抗新霉素的转化子。于R2YE琼脂培养基表面上生长的耐受新霉素的转化子无菌涂布在含有2μg/ml新霉素的YMS琼脂培养基上。所得每一菌株称为蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vphattBTG1::aveA4-aveA3-aveE。
实施例3
aveR向蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vphattBTG1::aveA4-aveA3-aveE的导入
用XbaI和HindIII消化载体质粒pUCBM21::aveR(所述质粒与如SEQ ID NO:5所示除虫菌素生物合成基因转录调控基因aveR的限制性酶AgeI DNA片段相连),用琼脂糖凝胶电泳分离并纯化含有aveR的3.27kb之DNA片段。含有aveR的3.27kb的XbaI-HindIII片段连接入染色体整合载体质粒pUC19aad3”-intФC31之XbaI和HindIII识别位点,转化大肠杆菌BL21ΔrecA。
将实施例2中获得的蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vphattBTG1::aveA4-aveA3-aveE孢子悬浮液接种入YEME培养基(500mlErlenmeyer烧瓶),其含有50ml 30%w/v蔗糖,0.5%w/v甘氨酸和5mM MgCl2,于30℃旋转摇床上振荡培养48小时。3000rpm离心10分钟收集菌丝体。加入20ml P10培养液并充分悬浮后,3000rpm离心悬浮液10分钟以洗涤菌丝体。含有1mg/ml卵溶菌酶的P10培养液加入经洗涤的菌丝体以悬浮,通过在30℃放置30分钟产生原生质体。与所加10ml P10培养液充分混合后,将原生质体悬浮液通过棉塞滤器,以除去溶菌酶消化的菌丝体。通过棉塞滤器的原生质体悬浮液于3000rpm离心10分钟以沉淀原生质体。除去上清并用10ml P10培养液充分悬浮后,通过3000rpm离心10分钟沉淀原生质体。再次向其中加入P10培养液10ml,悬浮原生质体,通过离心洗涤。所得经洗涤的原生质体悬浮在P10培养液(5ml)。将悬浮液(每个0.1ml)分装入灭菌的Eppendorf管中,于-80℃储存。将上述获得的质粒DNApUC19aad3”-intΦC31::aveR(约1μg)加入上述原生质体中,立即加入25%聚乙二醇(MW1000)溶液(2.5%蔗糖,0.05%KH2PO4,0.1MCaCl2和50mM Tris-maleate,pH 8.0)500μl并混合,室温下放置1分钟。
加入P10培养基450μl并充分混合,将其中每一100μl溶液置于R2YE琼脂培养基,与软琼脂培养基2.5ml一起涂布其上。在30℃孵育20小时后,覆盖含有大观霉素3mg/ml的软琼脂培养基2.5ml。于30℃培养所述培养基5天,以获得抗大观霉素的转化子。于R2YE琼脂培养基表面上生长的耐受大观霉素的转化子无菌涂布在含有300μg/ml大观霉素的YMS琼脂培养基上。所得每一菌株称为蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vph attBTG1::aveA4-aveA3-aveE
实施例4
将实施例3中所得整合有aveA3-4和aveR,在染色体上奈马克丁PKS模块7中***vph的菌株接种入奈马克丁种子培养基,于30℃培养3天。1ml培养液加入置于500ml Erlenmeyer烧瓶中的奈马克丁生产培养基50ml中。180rpm下于28℃振荡培养5天,于3000rpm离心10分钟,获得菌丝体。所得菌丝体用丙酮悬浮,室温下搅拌1小时,分别收集菌丝体和丙酮层。从丙酮层蒸发溶剂。向通过溶剂蒸发干燥的物质中加入水和氯仿,搅拌混合物。分别收集氯仿层,加入无水硫酸钠用于脱水。从氯仿层中蒸发溶剂。所得粗提物溶于小量氯仿。溶液上样于用氯仿平衡的硅胶柱(Sigma-Aldrich Co.,U.S.)。用氯仿洗柱后,用25%v/v乙酸乙酯/氯仿洗柱,除去不含有C-13羟基奈马克丁的级分。随后,除去用40%v/v乙酸乙酯/氯仿洗脱的级分,收集用50%v/v乙酸乙酯/氯仿洗脱的含有大量C-13羟基奈马克丁的级分。所得的洗脱物各自在真空中干燥,以得到黄色油状物质。利用HPLC按照如下条件分离并纯化所获得的黄色油状物质。
采用Pegasil ODS柱(ODS 3μm;柱体积:20mm×250mm;Senshu Scientific Co.,Ltd.,日本),用乙腈50%、甲醇18%和水32%的溶剂混合物作为流动相。246nm处检测,以流速8ml/分钟分离,分离保留时间为28分钟的的级分。所得化合物结构的分析通过1H-NMR图谱(参见图3)数据,13C-NMR图谱(参见图4)数据和质谱数据(M+1=629),证实为C-13羟基奈马克丁α(分子式:C36H52O9),由下式所示。
实施例5
来自除虫链霉菌的除虫菌素糖苷化基因aveBI-BVIII的获得
SEQ ID NO:6所述的11041bp片段,即与含有总aveBI-BVIII的DNA相连的pUC19::aveBI-BVIII用限制性酶XbaI和HindIII消化,将含有总aveBI-BVIII的DNA片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳。
利用酚提取、酚-氯仿提取以及乙醇沉淀的方法分离并纯化凝胶。此外,用限制性酶XbaI-HindIII消化***染色体的载体质粒pUC19intR4-tsr,琼脂糖凝胶电泳以分离并纯化11kb的DNA片段。利用Ligation High连接DNA片段,采用10μl DNA连接产物转化大肠杆菌BL21ΔrecA,获得重组质粒pUC19intR4-tsr::aveBI-BVIII。采用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基进行转化子的挑选。
实施例6
将实施例3中获得的蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vphattBTG1::aveA4-aveA3-aveE孢子悬浮液接种入YEME培养基(500ml Erlenmeyer烧瓶),其含有50ml 30%w/v蔗糖,0.5%w/v甘氨酸和5mM MgCl2,于30℃旋转摇床上振荡培养48小时。3000rpm离心10分钟收集菌丝体。加入20ml P10培养液并充分悬浮后,3000rpm离心悬浮液10分钟以洗涤菌丝体。含有1mg/ml卵溶菌酶的P10培养液加入经洗涤的菌丝体以悬浮,通过在30℃放置30分钟产生原生质体。与所加10ml P10培养液充分混合后,将原生质体悬浮液通过棉塞滤器,以除去溶菌酶消化的菌丝体。通过棉塞滤器的原生质体悬浮液于3000rpm离心10分钟以沉淀原生质体。除去上清并用10ml P10培养液充分悬浮后,通过3000rpm离心10分钟沉淀原生质体。再次向其中加入P10培养液10ml,悬浮原生质体,通过离心洗涤。所得经洗涤的原生质体悬浮在P10培养液转化(5ml)。将悬浮液以每个0.1ml的体积分装入灭菌的Eppendorf管中,于-80℃储存。将实施例5中所得的质粒DNA pUC19intR4-tsr::aveBI-BVIII(约1μg)加入上述原生质体中,立即加入25%聚乙二醇(MW1000)溶液(2.5%蔗糖,0.05%KH2PO4,0.1M CaCl2和50mM Tris-maleate,pH 8.0)500μl并混合,室温下放置1分钟。
加入P10培养基450μl并充分混合,将其中每一100μl溶液置于R2YE琼脂培养基,与软琼脂培养基2.5ml一起涂布其上。在30℃孵育20小时后,覆盖含有硫链丝菌素200μg/ml的软琼脂培养基2.5ml。于30℃培养所述培养基5天,以获得抗硫链丝菌素的转化子。于R2YE琼脂培养基表面上生长的耐受硫链丝菌素的转化子无菌涂布在含有20μg/ml硫链丝菌素的YMS琼脂培养基上。所得每一菌株称为蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vph attBTG1::aveA4-aveA3-aveEattBR4::aveBI-BVIII
实施例7
培养蓝灰链霉菌非生氰亚种ΔnemA4::vphattBTG1::aveA4-aveA3-aveEattBR4::aveBI-BVIII以及产物的分离和纯化
将实施例6中所得整合有aveA3-4、aveR和aveBI-BVIII,在染色体上奈马克丁PKS模块10中***vph的菌株接种入奈马克丁种子培养基,于30℃培养3天。1ml培养液加入置于500ml Erlenmeye摇瓶中的奈马克丁生产培养基50ml中。180rpm下于28℃振荡培养5天,于3000rpm离心10分钟,获得菌丝体。所得菌丝体用丙酮悬浮,室温下搅拌1小时,分别收集菌丝体和丙酮层。从丙酮层蒸发溶剂。向通过溶剂蒸发干燥的物质中加入水和氯仿,搅拌混合物。分别收集氯仿层,加入无水硫酸钠用于脱水。从氯仿层中蒸发溶剂。所得粗提物溶于小量氯仿。溶液上样于用氯仿平衡的硅胶柱(Sigma-Aldrich Co.,U.S.)。用氯仿洗柱后,用30%v/v乙酸乙酯/氯仿洗柱,除去不含有C-13糖基奈马克丁的级分。随后,收集用40%v/v乙酸乙酯/氯仿和50%v/v乙酸乙酯/氯仿洗脱的级分。所得的洗脱物各自在真空中干燥,以得到黄色油状物质。利用HPLC按照如下条件分离并纯化所获得的黄色油状物质。
采用Pegasil ODS柱(3μm;柱体积:20mm×250mm;SenshuScientific Co.,Ltd.,日本),用乙腈∶甲醇∶水=55∶18∶27的溶剂混合物作为流动相。流速设定为6ml/min,收集具有120分钟保留时间且具有246nm处吸收特征的级分。所得化合物结构的分析通过1H-NMR图谱(参见图5)数据,13C-NMR图谱(参见图6)数据和质谱数据(M+1=917),证实为C-13糖基奈马克丁α(分子式:C50H76O15),由下式所示。
以下显示用于上述实施例中的多种培养基和缓冲液的组成成分。
噬菌体稀释缓冲液(SM缓冲液)
Tris-HCl(pH 7.5) 10mM
氯化钠 100mM
硫酸镁7H2O 10mM
终止循环测序反应的溶液
溴酚兰 0.02%
EDTA(pH 8.0) 20mM
甲酰胺 95%
YEME培养基
酵母提取物(Difco Laboratories) 3g
麦芽提取物(Oxoid Ltd.) 3g
蛋白胨(Difco Laboratories) 5g
葡萄糖 10g
蔗糖 300g
蒸馏水 1000ml
未调pH。于121℃高压蒸汽灭菌1分钟。
微量元素溶液
六水合氯化亚铁 200mg
氯化锌 40mg
二水合氯化铜 10mg
四水合氯化锰 10mg
十水合硼酸钠 10mg
四水合钼酸铵 10mg
蒸馏水 1000ml
P10培养基
蔗糖 103g
硫酸钾 0.25g
六水合氯化镁 2.03g
微量元素溶液 2.0ml
于121℃高压蒸汽灭菌15分钟后无菌性加入如下成分:
0.5%磷酸钾 10ml
3.68%水合氯化钾 100ml
0.25M TES*(pH 7.2) 100ml
*N-tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸盐(酯)
R2YE琼脂培养基
蔗糖 103g
硫酸钾 0.25g
六水合氯化镁 10.12g
葡萄糖 10g
Casamino acid(Difco Laboratories) 0.1g
琼脂 22g
蒸馏水 800ml
于121℃高压蒸汽灭菌15分钟后无菌性加入如下成分:
微量元素溶液 2ml
0.5%磷酸钾 10ml
3.68%二水合氯化钾 80ml
20%L-脯氨酸 15ml
0.25M TES(pH 7.2) 100ml
10%酵母提取物(Difco Laboratories) 50ml
1M氢氧化钠 5ml
软琼脂培养基
蔗糖 103g
六水合氯化镁 10.12g
琼脂(Difco Laboratories) 6.5g
蒸馏水 820ml
于121℃高压蒸汽灭菌15分钟后无菌性加入如下成分:
3.68%二水合氯化钾 80ml
0.25M TES(pH 7.2) 100ml
YMS琼脂培养基
麦芽提取物(Difco Laboratories) 10g
酵母提取物(Difco Laboratories) 4g
可溶性淀粉(Difco Laboratories) 4g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
通过加入2M氢氧化钾调节pH 7.4,于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。灭菌后,分别将氯化镁和柠檬酸钾加至10mM和8mM。
LA培养基
Tryptone(Oxoid Ltd.) 10g
酵母提取物(Oxoid Ltd.) 5g
氯化钠 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000ml
通过加入2M氢氧化钾调节pH 7.2,于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
奈马克丁产生菌的种子培养基
葡萄糖 10g
糊精 20g
酵母提取物 5g
NZ-amine A 5g
碳酸钙 1g
蒸馏水 1000ml
未调pH。于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
用于产生奈马克丁的生产培养基
葡萄糖 50g
棉籽粉 25g
碳酸钙 7g
蒸馏水 1000ml
未调pH。于121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
工业实用性
如上述,本发明涉及如下发明:包括将奈马克丁类似化合物产生微生物的DNA导入属于链霉菌属的奈马克丁产生微生物,产生并累积C-13羟基奈马克丁和C-13糖基奈马克丁,收集之。通过分子遗传学技术方法制备C-13糖基奈马克丁能有效获得立体选择性糖苷化的奈马克丁衍生物。预期可改善如抗昆虫和抗寄生虫的生物活性。
序列表
<110>The kitasato Institute
<120>具有产生C-13取代的奈马克丁活性的属于链霉菌属的菌株及利用其制备C-13取代的奈马克丁
<160>6
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>1
gtgctgcaag gcgattaagt tgg 23
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>除虫链霉菌
<400>2
tccggctcgt atgttgtgtg ga 22
<210>3
<211>39912
<212>DNA
<213>除虫链霉菌
<400>3
gaattcttcg gcatcagccc ccgcgaagcc ctcgccatgg acccccagca acgactcctc 60
ctcgaaaccg cctgggaaac catcgaacac gccggcatca acccccacac cctccacggc 120
acccccaccg gagtcttcgc cggaatcaac gctcaagacc acgccgcgca tatccgccaa 180
agccgtgatg tggagaccat cgagggctac gccctgaccg gcagttcggg aagtgtggcg 240
tccggccggg tggcctacac gctcgggctc gaaggccccg cggtgtcggt ggatacggcg 300
tgttcgtcgt cgttggtggc gttgcattgg gcggcgcagg cgttgcgtgc gggtgagtgt 360
tcgatggcgc ttgccggggg tgtgacggtg atgtcgtctc cgggtacgtt tgtggagttc 420
tcacgtcagc ggggtctggc cgcggacggg cggtgcaagg cctattcggc ggctgctgac 480
ggtaccggct gggccgaggg tgtggggatg ctgctggtgg agcggctctc cgacgcccgt 540
cgcaacggtc accgtgtcct ggccgtggtg cgtggcagtg cggtcaacca ggacggtgcg 600
agcaacggtc tgaccgcgcc caacgggccc tcccagcagc gtgtcatccg tcaggccctg 660
gccaatgcgg gactgacccc ggccgatgtc gacgcagtgg agggccacgg caccgggacc 720
actctggggg acccgatcga ggcccaggca ctcctggccg cctacggaca acaccgcccc 780
caccaccgcc ccttgtggct gggatccctc aaatccaaca tcgggcacgc acaggccgcc 840
gcgggcgtgg gcggagtcat caagatggtg atggccctgc gcaacgggc tgctgccacag 900
accctccacg tggacgagcc caccccccag gtcgactggt ccacaggcgc agtacaactc 960
ctgacacaac cggtgccctg gcccgccgac ccggccggcc ggccacgcca cgccggcgtg 1020
tcatcattcg gcgtcagcgg caccaacgcc cacatcatcc tcgaagaagc acccactccc 1080
caggacagcg ataccgacga cgaaccgcct gccaacgcac cagccctgcc ccatcccctc 1140
cctcttcccg tgccggtgtc ggcgaggtct gaggccgggt tgcgggcgca ggcacaggcg 1200
ttgcgccagt acgtggcagc ccgcccggac atgtcacctg ccgacattgg tgcgggtctg 1260
gcccgcggcc gggccgtact ggaacaccgc gccgtcatcc tggccgcgga ccgcgaggaa 1320
ctggcgcagg cactgacagc cctggcagcc ggcgaacccc acccccacat caccacaggc 1380
cacacccggg gcggtgaccg cggcggcgtc gtcttcgtct tccccggaca gggcggccag 1440
tgggccggga tgggcctgac cctgctcacc tcctcacccg tgttcgccga acacatcgac 1500
gcatgcgaga aagccctcac cccctgggtg ccctggtccc tgaccgacat cctgcaccgc 1560
gaccccgacg accccgcatg gcaacaagcc gacgtggtcc agcccgtgct cttcagcatc 1620
atggtctccc tcgccgccct gtggcgctcc tacggcatcg aacccgacgc ggtcctcggc 1680
cactcccagg gagaaatcgc cgccgcccac atctgcggcg cactcagcct gaaagacgcc 1740
gccaaaaccg ttgcactgcg cagccgcgca ctggccgccg tacgaggccg gggcgccatg 1800
gcctcactgc ccctgcccgc ccaggacgtg cagcagctca tttccgaacg gtgggaaggg 1860
cagttgtggg tggcagccct caacggcccc cactccacca ccgtctccgg cgacaccaag 1920
gcggtggatg aggtgctggc gcactgcacc gacaccggcc tacgggccaa acgcatcccc 1980
gtcgactacg cctcccactg cccccacgtc caacccctcc acgacgaact cctgcacctg 2040
ctgggagaca tcacccccca gccgtccacc gtgccgttct tctccaccgt ggaaggcacc 2100
tggctggaca ccacaaccct ggacgccgcc tactggtacc gcaacctcca ccagcccgtc 2160
cgcttcagcc acgccatcca gaccctgacc gacgacggac accgcgcctt catcgaaatc 2220
agcccccacc ccaccctcgt ccccgccatc gaagacacca ccgaaaacac caccgaaaac 2280
atcaccgcga ccggcagcct ccgccgcggc gacaacgaca cccaccgctt cctcaccgcc 2340
ctcgcccaca cccacaccac cggcatcggc acacccacca cctggcacca ccactacacc 2400
caaacccacc cccaccccaa cccccacacc cacctcgacc tgcccaccta ccccttccaa 2460
caccagcact actggctcca accacccacc acaacaaccg acctcaccac caccggcctc 2520
acccccaccc accaccccct cctcaccgcc acactcaccc tcgccgacaa caacacacaa 2580
ctactcaccg gccgcctctc cctacgcacc cacccctggc tcaccgacca caccgtcgcc 2640
ggcatggtcc tcctgccggg caccgcgctc ctcgaactcg ccctccaagc cggcgaacgg 2700
gtggactgcc ctcgggtgga ggaactgacc ctgcacgcac cgttggtgat cccgcacacc 2760
gaggacgtga cgttgcaggt caccgttcgg gcagccgatg agagtggcca tcgcgccctc 2820
gcgatccact cgtactccgg caccgcgtcg tcggcggacc gggagtggac ccgtcacgcc 2880
acgggcctcc tcacacacca cgccgacacc gatcaccgtg ccgacacgca cacggacgcg 2940
tgccttggcg ggagctggcc cccgcccggc gcgcagccca tcgaactggg cgacgtctac 3000
ggtcgtatgg cggcggactc ggacatcgcc tacgggccgg tcttccaggg gctgcacgcc 3060
gcctggaggt tcggcgacga tgtcctggcc gaggtgcgtc tgccggaaga ggctctgcgc 3120
gatgctccgg cggcggcctt cggtgttcac ccggccttgc tcgacgcggc cctgcacgcc 3180
acggcgctca ccccccagaa cggggacggc tcgacggaga acgtcgccca ggagagcatg 3240
cctgaccgcg cagcccacca ggcgcgactg ccgttcagct ggagcggcgt gtccctgcac 3300
acggcgggca gttccgtgtt gcgcgtacgg ctgtcgcgca gtccgcagca cggtaatgcc 3360
gtggccctca ccgcggccga cgaggacggt cggccggtgg tgacgatcga gtcgctcgcg 3420
ctgcggccgg tgtccaccga ggagctgcgc gcggccgcgg atcgtacgcc cgagcacgag 3480
tcgctcttcc gactggactg ggtttccgta ccagtgcccg ccaacgcccc ttcgcccacc 3540
gcggaccggc cctgggcggt catcggcgcg ggccttcccc acctgcccgg cctgacggag 3600
cacgagcacg tgaccgcgta tgacgagccg gcggacctgc ttctggctct ggaccgcggt 3660
gctccgccgc ccggtgtgct ggtcgtaggt ggtgtcgccc acaccgaagc ccgggagtat 3720
tccgccgaag cccccgggga gcgcgggacc gaggcctgcg aggcccggcc ggacgtcgtg 3780
cacgtgggcg tcgtgcacac ggctgccgtg cacgcggctg ccgcgcagat gttggccagg 3840
ctccaggcct ggctgggcga cgagcgcctc gcagacagcc ggctgctcgt cctgacgtgc 3900
ggcgcggtcg cccgcgcctc cggcgacgat gcgacggacc tgcccggggc cgccgtgtgg 3960
gggctggtgc gttcggcgca gtccgagcac ccggaccgca tcacgctgct ggacttcgag 4020
cggggcacag aggcggagcc cggtcagctg gcgacggcgc tgaactgcgg ggagcggcag 4080
cttgccgtcc gccccggagg gctgttcacg ccacggctgg tgcgcgcgcc acgtgtcgcc 4140
gacgccgtac ccgccgtacc cgccgtggcc gtaccgtcag cgggtcacgc agccgtaccg 4200
gcagcgggtc ccttccttcc gggcggaacg gtgctgatca ccggcggaac cggtgtcctg 4260
ggccggctcg tggcccggca tctggtggag gcgcacggcg tacggcatct gttgctggcg 4320
ggtcggcgcg gaccggacgc cgagggtgcg ccggagttgc gggcggagct cggtgggctc 4380
ggcgcgacgg tggaggtcgt cgcctgcgac gcggcggacc ggcagcagct ggccgacctg 4440
ctgacacgga tccccgacga tcggccgctg accggtgtcg tgcacagtgc gggcatcctg 4500
gacgacggcg tgatcacgtc gctgtcgccg gagcggctcg gggccgtcct ccgggccaag 4560
gcggacgctg cgctgcttct cgacgagctg acgcgcgggg cagagctgtc ggctttcgtc 4620
atgttctcct ccgcgtcggc ggtggtcggc tcgcccgggc agggcaacta cgccgccgcc 4680
aacgccgtcc tcgacttcct tgctcatcgc cgccgcgccg aggggctgcc cgccgtctct 4740
ctcgcctggg gcctgtggga agagggcaca gggatgacgg gccacctcga cgtcgacgac 4800
catgcgcgga tcagccgcgc gggaatgcgg ccgctgccga ctgccgaggc tctggcgctg 4860
ttcgacgcgg ccttggccga cggcgagccg ttcctgatgc cggctcggct cgacctcacg 4920
gccgtacggt ctggtgccgc gtccgcaccg gtgccgccgc tgctgcaagg tctgcttcag 4980
ctgcctcggt cccgctcggc cgccgcggcc cccggccatg gggccccggc ggcggacgag 5040
gcggcggcct ggcgtgagcg tctggcccgg cagagtgccg gtgagcgcag gcaggcgctg 5100
ctgcgcctgg tgcggtcgca tgtcgcggcg gtgctcggcc atagcggtgc cgacggaatc 5160
gacgcatcgc gggcgttccg cgagctgggg ttcgactcgc tcacggcggt cgagctgcgc 5220
aaccgtctca cggccgcgac gggcctgcgg ctgcgggcca cgctggcctt cgatttcccg 5280
accccggcag cgctggccga gcacttgggc gagcgtctgc ttcccgacca ggaggccacg 5340
ggcgagcaag ccggcgatca gctctccggc ggcagcgagg aggacgtacg cagcctcctg 5400
acgtccattc cgatcggcag gctgcgggac gcggggctcc tcgggcccct gctcacgctc 5460
gcggacacgg gccgcggcgc ctcgggcgcc gccgcaggtc cggaggacgc gccgccctcc 5520
ggccaggaca caccggctcc cgtctcgatc gacgagatgg acatcgacga cctgatggat 5580
ctggcgcacg ggcatggcac cgcacccgcc cgtgagcccg ccgacgcaga ggactcgtcg 5640
tcatcacgaa accggacaca ccacacacac gaaggtgaga cagcgtgaac ccatccgagc 5700
cgctcggcct gcccaacgaa cgtgtagtag acacccgacc gtccgatgcc acgctctcac 5760
ccgaggccgg cctgaacagg tcaggagcgc tgccccgtga actgctgtcg ttgccggtgg 5820
tggtgtgggc cggggtcggc ctgctgtttc tggccctgca ggcgtacgtg ttcagccgct 5880
gggcggccga cggtggctac cggctgatcg agacggcggg ccagggtcag ggcggcagca 5940
aggatacggg gactaccgat gtggtctatc ccgtgatttc cgtcgtctgc atcaccgccg 6000
cggcggcgtg gctcttccgg aggtgccgtg tcgaacgacg gctgctgttc gacgcccttc 6060
tcttcctcgg gctgctgttc gcgagctggc agagcccgct catgaactgg ttccattccg 6120
ttctcgtctc caacgcgagt gtgtggggcg cggtgggttc ctggggtccg tatgtgcccg 6180
gctggcaggg ggcgggcccg ggtgcggagg cggaaatgcc gctggcgtcg gcctccgtct 6240
gcatgtcggc tctgatcgtc accgtgctgt gcagcaaggc actggggtgg atcaaggccc 6300
gccggccggc atggcggacc tggcggctgg tcctggccgt gttcttcatc ggcatcgtgc 6360
tcggtctgtc cgagccgctg ccgtccgcct ccgggatcag cgtatgggcc agagcgctgc 6420
ccgaggtgac cttgtggagt ggcgagtggt accagttccc cgtgtatcag gcggtcggtt 6480
ccggcctggt ctgctgcatg ctgggctcgc tgcgcttctt ccgcgacgaa cgcgatgagt 6540
cgtgggtgga acggggagcc tggcggttgc cgcaacgggc agcgaactgg gcgcgtttcc 6600
tcgccgtggt cggtggggtg aatgccgtga tgttcctcta cacctgtttc catatcctcc 6660
tgtccctcgt cggtggacag ccgcccgacc aactgccgga ctccttccaa gcgccggccg 6720
cttactgagt tcagggcagg tcggaggaga cggagaaggg gaggcgaccg gagttccggt 6780
cacctcccct ttgtgcatgg gtggacgggg atcacgctcc catggcggcg ggctcctcca 6840
gacgcaccac actcctcggt tcagcgatca tgcggagtcg gttggggaag acgtgagtgg 6900
ccttcgtctt gggccggacc tcgtcgcccg gaagggcgtg tagtcgccag tgggaggcga 6960
cgaccgcgac cgtaacggcc gtctcgagaa gggcgaagtt gtcgccgatg catttgtagg 7020
tgccgagcgc gaagggcacc cacgccccct tgggaactcc gcggctcgat cccttggttt 7080
cccagcggcc ggggtcgaga cgttcgggtt cggggtacca acgtgggtcg cgctggatgg 7140
cgtacgcgct gtacatgacc tccacatcgg cgggcaggtc gtgaccgccg agtcgtacgg 7200
gccgcaccgt ccggcgggac cccacccagc cggggtattt gcgcagtgcc tctttcacga 7260
ggttctgtgt gtacggcagc cgcgggaggt cctcgtgcgt gggcaaccgc ccgcccagga 7320
ccgtgtcgag ctctgcgtgc agccgactct cgatctcggc gttctgtccg agctcgtgga 7380
aaatccacgc cgtaatggca gctgggccgc cgatcccggc caccgcgatt cccatgacct 7440
cgtcatggac ctcctggtcc gtcatggagg caccttcggc gtccgtcgcg cgcagcatcg 7500
tcgagagcag gtcaccgtgg tcgcggccat cggcgcgata cgccgtgatc gcctcccgga 7560
tcgttgcgct cgtacggccc acggaccgct tgcccgcggt gggaagaacc tcgtaaaggg 7620
tgggggcgag agcactcagc cgggccacct tcagaatgtc gtgtccggtt ttccgcagcg 7680
ccgcctcggc cttcgcgccc aggtcggaga agaacagcgt cttcgtgatc atggcaagcg 7740
acaggtcgca ggcggcctgc tcaacgtcca ccacctgccc agcgctccag gaatcagcgg 7800
tctcctgcgc ggcggccgcc atggtggcga catagctctc gaggcgctgg cggtggaacc 7860
ctggctgcat ccgcctccgc tgtcgccggt gcgtctcccc cgatacggct acgaggatgg 7920
ggccgatgaa gcggctcgcg ccctgtgcgc ccttgctccg ggtgaaatcg cccgatccgg 7980
aggagaccag catggtccgc accaggtccg ggtgcgtggc gaggtaggcg gttttcggcc 8040
cgaggcggag cttgagcagg tctccgtgat ctgctgcgga gcgaaggaac tccaggggct 8100
gccgcatcaa cggcggcaca tggccgacga ccggccaggc gccgggcgcc tcgggaatgc 8160
tgctcgtcga ctgggacatc acgagtgctc ctttgcgggg tgaagggggg tggctgggag 8220
gggaacgaca gtgacgagtg aagggggagg tgtgggggtt ggcgtcggcc cgggggtgag 8280
cgtggacatg ggagtgggag ggagtgaagt gagctcggag tggtttctgg gcttcattga 8340
gattcgaatc cgacttccct gtcgatgaga gcgaacatct cctcgtccga tgtctctgcg 8400
aggtcggggg cggtgtcgtc gccgttcaac ttctgggcga gggaatgcag tcgggaggcc 8460
agccgcgtgc gcgcgccgtc gtccagcggg gcagcggagg atgtggtgga ggagagcact 8520
accgcctcca gccgctcgag ctccgagagc agcgagggca gccccggggg tgtcgttgcg 8580
gcgtccggct cggccgcggc ggtgagtccc ttgctgacga gttgtgtgtg gaggtggtgg 8640
gtgagggtgg tggggttggg gtggtcgaag gcgagggtgg tggggaggcg gagtccggtg 8700
gtgtgggaga gccggttgcg tagttcgacg gcggtgaggg agtcgaagcc gaggtcgcgg 8760
aacgcgcggt cgggggggat ggtgtcgggg gtggtgtggc ccaggacggt ggcgatgtgg 8820
gagcggacca gggcgaggag ggtggtgtgc tgttgttcgt gtgtctggcc ggccagccgg 8880
ccgtgcagct gggcgccgtt gtccgcacca ccggtagtgg tggtgcgggt ggtgcggcgg 8940
cgggtggcgg gcaggaggtc ctgcagcagg ggcggcaggg gcggggcggg acgcaggtcg 9000
gcgggcagca ggaccggccg gtccagagcc agggccgcat cgaagagggc cagtgcgtcc 9060
ggggtcgaca tgggatgcag accggaacgg atgatgcgcc ggtggtcggt gccggccaga 9120
tgcccggtca tcccgctggc ctcttcccac agcccccacg ccagcgacac ccccggcaga 9180
cccgccgccc gccgccggta cgccagcgcg tccagagcgg cattggccgc ggcgtagttg 9Z40
ccctgcccgg ccgaccccag gatccccgcg gccgaggaga acagcacgaa cgccgacagc 9300
tccatacccc gcgtcagctc atccagcaaa agagcggcat ccaccttggc cgcgaacacc 9360
gtgcccagcc gctcgggcgt gagagaggcg atcgtcgcat cgtccagcac accagccgca 9420
tgcacgacac ccgtcagcgg acacccggca ggaacaccct ccagcagccg gaccacctcc 9480
cgccgctccc ccacatcaca cgcaacaatc cgcacctccg cccccaacgc ggccagctcc 9540
gcccgcaaac cctccgcacc cggagcatcc ggaccacgcc ggctcaccaa caacagatcc 9600
cgcaccccac acacaccagc cagatgccgc gccaccgccg cacccagcac acccgtccca 9660
cccgtcacca acaccgaccc acccgacaac cacggcaaca cctcccgacc cgatacatca 9720
accggcgact caagtcgtgt caggcgtgcg gccagcaccc gctcaccacg caccgccaac 9780
tgcggctcac cacacgccac caccgcagcc acacgcccac catccagacc agaccccata 9840
ccggcctcgt tgccggcatc gcggtcagcg ccgctgtcga ggtcggtgtc caggtcgagg 9900
aggacaaacc ggtccggatg ctcagcctgc gccgaccgca ccagccccca caccgccgca 9960
cccaccacat ccaccgggcc atccaccggg ccgtcctccg ggccggccac caccgcaccc 10020
cgggtcacca ccaccagccg cgaacccgca aaccgctcca gccccagcca cccctgcacc 10080
acacccaaca ccccaccaac aacctcaccc acaccaccgc caccaccgcc gccatcggca 10140
ccggcatccg ggcaccgcaa caccaccacc cccggcacac catcctcctc agccgccaga 10200
ccaacgaggt cgtcggcacc atccagcacc accaccgatg ccccgcccga caccagtaca 10260
tctgagggca cctcaaccca cttcatgtcg aagagctcag cgcgctgtac ggcgcgctcg 10320
gcagctcgca attcgtccgc cgccaacggg cgcaccgcca acgcctcgac ggacgccacg 10380
ggcgtaccgg tgtcatccgt gaccagcacg gaaactgcgg cgtggccgct gttcggatcg 10440
gccggcgaga gtcgcacgcg caacgacgac gcattggcgg cgtgcagcgt cacaccggtg 10500
aaggagaacg gtacggatcc ctgcggcaga ctgcccgacg gcgcaaaggc cgctgcgtgc 10560
aaggcagcat ccagcagtgc cgggtgcagg ttgtacgcgg atgcctcgcc gtgcacctgt 10620
tctggaaggc gaacctcggc aaacacctcg tctcccagac gccaggcagc agtcagcccc 10680
cggaatgcgg ggccatagac aaagccattt gcctcgtagt cgccatacaa ggctgccaat 10740
tcctcatcag cacagcgaac tgcgcccgct ggcggccaca tcgacagatc atcgtggcta 10800
cggcctgtct caatgcgcga ggtcttggtt cccagaacgg ccgtggcgtg atgacgccag 10860
ggagccgctg cgggggcgtt ctcgcttcgc gagtagatcg tcagtgaacg agtgtcggtg 10920
tcgtccggtg gattgatgtg cacctgaacg tcgacggcac cctcacgggg gatgacgaga 10980
ggcgtgtgga gggcgagttc ttcgaggtgg tcggtcgtgg ttgcttggag ggcgagttcg 11040
aggagggcgg ttcctggcac aagagtggta ccgacgacgg tgtggtcggt gagccagggg 11100
tgggtgcgta gggagaggcg gccggtgagt agttgtgtgt tgttgttggc gagggtgagt 11160
gttgcggtga ggagggggtg gtgggtgggg gtgaggccgg tggtggtgag gtcggttgtc 11220
gtggtgggtg gttggagcca gtagtgctgg tgttggaagg ggtaggtggg caggtcgagg 11280
tggtggttgt gggggtgggg gtgggtttgg gtgtagtggt ggtgccaggt ggtgggtgtc 11340
cgaatgccgg tggtgtgggt gtgggcgagg gcggtgagga agcggtgggt gtcgttgtcg 11400
ccgcggcgga ggctgccggt cgcggtgatg ttttcggtgg tgttttcggt ggtgtcttcg 11460
atggcgggga cgagggtggg gtggggactg atttcgatga aggggcggtg tccgtcgtcg 11520
gtcagggtct ggatggcgtg gctgaagcgg acgggctggt ggaggttgcg gtaccagtag 11580
gcggcgtcca gggttgtggt gtaccagacc aggtgcccta cgacggtgga gaagaacggc 11640
atggtggacg gctggggggt gatgtctccc agcaggtgca ggagttcgtc gtggaggggt 11700
tggacgtggg ggcagtggga ggcgtagtcg acggggatgc gtttggcccg taggccggtg 11760
tcggcacagt gggtgaggag ttcttctact gcggtggtgt cgccggagac ggtggtggag 11820
tgggggccgt tgagggctgc cacccacaac tgcccttccc accgttcgga aatgagctgc 11880
tgcacgtcct gggcgggcag gggcagtgag accatggcgc cccggcctcg tacggcggcc 11940
agtgcctggc tgcgcagtgc aacggttttg gcggcgtctt tcaggctgag tgcgccgcag 12000
atgtgggcgg cggcgatttc tccctgggag tggccgagga ccgcgtcggg ttcgatgccg 12060
taggagcgcc acagggcggc gagggagacc atgatgctga agagcacggg ctggaccacg 12120
tcggcttgtt gccatgcggg gtcgtcgggg tcgcggtgca ggatgtcggt cagggaccag 12180
ggcacccagg gggtgagggc tttctcgcat gcgtcgatgt gttcggcgaa cacgggtgag 12240
gaggtgagca gggtcaggcc catcccggcc cactggccgc cctgtccggg gaagacgaag 12300
acgacgccgc cgcggtcact gccccgggtg tggcctgtgg tgatgtgggg gtggggttcg 12360
ccggctgcca gggctgtcag tgcctgcgcc agttcctcgc ggtccgcggc caggatgacg 12420
gcgcggtgtt ccagtacggc ccggccgcgg gccagacccg caccgatgtc ggcaggtgac 12480
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tcagacctcg ccgacaccgg caccggcacc ggcaccggct cagactcagc caccggaagg 12600
gctggattcg gagcacccac cgacacccca ccaccggcag caccgcccgc cgccgcaggc 12660
gcctcctcca aaatcacatg ggcgttggtg ccgctgacgc cgaatgatga cacgccggcg 12720
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gcgcctgtgg accagtcgac ctggggggtg ggctcgtcca cgtggagggt ctgtggcagc 12840
agcccgttgc gcagggccat caccatcttg atgactccgc ccacgcccgc ggcggcctgt 12900
gcgtgcccga tgttggattt gagggatccc agccacaagg ggcggtggtg ggggcggtgt 12960
tgtccgtagg cggccaggag tgcctgggcc tcgatcgggt cccccagagt ggtcccggtg 13020
ccgtggccct ccactgcgtc gacatcggcc ggggtcagtc ccgcattggc cagggcctga 13080
cggatgacac gctgctggga gggcccgttg ggcgcggtca gaccgttgct cgcaccgtcc 13140
tggttgaccg cactgccacg caccacggcc aggacacggt gaccgttgcg acgggcgtcg 13200
gagagccgct ccaccagcag catccccaca ccctcggccc agccggtacc gtcagcagcc 13260
gccgaatagg ccttgcaccg cccgtccgcg gccagacccc gctgacgtga gaactccaca 13320
aacgtacccg gagacgacat caccgtcaca cccccggcaa gcgccatcga acactcaccc 13380
gcacgcaacg cctgcgccgc ccaatgcaac gccaccaacg acgacgaaca cgccgtatcg 13440
acggtcacgg ccggaccctc aaggccaaag ctgtaggcca cccggccggt cgcgacgctg 13500
cctgcgctgc cgttggcgat gaggccttcg aaaccctcgg ggacatggtg gagacgcgcg 13560
gcgtagtcgt ggtacatcac cccggcgaag acacccgtac gggagccacg catcgacagc 13620
ggatcgatac ccgcccgctc gaacgcctcc cacgacgtct ccagcaacaa ccgctgctgc 13680
ggatccatcg ccaacgcctc acgcggactg atcccgaaga agtccgcatc gaactccccc 13740
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gccatcccca caatcgcaat cggctcatcc gcggcaacct gatgaagtgc gacctgcgat 13980
ggcgtctcgc cttccgcgtc gtcgcccatc agctcacgac gtaggtgacg cgccagggtc 14040
gctgcattcg gctggtcgaa gaccagactg gtcggcagtc gcagtcccgt tgcctcaccc 14100
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tgggcgccgt tgtccgcacc accggtagtg gtggtgcggg tggtgcggcg gcgggtggcg 14340
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cggtccggat gctcagcctg cgccgaccgc accagccccc acaccgccgc acccaccaca 15360
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cgcagaccgt tccacacatg gggcacgacg ggcgtccccg gacccgccac agaaagcagg 15900
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gcactggccg acgcatcggc tccaccactg ccgccctcac cgcgtgagtg gatggtcatc 16260
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tcaggaatga ccaacggtgt gtggagcgtc agctcgtcca cgtggtcgca acccacactt 16380
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ggtgggtggt aggtgagggt ttgggtgtgc tggtggagtt ggttgaggat ggggttggtg 17040
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cgttgggtga tgagggtggt ggcgtcggtg agggtgagga tgccggcgag gtgggcggcg 17340
gtgatttcgc cgagggagtg tccggcgtag tagtgggggg tgatgtggta gccgtcggtg 17400
aggaggcggt ggagggcgac ctggaaggcg aagagggcgg gctgggcgta cggggtctgc 17460
tggagcagtg cggccgcttc ttcgagggtg gtggtgtcct gggtgttggg gtcctgggtg 17520
aggaggggga ggagggggtg gtcgaggtgg gggtcgaggt gggtgcagat gtcgttgagt 17580
gcggcggcga agacggggtg ggtgtggtag aggccgtggg ccatgccggg gcgttgggtg 17640
ccctgtccgg agcagatgaa tgcggtcttt cctgcggcct ccccggtccc ggtcccgcct 17700
ggggcgctgc tgtggatgac ggcggggtgg ggttcgcctg cggcgagtgc ctggagtgct 17760
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gcgtgcaggg cctgggcctg ggcgcgcagg gccggctgcg acttggccga caccagccac 17940
ggccacaccc ctggactgcc ggcagcagcc tcctcgccac taccggcatc ctcgccggcg 18000
ggtggtcccc ccggaacgtc gtcggcgggt gtgtctgacg ggatgttgtg ggcgggtgct 18060
tcttcgagga tgacgtgggc gttggtgccg ctgacgccga atgatgacac tcctgcccgc 18120
cgtagccgcc cctccccgcc gggccagggc accgtctccg tcagcagctg caccgcaccc 18180
gcggaccagt ccacatgcgg cgacggctca tccacatgca acgtccgcgg cagcagacca 18240
ttccgcagcg ccatcaccat cttgatcacc ccggcgacgc ccgcggcagc ctgtgtgtga 18300
ccgacattgg acttgaccga gcccagccac agcggcccct cgccggcacg gtcctgcccg 18360
taggtcgcaa ggagggcctg ggcctcgatc gggtcgccca aagtggtgcc ggtgccgtgg 18420
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cgctccacca gcagcatccc cacaccctca ccccagccgg tcccgtccgc cgccgccgag 18660
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cgcgtatgcc accagcaagg cggcggtgct gatgctgagc gagtgcctgc gcgcggagtt 2100
cgcggagttc ggggtcggag tgagcgtggt gtgcccgggc ttcgtccgta cgtcgttcgc 2160
gtcggcgatg catttcgccg gtgtgccccg gctggagcag gagcggctgc gggcgctgtt 2220
cgccggtcgc ggatgcagcg cggagaaggt ggccgcggcg gtactgcggt cggtggcgcg 2280
cgactcggcc gtggtgaccg tgacggcgga agcgcggctg tcacggctga tgagccgctt 2340
cacgccacgc ctgcgcgccg cggtggcgcg gatggatccc ccttcgtagg gctggcgggg 2400
atcccctcct tgccttcgaa catcttccga cgatgggcag tgagagatgt cagatcattt 2460
tctcttcatg agtgcgccgt tctgggggca tgtgttcccc agtctcgccg tggcggagga 2520
gctcgtgcac cggggccacc acgtcacctt tgtgacgggc gcggaaatgg ccgatgcggt 2580
gcgttccgtg ggcgctgatt tcctgcggta cgagtccgcc ttcgagggtg tcgacatgta 2640
ccggctgatg accgaggccg agccgaacgc catccccatg acgctgtacg acgagggcat 2700
gtccatgttg cgttcggtgg aggagcacgt cggcaaggac gttccggacc tggtggccta 2760
cgacatcgcc acctccctca acgtgggtcg tgtcctcgcc gcctcctgga gcaggccggc 2820
catgacggtc attcccctgt tcgcgtccaa cgggcgcttc tccacgatgc agtcggtatt 2880
ggatccggat tccgctcagg tcagtgcgcc gccgccgcgc ttctcggagc agatggagtt 2940
gttcggcctc ggggcgctgg tgccgcgcct cgcggagctg ctcgtttccc ggggtatcac 3000
ggaaccggtc gacgatttcc tttccggacc ggaggacttc aacctggtgt gtctgccgcg 3060
cgccttccag tacgcgggcg acaccttcga cgagcggttc gccttcgtcg gaccatgtct 3120
gggtaagcgc aggggtctgg gcgagtggac accaccgggc agcgggcatc cagtggtgct 3180
catctccctc gggaccgtgt tcaaccggca gctgtccttc ttccgcacgt tcgtccgggc 3240
gttcaccgac gtccccgtgc acgtcgtgat ctcgctcggc aagggggtcg accccgatgt 3300
gctgcggccg ctgccgccga atgtcgaggt gcaccggtgg gtgccgcacc atgcggtgct 3360
ggagcatgcc agggctctgg tcacgcacgg cggtaccggc agtgtgatgg aggcactgca 3420
cgcagggtgc ccggtgctcg tcatgccctt gtcgcgggac gcgcaggtga ccggccggcg 3480
gatcgccgag ctggggctgg gtcgtatggt gcagccggag gaggtcacgg cgacgacgct 3540
gcgccggcac gtgctggaca tcatctccga tgacgcgatc acccgacagg tcaggcagat 3600
gcagcgggcc acggtcgagg cgggcggcgc cctgcgggca gcggacgaga ccgagcggtt 3660
tctgcgccgg acgcgccgtc actgaccggc agctcgggcc gggcggtgag tggctcccac 3720
agggttcggt tctccacgta ccactgaacg gtctgtgcca gcccctcctc gaagggcacg 3780
cggggcgcgt aaccgagctc ggcggagatc ttgctgatgt ccagcgagta gcgccggtcg 3840
tgccccttgc ggtcggtcac gggttcgacc atcgaccagt ccacgccgag caggtccagg 3900
agccgggcgg tgagctcacg gttggacagc tccgtcccgc ctccgatgtg gtagatctcg 3960
ccgggcctgc cgcgttcggc gaccagggcg atgccacggc agtggtcgtc cacgtgcagc 4020
cagtcgcgga cgttttcgcc gtcgccgtac aagggcacct tcgtgccgtt cagcagatgg 4080
gtgacgaacc gcgggatgag tttctccggg aactggtggg ggccgtagtt gttcgagcat 4140
cgggtgatga tcactggtag gccgtgcgtg cggtggaagg accgggcgag caggtcggag 4200
gacgccttgg acgcggagta gggcgagttc ggctccagcg gggcgtcctc ggtccacgag 4260
ccggagtcga tggagccgta gacctcgtcc gtcgagatgt acacgaagcg gtccacggcg 4320
gcgtcggtgg cggcgcggag cagggtgtga gtgccgagga cattggtgcg tacgaactcg 4380
gcggcgtcgg ccacggaccg gtccacgtgt gactccgccg cgaagtggac caccatgtcg 4440
gagccgtcca tcaggtccgc gaccaagggc ccgtcgcaga tgtcgccgtg cacgaagatc 4500
agggatgggc ttcccaggac cggtgcgagg ttctccaggc gacccgcgta ggtcagcttg 4560
tcgagcacca cgacctcggc accggtgaac gccggatacg cgcccgtcag caaccgccgt 4620
acgaaatggg aaccgatgaa accggcgccg cccgtcacga gtaggcgcat cccgggctcc 4680
tcaccgcggc ttccgccgca atactcatca gatactcgcc gtagccggag ccggccagtt 4740
cgaccccgcg cagatagcag tcgtccgcgt cgatcagacc catccggaag gcgatctcct 4800
cgagacaggc gatccgtact ccctggcgct tctccaggac ctgcacatac tgcccggcgt 4860
gcatcagcga gtcgtgcgtc cccgcatcga gccaggtgaa gccccggccc aggtccacca 4920
gccgggcccg cccctcggcg aggtaggccc tgttgacgtc ggtgatctcc agctcgccgc 4980
gggccgacga gcggatgccc cgggccacct cgatcacgtc gttgtcgtac aggtacaggc 5040
ctgtgatcgc caggttggac cggggggcgg tgggtttctc ctcgacggac agcagctttc 5100
cggaggcgtc gacctctccg actccgtacc gttcgggatc cgtcaccgcg tatccgaaca 5160
acacacagcc gtcgacatcg cgggtgtggc tgcgcagcag gtgcgaaaag cccatgccat 5220
ggaagatgtt gtccccaagg acaagggaca cctgatcctg accgatgaaa tcggcgccga 5280
tgaggaatgc ctcggcgatt cctcccggtc gctgctgcgc ggcgtagtcg atgttcagcc 5340
cgaggcggct tccgtctccg agcagtctcc ggaattgttc gagatgatcg ggtgaggaaa 5400
tcaccaggat gtcttttatg ccgccgagca tcaacacgga gagcgggtag tagatcatgg 5460
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agccggttcc ccccgcgagc acgattccct tcatgtcgga ctccccgcag tcgacgttat 5580
atatctctgc cgtctgcccg acggtaccaa gtggcggaaa acgcaccagg aattcgagcg 5640
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ccgccccggc cgaccggaat actgaagagc atgctgacga ctgggatgtg cgaccgaccg 5760
ctggtcgtcg tactcggagc ctccggctat atcgggtcgg ccgtcgcggc ggaactcgcc 5820
cggtggccgg tcctgttgcg gctggtggcc cggcgaccgg gcgtcgttcc gccgggcggc 5880
gccgcggaga ccgagacgcg tacggccgac ctgacggcgg cgagcgaggt cgccctcgcc 5940
gtgacggacg ccgacgtggt gatccacctg gtcgcgcgcc tcacccaggg agcggcatgg 6000
cgggcggcgg agagcgatcc ggtggccgag cgggtgaacg tcggggtgat gcacgacgtc 6060
gtcgcggccc tgcggtccgg gcgccgcgcc gggccgcccc cggtggtggt gttcgccggg 6120
tcggtctacc aggtgggccg cccgggtcgg gtcgacggca gtgagccgga cgagcccgtg 6180
acggcctatg cccgtcagaa actcgacgcc gaacggacgt tgaagtccgc cacggtcgag 6240
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cagggcaacg gcgtcgtgca ggcgatggtg ctccgggcgc tcgccgacga ggccctcacc 6360
gtgtggaacg gaagcgtggt ggagcgtgac ctggtgcatg tggaggatgt cgcgcaggcc 6420
ttcgtgagct gcctggcgca cgcggatgcg ctcgccgggc ggcactggct gctcggcagc 6480
ggtcgtcctg tgaccgtccc gcacctcttc ggtgccatcg ccgccggcgt gtccgcccgc 6540
accgggcgcc ccgcggtgcc cgtgaccgcg gtggaccctc cggcgatggc gacggcggcg 6600
gacttccacg ggaccgtcgt cgactcctcg gcgttccgcg cggtcaccgg gtggcggccg 6660
cggctgtcgc ttcaggaggg cctggaccac atggtggcgg cttacgtgta gcgccggggt 6720
ggcggccggg cccgggcggt gacggcccgg atccgggtcg gccgtcacag cttctcgtcg 6780
aggccgcggc tcgcgcggta ctccggcaac atgccgcgtc gcagggcctg ctggagagtc 6840
ggcgcgcgcc ggtcgcgctc ggagaggatc ggtgcccgcc cgaggtggtg gccgaggggc 6900
agggcgaggt ccggatcctc gggcgagagg gcgtgttcgt tctgcggaac gtagccgctc 6960
gacatcaggt acaccatcgc cgtgtcgtct tccagcgcca cgaacgcgtg cccgaccccg 7020
atcggcaggt agacggaacg gaagcgctcc tggtcgagga ggaccgagtc ccactgcccg 7080
aaagtcggtg agccggtgcg caggtcgacg acgaagtcca gggcccgtcc ccgggcgcag 7140
tggacgtact tggcctggcc gggtggtgtc gcggtgaagt gcacgccgcg gacgacgccg 7200
cggcgcgaga cgctctggca ggtctgcgcg gtgggaaacc ggtgcccgac ggcctcgctg 7260
aggaccggtt cctggtaggg ggtgacgaag agcccgcgct cgtcggggaa gaccgtcggg 7320
gtgaattcga cggcgccctc gacgacgagc ctccggaccg tgacaccggc ggcggtggcc 7380
cgggcgcccg cgggcggggc gggccggtcg gcggagctcc ggcgaggccg gccaagggtc 7440
atcgctgcac tctctctgtc gtgcgggttg tcatacgggt agtcgtacgg gccggttccg 7500
gagtcacagc tcgacggcgc gggtggtgag cagggacagc agggtgcggg cctgcacgtt 7560
cacgtaacgg ccgtaccgca gcagctgggt cagctggccc ggggtgcacc agcggtaccc 7620
cgggggcggg tcgttcggcg cctggctctc gtcggcctcg acgaacaggt agcgcgcctg 7680
tgcgtgcaga aagcgaccgc cctcctccga gtggaccgcc gcgtagcgga tgcggtcggg 7740
cgcggcctcc agcaccaggt cgaggaagcg cggcctggcc ggtcccgtga ggtgggcgta 7800
gttgcgcggg gtgtactgga ccgtcgggcc gagttcgatc gtgtcgagga agccgccctc 7860
gaccctgccg tgggcgagca ggtgcggtac gccgccgatc cgccgggtca ggaaggcggt 7920
gatgccgtgg ccgcacggtt cgatcagggg ctgggtccag gcggcgacct cccggttgga 7980
ggcctcgaca cggaccgcga ccacacggaa gtaccggtcc gcgtggtggg cgatggactc 8040
cgcgcccgtg gtccagccgg ggatgccggc caggggcacg cggcgggcgt gcacggagtg 8100
ccgggagcgt tcggcggcgt accaggagag cagttcggcg tcgctgtgca gggccgcggg 8160
ctcgtcgaac ggggtgggaa ggcaggcgag gaccgtgcgt gcgtccatgt tcaccaggtt 8220
gtcccggtgc atcagttcgc cgatctgccc cagtgtcagc cagcggaagt cgtcgtccag 8280
tggtacgtcc tcgtcggtct ccaccacgat gttgcggttg aacttccggt ggaaccaggc 8340
tccgtgctcg gactggagga cgtcgaccac cacggtggcg cgccggggct gtgtgaagta 8400
ctcgaggtac ttcacggcgg cgcccccgtg gaccttggtg tagttgctgc gcgtggcctg 8460
cacggtgggc gacagctgga ccaggttgat gttgccgggc tccatcttgg cctgcatcag 8520
gaagtgcagg accccgtcga acttcttggc gaggatgccg aggatgccga tctcgggctg 8580
gtggatgatg ggctgctgcc attccgggaa gggctgttca ccgcctcgga cgtgcagtcc 8640
ctccacggag aagaaccggc cgctgcggtg ggccagattg ccggttccgg ggtgaaacga 8700
ccaggcgtcc atcccgtgga aggggatgcg ctcgacccgg aaccggtggg ccccggaccg 8760
ccgcgtccac cagccggtga acgcgtcgag ggacgtccgg cgccggtgtc gcccacggcg 8820
gcggagcggg cgaggcacgc gggcagggcg gcgtcgtgcc gcgcggtgag cggtgctggg 8880
ctcggtgtgg tcggcatcgg ctcgtacgct catgcacccc acgtcatgta gatcaccggt 8940
ggctcgcggc cgggcagttg gcgcagtggg gcgtggtcga ggccgaacgc ctcgctcagc 9000
gccctggtct cccccggcca tttggggtgg gtgagttcgt cgaaggcgag gatgctgccc 9060
ctggtcaggt gcggtgtgat gacgtccagc agttcgcgcg tggggcggta gaggtccagg 9120
tcgaagtagg ccagcgcgat gacggtgtgc gggtgttccg ccaggtattg gggcaccgtt 9180
tcgcgtacgt cgccctggac cacgaaggaa cgctgggtgt ggccgtaggg ttcgttcgcc 9240
tcgtgcgccg cgagcacctg ccgcaggtgc tccacttcgc cgtccggcac ggcgaaccgc 9300
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tgatgagcag gtccatcgcc tgccacacct cgtcccagcc ggcgcggcgg tcgatgtggt 10380
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ccacgatatt gcgtacggac agtccgtgat cgttggggcc gctgcccatc ggatcgccga 10500
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gtccgccgat gttgaccgtt ccgagcgcca gtcggctgat cctcagccgg gtcctgccca 10740
gttcggtgtg gaggggagca ctgctgttgc tgtcggactg gacgggtgcg ggctcggccg 10800
tcgtaggcat catcgatcag tcgacactcc ctcgtgcgtg agcggcgggc gctcgagcag 10860
gaccctgacc tgaggcccag gaggctaccg gcgatcatgc gatacaggca gccgctcgat 10920
ggtgggacac gggctgccgt cgccgggcat aggggctgat gggggttgtc cggtgcgggt 10980
ccggctgaca gcttcgtgga caccaagttg atccagttga tccactccga aaggcagagg 11040
c 11041
Claims (9)
3.一种制备C-13羟基奈马克丁的方法,包括在培养基中培养权利要求2的微生物菌株,在培养基中产生并累积C-13羟基奈马克丁,以及从培养物中收集C-13羟基奈马克丁。
4.一种制备C-13糖基化的奈马克丁的方法,包括在培养基中培养权利要求1的微生物菌株,在培养基中产生并累积C-13糖基化的奈马克丁,以及从培养物中收集C-13糖基化的奈马克丁。
5.一种权利要求2所述微生物菌株的制备方法,所述微生物属于蓝灰链霉菌非生氰亚种,其保留了除虫链霉菌的除虫菌素糖苷配基生物合成基因的组,且具有产生C-13羟基奈马克丁的能力。
6.一种权利要求1所述微生物菌株的制备方法,所述微生物属于蓝灰链霉菌非生氰亚种,其保留了除虫链霉菌的除虫菌素糖苷配基生物合成基因的组,且具有产生C-13糖基化的奈马克丁的能力。
7.一种属于蓝灰链霉菌非生氰亚种的微生物菌株,其在KS10入突变体中保留了除虫链霉菌的除虫菌素糖苷配基生物合成基因aveA3-4,且具有形成带有NemA1-2和AVES3-4的嵌合PKS的能力。
8.一种微生物菌株,其属于蓝灰链霉菌非生氰亚种,且具有形成带有NemA1-2和AVES3-4的嵌合PKS的能力,其中所述微生物菌株保留了除虫链霉菌的除虫菌素生物合成基因的调控基因aveR。
9.一种微生物菌株,其属于蓝灰链霉菌非生氰亚种且具有形成带有NemA1-2和AVES3-4的嵌合PKS的能力,其中所述微生物菌株保留了除虫链霉菌的除虫菌素生物合成基因的调控基因aveR,以及除虫菌素糖苷化和齐墩果糖生物合成基因aveBI-BVIII。
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