CN100427593C - 固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用蚕丝丝素制造固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法，属于生物技术酶工程领域。其技术方案是：将酶与水溶性的再生丝素溶液充分混合后，注入到高速搅动的过量水溶性有机溶剂中，引起丝素变性和结构β化而形成乳白色结晶性丝素微粒，同时酶被包埋和固定在微粒中。经过滤或离心去除有机溶剂后，制成结晶性的固定化酶丝素纳米颗粒。这种固定化酶平均粒度35～125nm，活性回收率高达70%、热稳定性大大提高、不易被体外或体内的蛋白酶分解，能大大降低或消除酶的免疫原性。这种固定化酶丝素纳米颗粒在药物缓释***、工业酶反应器、食品添加剂和高级化妆品等方面有广泛的应用前景。

Description

固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明公开了一种固定化酶的载体及其制备方法，特别涉及一种用蚕丝丝素制造固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法，属于生物技术酶工程领域，也属于纳米技术领域和高分子化学技术领域。
背景技术
将酶或药物以微粒、微囊、脂质体、白蛋白、红细胞载体等形式引入体内，可以延长酶或药物的半衰期，使之缓慢释放，提高酶或药物对遗传性缺酶症、代谢紊乱症、肿瘤以及心血管病等的治疗功效。以天然生物材料作为酶固定化载体或作为药物的缓释载体的研究颇多，是因为它有安全、稳定、生物相容性并能在体内代谢等优点。家蚕生产的丝素蛋白是一种天然的高分子聚合物，分子量高达37万。由于这种蛋白质对人体无毒、无害、无免疫性，长期以来一直用作医用手术缝合线。近年来，对丝素进行在人工皮肤、化妆品和营养食品的原料或作为固定化细胞、酶和抗体的载体等方面的开发利用受到关注。特别是以丝素蛋白为固定化酶载体的研究在过去的二十多年中尤其活跃，已有许许多多实验充分证实丝素蛋白是一种优良的固定化酶生物材料。
以丝素蛋白作为酶固定化载体具有其它高分子材料所没有的优点，酶固定化的原理是建立在丝素蛋白从可溶性的无规线圈和α-螺旋的结构转变成不溶性的反向平行β-折叠结构，与此同时也完成了酶的固定化。用丝素作为固定化酶载体有多种形态如丝素膜、丝素纤维、丝素粉末或丝素凝胶。其中丝素粉末的制备及其应用研究十分活跃，已有大量的专利报道，主要是通过物理或化学方法诱导丝素蛋白凝聚如盐析、超声波、充气、高速搅拌，等电点凝聚、电析或先成膜后机械粉碎或直接对丝纤维进行多次机械粉碎等方法，制成1～100微米不等的超细丝素粉末，在化妆品、营养食品、添加剂、高吸水材料和涂料等方面有广泛的应用前景。然而，这些方法或加工环境大多不适合制备活性高、性能稳定的固定化酶。公开号为CN1560136的中国发明专利(国际专利WO2005085327 A1)“丝素纳米颗粒的制造方法”中，公开了一种将水溶性再生丝素溶液直接与过量的能与水混溶的有机溶剂混合制成丝素纳米颗粒的制备方法，但其中有些有机溶剂会引起酶的失活而不适宜制备固定化酶。
丝素粉末用于酶和活性物质的固定化研究起源于上个世纪80年代初，主要是利用盐析、高速搅动、蛋白冻融以及加入少量有机溶剂或调节等电点等方法使丝素蛋白沉淀、凝聚或变性，然后进行干燥和粉碎而制成固定化酶。水溶性丝素和酶混合液，用无机盐或无机盐与有机盐混合物进行盐析使之沉淀制备固定化酶(日本专利，特开昭JP56-15687；特开昭JP60-155125，国际专利，WO8503230；特开昭JP62-151180)；或者将丝素和酶混合液先调至酸性或碱性，再经盐析、冲洗、干燥后制成粉末状的固定化酶(日本专利，特开昭JP56-051983，特开昭JP56-39783)。在丝素和酶混合液中加入少量甲醇等有机溶剂直接诱导丝素凝聚，或者先将丝素酶混合液调节到丝素等电点附近，再加入少量有机溶剂诱导丝素凝聚，然后将凝聚物冲洗、干燥和粉碎后制成固定化α-淀粉和蔗糖酶(日本专利，特开昭JP1-313530)，或者制成固定化碱性或中性蛋白酶(日本专利，特开昭JP56-18590)。通过高速搅动使丝素凝聚或充气引起丝素和酶混合液产生大量泡沫而制成固定化酶(日本专利，特开昭JP60-227679，特开昭JP61-187790)。将丝素和酶的混合液先冻结后融化使丝素变性而制成固定化碱性磷酸酶(日本专利，特开昭JP01-120287)。还有利用盐析法先制成丝素粉末，然后应用交联剂将丝素粉末与糖化酶交联制成固定化酶粉末[《蚕业科学》，25(2)：113-119，1999]。除此以外，有关以丝素粉末为载体的固定化酶研究在国内外没有更多的报道。究其原因主要是由于上述这些方法制备的丝素粉末结晶性差、稳定性差、比表面小、固定化酶活性低下。而且在制备过程中形成的凝聚物或沉淀物都需要干燥和反复粉碎等加工工艺，由此制备的丝素粉末粒径大，形状各异，都在微米级以上。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种具有良好的生物相容性、酶活性回收率高、生产工艺简单的固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法。
本发明采用的技术方案是：提供一种固定化酶的丝素纳米颗粒，它以丝素蛋白为核心，酶被包埋并固定于微粒表层中，平均粒度为35～125nm，不溶于水；所述的丝素蛋白呈β-折叠结构，结晶度为20％以上。
制备上述固定化酶的丝素纳米颗粒的方法，将水溶性丝素溶液与酶混合均匀，再将丝素酶混合液注入到快速搅动的水溶性有机溶剂中，其丝素酶液与有机溶剂的混合体积比为1∶2.3以上，形成乳白色丝素蛋白为核心，表层包埋并固定酶的球形微粒分散在有机溶剂体系中，得到固定化酶的丝素纳米颗粒混合液或悬浮液，再去除其中的有机溶剂，得到固定化酶的丝素纳米颗粒。
上述技术方案中所述的水溶性丝素包括由家蚕丝或野蚕丝，或者由基因工程生产的类蚕丝蛋白纯化而成；所述的丝素溶液浓度为0.1～20％。
上述技术方案中所述的与丝素液混合的酶指氧化还原酶、水解酶和异构酶当中的一种或者二种以上的混合酶。
在上述丝素酶液注入有机溶剂时，搅拌速度在50转/分钟以上。
所述的水溶性有机溶剂为乙醇或丙酮。
上述固定化酶的丝素纳米颗粒的制造方法，其制备工作环境温度在10～45℃，最好在25～37℃之间。
对固定化酶丝素纳米颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行反复离心脱水处理，或进行反复过滤、清洗处理，直至完全去除有机溶剂。
对获得的丝素纳米颗粒加入纯水或水溶液后进行超声处理1～10min，制成固定化酶的纳米丝素液。
对获得的固定化酶的丝素纳米颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行真空冷冻干燥，制成固定化酶纳米丝素粉末。
众所周知，水溶性有机溶剂是一种最常用的蛋白变性剂，当具有生物活性的蛋白酶遇到高浓度有机溶剂时会变性失活。丝素也是一种高分子蛋白，当将丝素纤维制成再生的水溶性丝素蛋白时，易受到物理或化学因素影响而发生蛋白变性，尤其是遇到有机溶剂时更易发生结构变化而凝聚沉淀。在以往研究中，是将少量有机溶剂加入到丝素与酶的混合溶液中促使丝素蛋白凝聚或沉淀，使酶包埋在丝素沉淀物中，然后再干燥和粉碎制成固定化酶。本发明利用蚕丝蛋白结构易受改变和水溶性有机溶剂易引起蛋白变性的二大特性，将少量的丝素与酶的混合溶液注入到高速搅动的超大量的纯有机溶剂中，促使丝素蛋白快速分散与变性，水溶性丝素直接从α-螺旋和无规线圈转变成β-折叠结构，在形成结晶性丝素颗粒的同时，酶被包埋和固定化，从而获得纳米级的、性能稳定的、不溶于水的固定化酶丝素纳米颗粒。本发明还发现固定化酶效果较好的是乙醇和丙酮，因此，优选的技术方案是，有机溶剂为乙醇或丙酮。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
由于丝素与过量的水溶性有机溶剂混合后，可溶性的丝素蛋白从无规线圈和α-螺旋结构瞬间转化为不溶性的反向平行β-折叠结构。因此，得到的固定化酶丝素颗粒平均80nm左右，酶活性回收率高达60％，电子显微镜观察呈球形，结晶度达20％以上、性能稳定、不易被蛋白酶分解，具有强力阻挡紫外辐射的功能，在体内能大大降低或消除酶的免疫原性，延长酶半衰期。
本发明技术方案所提供的固定化酶的丝素纳米颗粒稳定性好，无论是颗粒悬浮液还是冻干粉状态，可长期放在室温下，而酶活性不会受到任何影响，不需象纯酶那样须在4℃或4℃以下保存；制造的冻干粉状态的固定化酶丝素纳米颗粒能抗高温，在90～100℃烘干1小时也不丢失酶活性。
按本发明技术方案，由于在制备过程中不使用有毒的化学试剂，因此，得到的固定化酶的纳米丝素对人体无毒、无害，且具有良好的生物相容性，是一种绿色环保产品。所使用的乙醇、丙酮等有机溶剂与丝素酶溶液混合后，生成乳白色固定化酶丝素纳米颗粒悬浮液，经过滤或离心分离，其废弃的过滤液或上清液可回收重蒸；或者经真空冷冻干燥后升华的有机溶剂水溶液也同样可回收重蒸，循环使用。还由于产品制备工艺简单，成本低、效益高，因此，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1是按本发明实施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒的荧光发射光谱；
图2是按本发明实施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒的红外吸收光谱；
图3是按本发明实施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒的X-射线衍射图谱；
图4是按本发明实施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒的粒度分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例一：
取在蚕桑、种茧生产和缫丝、纺织生产中的种茧、茧衣、废丝或废绸布等清洗后，加入30倍量的0.5％碳酸钠水溶液或其它碱性溶液或者加入表面活性剂等进行煮沸1小时，再换液1次，再煮沸1小时，确保将丝胶全部脱除。脱除丝胶的丝素纤维经反复用水冲洗后烘干备用。
取上述脱除丝胶的丝素纤维与5～20倍量(W/V)的8～9M溴化锂水溶液或者是溴化锂甲醇水三元混合溶剂混合，在40℃以上溶解2～40小时；或者是将丝素纤维与5～20倍量的氯化钙/乙醇/水三元混合溶剂(摩尔比1∶2∶8)混合，在50℃以上溶解1～5小时；或者是将上述丝素纤维溶解在其它浓盐溶液或有机溶剂中。将上述获得的各种丝素溶解液进行透析、脱盐、纯化，制成浓度为0.5～15％的水溶性丝素溶液，最好是浓缩或稀释成1.5～3.5％水溶性丝素溶液。
取上述浓度为1.5～3.5％水溶性丝素溶液，加入占丝素总量0.0001～1％的葡萄糖氧化酶，通过搅拌装置使丝素酶混合溶液搅动，在10～45℃的环境条件下，最好是在25～37℃环境条件下，快速加入过量的丙酮(最终体积70％以上)中，使丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，经滤纸过滤，将过滤后的固定化酶丝素湿粉末置缓冲溶液中，经超声处理后成固定化葡萄糖氧化酶的丝素纳米颗粒悬浮液，可直接用于酶活性测定；或者将过滤后的固定化酶丝素湿粉末置-20℃冻结，最后，进行真空冷冻干燥，得到粉末状的固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒。
采用以前报道的方法(Kawahara Y：Journal of Sericulture Science ofJapan，62(4)，272-275，1993)略加改进后测定葡萄糖氧化酶活性。具体操作步骤如下：在测定管、标准管和空白管中分别加入2.4ml染色缓冲液、0.5mL 10％底物葡萄糖溶液和0.1ml过氧化物酶溶液，摇匀，置37℃恒温2～5min后最后加入游离酶开始反应，以空白管为对照，500nm波长处测定5分钟内反应的吸光度变化值，然后除5得到每分钟将1.0mmol/L β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和H2O2所增加的吸光度值。当测定固定化酶时，因丝素颗粒悬浮在比色皿中边反应边测定会挡住紫外光线的透过，干扰测定，所以，自制固定化酶反应器，当反应5min后，立即抽滤出反应液测定吸光度值。1个单位葡萄糖氧化酶活性定义为在37℃，pH5.5磷酸钠缓冲液条件下每分钟催化1.0mmol/L β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和H2O2所产生的吸光度变化值。表中数值均为5次重复测定的平均值。从表中可知，固定化酶的活性回收率在24.5～72.9％之间。
表1：固定化葡萄糖氧化酶活性回收率
Figure C20061003919100081
参见附图1，固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒水中悬浮液和含酶水溶性丝素溶液在日立荧光分光光度计(F-4500 FL Spectrophotometer)上测度的荧光发射光谱。测定条件：激发波长290nm，激发狭缝10.0nm，发射狭缝5.0nm，扫描速度240nm/min，灵敏度0.5s。从图中可以发现丝素纳米化以后，荧光发射光谱发生蓝移10nm左右，表明丝素分子从无规线圈和α-缓螺旋转变成β-折叠的构造。
参见附图2，固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒冻干粉和含酶水溶性丝素溶液冻干粉用少许KBr压片制样，在Magna 550红外分光光度计(NicoletInstrument Corp.USA)上进行测定，扫描范围为4000～200cm-1。图中含酶水溶性丝素的红外吸收光谱显示无规卷曲和α-缓螺旋或称曲柄形结构(Silk I)特征，当丝素纳米化后其吸收带发生位移，出现了反向平行β-折叠(Silk II)的构造。
参见附图3，在MERCURY CCD-AFC8型CCD单晶X-射线衍射仪(日本理学电机株式会社)进行丝素样品分析，管电压为4.0kV，管电流为35mA，扫描速度2°/min，Ni滤波。从2θ＝5°～45°进行扫描，得到固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒冻干粉和含酶水溶性丝素溶液冻干粉的X-射线衍射图谱。含酶水溶性丝素冻干粉可确认为完全无定形结构，而在丙酮中丝素纳米化后，丝素分子构象由Silk I向Silk II转化，成为结晶性的固定化酶丝素纳米颗粒。
参见附图4，固定化葡萄糖氧化酶丝素纳米颗粒用水稀释，超声处理后直接放入样品杯，在Zetasizer 3000HSa激光粒度仪(Malvern Instruments Ltd，Malvern UK)上测定颗粒粒度分布情况。从图可知，固定化酶的丝素纳米颗粒粒度分布在35～125nm之间。
实施例二：
与实施例一制备方法相同，将1.5～3.5％的水溶性丝素溶液与超氧物歧化酶混合后，加入快速搅动的过量丙酮(最终体积70％以上)中，其余制备步骤全部相同。用这种丙酮处理方法分别制备得到固定化超氧物歧化酶丝素纳米颗粒悬浮液或冻干粉，其活性测定方法以及固定化酶的活性回收率见表2。表中数值均为5次重复测定的平均值。
本实验使用超氧物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所一分所生产)测定溶液酶或固定化酶的活性。其测定方法是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应***产生O2 -，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现***，用日立U3000紫外可见分光光度计测定其吸光度。当被测样品中含有SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算被测样品SOD活力(NU/ml，以亚硝酸盐单位表示)。表中固定化酶活性回收率是以牛血超氧化物歧化酶(上海东方丽珠生物化学制品有限公司生产)活性为100％计算的。结果表明固定化超氧物歧化酶的活性回收率在25～79.4％之间。
表2.固定化超氧物歧化酶的活性回收率
Figure C20061003919100091
实施例三：
与实施例一制备方法相同，将1.5～3.5％的水溶性丝素溶液与L-天冬酰胺酶混合后，加入快速搅动的过量丙酮(最终体积70％以上)中，其余制备步骤全部相同。用这种丙酮处理方法分别制备得到固定化L-天冬酰胺酶丝素纳米颗粒悬浮液或冻干粉，其活性测定方法以及固定化酶的活性回收率见表3。表中数值均为5次重复测定的平均值。
L-天冬酰胺酶活性测定方法(Mashburn，L.T.，Wriston，J.C.，jr.：Tumorinhibitory effect of L-Asparaginase.Biochen.Biophys.Res.Comm.12：50，1963)：用移液管向数支离心管滴入0.2ml Tris-HCl缓冲溶液(pH8.6)和1.7ml底物溶液，置于水浴中调温至37℃。加0.10ml游离酶溶液或固定化酶后精确保温10min。加0.10ml三氯醋酸溶液，反应终止。离心分离后取出0.50ml上清液滴入7.0ml蒸馏水中，再加1.0ml奈氏试剂。室温下静置10min后用分光光度计(480nm处)以空白管为对照测定吸光度。当一系列不同浓度的游离酶经上述同样方法测定后，计算游离酶浓度与吸光度关系，作出校正曲线获得线性方程。然后，根据这个线性方程(y＝0.4286x+0.0555)计算固定化酶样品中实测到的酶活性，最后将样品中酶的加入总量除以样品中实测酶活性得出固定化酶活性回收率，结果见表3。从表中可知，固定化L-天冬酰胺酶活性回收率在13％以上，最高可达76％。
表3固定化L-天冬酰胺酶的活性回收率
实施例四：
与实施例一制备方法相同，将1.5～3.5％的水溶性丝素溶液与青霉素酰化酶混合后，加入快速搅动的过量丙酮(最终体积70％以上)中，其余制备步骤全部相同。用这种丙酮处理方法分别制备得到固定化青霉素酰化酶丝素纳米颗粒悬浮液或冻干粉，其活性测定方法以及固定化酶的活性回收率见表4。表中数值均为5次重复测定的平均值。
应用PDAB(P-dimethylaminobenzaldehyde)方法测定青霉素酰化酶(penicillin Acylase E.C.3.5.11)的活性(Balasshingham K，Warburton D，Dunnill P et al.，The isolation and kinetics of penicillin amidase fromEscherischia Coli.，Biochim Biophys Acta，1972，276：250-256)。青霉素酰化酶(1000U/mL)在37℃裂解青霉素产生6-APA在酸性条件下，进而与PDAB形成西夫碱，在415nm有最大吸收。酶活测定操作步骤如下：酶液0.5ml或固定化酶约20mg加入到4.5ml磷酸盐缓冲液(pH 7.8)稀释。吸取1.0ml置试管中，于37℃平衡5min。另将4％的青霉素G溶液于37℃平衡5min，吸取1.0ml加入上述含酶的试管中，摇匀，准确反应5min，加入3ml乙醇中止反应。吸取0.75ml加入5.25ml PDAB生色液，放置3min。在415nm处测定光密度.对照标准曲线得6-APA浓度。在pH 7.8，温度37℃条件下每分钟催化青霉素G钾盐水解产生1μmol的6-APA所需的酶量，定义为1个酶活单位(U)。
配制一系列不同浓度的青霉素酰化酶，按上述方法测定酶活性，计算酶浓度与吸光度的标准曲线，求出线性方程y＝0.0984x+0.2526，然后计算实际样品中测得的酶活性，根据样品制备时加入的酶量计算固定化酶活性回收率。结果表明，固定化青霉素酰化酶的活性回收率在20～80％之间。
表4.固定化青霉素酰化酶丝素纳米颗粒的酶活性回收率
Figure C20061003919100111

Claims (2)

1、一种固定化酶的丝素纳米颗粒，其特征在于：它以丝素蛋白为核心，酶被包埋并固定于微粒表层，平均粒度为35～125nm，不溶于水；所述的丝素蛋白呈β-折叠结构，结晶度为20％以上；所述的酶包括氧化还原酶、水解酶和异构酶当中的一种或者二种以上的混合酶。
2、制备固定化酶的丝素纳米颗粒的方法，其特征在于：将水溶性丝素溶液与酶混合均匀，再将丝素酶混合液注入到快速搅动的水溶性有机溶剂中，有机溶剂的体积占最终体积的70％以上，所述有机溶剂为丙酮，形成乳白色丝素蛋白为核心，表层包埋并固定酶的球形微粒分散在有机溶剂体系中，得到固定化酶的丝素纳米颗粒混合液或悬浮液，去除其中的有机溶剂，得到固定化酶的丝素纳米颗粒；所述的酶，包括氧化还原酶、水解酶和异构酶当中的一种或者二种以上的混合酶。
CNB2006100391918A 2006-03-30 2006-03-30 固定化酶的丝素纳米颗粒及其制备方法 Expired - Fee Related CN100427593C (zh)

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