CN100419089C - 快速检测hiv病毒的核苷酸序列、方法及体外诊断试剂盒 - Google Patents

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CN100419089C CNB2006101136131A CN200610113613A CN100419089C CN 100419089 C CN100419089 C CN 100419089C CN B2006101136131 A CNB2006101136131 A CN B2006101136131A CN 200610113613 A CN200610113613 A CN 200610113613A CN 100419089 C CN100419089 C CN 100419089C
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Abstract

本发明涉及一种快速检测HIV病毒的核苷酸序列、方法及体外诊断试剂盒，属于病毒分子生物学领域和医学生物技术领域。一组检测HIV病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ IDNo.1至SEQ ID No.7所示碱基序列。本发明的有益效果是：我们发明的一组新的HIV检测序列和试剂盒可以检测出M族的A-H亚型和O族，比目前市售商品试剂盒检测范围广；方法操作简单，易于掌握，对操作人员要求不高；检测下限低至125IU/ml；采用双探针双引物体系对各种HIV-1亚型都能良好准确的定量，保证了对各种型别的亚型都能结合到及能适应结合部位可能的突变变化，从而准确定量；成本低廉，相对于进口试剂盒50-80美元/人份的成本，我们发明的试剂盒成本仅为10-20元人民币/人份。

Description

快速检测HIV病毒的核苷酸序列、方法及体外诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速检测HIV病毒的核苷酸序列、方法及体外诊断试剂盒，属于病毒分子生物学领域和医学生物技术领域。
背景技术
HIV病毒属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。迄今为止，根据血清学反应和病毒核酸序列测定，全球流行的HIV可分为2型：HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型内，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为三个组：M组(主要组)、O组(***组)和N组(新组或非M非O组)，M组内又可分为A-J10个亚型。在HIV-1型和HIV-2型之间，其核苷酸序列有45％的同源性，并且存在免疫交叉反应。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。
目前，国际公认检测试剂有罗氏公司生产的Amplicor HIV-1Monitor Test。这种试剂采用RT-PCR-ELISA原理进行检测，仅使用对应HIV gag gene的一对引物及探针，不能保证与各亚型的特异结合及引物或探针结合区域可能的突变引起的结合的变化，有文献报道证明，该试剂盒存在漏检或定量低估的现象。此外，该试剂盒价格昂贵，检测成本约50-80美元/人份，限制了其在国内的普及。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是提供一组可用于检测HIV病毒的核苷酸序列。
本发明要解决的再一个技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、检测成本低的检测HIV病毒的方法。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种特异性强、成本低的含有双引物、双探针的检测HIV病毒的体外诊断试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组可用于检测HIV病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的序列。
引物1正向5’-ACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3’SEQ ID No.1
引物1反向5’-CTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’SEQ ID No.2
探针1 5’-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGG-3’SEQ ID No.3
引物2正向5’-GCTTTCAGCCCAGAAGTAATACC-3’SEQ ID No.4
引物2反向5’-ATTTGCATAGCTGCTTGATGTCC-3’SEQ ID No.5
探针2 5’-TCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACA-3’SEQ ID No.6
探针3 5’-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAC-3’SEQ ID No.7
其中，探针1和探针2序列的5’端分别标记荧光报告基团FAM，3’端分别标记荧光淬灭基团TAMRA；探针3的5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA。
通过对所有已知的HIV-1序列进行生物信息学方法的比对，获得HIV-1序列中保守的核酸序列区域，根据引物设计的一般原则(如考虑引物探针的长度、融解温度、GC含量、重复碱基数、末端碱基等)采用生物学软件设计多对引物探针。将每一对引物探针与HIV-1序列进行比对，最终采用匹配程度好的引物探针。经过实验筛选我们最终使用SEQ IDNo.1至SEQ ID No.6所示的碱基序列作为实时荧光定量PCR反应的双引物和双探针。
一种灵敏度高、特异性强的检测HIV病毒的方法，使用SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的序列作为双引物和双探针进行荧光实时定量PCR。该方法还包括使用病毒样颗粒和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列作为内标质控物的检测探针，将病毒样颗粒加入到样本中参与样本提取、逆转录、PCR扩增及产物检测全过程的质量控制。
我们采用TaqMan方法，在两端分标记荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后，其标记基团被具有5′-3′外切酶活性的Taq DNA聚合酶切掉，与淬灭基团分离从而产生荧光，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进行定性和定量。该方法提高了检测反应的灵敏度与特异性，并且易于操作。
一种含有双引物、双探针的检测HIV病毒的体外诊断试剂盒，由以下试剂组成：
1.RNA提取试剂：选自Trizol或磁珠法提取试剂中的一种，均含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒：
(1)Trizol：含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，由本实验室制备，方法参考公开文献，4℃保存。
(2)磁珠法提取试剂：包含裂解液等多种试剂，在其裂解液中含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，由本实验室制备，方法参考公开文献，4℃保存。
2.反应液：由50mM Tris(使用浓度20mM)、125mM KCl(使用浓度50mM)、10mMMgCl2(使用浓度4mM)、500ug/ml BSA(使用浓度200ug/ml)、0.375mM Sorbitol(山梨醇，使用浓度0.15mM)、0.025mM Triton(使用浓度0.01mM)、RNase抑制剂Rnasin2.5-5U/ul(使用量为5-10U/人份)，和750μM dNTP(使用浓度300μM)组成，-20℃保存。
3.酶混合物：200U/ul MMLV逆转录酶(使用量为100-200U/人份)和2.5-5U/ulHotstartTaq DNA聚合酶(使用量为2-5U/人份)，-20℃保存。
酶混合物还可以为200U/ul Superscript III逆转录酶(使用量为50-100U/人份)和2.5-5U/ul Taq Plantium DNA聚合酶(使用量为2-5U/人份)，-20℃保存。
4.引物和探针混合物：包括引物序列(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)6μM(使用浓度为200nM)、引物探针(SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端荧光淬灭基团TAMRA)6μM(使用浓度为200nM)和内标探针(SEQ ID No.7，5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA)3μM(使用浓度为100nM)，-20℃保存。
需要特别说明的是，该试剂盒的核心成分为引物、探针及内标质控病毒样颗粒，其余试剂可以根据实验习惯选择使用，例如作为提取RNA的试剂，可以选择“Trizol”或“磁珠法提取试剂”；作为扩增反应用的逆转录酶，可以选择“MMLV逆转录酶”或“Superscript III逆转录酶”；DNA聚合酶也可以选择“Hotstart Taq DNA聚合酶”或“Taq Plantium DNA聚合酶”。但是，当选用“MMLV逆转录酶”时，应配合使用“HotstartTaq DNA聚合酶”，而选择“Superscript III逆转录酶”时，应配合使用“Taq PlantiumDNA聚合酶”。
在本发明中，为了达到更优异的检测效果，在使用Taqman方法作定量PCR时，我们还使用具有独创性的内对照***--病毒样颗粒内对照***进行假阴性控制，以校正PCR效率而获得准确的定量结果。在MS2噬菌体包膜蛋白的研究中发现包膜蛋白与噬菌体复制酶5’端由19个碱基(19mer)组成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。国外研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装。根据这个原理，通过重叠PCR的方法构建内标病毒样颗粒的重组质粒(重组质粒中只是用内标探针序列替换了原始序列中的检测探针序列)。基本质粒为pET28b(Novagen公司)，在多克隆位点NcoI和BamHI位点***MS2噬菌体基因组81位-1769位的核酸序列(SEQID No.8)，然后在多克隆位点BamHI位点和HindIII位点***HIV-1病毒GAG基因的335bp片段SEQ ID No.9)。
MS2噬菌体基因组81位-1769位的核酸序列(SEQ ID No.8)：
ATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTACCCTTGAT
AGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAGATAACTCATTCTCTTT
AAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGCCAAAACGAAACAGTGGCACTACCCCT
CTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGTGGGTCATCGTGG
GGTCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACGCTCCTGCTACAGCCTCTTCCCTGT
AAGCCAAAACTTGACTTACATCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTCGACCGAAGTCCTGCAAAAGG
TCACCCAGGGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTTAGCAGAGGCCAGGTCGACAGCCTCACAACTCGCGACGCAA
ACCATTGCGCTCGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGCGGTAATTGGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCT
AAACGAAGATCGAAAGTTTCGATCAAAACACGTGGCCGGCAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCAC
TAATGAGTGATATCCAGGGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCC
GTACGTCAGGTCGGTACTAACATCAAGTTAGATGGCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTG
CAACATATCGCGACGTATCGTGATATGGTTTTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTAGGTA
TCTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGGGAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGTTGTCGACTGGCTCCTACCTGTAGGT
AACATGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGG
TGAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGCCCAAATCT
CAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCAACAACTGGCGCGTACGTAAAGTCTCCTTTCTCGATGGTC
CATACCTTAGATGCGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCTCTCTAGATAGAGCCCTCAACCGGAGTTTGAAGCATG
GCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTT
CGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTC
AGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGT
GTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTC
CGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAG
CAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAA
HIV-1病毒GAG基因的335bp片段(SEQ ID No.9)：
TCTCCAAGGGCAAATGGTACATCAGCCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTGGTAGAAGAGA
AGGCTTTTAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGGCCCCCTCAAAGCCGACAGATTTAAACACCATGCTAAA
CACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGCTAAAAGATTCAGGCCCCCTCAAAGCCGACATAGGCTACA
TCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAAATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTA
GTAACCTGCAGGAACAAATAGCATGGATGACGGGTAACC
用本领域常规方法将测序结果证明正确的大肠杆菌克隆进行大量表达。参考文献见：含人甲胎蛋白mRNA部分序列的耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达，中华肝脏病杂志，2005年04期。接种内标质粒克隆培养过夜，1∶100转接后继续培养2小时后进行IPTG诱导。培养20小时后离心菌体，超声破菌，离心收集上清，DNASE/RNASE 37℃消化2小时，电泳。将收集的上清加入0.6G/ML氯化铯，进行超速离心纯化病毒样颗粒，45000RPM×20小时。按照每管400UL进行取样分离，取小样电泳，合并有病毒样颗粒的管进行超声处理液进行透析。再进行一次超离纯化。将透析液中加入0.6G/ML氯化铯，56300RPM×20小时。再按照每管400UL进行取样分离，取小样电泳，合并有病毒样颗粒的管进行超声处理，处理液进行透析即得到了纯化的病毒样颗粒。将纯化后的病毒样颗粒进行定量，保存在20mM Tris(美国Sigma公司)pH8.8；50mM KCl(美国Sigma公司)；4mM MgCl2(美国Sigma公司)溶液中，浓度为5*1012拷贝/ml)，使用浓度为1000拷贝/ml。
我们根据实验设计目的对病毒样颗粒内的核酸序列进行修饰，改变HIV-1检测序列中探针结合位点的序列，从而将内标质控的序列与目的片段区分开来，从而构建相应的内标质控物。病毒样颗粒具有以下特点：(1)在正常人阴性血清中45℃，放置3天都能保持稳定，符合生物材料运送的稳定性标准；(2)病毒样颗粒能够对RNASEA和DNASEI有很好的耐受性；(3)无传染性。
为确定最佳内标掺入量，我们将未知浓度的病毒样颗粒进行做10倍系列稀释后(106-13稀释)采用VIC标记的探针(SEQ ID No.7)进行检测，标准品为采用分光光度计定量的内标重组质粒体外转录的RNA，做实时PCR。以7500Real Time PCR System(美国应用生物***公司)进行扩增，反应条件：50℃30分钟94℃，3分钟；95℃，10秒60℃，45秒(50cycles)，测得病毒样颗粒浓度为5*1012拷贝/ml。再以三份不同浓度的样品(HIV 4000IU/ml、HIV 40000IU/ml和HIV 2000000IU/ml)与不同稀释度的内标病毒样颗粒(103、104、105、106和107)进行棋盘法PCR，然后以科华公司的磁珠法提取试剂(上海科华生物工程股份有限公司的HBV-HCV-HIV核酸扩增(PCR)荧光联合检测试剂盒(KHB PCR HBV-HCV-HIV-02(科研用))中的磁珠法提取试剂)提取核酸，进行扩增检测。结果显示1000拷贝/ml的病毒样颗粒作为内标质控物加入到样本中是最佳的。
核酸检测的基础在于引物探针和目标序列的匹配。由于HIV-1的核酸序列变异度较大，采用一对引物探针不能覆盖所有的亚型，必然会造成漏检。我们发明的双特异探针检测试剂盒采用了两对引物探针从而最大可能的避免了漏检。与单探针检测试剂盒相比，我们发明的双探针检测试剂盒具有检测灵敏度高，假阴性率低，检测特异性好的特点。双探针检测试剂盒的检测下限大约在125IU/ml，可以检测出M族的A-H亚型和O族，在检测中国药品生物制品检定所提供的国内流行株A，B，C，D，F，G，CRF01-AE，CRF07-BC，CRF08-BC的分型血清时，所有国内流行株均能检出。在检测HIV-1阴性样本和其他病毒样本时具有100％的特异性，没有非特异的扩增。在进行60份临床样本进行检测时，与单探针检测试剂盒相比，我们发明的双探针检测试剂盒具有更好的检测率(60份中检出50份阳性，剩余的10份阴性结果采用公认的AmplicorHIV-1 Monitor vl.5test检测证明为阴性)。
本发明的有益效果是：我们发明的一组新的HIV检测序列和试剂盒可以检测出M族的A-H亚型和O族，比目前市售商品试剂盒检测范围广；方法操作简单，易于掌握，对操作人员要求不高；检测下限低至125IU/ml；采用双探针双引物体系对各种HIV-1亚型都能良好准确的定量，保证了对各种型别的亚型都能结合到及能适应结合部位可能的突变变化，从而准确定量；成本低廉，相对于进口试剂盒50-80美元/人份的成本，我们发明的试剂盒成本仅为10-20元人民币/人份。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为本发明检测下限结果图：A为采用探针1和引物对1体系时的检测下限结果，B为采用探针2和引物对2体系时的检测下限结果。
图2为特异性试验结果图。
具体实施方式
实施例1.检测HIV病毒的引物和探针序列
委托上海基康生物技术有限公司合成
引物1正向5’-ACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3’SEQ ID No.1
引物1反向5’-CTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’SEQ ID No.2
探针1 5’-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGG-3’SEQ ID No.3
引物2正向5’-GCTTTCAGCCCAGAAGTAATACC-3’SEQ ID No.4
引物2反向5’-ATTTGCATAGCTGCTTGATGTCC-3’SEQ ID No.5
探针2 5’-TCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACA-3’SEQ ID No.6
探针3 5’-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAC-3’SEQ ID No.7
其中，探针1和探针2序列的5’端分别标记荧光报告基团FAM，3’端分别标记荧光淬灭基团TAMRA；探针3的5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA。
实施例2.检测HIV病毒的体外诊断试剂盒1
一.组成
1.RNA提取试剂：选自Trizol或磁珠法提取试剂中的一种，均含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒：
(1)Trizol：购于Invitrogen公司，含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，由本实验室制备，方法参考公开文献，4℃保存。
(2)磁珠法提取试剂：包含裂解液等多种试剂，购于上海科华生物工程股份有限公司；在其裂解液中含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，由本实验室制备，方法参考公开文献，4℃保存。
2.反应液：由50mM Tris(使用浓度20mM)、125mM KCl(使用浓度50mM)、10mMMgCl2(使用浓度4mM)、500ug/ml BSA(使用浓度200ug/ml)、0.375mM Sorbitol(使用浓度0.15mM)、0.025mM Triton(使用浓度0.01mM)、RNase抑制剂Rnasin 2.5-5U/ul(购于美国Promega公司，使用量为5-10U/人份)，和750μM dNTP(使用浓度300μM)组成，-20℃保存。
3.酶混合物：200U/ul MMLV逆转录酶(购于美国Promega公司，使用量为100-200U/人份)和2.5-5U/ul HotstartTaq DNA聚合酶(购于天根生化科技(北京)有限公司，使用量为2-5U/人份)，-20℃保存。
4.引物和探针混合物：包括引物序列(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)6μM(使用浓度为200nM)、引物探针(SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端荧光淬灭基团TAMRA)6μM(使用浓度为200nM)和内标探针(SEQ ID No.7，5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA)3μM(使用浓度为100nM)，均委托上海基康生物技术有限公司合成，-20℃保存。
病毒样颗粒RNA的制备方法简述如下：基本质粒为pET28b(Novagen公司)，在多克隆位点NcoI和BamHI位点***MS2噬菌体基因组81位-1769位的核酸序列(SEQ IDNo.8)，然后在多克隆位点BamHI位点和HindIII位点***HIV-1病毒GAG基因的335bp片段(SEQ ID No.9)。用本领域常规方法将测序结果证明正确的大肠杆菌克隆进行大量表达。接种内标质粒克隆培养过夜，1∶100转接后继续培养2小时后进行IPTG诱导。培养20小时后离心菌体，超声破菌，离心收集上清，DNase/RNase 37℃消化2小时，电泳。将收集的上清加入0.6g/ml氯化铯，进行超速离心纯化病毒样颗粒，45000rpm×20小时。按照每管400ul进行取样分离，取小样电泳，合并有病毒样颗粒的管进行超声处理液进行透析。再进行一次超离纯化。将透析液中加入0.6g/ml氯化铯，56300rpm×20小时。再按照每管400ul进行取样分离，取小样电泳，合并有病毒样颗粒的管进行超声处理，处理液进行透析即得到了纯化的病毒样颗粒。将纯化后的病毒样颗粒进行定量。
二.使用方法
在30ul反应体系中，加入反应液12ul，酶混合物2ul，引物探针混合物1ul，提取的RNA样本15ul(采用Trizol法或磁珠法提取得到，见实施例4)。
试剂盒1的反应条件为：以7500Real Time PCR System(美国应用生物***公司)进行扩增，反应条件：42℃30分钟95℃，3分钟；95℃，10秒，55℃，20秒，72℃，30秒(5cycles)；95℃，15秒60℃，45秒(50cycles)。
实施例3.检测HIV病毒的体外诊断试剂盒2
一.组成
1.RNA提取试剂：选自Trizol或磁珠法提取试剂中的一种，均含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒：
(1)Trizol：购于Invitrogen公司，含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，由本实验室制备，方法参考公开文献，4℃保存。
(2)磁珠法提取试剂：包含裂解液等多种试剂，购于上海科华生物工程股份有限公司；在其裂解液中含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，由本实验室制备，方法参考公开文献，4℃保存。
2.反应液：由50mM Tris(购于美国Sigma公司，使用浓度20mM)、125mM KCl(购于美国Sigma公司，使用浓度50mM)、10mM MgCl2(购于美国Sigma公司，使用浓度4mM)、500ug/ml BSA(购于美国Sigma公司，使用浓度200ug/ml)、0.375mMSorbitol(购于美国Sigma公司，使用浓度0.15mM)、0.025mM Triton(购于美国Sigma公司，使用浓度0.01mM)、RNase抑制剂Rnasin 2.5-5U/ul(购于美国Promega公司，使用量为5-10U/人份)和750μM dNTP(购于美国Promega公司，使用浓度300μM)组成，-20℃保存。
3.酶混合物：200U/ul Superscript III逆转录酶(购于Invitrogen公司，使用量为50-100U/人份)和2.5-5U/ul Taq Plantium DNA聚合酶(购于天根生化科技(北京)有限公司，使用量为2-5U/人份)，-20℃保存。
4.引物和探针混合物：包括引物序列(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)6μM(使用浓度为200nM)、引物探针(SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端荧光淬灭基团TAMRA)6μM(使用浓度为200nM)和内标探针(SEQ ID No.7，5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA)3μM(使用浓度为100nM)，均委托上海基康生物技术有限公司合成，-20℃保存。
二.使用方法
在30ul反应体系中，加入反应液12ul，酶混合物2ul，引物探针混合物1ul，提取的RNA样本15ul(采用Trizol法或磁珠法提取得到，见实施例4)。
以7500Real Time PCR System(美国应用生物***公司)进行扩增，反应条件：50℃25分钟95℃，3分钟；95℃，10秒，55℃，20秒，72℃，30秒(5cycles)；95℃，15秒60℃，45秒(50cycles)。
实施例4.检测实验
一.材料
采用的标准品为来自于NIBSC(英国国家生物标准化及控制研究所)的HIV-1国际标准品(1*103IU/ml)和国际标准血清盘(含M族A-H亚型，N族，O族和阴性血清)，60份病人血清来自于地坛医院和佑安医院。
二.方法
1.提取RNA：可根据操作习惯采用实施例2和实施例3两种试剂盒中的任何一种：
(1)Trizol法提取RNA：
取高压灭菌的1.5ml离心管，每管加入300ul Trizol(购于Invitrogen公司)，然后分别加入100ul样本，100ul水做为阴性对照，吸头反复吹打混匀，然后加入预冷100ul氯仿，颠倒混匀；13,000rpm，离心15分钟；取灭菌离心管，每管加入200ul预冷异丙醇，取上述上层液相加入异丙醇管中，颠倒混匀；13,000rpm，离心15分钟，吸头吸去上清，加入300ul预冷的75％乙醇，颠倒洗涤，13,000rpm，离心10分钟，用吸头吸去上清，50℃，干燥5分钟，加入DEPC水30ul溶解RNA。
(2)采用上海科华生物工程股份有限公司的磁珠法提取试剂提取核酸：
A在96孔板中每孔加入20ul去抑制剂，加入样本100ul，加入裂解液100ul；
B在科华公司的核酸提取仪上进行第一步反应加热裂解；
C在其他5快板中分别加入磁珠溶液100ul、洗涤液A 200ul、B 200ul、C 200ul以及洗脱液60ul；
D等待第一步结束后放入第二块板(加入了磁珠溶液)吸附磁珠；
E再重新放入第一块板将磁珠和裂解的样本杂交；
F洗涤磁珠，洗涤液A 200ul、B 200ul、C 200ul各一次；
G洗脱核酸于洗脱液60ul中。
2.检测：可根据操作习惯采用实施例2和实施例3两种试剂盒中的任何一种，检测方法见实施例2和实施例3。
三.结果
将60份临床样本加入病毒样颗粒后进行核酸提取后，进行检测，结果显示采用双探针检测体系具有更好的检出率。
表1 60份临床样本的检测临床检测结果
Figure C20061011361300131
实施例4.灵敏度试验
一.方法
将标准品进行梯度稀释，和国际标准血清盘一起采用科华公司的磁珠法提取试剂提取核酸(提取方法同实施例3)，然后进行扩增检测。提取的样本见表2：
表2提取样本列表
  100000   250   250   125   62.5   A   N
  100000   250   250   125   62.5   B   O
  10000   250   125   125   62.5   C   阴性
  10000   250   125   125   62.5   D
  1000   250   125   62.5   62.5   E
  1000   250   125   62.5   62.5   F
  500   250   125   62.5   阴性   G
  500   250   125   62.5   阴性   H
二.结果
结果显示双探针检测试剂盒的检测灵敏度为125IU/ml左右，见图1和表3所示。
表3采用双探针体系时的检测下限结果
Figure C20061011361300141
实施例5.特异性试验
一.方法
国际血清型盘进行型特异性检测。提取扩增方法同实施例4。
二.结果
如图2所示，结果显示采用双探针检测体系时可以检测出M族的A-H亚型和O族，但是采用单探针体系时M族有亚型漏检，N族和O族不能检出。
综上所述，我们发明的一组新的HIV检测序列和试剂盒比国内外HIV-1核酸检测试剂盒具有明显的优越性，适合国内的生产使用。
序列表
<110>***北京医院
<120>快速检测HIV病毒的核苷酸序列、方法及体外诊断试剂盒
<130>
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
acatcaagca gccatgcaaa t        21
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ctatgtcact tccccttggt tctct    25
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
accatcaatg aggaagctgc agaatggg     28
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
gctttcagcc cagaagtaat acc          23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
atttgcatag ctgcttgatg tcc          23
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
tcagcattat cagaaggagc caccccaca    29
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
tcaggccccc tcaaagccga c                                               21
<210>8
<211>1689
<212>DNA
<213>MS2噬菌体基因组81位-1769位的核酸序列
<400>8
atggctatcg ctgtaggtag ccggaattcc attcctagga ggtttgacct gtgcgagctt     60
ttagtaccct tgatagggag aacgagacct tcgtcccctc cgttcgcgtt tacgcggacg    120
gtgagactga agataactca ttctctttaa aatatcgttc gaactggact cccggtcgtt    180
ttaactcgac tggggccaaa acgaaacagt ggcactaccc ctctccgtat tcacgggggg    240
cgttaagtgt cacatcgata gatcaaggtg cctacaagcg aagtgggtca tcgtggggtc    300
gcccgtacga ggagaaagcc ggtttcggct tctccctcga cgcacgctcc tgctacagcc    360
tcttccctgt aagccaaaac ttgacttaca tcgaagtgcc gcagaacgtt gcgaaccggg    420
cgtcgaccga agtcctgcaa aaggtcaccc agggtaattt taaccttggt gttgctttag   480
cagaggccag gtcgacagcc tcacaactcg cgacgcaaac cattgcgctc gtgaaggcgt   540
acactgccgc tcgtcgcggt aattggcgcc aggcgctccg ctaccttgcc ctaaacgaag   600
atcgaaagtt tcgatcaaaa cacgtggccg gcaggtggtt ggagttgcag ttcggttggt   660
taccactaat gagtgatatc cagggtgcat atgagatgct tacgaaggtt caccttcaag   720
agtttcttcc tatgagagcc gtacgtcagg tcggtactaa catcaagtta gatggccgtc   780
tgtcgtatcc agctgcaaac ttccagacaa cgtgcaacat atcgcgacgt atcgtgatat   840
ggttttacat aaacgatgca cgtttggcat ggttgtcgtc tctaggtatc ttgaacccac   900
taggtatagt gtgggaaaag gtgcctttct cattcgttgt cgactggctc ctacctgtag   960
gtaacatgct cgagggcctt acggcccccg tgggatgctc ctacatgtca ggaacagtta  1020
ctgacgtaat aacgggtgag tccatcataa gcgttgacgc tccctacggg tggactgtgg  1080
agagacaggg cactgctaag gcccaaatct cagccatgca tcgaggggta caatccgtat  1140
ggccaacaac tggcgcgtac gtaaagtctc ctttctcgat ggtccatacc ttagatgcgt  1200
tagcattaat caggcaacgg ctctctagat agagccctca accggagttt gaagcatggc  1260
ttctaacttt actcagttcg ttctcgtcga caatggcgga actggcgacg tgactgtcgc  1320
cccaagcaac ttcgctaacg gggtcgctga atggatcagc tctaactcgc gttcacaggc    1380
ttacaaagta acctgtagcg ttcgtcagag ctctgcgcag aatcgcaaat acaccatcaa    1440
agtcgaggtg cctaaagtgg caacccagac tgttggtggt gtagagcttc ctgtagccgc    1500
atggcgttcg tacttaaata tggaactaac cattccaatt ttcgctacga attccgactg    1560
cgagcttatt gttaaggcaa tgcaaggtct cctaaaagat ggaaacccga ttccctcagc    1620
aatcgcagca aactccggca tctactaata gacgccggcc attcaaacat gaggattacc    1680
catgtcgaa                                                            1689
<210>9
<211>335
<212>DNA
<213>HIV-1病毒GAG基因的335bp片段
<400>9
tctccaaggg caaatggtac atcagcccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa     60
agtggtagaa gagaaggctt ttagcccaga agtaataccc atgttttcag gccccctcaa    120
agccgacaga tttaaacacc atgctaaaca cagtgggggg acatcaagca gccatgcaaa    180
tgctaaaaga ttcaggcccc ctcaaagccg acataggcta catccagtgc atgcagggcc    240
tattgcacca ggccaaatga gagaaccaag gggaagtgac atagcaggaa ctactagtaa    300
cctgcaggaa caaatagcat ggatgacggg taacc                               335

Claims (4)

1. 一组检测HIV病毒的核苷酸序列，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7所示碱基序列；其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物对，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物对，SEQ ID No.3、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7分别为探针序列；在一次检测中共同使用。
2. 一种含有双引物、双探针的检测HIV病毒的体外诊断试剂盒，由以下试剂组成：
(一)RNA提取试剂：选自Trizol或磁珠法提取试剂中的一种，均含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒；
(1)Trizol：含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，4℃保存；
(2)磁珠法提取试剂：在其裂解液中含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，4℃保存；
(二)反应液：由50mM Tris、125mM KCl、10mM MgCl2、500ug/ml BSA、0.375mMSorbitol、0.025mM Triton、RNase抑制剂Rnasin 2.5-5U/ul和750μM dNTP组成，-20℃保存；
(三)酶混合物：200U/ul MMLV逆转录酶和2.5-5U/ul HotstartTaq DNA聚合酶，-20℃保存；
(四)引物和探针混合物：包括引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，6μM、引物探针SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端荧光淬灭基团TAMRA，6μM和内标探针SEQ ID No.7，5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA，3μM，-20℃保存。
3. 一种含有双引物、双探针的检测HIV病毒的体外诊断试剂盒，由以下试剂组成：
(一)RNA提取试剂：选自Trizol或磁珠法提取试剂中的一种，均含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒：
(1)Trizol：含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，4℃保存；
(2)磁珠法提取试剂：在其裂解液中含有1000拷贝/ml内标病毒样颗粒，4℃保存；
(二)反应液：由50mM Tris、125mM KCl、10mM MgCl2、500ug/ml BSA、0.375mMSorbitol、0.025mM Triton、RNase抑制剂Rnasin 2.5-5U/ul和750μM dNTP组成，-20℃保存；
(三)酶混合物：200U/ul Superscript III逆转录酶和2.5-5U/ul Taq PlantiumDNA聚合酶，-20℃保存；
(四)引物和探针混合物：包括引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，6μM、引物探针SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端荧光淬灭基团TAMRA，6μM和内标探针SEQ ID No.7，5’端标记荧光报告基团VIC，3’端荧光淬灭基团TAMRA，3μM，-20℃保存。
4. 根据权利要求2或3所述的一种含有双引物、双探针的检测HIV病毒的体外诊断试剂盒，其特征在于：
所述内标病毒样颗粒通过以下方法制得：基本质粒为pET28b，在多克隆位点NcoI和BamHI位点***MS2噬菌体基因组81位-1769位的核酸序列SEQ ID No.8，然后在多克隆位点BamHI位点和HindIII位点***HIV-1病毒GAG基因的335bp片段SEQ IDNo.9，用大肠杆菌表达并纯化。
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实时荧光RT-PCR在HIV母婴传播病例诊断中的应用. 颜苹苹等.海峡预防医学杂志，第10卷第4期. 2004
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