CN100415887C - 一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个棉花组织特异以及病原菌诱导及其应用，属于生物技术领域。启动子含有CAAT-box、TATA-box及乙烯、茉莉酸甲酯、脱落酸应答元件、病原菌诱发子反应元件W boxes、GT-1、MYB、MYBST1和MYB1LEPR等。还存在一些根特异表达元件，增强GUS基因的表达。GUS基因主要在根、蕾、茎的韧皮部、叶片的叶脉以及气孔的保卫细胞中表达，表现为器官特异性表达。石蜡切片观察表明GHNBS启动子在韧皮部伴胞细胞中表达。SA，MeJA，Ethylene，枯萎病病原菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型和细菌丁香假单胞杆菌DC3000处理后GUS活性均有显著上升，是一个器官特异以及病原相关的启动子。

Description

一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子及其应用

一、技术领域

本发明涉及植物基因启动子及其应用，提供了一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子。属于生物技术领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

由真菌、细菌、病毒以及线虫引起的植物疾病为作物生产带来了巨大的影响。植物拥有两套不同的抗性机制：一是被动防御机制，是指一些抗性相关的形态结构，如表皮和坚硬的细胞壁(Brady J.D.，Fry S.Formation of di-isodityrosine and loss of isodityrosinein the cell walls of tomato cell-suspension cultures treated with fungal elicitors or H2O2.PlantPhysiol 1997，115：87-92.)。另外一个是主动防御，主动防御是抗性基因与病原菌识别并且互作所引起的。病原物无毒基因(avr)编码的激发子与寄主植物相应的抗病基因(R)编码激发子的受体分子相作用产生抗病反应。植物抗病防卫反应一般经历信号识别、信号传导、防卫基因表达三个环节。主动防御中所有类型的抗病机制都要依靠防卫基因表达，抵抗的有效性取决于基因表达的时空特性。正是由于防卫基因的时空表达特性，其启动子往往具有某些特殊的顺式作用元件，人们可以利用防卫基因、尤其是其顺式元件为基因工程改良提供有利的工具。植物中绝大部分抗病基因都编码具有核苷酸结合位点以及亮氨酸重复的蛋白(NBS-LRR)，(McHale L，Tan X，Koehl P，MichelmoreRW.Plant NBS-LRR proteins：adaptable guards，Genome Biol.2006，26；7(4)：212)。但是对于这类基因的启动子研究还比较少。

植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，是转录调控的中心。从1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是：它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。

目前，已经找到一些组织特异性或诱导表达启动子，并发现其上存在的相应的顺式因子。为后来的启动子研究奠定了基础。烟草的Sar8.2b基因受水杨酸(SA)诱导，在其启动子上发现了几个顺式作用因子，包括as-1因子、GT21和Dof结合序列。SA诱导Sar812b基因表达可能存在于-728至-927bp和-197至-351bp的区域的顺式因子中(Song F.Goodman R M.Cloning and identification of the promoter of the tobacco Sar8.2bgene.a gene involved in systemic acquired resistance.Gene，2002，290(122)：115～124.)。玉米蔗糖合成酶1只在韧皮部细胞中表达(Yang N S，Russell D.Maize sucrosesynthase-1 promoter directs phloem cell specific expression of Gus gene in transgenic tobaccoplants.Proc Natl Acad Sci 1990，87(11)：4144～4148.)。PsGNS2启动子只在种子中特异表达(Buchner P，Rochat C，Wuilleme S，Boutin J P.Characterization of a tissue-specific anddevelopmentally regulated beta-1，3-glucanase gene in pea(Pisum sativum).Plant Mol Biol2002，49(2)：171～186.)。

棉花是世界重要的经济作物，棉花的真菌病害、细菌病害以及线虫都会造成产量减少以及品质下降。棉花抗病基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。目前为止，棉花抗病基因的启动子的分离及功能研究还未见报道。本发明的发明人先前通过根据NBS-LRR蛋白的保守结构域，通过设计简并引物，从常抗棉中获得了棉花的NBS-LRR基因序列(GENBANK登陆号为：DQ785169)，进而获得了该基因的启动子序列。由于棉花再生体系的困难，一些研究小组采用模式植物烟草(Hsu CY，Creech RG，Jenkins JN，Ma DP.Analysis of promoteractivity of cotton lipid transfer protein gene LTP6 in transgenic tobacco plants.Plant Sci1999；143：63-70.)或拟南芥(Wang S，Wang J W，Yu N，Li Ch H，Luo B，Gou J Y，Wang L J，Chen X Y.Control of Plant Trichome Development by a Cotton Fiber MYB Gene.The PlantCell 2004，16：2323-2334)来对棉花启动子进行分析，其研究结果表明GUS报告基因完全可以在这些模式植物中正常表达。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子，该启动子能够在根、蕾、茎的韧皮部伴胞细胞、叶片的叶脉以及气孔的保卫细胞处表达，还能够被棉花枯萎病病原菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型、丁香假单胞杆菌DC3000所激活，同时，也能被水杨酸、乙烯、茉莉酸甲酯处理所激活。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病、抗虫性状及抗非生物逆境。

技术方案

本发明所提供的一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子pGHNBS，来源于陆地棉(Gossypium hirsutum)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(15mM NaCl，1mM NaH₂PO₄，0.1mM EDTA)、0.1×SSC(15mM NaCl，1.5mM柠檬酸钠)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由1600个碱基组成。自5’端第1532位碱基为转录起始位点，记为+1。

其中TATA框位于转录起始位点上游的-39至-34位碱基，而CAAT框位于-136至-139位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。

自5’端第-1460至-1455位，-1360至-1355位碱基为水杨酸诱导或光诱导元件ASF1；自5’端第-1424至-1419位，-566至-561位，-550至-545位碱基为根特异表达元件OSE1ROOTNODULE；自5’端第-1052位，-767位，-441位，-420位，-186位，-121位，-1149位，-875位，-349位，-1200位，-881位，-469位，-333位，-100位碱基为水杨酸或光诱导元件GT1CONSENSUS；自5’端第-1168位，-920位，-860位，-531位碱基为增强子元件EECCRCAH1；自5’端第-1052位，-767位，-100位碱基为病原菌诱导表达元件GT-1；自5’端第-1065位碱基为抗病基因表达元件MYB1LEPR；自5’端第-1503位，-1160位，-1144位，-926位，-905位，-672位，-238位为ABA诱导表达元件；自5’端第-1248位，-181位，-919位，-530位碱基为糖响应元件WBOXHVISO1；自5’端第-612位，-182位，-1465位，-1359位，-918位，-234位碱基为水杨酸诱导元件WBOXATNPR1。GHNBS启动子pGHNBS的序列分析结果表明GHNBS基因在棉花抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。

本发明提供了含有本发明启动子的表达载体和宿主菌以及扩增启动子任一片段的引物。

本发明一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子pGHNBS，拟南芥转基因证明发现pGHNBS能赋予GUS基因在植物根、蕾、茎的韧皮部、叶片的叶脉以及气孔的保卫细胞中高效表达，表现出器官特异表达模式，进一步研究确认pGHNBS启动子在韧皮部的伴胞细胞中特异表达。并且转基因植株受到SA，MeJA，Ethylene，枯萎病菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型和丁香假单胞杆菌DC3000诱导后GUS活性均有显著上升，说明pGHNBS含有相应的应答反应因子。pGHNBS在模式植物中的表达特征表明其是一个器官特异以及病原相关的启动子。pGHNBS的功能研究可为揭示GHNBS的表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于棉花抗病、抗虫基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果

1.本发明获得了一个全新的棉花病原菌诱导启动子。棉花是世界重要的经济作物，棉花的真菌病害、细菌病害以及线虫都会造成产量减少以及品质下降。棉花抗病基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。但是到目前为止，还没有分离出任何棉花抗病基因的启动子。本发明获得的GHNBS基因的启动子是一个全新的启动子，BLAST显示没有同源性。并且通过转化拟南芥分析，发现此启动子在受到病原菌和SA等诱导后表达量显著上调，说明此启动子是一个病原菌诱导启动子。

2.本发明首次获得了一个棉花病原菌相关组织特异表达启动子。从1983年第一株转基因植物问世以来，获取合适有效的启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。目前作物转基因改良中使用最多的是来源于花椰菜花叶病毒的启动子p35S，这类启动子虽然可以使目的基因高效表达，但是它们启动的外源基因在受体植物中是非特异性的持续、高效表达，不仅造成浪费，而且有可能产生负面效果(Song P，Heinen JL.，BurnsTH.，Allen RD.Expression of Two Tissue-Specific Promoters in Transgenic Cotton Plants.The Journal of Cotton Science 2000；4：217-223)。而特异表达或诱导表达的启动子可以克服这些缺陷，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。本发明中的启动子pGHNBS是一个组织特异表达的棉花启动子。组织特异表达以及病原菌诱导启动子可以应用于农业生物育种和基因工程以提高作物抗病、抗虫性状和其他生产形状的改良。

3.表达有效。在启动子序列上存在3个增强元件，它们可能增强目的基因的表达。GUS染色和活性测定也结果表明这个启动子启动的目的基因的表达量较高，能够满足基因工程改良作物性状的要求。

4.更好了解抗病基因的作用机制及用于抗病育种。虽然目前有一些抗病基因被克隆出来，但是对抗性机制的了解还不是很深入。抗病基因一般是受外界调控表达的，而植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物基因的启动子是重要的顺式作用元件，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。通过对启动子进行分析，可以了解抗病基因的表达模式甚至相关的反式作用因子，进而了解抗病基因的作用机制与机理。而构建的重组载体可以方便地应用于作物抗病育种。

四、附图说明

图1-1559bp～-28bp启动子区域转化拟南芥植株后的GUS染色结果。A：解剖镜下完整植株的GUS染色结果；B：解剖镜下根的GUS染色结果；C：解剖镜下叶的GUS染色结果；D：解剖镜下茎部表达的横截面图；E：显微镜下叶片的染色结果；F：叶片的进一步放大结果，可以明显看出GUS在气孔的保卫细胞中表达；G：解剖镜下花蕾的GUS染色结果。

图2-1559bp～-28bp启动子区域转拟南芥植株的茎部石蜡横截面图。GUS基因主要在伴胞中表达。

图3启动子-1559bp～-28bp区段转拟南芥植株受到病原菌等诱导后的GUS活性测定。CK为对照；SA为水杨酸；MJ为茉莉酸甲酯；ethylene为乙烯；DC3000为番茄的细菌病原菌丁香假单胞杆菌；Fusarium为棉花的枯萎病致病菌病病原菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海博亚生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验所用的陆地棉(Gossypium.hirsutum)品种均为常抗棉(陆郝胜，濮伟新，皇甫国华，殷惠玉，戴新.高耐落叶型黄萎病新品种-常抗棉.中国棉花1997；11：26-27.)，拟南芥品种为哥伦比亚型(Lin X，Kaul S，Rounsley S，Shea TP，Benito MI，Town CD，Fujii CY，Mason T，BowmanCL，Barnstead M，Feldblyum TV，Buell CR，Ketchum KA，Lee J，Ronning CM，Koo HL，Moffat KS，Cronin LA，Shen M，Pai G，Van Aken S，Umayam L，Tallon LJ，Gill JE，AdamsMD，Carrera AJ，Creasy TH，Goodman HM，Somerville CR，Copenhaver GP，Preuss D，Nierman WC，White O，Eisen JA，Salzberg SL，Fraser CM，Venter JC.Sequence and analysisof chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana.Nature 1999；16；402(6763)：761-8.)。棉花与拟南芥都在培养箱中生长。光照强度为130μmol photons m^-2s^-1，湿度为65％。

一：棉花GHNBS基因启动子pGHNBS的克隆以及序列分析

根据一个具有CC-NBS-LRR结构域的棉花抗性相关基因GHNBS(GENBANK登陆号为：DQ785169)设计了3个反向引物(5′-AATTGCAGCTCATCCTGAAGTGATTG-3′；5′-CCACGAATCAACTGAACTTGTTTTGC-3′；5′-CGGTTATTATAGATACAATGGCTTCC-3′)用来获得基因的5’末端。参照Paterson等的方法(Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF.A rapid method for extraction cotton(Gossypium spp.)Genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.Plant Mol Biol Rep1993；11：122-7.)提取常抗棉叶片的核基因组DNA，分别用限制性内切酶HindIII、DraI对所提取的核基因组DNA进行酶解。然后用染色体步行法克隆棉花抗性相关基因GHNBS的启动子序列。采用clontech公司的GenomeWalker^TM试剂盒并按试剂盒说明书进行操作，具体方法为：首先将上述经不同限制性内切酶酶解后产生的不同长度的DNA片段连接各自相应的接头，得到带有接头的基因组DNA文库；然后以含有接头的基因组DNA文库作为模板，在外侧接头引物AP1：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′和外侧基因特异引物GSP1：5′-AATTGCAGCTCATCCTGAAGTGATTG-3′的引导下，进行第一轮PCR扩增；再以第一轮PCR扩增产物为模板，在内侧接头引物AP2：5′-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3′和内侧基因特异引物GSP2：5′-CCACGAATCAACTGAACTTGTTTTGC-3′的引导下，进行第二轮的PCR扩增。第二轮PCR扩增结束后，用维特洁公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T Easy中(Promega公司)，转化E.coli JM109(大连宝生物公司)感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由ABI310DNA测序仪完成(Applied Biosystem Inc.，Foster City，TX，USA)。结果以DraI酶解的棉花核基因组DNA片段库为模板，经过两轮PCR扩增后，获得一个长度为1.6kb的DNA片段，具有序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。与已克隆的GHNBS的cDNA序列进行比较，结果该1.6kb的DNA片段含有GHNBS cDNA序列5’端编码区的69个核苷酸，即5’端编码区部分重叠，表明所克隆到的长度为1.6kb的DNA片段就是目标基因GHNBS的启动子序列，将该启动子命名为pGHNBS。而将上述含有pGHNBS的重组载体命名为pGEM-T Easy-pGHNBS。将用5’-RACE法扩增分离到的GHNBS cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点，即序列表中SEQ ID NO.1自5’端的第575位碱基。

用PLACE(Higo K，Ugawa Y，Iwamoto M，Korenaga T.Plant cis-acting regulatoryDNA-elements(PLACE).Nucl Acids Res 1999；27：297-300.)和PlantCARE(Lescot M，Déhais P，Thijs G，Marchal K，Moreau Y，Van de Peer Y，RouzéP，Rombauts S.PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis ofpromoter sequences.Nucl Acids Res 2002；30：325-7.)软件对棉花抗性相关基因GHNBS的启动子的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID NO.1)进行序列分析。用上述软件对GHNBS基因启动子pGHNBS中的顺式作用元件进行搜索、预测，结果该启动子中含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列。其中，将用5’-RACE法扩增分离到的GHNBS cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点(记为+1)，即序列表中SEQ IDNO.1自5’端的第1532位碱基，其中TATA框位于转录起始位点上游的-39至-34位碱基，而CAAT框位于-136至-139位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。自5’端第-1460至-1455位，-1360至-1355位碱基为水杨酸诱导或光诱导元件ASF1(DespresC，Chubak C，Rochon A，Clark R，Bethune T，Desveaux D，Fobert PR.The Arabidopsis NPR1disease resistance protein is a novel cofactor that confers redox regulation of DNA bindingactivity to the basic domain/leucine zipper transcription factor TGA1.Plant Cell 2003；15：2181-2191.)；自5’端第-1424至-1419位，-566至-561位，-550至-545位碱基为根特异表达元件OSE1ROOTNODULE(Vieweg MF，Fruhling M，Quandt HJ，Heim U，BaumleinH，Puhler A.Kuster H，Andreas MP.The promoter of the Vicia faba L.leghemoglobin geneVfLb29 is specifically activated in the infected cells of root nodules and in the arbuscule-containing cells of mycorrhizal roots from different legume and nonlegume plants.Mol PlantMicrobe Interact 2004；17：62-69.)；自5’端第-1052位，-767位，-441位，-420位，-186位，-121位，-1149位，-875位，-349位，-1200位，-881位，-469位，-333位，-100位碱基为水杨酸或光诱导元件GT1CONSENSUS(Villain P，Mache R，Zhou DX Themechanism of GT element-mediated cell type-specific transcriptional control。J Biol Chem1996；271：32593-32598)；自5’端第-1168位，-920位，-860位，-531位碱基为增强子元件EECCRCAH1(Kucho K，Yoshioka S，Taniguchi F，Ohyama K，Fukuzawa H.Cis-actingelements and DNA-binding proteins involved in CO2-responsive transcriptional activation ofCah1 encoding a periplasmic carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol2003；133：783-793.)；自5’端第-1052位，-767位，-100位碱基为病原菌诱导表达元件GT-1(Park HC，Kim ML，Kang YH，Jeon JM，Yoo JH，Kim MC，Park CY，Jeong JC，MoonBC，Lee JH，Yoon HW，Lee SH，Chung WS，Lim CO，Lee SY，Hong JC，Cho MJ.Pathogen-and NaCl-induced expression of the SCaM-4 promoter is mediated in part by a GT-1 box thatinteracts with a GT-1-like transcription factor.Plant Physiol 2004；135：2150-2161.)；自5’端第-1065位碱基为抗病基因表达元件MYB1LEPR(Chakravarthy S，Tuori RP，DAscenzoMD，Fobert PR，Despres C，Martin GB The tomato transcription factor Pti4 regulates defence-related gene expression via GCC box and non-GCC box cis elements Plant Cell 2003；15：3033-3050)；自5’端第-1503位，-1160位，-1144位，-926位，-905位，-672位，-238位为ABA诱导表达元件(Abe H，Urao T，Ito T，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-ShinozakiK.Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcriptional activatorsin abscisic acid signaling。Plant Cell 2003；15：63-78)；自5’端第-1248位，-181位，-919位，-530位碱基为糖响应元件WBOXHVISO1(Sun C.，Palmqvist S.，Olsson H.，Boren M.，Ahlandsberg S.，Jansson C.A novel WRKY transcription factor，SUSIBA2，participates insugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the iso1 promoter，Plant Cell 2003；15：2076-2092)；自5’端第-612位，-182位，-1465位，-1359位，-918位，-234位碱基为水杨酸诱导元件WBOXATNPR1(Yu D，Chen C，Chen Z Evidence for animportant role of WRKY DNA binding proteins in the regulation of NPR1 gene expression.Plant Cell 2001；13：1527-1540)。GHNBS启动子pGHNBS的序列分析结果表明GHNBS基因在棉花抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。

表1GHNBS启动子序列中的调控元件分析

序列<sup>①</sup>	位置	名称和功能	参考文献
				TGACG	-1460(-)，-1360(-)	ASF1，水杨酸诱导或光诱导	Despres C，Chubak C，Rochon A，Clark R，Bethune T，DesveauxD.Fobert PR.The Arabidopsis NPR1 disease resistance proteinis a novel cofactor that confers redox regulation of DNA bindingactivity to the basic domain/leucine zipper transcription factorTGA1.Plant Cell 15：2181-2191(2003)
AAAGAT	-1419(+)，-561(+)，-545(-)	OSEIROOTNODULE，根结特异表达元件	Vieweg MF，Fruhling M，Quandt HJ，Heim U，Baumlein H，Puhler A.Kuster H，Andreas MP.The promoter of the Vicia fabaL.leghemoglobin gene VfLb29 is specifically activated in theinfected cells of root nodules and in the arbuscule-containingcells of mycorrhizal roots from different legume and nonlegumeplants.Mol Plant Microbe Interact. 17：62-69(2004)
				GGATA	-934(+)，-249(+)-1200(-)，-474(-)	MYBST1，转录激活	Baranowskij N，Frohbetg C，Prat S，Willmilzer L A novel DNAbinding protein with homology to Myb oncoproteins conrainingonly one repeat can function as a transcriptional activator EMBOJ 13：5383-5392(1994)
GRWAAW	-1052(+)，-767(+)，-441(+)，-420(+)，-186(+)，-121(+)，-1149(-)，-875(-)，-349(-)，-1200(-)，-881(-)，-469(-)，-333(-)，-100(-)	GT1CONSENSUS，水杨酸诱导或光诱导	Villain P，Mache R，Zhou DX The mechanism of GT element-mediated cell type-specific transcriptional control，J Biol Chem271：32593-32598(1996)
				GANTTNC	-1168(+)，-920(-)，-860(-)，-531(-)	EECCRCAH1，增强子	Kucho K，Yoshioka S，Taniguchi F，Ohyama K，Fukuzawa H.Cis-acting elements and DNA-binding proteins involved in CO2-responsive transcriptional activation of Cahl encoding aperiplasmic carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol.133：783-793(2003).
GAAAAA	-1052(+)，-767(+)，-100(-)	GT-1motif.病原菌诱导	Park HC，Kim ML，Kang YH，Jeon JM，Yoo JH，Kim MC，ParkCY，Jeong JC，Moon BC，Lee JH，Yoon HW，Lee SH，ChungWS，Lim CO，Lee SY，Hong JC，Cho MJ，Pathogen-and NaCl-induced expression of the SC aM-4 promoter is mediated in partby a GT-1 box that interacts with a GT-1-like transcription factorPlant Physiol.135：2150-2161(2004)
				CNGTTR	-1228(+)，-614(+)，-452(+)，-379(+)，-429(-)，-1282(-)	MYBCORE，	Urao T.Yamaguchi-Shinozaki K，Urao S.Shinozaki K AnArabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress andits gene product binds to the conserved MYB recognitionsequence Plant Cell 5：1529-1539(1993)
GTTAGTT	-1065(+)	MYBILEPR，抗病基因表达元件	Chakravarthy S.Tuori RP，DAscenzo MD，Fobert PR，DespresC.Martin GB The tomato transcription factor Pti4 regulatesdefence-related gene expression via GCC box and non-GCC box

			cis elements Plant Cell 15：3033-3050(2003)
				CANNTG	-1503(+)，-1160(+)，-1144(+)，-926(+)，-905(+)，-672(+)，-238(+)	MYCCONSENSUSAT，ABA诱导	Ahe H，Crao T.I to T.Seki M.Shinozaki K，Yamaguchi-Shi nozaki K.Arabidopsis AtMYC2(bliLll)andAtMYB2(MYB)function as transcriptional activatorsin abscisic acid signaling.Plant Cell 15：63-78(2003)
ATATT	-1314(+)，-1195(+)，-1059(+)，-1039(+)，-1005(+)，-296(+)，-1356(-)，-1315(-)，-1006(-)，-657(-)，-279(-)，-206(-)	ROOTMOTIFTAPOX1，根特异	Elmayan T.Tepfcr M Evaluation in tobacco of theorgan speeifieity and strength of the rol Dpromoter，domain A of the 35S promoter and the 35S 2promoter Transgenic Res 4：388-396(1995
				WAACCA	-1068(-)，-316(-)	MYBIAT，ABA识别位点	Abe H，Urao T.Ito T.Seki M.Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki Arahidopsis AtMYC2(bliLll)andAtMYB2(MYB)function as transcriptional activatorsin abscisic acid signaling Plant Cell 15：63-78(2003)
TGACT	-1248(+)，-181(+)，-919(-)，-530(-)	WBOXHVISOI，糖响应元件	C.Sun，S.Palmqvist，H Olsson.M.Boren，S.Ahlandsberg，CJansson.A novel WRKY transcription factor，SUS1BA2.participates in sugar sigmaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the isol promoter，Plant Cell 15(2003)2076-2092
				TTGAC	-612(+)，-182(+)，-1465(-)，-1359(-)，-918(-)，-234(-)	WBOXATNPR1，水杨酸诱导	Yu D，Chen C，Chen Z Evidence for an important role of WRKYDNA binding proteins in the regulation of NPR1 gene expressionPlant Cell 13：1527-1540(2001)

①N代表A，C，G或T；R代表A或G；W代表A或T；

二.构建GHNBS启动子序列与GUS基因融合的重组载体并转化拟南芥

为检测启动子在以常抗棉DNA为模板，用正向引物(5′-CGAAGCTTATACGACACACTTAAAAGGAATG-3′带下划线碱基为限制性内切酶HindIII识别位点)和反向引物(5′-CCGGATCCACTAATTTGCCTTGTTATTTCAGA-3′，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)扩增启动子片段，获得序列SEQID NO.1的片段-1559bp～-28bp区域，并在序列两段分别添加上限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物用HindIII和BamHI进行酶切，与经相同酶双酶切的植物表达载体pBI101.1(Clontech公司)连接。将以上获得的启动子片段连接在β-葡聚醛酸酶(GUS)基因的上游5’端获得重组载体，命名为pBI-pGHNBS::GUS，用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404。用花浸染方法(Clough S J，Bent A F.FIoral dip：A Simplified Method for Agrobacterium-Mediated Transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J 1998；16：735-743)转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法进一步检测转基因植株。收获转基因工程植株种子。

将转基因工程植株种子播种于含有40mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于启动子功能以及特征研究。将转基因株系植株进行组织化学染色以检测GUS基因的表达位置和特征。

三：GUS活性的组织化学定位分析和荧光定量测定

GUS活性的组织化学定位分析方法为：

取步骤二在温室中生长的pBI-pGHNBS::GUS拟南芥转基因幼苗全株，将植株根部洗净。参考Jefferson等的荧光组织化学定位法(Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions：p-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J 1987；6：3901-7.)测定GUS活性，具体方法为：GUS组织化学染色以5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-Dglucuronic acid(X-Gluc)作为底物。将整株拟南芥用90％的丙酮充分脱色处理后，浸泡在GUS反应液中(含50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，10mmol/L EDTA，2mmol/L铁***，2mmol/L亚铁***，2.0mmol/L X-gluc及0.2％Triton X-100)，37℃温育1～3天，直至着色达到足够强度。再将拟南芥植株用70-100％系列乙醇脱色以去掉叶绿素，最后解剖镜下镜检。GUS组织化学染色的结果如图1所示，在转基因植株中，GUS基因在根部的表达很强(图1B)，在茎、蕾和叶片中也都有表达，其中在叶片中的表达局限在叶脉中(图1C)，表现为维管束特异表达。进一步观察转基因植株茎部的横截面，发现GUS基因只在韧皮部表达(图1D)；在显微镜下观察，发现在叶片中，GUS基因除了在叶脉中表达外，还在气孔中表达(图1E)；进一步放大，发现GUS基因是在气孔的保卫细胞中表达(图1F)；在蕾中的表达也局限在维管束中(图1G)。上述GUS荧光组织化学定位结果表明了GHNBS基因在植物体内的表达为组织特异性表达。GHNBS启动子上存在9个在根中特异表达的元件，它们可能GUS基因根特异高效表达的基础。

利用荧光定量法进行测定GUS基因活性，GUS基因以4-methylumbelliferylglucuronide作为作用的底物产生有荧光的产物4-甲基伞形酮(4-MU)，通过检测产物的荧光强度来检测GUS基因的活性大小。GUS活性以每毫克可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-MU为单位。

具体方法为：将转基因拟南芥叶片约0.2克左右用液氮研磨，然后将匀浆悬浮于GUS提取缓冲液(含50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，0.1％Triton X-100，10mM B-巯基乙醇，10mM EDTA以及0.1％SDS)中，在12,000g、4℃离心10min后收集上清。取适量上清样品加入到反应缓冲液(含50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，0.1％Triton X-100，10mM β-巯基乙醇，10mM EDTA，0.1％SDS，5mM 4-MUG)中充分混匀，于37℃温育。用1M Na₂CO3终止反应。用SHIMADZU RF-5301PC荧光光度计测定产物中4-MU的含量。参照Bradford的方法(Bradford MM.A rapid and sensitivemethod for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding.Anal Biochem 1976；72：248-54.)对提取液中的蛋白质进行浓度定量，用牛血清白蛋白(BSA)作标准曲线。

四：GUS染色后茎部的石蜡切片

维管束组织包括木质部和韧皮部两部分，而韧皮部的主要组分包括筛管和伴胞。为了进一步确认GUS基因的表达位置，将转基因拟南芥植株GUS组织化学染色后，对其茎部进行石蜡切片观察。由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。用70％、80％、90％、95％和100％各级乙醇溶液脱水各30min。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯过渡。用纯酒精与二甲苯等量混合液以及纯二甲苯溶液透明处理各30min，再换一次二甲苯。用新鲜的石蜡液体进行渗蜡和包埋。手动切片机切片，最后用1％的番红对木质化的细胞壁及细胞核进行染色以呈现整个茎部横截面区域。显微镜下镜检检测。结果发现木质部和筛管没有GUS基因表达而呈现的蓝色，蓝色染色区域位于伴胞中(图2)，红色的区域是被番红染色的木质化的细胞壁及细胞核。这些说明GHNBS基因的启动子主要在韧皮部的伴胞中表达。

五：检测pGHNBS转基因植株对病原菌以及植物激素的诱导反应

取在温室中生长约3周的T2代pBI-pGHNBS::GUS拟南芥转基因幼苗做各种处理。分别用番茄的致病菌丁香假单胞杆菌DC3000(Buell CR，Joardar V，Lindeberg M，etal.The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudomonassyringae pv.tomato DC3000.Proc Natl Acad Sci U S A 2003：2；100(18)：10181-6)、棉花真菌性枯萎病病原菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vesinfectum)(吴蔼民，顾本康，傅正擎，夏正俊.棉花品种(系)抗枯、黄萎病性鉴定.中国种业1999(1)：29～30)以及水杨酸SA、茉莉酸甲酯和乙烯这三种植物激素处理拟南芥幼苗，并设置未处理和伤处理对照。检测不同转基因株系不同处理前后GUS活性的大小。其中DC3000在含有50mg/L利福平的LB液体培养基中过夜培养；枯萎病病原菌在马铃薯葡萄糖培养基(5％马铃薯汤液，1％葡萄糖)上25℃培养3天，离心收集菌体并用蒸馏水重悬，采用伤诱导法接菌，接种病原菌后3天取植株叶片进行分析；激素的处理方法为：用浓度为200uM的SA直接喷洒拟南芥幼苗；用浓度为200PPM的乙烯直接喷洒拟南芥幼苗。茉莉酸甲酯的处理方法为：在一个密闭的20L的容器中，放置一个蘸有200ul 0.5％(w/v)茉莉酸甲酯的棉花球。所有激素处理时间均为36h。

经上述不同处理的转基因植物的GUS活性分析结果如图3所示，其中DC3000处理后的转基因植株的GUS活性是未处理的6.55倍。枯萎病病原菌处理后转基因株系GUS表达量增加3倍，这说明启动子中存在病原菌诱导元件。SA，MJ处理后的转基因植株的GUS活性分别是未处理的4.25和5.02倍。乙烯处理后GUS活性增加3.51倍。

这些结果说明GHNBS启动子是受到病原菌、SA(水杨酸)，MeJA(茉莉酸甲酯)，Ethylene(乙烯)诱导的，其上存在相应的应答元件。是一个器官特异以及病原相关的启动子。序列分析表明其上存在2个AS-1增强子元件。

我们发现相当一部分病原菌相关蛋白(PR)的表达模式与GHNBS的相似：即维管束特异表达以及受植物激素诱导表达。如来源于烟草的PRB-1b表现为维管束特异表达，并且在受到乙烯诱导以后表达量增加了20倍(Eyal Y，Meller Y，Lev-Yadun S，FluhrR.A basic-type PR-1 promoter directs ethylene responsiveness，vascular and abscission zone-specific expression.Plant J1993，4(2)：225～234)。马铃薯的PR-1b基因在气孔的保卫细胞，腺毛以及叶片的维管束组织中特异表达(Erika Hoegen，Anita 

UllaPihlgren and Erich  Kombrink.Primary structure and tissue-specific  expression of thepathogenesis-related protein PR-1b in potato.Molecular Plant Pathology 20023：5，329-345)。拟南芥AtPRB1只在花器官、茎和根中表达，在成熟叶片中不表达。并且在乙烯和茉莉酸甲酯诱导后，表达量迅速上升(Santamaria M.，Thomson C J.，Read N D.，Loake G J.The promoter of a basic PR1-like gene，AtPRB1，from Arabidopsis establishes anorgan-specific expression pattern and responsiveness to ethylene and methyl jasmonate.PlantMolecular Biology 2001，47：641-652.)。蔗糖转运子AtSUC2的启动子受线虫诱导并主要在伴胞中表达。(Hoth S，Schneidereit A，Lauterbach C，Scholz-Starke J，Sauer N.Nematode infection triggers the de novo formation of unloading phloem that allowsmacromolecular trafficking of green fluorescent protein into syncytia.Plant Physiol 2005，138(1)：383-92.)。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子及其应用

<130>说明书

<140>00

<141>2006-06-20

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1600

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum(陆地棉)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1536)

<223>

<400>1

agtggagtag caaaggaaag gaacagatgg agggacctgt catacgacac acttaaaagg    60

aatgcaacgt caatggcgat gcctaattgt tacttacagc aggttccaaa gatttgttcc    120

accacgcgtg aaggaatcag attcgactgc tcccaactta catgcaacgt caatatcaat    180

cctcatataa agctgattaa aagttgattt ttaatattaa gaatagcatc ccattcacct    240

cccataacag tgatcatttt gtaacatttt aaagttaagt gactaaaaca taaatttact    300

gttaatttag tgatcttgga tgtaatttat ccatatttat gttacatgca cggtgaagac    360

ttcctgcatt tgggaacatt ttcacttgtc tttctttact tcattcttgt actttaatct    420

atctcaacca agattaagat tctgtatgtt gagaactttg gttagtttat atttgaaaaa    480

aattattgat attattaaaa aaaataacta taaatttaaa aaatattaaa aacatgtaca    540

accaaaacat ctattttaaa tgaagcattt cgaaagcgaa tttgattaaa aaaggatagc    600

catgtgaaag tcaactttga gcatgtgaac aacttattga aatcatttat cattttcaat    660

tagttgaaag tcctaaattt attttttaaa aatcggtttg tttaaaacta aggtgttgat    720

agaataagta tttaattaaa tgcattattt ttagtgtaag aaaaataata attcagtatg    780

ccatgtaatt gatgtggtac gattaagttc gagcaacaaa tcgaaaggag gcggtttttg    840

ggcatgctat agggcatttg gttccgtaca aatatgcaaa taagtttaaa tgtaattttg    900

atggggccct ctctgttgac agtgggtatt cggggtgaat ttgtgcggtg catctcgagt    960

tttataaaga tcgcaaagtc catctttctg cggtggaagt catgtctact catcattgct    1020

ttattgaaag caaactactt tgaatgtatt tcttatcctg ttttatcatt catactgtta    1080

atgttgataa attgttacaa caggatgaaa ataagatagg acttagaaaa gggtgtattg    1140

ggtaagccgg ttgatttgga tttaatctgt accacttatt ttcattttgt tttcttttta    1200

tcagttttac tggtttaatg aatttgattt tatatttaaa aaaaatcaaa tataaatgtt    1260

tagttgccat cagcattagg atatcaacca catgtcaagc atgattgctt aatttgattt    1320

aaatatatat aataataaat gaaaattgac tttttggttg gatgataaca tcacttatgt    1380

aagctaaaat tgcaatttaa aatcagaaaa tgaaatcctc gagttctttt tcattcatac    1440

tttcataaat tcaactatag ttaataatag atcataaatg cagtccagtt tcttataata    1500

aaaaaacaag gtaggtctta aattcttata aatgcaagca gtccagtttc tgaaataaca    1560

aggcaaatta gttttctgag tgactaaaaa gttagggagc                          1600

Claims (4)

1. 一个棉花组织特异以及病原菌诱导启动子，是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，该启动子能够使目的基因在根、蕾、茎的韧皮部伴胞细胞、叶片的叶脉以及气孔的保卫细胞处表达。

3. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，该启动子能够被病原菌激活，或者在用水杨酸、乙烯、茉莉酸甲酯处理时能被激活。

4. 权利要求1～3之一所述启动子在植物品质改良及植物抗性改良中的应用。

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