CN100415886C

CN100415886C - 利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促进植物在逆境条件下的生长

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Publication number: CN100415886C
Application number: CNB2005100195975A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 侯昕
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2025-10-17
Also published as: CN1952141A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、功能验证及其在转基因水稻中的应用。所述的DNA片断包含水稻逆境诱导的核蛋白基因OsSKIP1，它赋予植物在逆境和/或正常条件下的生长速度显著提高的能力。将代表该基因的DNA片段与外源启动子结合后直接转入植物体，转基因植物在正常和逆境条件下的生长速度比对照显著提高。

Description

利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促进植物在逆境条件下的生长

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域.具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用.所述的基因OsSKIP1与植物生长有关.将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)结合后直接转入水稻，转基因植株在逆境条件下的生长速度显著提高；而通过RNAi技术抑制内源基因OsSKIP1的表达则显著降低植株生长速度.

背景技术

植物的生长速度除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响，其中一些不利的非生物逆境(如干旱、高温、低温或盐害等)往往限制了植物正常生长，从而造成作物减产.非生物逆境在许多地区是农业发展的瓶颈，因此，培育抗逆性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一.为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等，Cell signaling during cold，drought andsalt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002).而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到调控因子的精细调节.转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果.Kawasaki等(2001)利用表达芯片分析了水稻在高盐胁迫下的早期表达谱，发现有大量的基因能被诱导或抑制，这些基因的诱导表达受到了转录因子的调节参与(Kawasaki S，Borchert C，Deyholos M，Wang H，Brazille S，KawaiK，Galbraith D and Bohnert H J.Gene expression profiles during the initial phase of salt stressin rice.Plant Cell，13：889-905，2001).而在拟南芥中发现AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP类转录因子家族在不同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制(Shinozaki等，Monitoring the Expression Patternof 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray.Plant Cell，13：61-72，2001).因而认为这些转录因子家族在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的调控作用.因此分离和鉴定对逆境起核心调控作用的转录因子，并用于作物抗逆境的遗传改良有着重要的意义.根据已有的拟南芥转录因子的信息，人们已在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南芥植株，其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(Liu Q等，Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell，10：1391-1406，1998).美国Michigan州立大学的Thomashow MF研究小组利用拟南芥CBF1基因，进行遗传转化，也培育出耐寒性增强的植株(Jaglo-Ottosen等，Arabidopsis CBF1 overexpression induces CORgenes and enhances freezing tolerance.Science，280(5360)：104-106，1998).近年来，通过遗传转化其它类型的转录因子来提高植物的抗逆性的报道也不少，如拟南芥NAC基因(Tran等，Isolation andfunctional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to adrought-responsive cis-element in the earlyresponsive to dehydration stress 1 promoter.Plant Cell，16：2481-2498，2004)，水稻锌指蛋白基因OSISAP1(Mukhopadhyay等，Overexpression of a zinc-fingerprotein gene from rice confers tolerance to cold，dehydration，and salt stress in transgenic tobacco.Proc Natl Acad Sci USA，101：6309-6314，2004).

这些已经报道的转录调控基因所介导的抗逆性通常是使植物对极端逆境的耐受能力增强，但对于逆境条件下植物生长速度的影响还无详细研究.由于植物在遭受逆境胁迫时生长往往受阻(如水稻在孕穗期遭受干旱胁迫会延迟抽穗)，甚至暂时停止生长，这是植物避开不利环境的自我保护机制.但是，这种逆境导致的生长减缓往往使植物体变小、生育期延长从而使产量降低.因此，植物抗逆性遗传改良不仅要增强植物对极端逆境的耐受能力，更为重要的是要把植物在逆境条件下的生长受阻降低到最低程度.

水稻是最重要的粮食作物之一，培育抗逆水稻新品种具有重要意义.在我们的前期研究中分离到一条受干旱诱导的cDNA，序列分析表明它与人类和动物中的SKIP(Ski-interacting protein)蛋白有一定的相似性.SKIP可能是一个起核心作用的核蛋白，通过它与众多不同的核蛋白互作来实现对基因组的表达调控(Scott等，CHES1/FOXN3 interacts with Ski-interacting protein and acts as a transcriptional repressor.Gene，359：119-126，2005；Leong等，Ski-interacting protein interacts with Smad proteins to augmenttransforming growth factor-beta-dependent transcription.J Biol Chem.276：18243-8，2001；Prathapam等，Ski interacts with the evolutionarily conserved SNW domain of Skip.Nucleic Acids Res.229：3469-76，2001).目前在植物中尚无SKIP同源基因的报道.因此，从水稻中分离出SKIP同源基因并鉴定它对水稻在非生物逆境条件下的生长速度的影响，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要意义.

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含核蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段，利用该基因提高水稻或其它植物在逆境和/或正常条件下的生长速度.对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与人类和动物中的SKIP(Ski-interacting protein)蛋白有一定的相似性，因此被命名为OsSKIP1.

本发明涉及分离和应用一种包含OsSKIP1基因的DNA片段，该片段赋予植物(例如水稻)在在正常和逆境条件下的生长速度加快的能力.其中，所述片段如序列表SEQID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段.

可以采用已经克隆的OsSKIP1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsSKIP1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA.采用以上技术，可以分离得到包含OsSKIP1基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得在正常和逆境条件下的生长速度加快的转基因植株.本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译.

携带有本发明OsSKIP1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2^nd Edition).

可使用包括本发明的OsSKIP1基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱，抗盐或抗寒的植物品种.

本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下的生长速度.

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明.

附图说明

序列表SEQ ID No：1显示的是本发明分离克隆的包含有OsSKIP1基因编码区和启动子区的DNA片段序列.

图1：是本发明利用ClustalW软件(公开使用软件)将OsSKIP1基因预测的蛋白序列与SKIP同源蛋白序列进行比对的结果.

图2：是本发明利用RT-PCR检测OsSKIP1基因在不同组织中的的表达水平.图中：1.分蘖期的根；2.剑叶；3.茎；4.短于1cm的幼穗；5.3-5cm的幼穗；6.长于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.发芽3天的幼苗；3周的幼叶；10.3周的幼苗；11.3周的黄化苗.

图3：是本发明的OsSKIP1基因的启动子控制的GUS报告基因在转基因水稻中的表达情况.其中：A为对照植株；B：为转基因植株；C为对照植株D：为转基因植株

E：为对照植株；F为转基因植株；G：为对照植株；H转基因植株

I：上为对照植株；I：下为转基因植株；J：为转基因植株愈伤时期的GUS染色图.

图4：是本发明的RNAi转基因植株T1代种子无菌条件下在含125μM G418(一种在植物转基因筛选中使用的商品化的抗生素)的生根培养基上发芽(经PCR检测，G418上能发芽的均为转基因阳性)，对照(野生型中花11)三天后在不含抗生素的生根培养基上发芽，长到大小基本一致移栽.图为其中一个RNAi转基因植株(S59R)和对照(ZH11)的生长曲线.

图5：是本发明在水培条件下10个代表性OsSKIP1抑制表达转基因家系(T1)的生长速度(生长天后的株高和鲜重).其中1号家系为转基因阴性.

图6：是本发明在水培条件下代表性OsSKIP1超量表达转基因家系(T1)和对照的生长速度比较.

图7：是本发明在不同逆境条件下5个OsSKIP1超量表达转基因家系(T1)和对照的生长速度比较.

图8：本发明的超量表达载体OsSKIP1pCAMBIA1301的结构示意图.将本发明实施实例中用到的启动子CaMV35S***pCAMBIA1301多克隆位点EcoRI和SacI处，再将OsSKIP1全长基因***该启动子后.

图9：本发明的抑制表达载体OsSKIP1’pHellsgate2的结构示意图.将OsSKIP1的一段特异序列重组到抑制表达载体pHellsgate2上.

图10：本发明的启动子表达载体OsSKIP1PpCAMBIAI1391Z载体结构示意图.将OsSKIP1的启动子***pCAMBIAI1391Z的多克隆位点.

具体实施方式

本发明的前期工作获得了来源于水稻品种“明恢63”(一种中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)的cDNA克隆V2CHIP15006.该cDNA是OsSKIP1基因的cDNA片段，是一个影响植物生长速度的SKIP同源基因.主要依据有以下几个方面：(1)采用cDNA芯片技术分析发现cDNA克隆V2CHIP15006在水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)干旱胁迫处理15天后表达量增加2.1倍.对其进行测序，分析发现其编码产物与人蛋白SKIP同源性高达62.3％，且含有保守的SNW结构域(图1)，据此将此基因命名为OsSKIP1.(2)对其进行逆境条件下的表达谱分析，发现在胁迫处理的过程中，表达量有明显的提高，RT-PCR(图2)和启动子表达活性分析(图3)表明OsSKIP1在不同组织中均有一定表达量.(3)通过RNAi技术抑制水稻内源基因OsSKIP1的表达，转基因植株与对照植株相比，其生长速度大大降低((图4，图5)；而将其全长基因在植株中超量表达后，转基因植株与对照植株相比，无论在正常生长条件还是在逆境条件下其生长速度都显著要快(图6，图7).这些结果都表明OsSKIP1基因不仅是水稻中一个新的SKIP同源基因，并且可用于调控植物的生长速度.

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsSKIP1基因完整编码区段的DNA片段以及验证OsSKIP1基因功能的方法.根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件.

实施例1：分离克隆包含有OsSKIP1基因区段的DNA片段和OsSKIP1基因

通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱诱导(干旱胁迫后期表达量提高2.1倍)的EST(表达序列签)，经序列分析发现，该基因(OsSKIP1)编码产物与人蛋白SKIP有62.3％同源性，并且是5’端部分序列.通过查找日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J013098N03，并将其定位于第2染色体BAC克隆AP004159的34212 bp-36565bp上.根据BAC克隆AP004159中OsSKIP1对应的基因组序列，预测其启动子区域，并设计引物PF(5’-TAGGTACCGATCGCGTTGCCCAAATAATTAC，见序列表SEQ ID NO：1所示，该序列特异引物外加接头KpnI位点)和PR(5’-TAGGATCCCAGAACACGGAATTTATGTATC，见序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列特异引物外外加接头BamHI)，将BAC克隆AP004159的34212bp-36581bp从“明恢63”(一个中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)的总DNA中扩增出来.扩增产物就是本发明的序列1-2351bp.具体步骤为：提取水稻品种“明恢63”叶片中的总DNA(CTAB法抽提，参照文献：Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，Theor Appl Genet，83，495-499，1992)作为模板进行扩增，反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环；72℃延伸5min.将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪)，获得所需的包含有OsSKIP1基因的DNA片段.该克隆命名为pGEM-OsSKIP1.

采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号”中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第-链，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min.用上述引物(PF和PR)扩增出OsSIPK1基因的全长cDNA.PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min.将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因cDNA.该克隆命名为pGEM-OsSKIP1c.

实施例2，OsSKIP1基因抑制表达、超量表达以及启动子表达载体的构建和转化

为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中抑制表达和超量表达，从转基因植株的表型来验证；同时也将其启动子融合于GUS报告基因后转化水稻，检测其活性.

抑制表达(RNAi)载体构建方法如下：本发明如图9所示：首先用RNAi引物V15006F：(5’-CACCGACTCTGGGTTTGCTACAG)和V15006R(5’-AAGATGCCCCTTGGAAGTAGA)以从实施例1获得的克隆pGEM-OsSKIP1c为模板扩增出OsSKIP1基因的特异片段(572bp).反应条件为：94℃预变性2min；94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min.将该片段亚克隆到pGEM-T载体上.再用引物ALLF(5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G)和ALLR(5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TAT AG)从带有该片段的pGEM-T载体上扩增出一条可供重组到pHellsgate2载体上的片段(622bp).PCR条件同上.重组反应按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行.pHellsgate2是已公开发表的专门用于RNAi载体构建的载体(Wesley等，Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing inplants.Plant J，27：581-590，2001).

超量表达载体构建方法如下：如图8所示：首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsSKIP1质粒用BamHI和KpnI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带不同启动子的遗传转化载体pC1301S酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(按体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物.用包含OsSKIP1基因的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司).通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体.遗传转化的载体pC1301S是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(其构建见图8，其原始载体来自澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture]实验室)基础上，在酶切位点EcoRI和SacI处引入广泛使用的组成型表达的CaMV 35S启动子而得到的.

启动子与报告基因的融合载体构建方法如下：如图10所示：OsSKIP1启动子序列通过引物5’-TAAAGCTTTGTTTGTGCTTTTGGAG和5’-TAAGAATTCTTTGGTTCGATTCGTGTAAT，见序列表SEQ ID NO：2所示(扩增产物对应NCBI数据库中BAC克隆AP004159的36566-37565bp)，以水稻品种明恢63的基因组DNA为模板扩增获得；通过HindIII和EcoRI将OsSIPK1启动子序列酶切后连接到国际上常用的植物启动子活性检测载体pCAMBIA1391Z(来自澳大利亚CAMBIA实验室)中的GUS报告基因前面.

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素或G418抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株.农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6：271-282，1994)基础上改良进行.

具体步骤：(1)愈伤诱导：将成熟的水稻种子(水稻品种“中花11”)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃.(2)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃.(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃.(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，温度28℃；将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时.(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃.(6)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次培养2周(第一次筛选用400ppm羧苄青霉素+250ppm潮霉素，第二次以后为250ppm羧苄青霉素以+250ppm潮霉素).(7)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周.转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃.

(8)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃.(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

上述步骤的培养基如下所述：

试剂配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(激动素或称细胞***素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2、4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml.

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

室温下溶解并定容至1000ml.

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用.

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用.

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

室温下溶解并定容至1000ml.

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml.

7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml.

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml.

9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml.

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌.

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100K) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌.使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿).

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，lN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌.使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿).

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌.使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液.

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌.使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿).

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌.使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿).

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0.煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌.

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8.煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌.

将OsSKIP1抑制表达的转基因水稻植株分别命名为S59-N(其中S59为pHellsgate2-OsSKIP1载体，含有组成型启动子CaMV 35S，N独立转化植株的编号)；将OsSKIP1超量表达的转基因水稻植株分别命名为S60-N(S60为pC1301S-OsSKIP1载体，含有组成型启动子CaMV 35S)；将OsSKIP1启动子与GUS报告基因的融合载体的转基因水稻植株分别命名为S61-N(S61为pCAMBIA1391-OsSKIP1-P载体，含有OsSKIP1启动子和GUS报告基因).每个转化载体获得了至少30株独立的转基因水稻植株，本发明总共获得独立转基因水稻植株101株.

实施例3：检测水稻内源基因OsSKIP1的表达水平

以水稻品种“明恢63”为材料，提取不同生长时期的组织的RNA用RT-PCR检测OsSKIP1基因的表达水平.选取的10种组织分别是：1.分蘖期的根；2.剑叶；3.茎；4.短于1cm的幼穗；5.3-5的幼穗；6.长于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.发芽3天的幼苗；10发芽3周的幼叶；11.3周的黄化苗.总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成eDNA第一链(方法根据反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃ 5min，42℃ 50min，70℃10min.以eDNA第一链为模板，采用引物(5’-GACTCTGGGTTTGCTACAG和5’-AAGATGCCCCTTGGAAGTAGA)PCR扩增出OsSKIP1基因的特异片段(572bp).采用引物(AF：5’-GCGTCGACTCCACTCTCGC和AR：5’-CCATGAAACAAATCCAACAACA)扩增出的水稻Actin1基因的特异片段(1400bp)以作为内对照进行定量分析.反应条件为：94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min.将扩增出的OsSKIP1基因及Actin1基因的特异带的亮度进行比较，并以Actin1基因的特异带的亮度为标准进行均一化后比较不同组织中OsSKIP1基因的表达量.结果表明：OsSKIP1基因在所选取的组织中均有一定量的表达，但以黄化苗和幼穗中表达量相对较高(图2).

启动子活性分析：将OsSKIP1基因启动子序列通过引物5’-TAAAGCTTTGTTTGTGCTTTTGGAG和5’-TAAGAATTCTTTGGTTCGATTCGTGTAAT(扩增产物对应NCBI数据库中BAC克隆AP004159的36566-37565bp)从水稻品种明恢63扩增获得后，通过HindIII和EcoRI将OsSKIP1启动子序列酶切后连接到国际上常用的植物启动子活性检测载体pCAMBIA1391Z(由澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture]实验室提供)的GUS报告基因前面并通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11中.对转基因植株不同组织和器官进行GUS染色.染色液配方：pH＝7.0的0.1M磷酸钠缓冲液20mL，0.5M EDTA溶液1mL，Trion X-100 0.5 mL，亚铁***(Pataxium ferrocyamide)425mg，铁***(Pataxium ferricyamide)33mg，氯霉素(Chloramphenicol)5mg，X-Gluc 50mg，甲醇溶液10mL，加水至50mL).取新鲜的转化植株的不同组织器官浸泡于GUS染液中置于37℃恒温箱中过夜.脱色后(脱色液使用70％的乙醇)过夜后观察并拍照记录.GUS染色情况(图3)表明：OsSKIP1基因启动子具有组成型表达活性，这与RT-PCR的结果是一致的.

实施例4：OsSKIP1抑制表达转基因T₁家系的生长速度

本发明选取了10个OsSKIP1表达受明显抑制的T₁家系进行生长速度的测定.具体步骤如下：每个T₁代家系选取30-40粒种子在含有G418抗生素的水溶液(50mg/ml)中浸种，去除不发芽种子(不含转基因的种子).将转基因和野生型对照(水稻品种中花11)发芽后5天的幼苗水培种植在90×60×20cm³的培养盒中，培养盒上盖有92×62cm²大小的木盖，木盖上钻有均匀分布的96个孔，每孔种一棵苗，用海绵固定植株.水培的营养液成份如下：N：40ppm；P：10ppm；K：40ppm；Ca：40ppm；Mg：40ppm；Mn：0.5ppm；Mo：0.05ppm；B：0.2ppm；Zn：0.01ppm；Cu：0.01ppm；Fe：2ppm.母液配方如下：

1、NH₄NO₃：914g/10L

2、NaH₂PO₄-2H₂O：403g/10L

3、K₂SO₄：714g/10L

4、CaCl₂：886g/10L

5、MgSO₄-7H₂O：3240g/10L

6、MnCl₂-4H₂O：15g，(NH₄)6Mo₇O₂₄-4H₂O：0.74g，H₃BO₃：9.34g，ZnSO₄-7H₂O：0.35g，CuSO₄-5H₂O：0.31g，FeCl₃-6H₂O：77g，(CH₂O)₁₁：119g.分别溶解后与500ml浓硫酸混合，定容至10L.

水培时，每3970mL水中加上述母液各5mL.

每家系种植8单株，随即区组设计，三次重复(每个盒中设置对照).在发芽后的第8，14，20，26，45天时小心45取出秧苗测量植株高度和鲜重.随后将45天的秧苗移栽到大田，按水稻生产上的正常的栽培管理，考查抽穗期和单株产量.图4是一个代表性转基因家系和对照的苗期生长曲线；图5是10个转基因家系和对照在水培45天后的株高和鲜重比较.结果表明：OsSKIPl抑制表达的转基因植株的生长显著地受到抑制.

实施例5：OsSKIP1超量表达转基因T₁家系在不同环境条件下的生长速度

本发明选取了5个OsSKIP1超量表达T₁家系进行了不同条件下生长速度的测定.具体步骤如下：每个T₁代家系选取100-150粒种子在含有潮霉素抗生素的水溶液(50mg/ml)中浸种，去除不发芽种子(不含转基因的种子).将转基因和野生型对照(水稻品种中花11)发芽后5天的幼苗水培种植.水培种植方法同实施例4.与实施例4不同的是，除了正常生长实验外还设置了三个逆境处理实验：缺水胁迫(发芽后第10天加入PEG6000，终浓度10％)，盐胁迫(发芽后第10天加入NaCl，终浓度100mM)和低温处理(发芽后第10天移入低温生长箱，昼温10℃保持16小时并且光照充足，夜温6℃保持8小时无光照).四个生长条件下的生长实验均按随即区组设计，三次重复(每个盒中设置对照)，每个重复中每家系种植8单株.在发芽后的第8，14，20，26，45天时小心取出秧苗测量植株高度和鲜重.随后将45天的秧苗移栽到大田，按水稻生产上的正常的栽培管理，考查抽穗期和单株产量.图6是5个代表性转基因家系和对照的苗期生长曲线；图7是5个转基因家系和对照在不同逆境条件下生长45天后的植株鲜重比较.结果表明：OsSKIP1超量表达的转基因植株的生长不论在正常条件还是在逆境胁迫处理下都要显著地优于对照，说明OsSKIP1基因的表达不仅对水稻生长具有促进作用，而且还可以缓解逆境条件造成的植株生长受阻.

SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促进植物在逆境条件下的生长

<130>

<141>2005-10-13

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2351

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2351)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(2330)..(2351)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(23)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(132)..(1955)

<223>

<400>1

gatcgcgttg cccaaataat tacacgaatc gaaccaaacc ctagcttttc ctcttcgatt 60

cccgatcccc cacccagcga ctcgccggaa ccctagccct agatcccgcg cggcttgccg 120

ccgtgctagc c atg gcg tcc ctc aag gag ctc ctc ccg acg ccc aag gcg 170

Met Ala Ser Leu Lys Glu Leu Leu Pro Thr Pro Lys Ala

1 5 10

gcg gcg tcg acg ttc tac gac cac agc agc gac ccg tgg ttc aag gag 218

Ala Ala Ser Thr Phe Tyr Asp His Ser Ser Asp Pro Trp Phe Lys Glu

15 20 25

cgg tat ggc ggg gag tcg gcg caa tcc gac gcg gcg gcg gcg gcg gcg 266

Arg Tyr Gly Gly Glu Ser Ala Gln Ser Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala

30 35 40 45

aag cct tcg ggc ccc gcc aag ccc gtg ccg ccg tat ggg aag cgt ggc 314

Lys Pro Ser Gly Pro Ala Lys Pro Val Pro Pro Tyr Gly Lys Arg Gly

50 55 60

ggg ttc gtg ccg cgg cgg ccg gag gac ttc ggc gac ggc ggc gcc ttc 362

Gly Phe Val Pro Arg Arg Pro Glu Asp Phe Gly Asp Gly Gly Ala Phe

65 70 75

ccg gag atc cac gtc gcg cag tac ccg ctc ggc atg ggc cgg cgc gac 410

Pro Glu Ile His Val Ala Gln Tyr Pro Leu Gly Met Gly Arg Arg Asp

80 85 90

gag aag ggc ggt tcg aag atc ctc gcg ctc acc gtc gac gcc aag ggc 458

Glu Lys Gly Gly Ser Lys Ile Leu Ala Leu Thr Val Asp Ala Lys Gly

95 100 105

agc gtc gcc ttc gac gcc gtc gtg aag cag ggt gag aac gcc tct aag 506

Ser Val Ala Phe Asp Ala Val Val Lys Gln Gly Glu Asn Ala Ser Lys

110 115 120 125

atc gtt tac tca aag cac agc gac ctc gtg ccc aag att gcc acg gct 554

Ile Val Tyr Ser Lys His Ser Asp Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Ala

130 135 140

gat tcc gag gca acc gcg gac gac gag gag tac cag aaa cag atc gaa 602

Asp Ser Glu Ala Thr Ala Asp Asp Glu Glu Tyr Gln Lys Gln Ile Glu

145 150 155

aaa acc act gaa cga act aaa gct gcc ttg gag aag ggt gtc aat gtt 650

Lys Thr Thr Glu Arg Thr Lys Ala Ala Leu Glu Lys Gly Val Asn Val

160 165 170

cgg ttt ttc gcc gac aag cca aag aat gtg cca acg cat gat tca aag 698

Arg Phe Phe Ala Asp Lys Pro Lys Asn Val Pro Thr His Asp Ser Lys

175 180 185

tca aag ttt atc aag tat aag cca tcg cag caa tcg gca gcc ttc aat 746

Ser Lys Phe Ile Lys Tyr Lys Pro Ser Gln Gln Ser Ala Ala Phe Asn

190 195 200 205

tca ggt gcc aag gaa agg att att agg atg tca aag atg gtt aag gat 794

Ser Gly Ala Lys Glu Arg Ile IleArg Met Ser Lys Met Val Lys Asp

210 215 220

cct ctt gag cca ccg aaa ttc aag cat aag cga gtg ccc cgc gct tct 842

Pro Leu Glu Pro Pro Lys Phe Lys His Lys Arg Val Pro Arg Ala Ser

225 230 235

gga tca ccg cct gtc cca gtg atg cac tcg cca cca cgg cca gtg aca 890

Gly Ser Pro Pro Val Pro Val Met His Ser Pro Pro Arg Pro Val Thr

240 245 250

gtg aag gac cag caa gat tgg aag att cca cca tgc att tca aat tgg 938

Val Lys Asp Gln Gln Asp Trp Lys Ile Pro Pro Cys Ile Ser Asn Trp

255 260 265

aaa aat cca aag ggt tac acc ata cca ctc gac aag agg ttg gca gct 986

Lys Asn Pro Lys Gly Tyr Thr Ile Pro Leu Asp Lys Arg Leu Ala Ala

270 275 280 285

gat gga agg ggg ctg cag gag gtt caa att aat gat aac ttt gca aag 1034

Asp Gly Arg Gly Leu Gln Glu Val Gln Ile Asn Asp Asn Phe Ala Lys

290 295 300

ctc tct gaa gca ctg tat gtg gcg gag cag aag gcc agg gag gca gta 1082

Leu Ser Glu Ala Leu Tyr Val Ala Glu Gln Lys Ala Arg Glu Ala Val

305 310 315

cag atg cga tcc aag gtg cag agg gag ctg cag ctg aag gag aag gag 1130

Gln Met Arg Ser Lys Val Gln Arg Glu Leu Gln Leu Lys Glu Lys Glu

320 325 330

agg aag gag caa gag cta agg gca ctt gca cag aag gcg cgc atg gag 1178

Arg Lys Glu Gln Glu Leu Arg Ala Leu Ala Gln Lys Ala Arg Met Glu

335 340 345

agg act ggt gcc cca cct gca cct aca ggg gtt cct gct ggt ggt ggt 1226

Arg Thr Gly Ala Pro Pro Ala Pro Thr Gly Val Pro Ala Gly Gly Gly

350 355 360 365

aga ggt gct gtt ggt gac agg gag gaa gat atg gat ttg gag cag cct 1274

Arg Gly Ala Val Gly Asp Arg Glu Glu Asp Met Asp Leu Glu Gln Pro

370 375 380

cgt gag caa cga agg ggg agt aga gaa gaa agg gaa gca agg att gag 1322

Arg Glu Gln Arg Arg Gly Ser Arg Glu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Glu

385 390 395

cgt gac agg att cgt gag gag agg aga cgt gag agg gag aga gag agg 1370

Arg Asp Arg Ile Arg Glu Glu Arg Arg Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg

400 405 410

agg ctg gag gcc agg gat gct gca atg ggc aag aag agt aag ctc act 1418

Arg Leu Glu Ala Arg Asp Ala Ala Met Gly Lys Lys Ser Lys Leu Thr

415 420 425

aga gac agg gat cgt gat gtc agt gag aag att gcc ctg ggc atg gca 1466

Arg Asp Arg Asp Arg Asp Val Ser Glu Lys Ile Ala Leu Gly Met Ala

430 435 440 445

agc act ggc ggt gct aaa ggt ggg gaa gtc atg tat gac cag agg ttg 1514

Ser Thr Gly Gly Ala Lys Gly Gly Glu Val Met Tyr Asp Gln Arg Leu

450 455 460

ttc aac cag gat aaa gga atg gac tct ggg ttt gct aca gat gat cag 1562

Phe Asn Gln Asp Lys Gly Met Asp Ser Gly Phe Ala Thr Asp Asp Gln

465 470 475

tat aac atc tac tcc aag ggt ctc ttc aca gcg cag cca acg cta tcc 1610

Tyr Asn Ile Tyr Ser Lys Gly Leu Phe Thr Ala Gln Pro Thr Leu Ser

480 485 490

aca ctt tac agg ctt aag aag gac ggt gat tct gat gtg tat ggc gat 1658

Thr Leu Tyr Arg Leu Lys Lys Asp Gly Asp Ser Asp Val Tyr Gly Asp

495 500 505

gca gat gaa caa ctg gag aag gtt atg aag aca gat agg ttc aaa cca 1706

Ala Asp Glu Gln Leu Glu Lys Val Met Lys Thr Asp Arg Phe Lys Pro

510 515 520 525

gac aaa gga ttt tct ggt gct tca gag agg tct gga aag aga gac aga 1754

Asp Lys Gly Phe Ser Gly Ala Ser Glu Arg Ser Gly Lys Arg Asp Arg

530 535 540

cct gtg gag ttt gat aaa cag gag gag aat gat ccc ttc ggt ctt gat 1802

Pro Val Glu Phe Asp Lys Gln Glu Glu Asn Asp Pro Phe Gly Leu Asp

545 550 555

cag ttc ttg act gaa gtg aag aag ggg aag aaa gct gtt gag aag att 1850

Gln Phe Leu Thr Glu Val Lys Lys Gly Lys Lys Ala Val Glu Lys Ile

560 565 570

gga agc gga gga gcc atg agg gca agt ggt gga tcc tca atg aga gat 1898

Gly Ser Gly Gly Ala Met Arg Ala Ser Gly Gly Ser Ser Met Arg Asp

575 580 585

gat tac gag ggt gga gga tct ggg agg tcc cgc att aac ttt gaa aga 1946

Asp Tyr Glu Gly Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Ile Asn Phe Glu Arg

590 595 600 605

ggt cgt tga ggtattagat ctgcatgttt tgttcagaag tttctccatg 1995

Gly Arg

cattccaaat gttatctgga gggtattctg ttgagaatat caacttcttg atgagagaag 2055

gacttgatgt ctgagttgtc ttaatgcaac gtctacttcc aaggggcatc ttaagggtgg 2115

gcgccctacc ctgctttttg accaagtggc attatagctt gttgtttatc tatttgtgga 2175

tggatctgta agcttaactt atcatcattc catatccctt atattttgtg gtgctttatg 2235

aagtctcgat gtgtctggct gaccttacat tttctggtac tgtaccaagt ctttaagatg 2295

tatctgccta tctggctgaa atactgagac acgggataca taaattccgt gttctg 2351

<210>2

<211>607

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Ser Leu Lys Glu Leu Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Asp His Ser Ser Asp Pro Trp Phe Lys Glu Arg Tyr Gly

20 25 30

Gly Glu Ser Ala Gln Ser Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Pro Ser

35 40 45

Gly Pro Ala Lys Pro Val Pro Pro Tyr Gly Lys Arg Gly Gly Phe Val

50 55 60

Pro Arg Arg Pro Glu Asp Phe Gly Asp Gly Gly Ala Phe Pro Glu Ile

65 70 75 80

His Val Ala Gln Tyr Pro Leu Gly Met Gly Arg Arg Asp Glu Lys Gly

85 90 95

Gly Ser Lys Ile Leu Ala Leu Thr Val Asp Ala Lys Gly Ser Val Ala

100 105 110

Phe Asp Ala Val Val Lys Gln Gly Glu Asn Ala Ser Lys Ile Val Tyr

115 120 125

Ser Lys His Ser Asp Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Ala Asp Ser Glu

130 135 140

Ala Thr Ala Asp Asp Glu Glu Tyr Gln Lys Gln Ile Glu Lys Thr Thr

145 150 155 160

Glu Arg Thr Lys Ala Ala Leu Glu Lys Gly Val Asn Val Arg Phe Phe

165 170 175

Ala Asp Lys Pro Lys Asn Val Pro Thr His Asp Ser Lys Ser Lys Phe

180 185 190

Ile Lys Tyr Lys Pro Ser Gln Gln Ser Ala Ala Phe Asn Ser Gly Ala

195 200 205

Lys Glu Arg Ile Ile Arg Met Ser Lys Met Val Lys Asp Pro Leu Glu

210 215 220

Pro Pro Lys Phe Lys His Lys Arg Val Pro Arg Ala Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

Pro Val Pro Val Met His Ser Pro Pro Arg Pro Val Thr Val Lys Asp

245 250 255

Gln Gln Asp Trp Lys Ile Pro Pro Cys Ile Ser Asn Trp Lys Asn Pro

260 265 270

Lys Gly Tyr Thr Ile Pro Leu Asp Lys Arg Leu Ala Ala Asp Gly Arg

275 280 285

Gly Leu Gln Glu Val Gln Ile Asn Asp Asn Phe Ala Lys Leu Ser Glu

290 295 300

Ala Leu Tyr Val Ala Glu Gln Lys Ala Arg Glu Ala Val Gln Met Arg

305 310 315 320

Ser Lys Val Gln Arg Glu Leu Gln Leu Lys Glu Lys Glu Arg Lys Glu

325 330 335

Gln Glu Leu Arg Ala Leu Ala Gln Lys Ala Arg Met Glu Arg Thr Gly

340 345 350

Ala Pro Pro Ala Pro Thr Gly Val Pro Ala Gly Gly Gly Arg Gly Ala

355 360 365

Val Gly Asp Arg Glu Glu Asp Met Asp Leu Glu Gln Pro Arg Glu Gln

370 375 380

Arg Arg Gly Ser Arg Glu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Glu Arg Asp Arg

385 390 395 400

Ile Arg Glu Glu Arg Arg Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Arg Leu Glu

405 410 415

Ala Arg Asp Ala Ala Met Gly Lys Lys Ser Lys Leu Thr Arg Asp Arg

420 425 430

Asp Arg Asp Val Ser Glu Lys Ile Ala Leu Gly Met Ala Ser Thr Gly

435 440 445

Gly Ala Lys Gly Gly Glu Val Met Tyr Asp Gln Arg Leu Phe Asn Gln

450 455 460

Asp Lys Gly Met Asp Ser Gly Phe Ala Thr Asp Asp Gln Tyr Asn Ile

465 470 475 480

Tyr Ser Lys Gly Leu Phe Thr Ala Gln Pro Thr Leu Ser Thr Leu Tyr

485 490 495

Arg Leu Lys Lys Asp Gly Asp Ser Asp Val Tyr Gly Asp Ala Asp Glu

500 505 510

Gln Leu Glu Lys Val Met Lys Thr Asp Arg Phe Lys Pro Asp Lys Gly

515 520 525

Phe Ser Gly Ala Ser Glu Arg Ser Gly Lys Arg Asp Arg Pro Val Glu

530 535 540

Phe Asp Lys Gln Glu Glu Asn Asp Pro Phe Gly Leu Asp Gln Phe Leu

545 550 555 560

Thr Glu Val Lys Lys Gly Lys Lys Ala Val Glu Lys Ile Gly Ser Gly

565 570 575

Gly Ala Met Arg Ala Ser Gly Gly Ser Ser Met Arg Asp Asp Tyr Glu

580 585 590

Gly Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Ile Asn Phe Glu Arg GIy Arg

595 600 605

<210>3

<211>1450

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1450)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1431)..(1450)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(19)

<223>

<400>3

tttgtttgtg cttttggagg gtgacatgtg gcgctttctc ttttgctcgc tccttttctc 60

tgagtaccac ctgtgtgtgt ggtgtggttt cgcattcttt ggatggatct actttcattt 120

tcattcttct ttttctggta caattatact ccctgtaact gtagtcctgt accatgcaat 180

ttaactgtag cataattcgt attctagaag attttggcct gttaaaatac aaacaaattg 240

atagtgtccg tagtacatgt ggagtagtat gtgctgccca tttagatcga gttgtctggg 300

tacttccacg ccaccatttt ttccaagtcc ataaaatatt ttctatttat tttagtacgg 360

cagattttca ttcgctagcc aaccatagaa ctgacacatt acataggcac tttctctttt 420

tcctgggata atacattaac atttggggta acattttcta gtggaccaaa aattttgtcg 480

gctggtaaca cggcctttga gaaggcccag tactgcaggt ataccattcc gtccggtctc 540

cagcccgctt ccttacgttg tacttagtag gataatttgg gctggcacag taagtaggcc 600

tagcattttc accgaccacg cgcgtgggcc tggctgggtg gtgacaatgt gtgtcatgtg 660

gagcccaaat tggcagatta aactcgtgtt agcaagcgaa attaatgggc ccacttgtca 720

gtctcattta ttctcgttaa acaaacaggc aaacattccg agccgttaat accgtagcct 780

cgttactcgt tactcactcc gtccaaaaaa aaataaatct aaaatataga atgtgacata 840

tcctagtaga acgaatctgg acatatgtat gtccagattt attgtactag gaagtactat 900

gttggttttt tatgagacgg agggagtagc cattacccgt gcagacaagc atggctccgt 960

tcgagcagga gagattgctg ggagattgag gagaaaacat ctacttttct acgcgcacac 1020

ttcccaaact actaaacgat gcgtttttgg caaaaaaaaa ttcttttgaa aagttgtttt 1080

aaaaaatcat attaatctat ttttaaaact tacaatagtt aatactcaat taataataca 1140

ctaatggctc acctcacctt attttgcgta tcttctcaat cccctctttc ctatcctctc 1200

aggattcaac ccagttatca tcatcaccag tattaatagt ttccagccca aggaattatt 1260

ttgtttcgga ctagaagtct cagacacgat ggtatttgct tcggattggc taaggatttg 1320

gtgcatattt atcggcccag cccaaattct tatcgggcct agcccatccg gtagccgcca 1380

taaccccacc ggccaccgtg gtcagcttct cttatcgcgt tgcccaaata attacacgaa 1440

tcgaaccaaa 1450

Claims

1. 一个分离克隆的OsSKIP1基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第1-2351位所示。

2. 权利要求1所述的OsSKIP1基因编码的蛋白质，它是序列表SEQ ID NO：1中第132-1955位所示的读码框编码的氨基酸序列。

3. 赋予水稻在逆境和/或正常条件下生长速度加快的基因，它是序列表SEQ ID NO：1中第1-2351位所示的核苷酸序列。

4. 权利要求1或3所述的基因在促进水稻在逆境和/或正常条件下生长中的应用。

5. 权利要求2所述的蛋白质在促进水稻在逆境和/或正常条件下生长中的应用。