CN100415765C

CN100415765C - 兔单克隆抗体的人源化方法

Info

Publication number: CN100415765C
Application number: CNB038271109A
Authority: CN
Inventors: F·J·R·D·柯特
Original assignee: Epitomics Inc
Current assignee: Epitomics Inc
Priority date: 2003-08-07
Filing date: 2003-08-07
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2023-08-07
Also published as: AU2003259718A1; CA2533830A1; WO2005016950A1; EP1651659A1; JP2007520991A; US20050033031A1; CN1839144A; EP1651659A4

Abstract

本发明提供了一种对兔单克隆抗体进行人源化的方法。总体上看，这种方法包括把兔亲本抗体的氨基酸序列与类似的人抗体的氨基酸序列进行比较，改变兔亲本抗体的氨基酸序列，这样，兔亲本抗体的构架区在序列上更接近于类似人抗体的对应构架区。在很多实施方案中，不属于互补决定区接触残基、链间接触残基或隐蔽残基的兔亲本抗体中的氨基酸不加以修饰。本发明还提供了编码目标抗体的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及制备目标抗体的方法。目标抗体、核酸组合物以及试剂盒具有多种用途，包括诊断、临床治疗以及疾病和不适的研究。

Description

兔单克隆抗体的人源化方法

技术领域

本发明的领域属于抗体，特别是对兔单克隆抗体进行人源化的方法。

背景技术

由于单克隆抗体能靶向实质上任何具有某种特异性的分子，因此，单克隆抗体及其缀合物和衍生物都将可能成为未来的一种主要的治疗剂。尽管人们早已认识到这种可能性，但是为了实现这种可能性进行的第一次尝试却以失败而告终，其主要原因是，即使是治疗中使用的单克隆抗体仅以单一低剂量注射一次(Dillman，Cancer Biother 19949：17-28)，单克隆抗体也会在患者体内产生强烈的免疫反应(Schroff，1985 Cancer Res 45：879-85，Shawler.J Immunol 1985135：1530-5)。科学家们预言，人抗体不会产生这种不良的免疫反应，但目前的杂交瘤技术还无法产生人单克隆抗体。此后，其它一些可替代性的制备人抗体的技术已经陆续面世，例如使用噬菌体展示(Phage display)和转基因动物。然而，啮齿类动物抗体已经具备了良好的实用性和充分表征的抗原特异性，因此，我们仍然有必要设计出能够克服啮齿类动物抗体免疫原性的手段。此外，某些有用的抗原结合特性可能极为罕见，而且很难或是根本不可能在啮齿类动物免疫***之外重现。

抗体的免疫原性取决于多种因素，其中包括施用方法、注射的次数、剂量、结合反应性能、所采用的特异性片段、抗原的聚集状态以及抗原的性质(例如，Kuus-Reichel，Clin Diagn Lab Immunol 19941：365-72)。在这些因素中，很多或者绝大多数都是可以控制的，从而达到降低免疫反应的目的，但是，如果最初的抗体序列属于“危险性”或是“异质性”的，那么，迟早都会出现强烈的免疫反应，进而制约了抗体在治疗中的应用。

嵌合抗体的工程化使啮齿类动物的FV片段与人的FC片段结合在一起(例如，Boulianne Nature 1984312：643-6)，使得在治疗中利用人类效应器结构域(Clark，Immunol Today 200021：397-402)成为可能的同时，大幅度地降低了免疫原性问题(例如，LoBuglio，ProcNatl Acad Sci 198986：4220-4)。此外，在构建人源化抗体的时候，FV本身的啮齿类动物序列在至少保持其亲本互补决定区(CDRs)的同时，结构尽可能地接近于人类序列(例如，Riechmann，Nature 1988332：323-7)。人源化啮齿类动物抗体在人类患者中也显示出免疫原性的大为减少(Moreland，Arthritis Rheum 199336：307-18)，尽管某些人源化抗体对绝大多数患者仍然是免疫原性的，但这更可能是啮齿类动物互补决定区(CDRs)自身所固有的免疫原性造成的(Ritter，Cancer Res 200161：6851-9；Welt，Clin Cancer Res20039：1338-46)。

目前(2003)，全世界临床使用的单克隆抗体产品多达十几种，已经创造了20亿美元的收入，还有几十种单克隆抗体产品处于临床试验阶段。进入临床使用的许多抗体属于嵌合的、人源化或人类抗体，其中的绝大多数最初是鼠的单克隆抗体。

鼠抗体之所以得到广泛的应用，不是由于它们具有其它物种的抗体所不具备的优势，而是由于至今在非啮齿类动物杂交瘤技术方面的欠缺。目前，这种状况已经所有改变。兔子由于其自身所固有的强烈的免疫反应特性，及其生成对众多表位具有高亲合力抗体的能力，使之成为高质量抗体的最佳来源之一。最近，利用传统的融合方法制备兔的单克隆抗体已经成为可能(Spieker-Polet，Proc Natl Acad Sci199592：9348-52)。因此，能生产非常高质量的单克隆兔抗体。

但是如果用于治疗的话，和鼠抗体一样，兔抗体同样也会引起强烈的免疫反应，其将阻碍延长的重复施用。因此，在临床使用之前，同样需要制备嵌合的与人源化的兔抗体。然而，制备嵌合的与人源化的啮齿类动物抗体的方法却由于如下的原因而无法用于许多兔抗体：

首先，很多兔抗体的κ链在可变区和恒定区之间具有二硫键。这种结构上的特征在制备嵌合与人源化抗体时带来一个问题，据我们所知，这个问题尚未在研究中得到解决。同型κ-1(K-1)链是目前使用最多的兔抗体轻链。常见的五种K-1异型抗体中的三种(b4，b5和b6)在可变区(VK)骨架3的80位点处有一个半胱氨酸。该残基的侧链为裸露的，并可与恒定区κ链上的另一个半胱氨酸残基形成二硫键。尽管兔的第四种常见K-1异型抗体--b9，也有多余的二硫化物，但是在这种情况下，可变区的半胱氨酸残基占据了骨架4中VK的最后一个位置，残基108。人抗体和啮齿动物抗体的κ链中没有这种多余的二硫键。因此，如果要想利用许多已知方法中的一种，通过连接兔的可变区κ链与人的恒定区κ链构建嵌合或人源化的抗体，可变区κ链的半胱氨酸残基就会保持不成对状态。这极可能会导致出现蛋白质的折叠和表达问题，并且即使获得了高产量的折叠正确的抗体，不成对的半胱氨酸残基也极有可能会导致抗体的一部分通过其VK半胱氨酸残基形成二聚物，这通常是我们不希望看到的结果。

其次，相对于人类和鼠类的氨基酸残基，很多兔类重链可变区在β链D和E之间的环上缺少一或两个氨基酸残基。此外，与人和鼠类的链相比，很多重链和轻链在氨基端上也缺少一个残基。尽管在人和鼠类抗体中，这两个区域一般不与抗原相接触，但它们却都非常接近于互补决定区(CDRs)，并且经常和互补决定区残基相接触。显然，对于这些兔类的抗体链来说，由于不存在这些残基的位置，因此，我们不能在所述位置上找到相应的同源的人类残基。

第三，与人和鼠类的对应物相比，很多兔类的VH链有额外成对的半胱氨酸。例如，在某些兔类的VH链中，除了Cys 22-Cys 92“正常”的二硫键之外，不仅还有一个Cys 21-Cys 79的二硫键，而且在CDR H1的最后一个半胱氨酸残基和CDR H2的第一个半胱氨酸残基之间还有另一个二硫键。人们还经常在VK L3互补决定区中发现成对的半胱氨酸残基。通过根据同源性把兔类抗体结构与已知结构进行的模型分析，我们可以看到，半胱氨酸对呈现出空间布置状态，其允许二硫键的形成。

最后，很多兔类抗体CDR并不属于前面已知的规范结构。尤其是VK CDR L3常常比已知的人或鼠类抗体L3 CDR长得多。由于以前缺少对兔类CDR结构的认识，使得人们很难精确地进行模型分析。

因此，由于兔类单克隆抗体的独特性，目前对啮齿类动物抗体进行人源化的方法并不能轻易用于对兔类单克隆抗体进行人源化。所以说，目前迫切需要一种对兔类抗体进行人源化的方法。本发明就是为了解决这一问题及其它相关要求。

参考文献

相关的参考文献包括：美国专利6,331,415 B1、5,225,539、6,342,587、4,816,567、5,639,641、6,180,370、5,693,762、4,816,397、5,693,761、5,530,101、5,585,089、6,329,551以及相关出版物，Morea等人，Methods 20：267-279(2000)，Ann.AllergyAsthma Immunol.81：105-119(1998)；Rader等人，J.Biol.Chem.276：13668-13676(2000)；Steinberger等人，J.Bio.Chem.275：36073-36078(2000)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973(1994)；Delagrave等人，Prot.Eng.12：357-362(1999)；Rogusca等人，Prot.Eng.9：895-904(1996)；Knight和Becker，Cell 60：963-970(1990)；Becker and Knight，Cell 63：987-997(1990)以及Popkov，J Mol Biol 325：325-35(2003)。

发明内容

本发明提供了一种对兔单克隆抗体进行人源化的方法。总体上看，这种方法包括对兔亲本抗体的氨基酸序列与类似人抗体的氨基酸序列进行比较，改变兔亲本抗体的氨基酸序列，以便使兔亲本抗体的构架(FW)区与类似人抗体的相应构架区在序列上更为接近。在某些实施方案中，可以将来自兔抗体重链和轻链的FW1区替换为类似人抗体的对应的FW1区，在大多数实施方案中，其添加了至少一个氨基酸(也就是说，增加1、2、3或更多个氨基酸)到人源化的抗体序列，与亲本抗体序列相比。在其它实施方案中，兔抗体重链可变区的整个D-E环可以被类似的人抗体的对应的环替代，在许多实施方案中，其添加了至少一个氨基酸(也即，1，2或3或更多个氨基酸)。在某些实施方案中，例如在抗体的轻链中存在一个半胱氨酸80的话，这个氨基酸被对应的氨基酸所替代，或被人抗体中对应的E-F环所替代。最后，被认为相互接近的半胱氨酸对也有可能会改变。在很多实施方案中，如果兔亲本抗体中的氨基酸是互补决定区的接触残基、链间接触残基或隐蔽残基，则这些氨基酸不加以修饰。

本发明还进一步提供了编码目标抗体的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞和制备目标抗体的方法。目标抗体、核酸组合物以及试剂盒具有多种用途，包括诊断、治疗及疾病和不适的研究。

在很多实施方案中，互补决定区(CDR)接触所涉及的氨基酸选自重链可变区中的1，2，4，24，27，28，29，30，36，38，40，46，48，49，66，67，68，69，71，73，78，80，82，86，92，93和94位置上的氨基酸以及κ轻链可变区中的1，2，3，4，5，7，22，23，35，45，48，49，58，60，62，66，67，69，70，71和88位置上的氨基酸。

在很多实施方案中，链间接触所涉及的氨基酸选自重链可变区中的37，39，43，44，45，47，91，103和105位置上的氨基酸以及κ轻链可变区中的36，38，43，44，46，85，87，98和100位置上的氨基酸。

在很多实施方案中，隐蔽残基选自重链可变区中的6，9，12，18，20，22，76，82c，88，90，107，109和111位置上的氨基酸以及κ轻链可变区中的6，11，13，19，21，37，47，61，73，75，78，82，83，84，86，102，104和106位置上的氨基酸。

对于本领域技术人员来说，在详细阅读如下充分描述的本发明细节之后，必将会认识到本发明的这些和其它优点和特征。

附图说明

图1是一个说明了本发明的某些实施方案的图例。

图2克隆自不同兔杂交瘤的可变κ链(上部)和可变重链(下部)的多重序列比对。标准编号、β链(A，A′，B，C，C′，D，E，F，G)的位置见各队列的上部。这些位置是以相关文献为基础的(Chothia JMol Biol 1998 278：457-79)。UP4_31：SEQ ID NO：1；UP4_29：SEQID NO：2；UP4_23：SEQ ID NO：3；CALK_VK：SEQ ID NO：4；CD79_A：SEQID NO：5；UP 3_4_V：SEQ ID NO：6；CS1_108：SEQ ID NO：7；CS1_115：SEQ ID NO：8；PLAP_VK：SEQ ID NO：9；B1_VK：SEQ ID NO：10；DEW76：SEQ ID NO：11；DEW148：SEQ ID NO：12；B1_VH：SEQ ID NO：13；DEW73：SEQID NO：14；DEW70：SEQ ID NO：15以及KabX：SEQ ID NO：16。

图3是抗整联蛋白β-6兔单克隆抗体B1人源化的多重序列比对。图中所示的原始B1 VK和VH序列与它们各自最近的人类目的基因胚系序列和最终的人源化链序列进行了比对。为方便阅读，比对在互补决定区(CDRs)和构架(FRs)的末端中断。标准编号位于上部的基线位置。编码上的阴影区说明了互补决定区的位置。其它阴影区域代表着不同于原始兔序列的构架位置。黑色单元部分为相对于人对应物而在兔序列中缺失的部分。由于部分人VK CDR3和全部VH CDR3没有在人的胚系中被准确地编码，因而在图中没有显示出来。B1VK：SEQ ID NO：17；Hu_L12_JK4：SEQ ID NO17；B1_VK_HZ1：SEQ ID NO：20；B1VH：SEQ IDNO：21；B1VH_HZ1：SEQ ID NO：22。

图4显示了VK和CK之间“额外”二硫键的Fab抗体片段，它存在于某些兔类κ链中，但不存在于人或鼠类的κ链中。

图5显示了三个互补决定区和D-E环位置的兔类VH区的结构。

定义

在进一步叙述本发明之前，我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围仅受附加的权利要求书的限制，因此，本文所使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。

除另有其它定义，否则，本文所使用的所有科学技术术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料都可用于实施本发明或是对本发明进行检验，但优选的方法和材料是现在描述的。对于本文所提及的所有出版物都引入这里作为参考，以结合所引用的出版物用于公开和描述本发明方法和/或材料。

必须注意的是，在正文及附加权利要求书中所用，除非上下文中另外清楚地指明，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数形式。例如，“一种抗体”也包括这种抗体的复数形式，“一个构架区”即可以指一个构架区，也可以指多个构架区，以及本领域技术人员已知的其等价物，等等。

本文所提到的出版物仅为在本申请的申请日之前公开的内容。但此处公开的内容不得理解为承认本发明不具备因在先发明而早于所述出版物的资格。此外，所提供的出版物的日期可能会与实际出版日期有所不同，这一点可能需要单独予以核实。

术语“宿主生物”是指所有能产生与兔具有相似可变区结构抗体的动物。示例的宿主生物包括人类、小鼠、大鼠等。

与另一个氨基酸残基“紧密接触”、“紧密接近”或“亲近”的氨基酸残基是其侧链靠近另一个氨基酸的侧链——即：与另一个氨基酸侧链的距离在7、6、5或4埃的氨基酸。例如，一个接近于互补决定区的氨基酸就是一个非互补决定区氨基酸，它的侧链接近于互补决定区中的氨基酸的侧链。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N-末端成熟区域。所有区域、互补决定区和残基的编号都是基于序列比对和结构知识指定的。构架残基的识别和编号见Chothia等人的文章(Chothia：免疫球蛋白可变区序列中的结构决定簇，J Mol Biol 1998；278；457-79)。

VH是抗体重链的可变区。VL是抗体轻链的可变区，它可能是κ(K)或λ的同型。K-2抗体具有κ-1同型，而K-2抗体则具有κ-1同型。VL是可变区的λ轻链。

“隐蔽残基”是其侧链相对可溶性低于50％的氨基酸残基，可溶性是指在延伸的GGXGG(SEQ ID NO：23)肽中相对于相同残基X可溶性的百分比。可溶性的计算方法是本领域已知的，(Connolly 1983 J.appl.Crystallogr，16，548-558)。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

目前已知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，以及α、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ重链，或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH₂-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及前面所述的重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以进行可检测标记的，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测产物的酶、荧光蛋白质等等。抗体也可以与其它成分缀合，如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对)等等。抗体还可以结合于固态支持物上，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’，Fv，F(ab’)₂和/或其它保持与抗原特异性结合的抗体片段。

抗体还可以以多种其它形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab′)₂，以及双功能(即：双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17，105(1987))以及以单链形式(例如，Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird etal.，Science，242，423-426(1988)，在此引用作为参考)。(一般知识请参见：Hood et al.，″Immunology″，Benjamin，N.Y.，2nd ed.(1984)，和Hunkapiller and Hood，Nature，323，15-16(1986)，)。

免疫球蛋白重链或轻链可变区由一个“构架”区(FR)构成，这个“构架”区被三个高变区分开，也被人们称为“互补决定区”或CDR。有关学者已经对构架区和互补决定区的范围进行了精确的定义(见″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″E.Kabat etal.，U.S.Department of Health and Human Services，(1991))。不同重链或轻链构架区的序列在同物种之内保持相对保守性。抗体构架区——也就是由重链或轻链组成的组合构架区——其作用是确定互补决定区的定位和排列。互补决定区(CDRs)主要负责与抗原表位结合。

在嵌合抗体中，其重链和轻链基因一般是通过基因工程，由属于不同物种的抗体可变区和恒定区构建的。例如，来自兔单克隆抗体基因可变区段可以连接于人的恒定区段，例如γ1和γ3。治疗用嵌合抗体的一个例子是由兔抗体可变区或抗原结合区与人抗体恒定区或效应器区构成的杂合蛋白质(例如，由A.T.C.C.保藏登记号CRL 9688的细胞制备的抗-Tac嵌合抗体)，当然，也可以使用其它哺乳动物物种。

在本文中，术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指一种抗体，它包含兔抗体的一个或多个互补决定区；以及一个在人抗体序列上含有氨基酸替代和/或缺失和/或***的兔构架区。提供互补决定区的兔免疫球蛋白被称为“母体”或“受体”，提供构架改变的人抗体被称为“供体”。人源化免疫球蛋白不需要存在恒定区，但如果存在的话，它们一般与人抗体的恒定区基本相同，即：至少有约85-90％一致性，优选大约95％或更高的一致性。因此，在某些实施方案中，全长的人源化兔重链或轻链免疫球蛋白含有人的恒定区、兔的互补决定区以及具有许多“人源化”氨基酸变异的基本的兔构架区，这将在下面详细描述。在很多实施方案中，“人源化抗体”是一种由人源化可变轻链和/或人源化可变重链构成的抗体。例如，人源化抗体可能不包括上述定义的典型嵌合抗体，例如因为嵌合抗体的全部可变区都不是人类的。通过“人源化”过程而进行了“人源化”的修饰抗体结合与提供互补决定区的亲本抗体相同的抗原，这种抗体与亲本抗体相比，其在人类中的免疫原性一般较低。

我们应该认识到，按本方法设计和制备的人源化抗体可能会具有其它的保守性氨基酸置换，而这些置换对于与抗原的结合或其它抗体功能基本上没有影响。保守性置换是指预期的组合，如来自以下群组的组合：gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg和phe，tyr。不存在于同一组中的氨基酸为“实质上不同的”氨基酸。

在本文中，术语“确定”、“测量”以及“评价”和“测定”可以互换使用，它们都包括定量和定性的测定方法。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，它们都是指任何长度的聚合形式的氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、通过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列，带有或不带有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；带有免疫标记的蛋白；带有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如包括荧光蛋白质、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等等作为融合伴侣的融合蛋白，等等。

本文中所使用的术语“分离的”，即文中的分离抗体，指的是在纯化之前感兴趣的抗体至少60％、至少75％、至少90％、至少95％或至少98％，甚至是至少99％没有抗体结合的其它成分。

术语“治疗”及其它类似术语是指对哺乳动物的任何疾病或不适进行的任何治疗，尤其是人或鼠类，包括：a)预防疾病、不适或疾病或不适的症状出现在怀疑患有某种疾病但是还没有诊断为患有该疾病的个体中；b)抑制疾病，不适，或疾病或不适的症状，例如抑制它的发展，和/或推迟它在患者身上的恶化或显露；和/或c)缓解疾病，不适或疾病或不适的症状，例如使这种不适或疾病和/或其症状衰退。

术语“对象”、“宿主”、“患者”以及“个体”在本文中可以交替使用，具体是指接受诊断或治疗的任何哺乳动物，尤其是指人类。其它对象可能包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠和马等。

优选实施方案的祥述

本发明提供了一种对兔单克隆抗体进行人源化的方法。总体上看，这种方法涉及到对兔亲本抗体的氨基酸序列与类似人抗体的氨基酸序列进行比较，改变兔亲本抗体的氨基酸序列，使其构架区与类似人抗体的相应构架区在序列上更为接近。在很多实施方案中，对于不属于互补决定区接触残基、链间接触残基或隐蔽残基的兔亲本抗体中的氨基酸不加以修饰。本发明还进一步提供了编码目标抗体的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞和制备目标抗体的方法。目标抗体、核酸和组合物以及试剂盒具有多种用途，包括诊断、治疗以及疾病和不适的研究。

在进一步对本发明进行描述的过程中，首先将讨论对兔单克隆抗体进行人源化的方法，然后，阐述按本文所介绍方法对人源化抗体进行编码的核酸，最后，综述各种相关方法以及它们在本文所讨论***中的典型应用。

对兔单克隆抗体进行人源化的方法

本发明提供了一种兔单克隆抗体进行人源化的方法。这种方法一般包括改变抗体重链和轻链可变结构构架区的某些氨基酸，使人源化兔抗体的构架区与人抗体的构架区在序列上更为接近。与未经修饰的兔亲本抗体相比，这些人源化的兔抗体在人宿主中一般具有较弱的免疫原性，同时保持以高亲和力与抗原、一般是预先确定的抗原特异性结合。换句话说，本方法可以用于生产人源化的兔抗体，与兔亲本抗体相比，人源化兔抗体在人宿主内具有较弱的免疫原性，从而与未经修饰的亲本抗体结合的抗原的结合亲和力为至少约10⁷M^-1的亲和力，优选10⁸M^-1到10¹⁰M^-1，或更高。在很多实施方案中，改变仅针对结构上不重要的氨基酸进行，这些结构上重要的氨基酸可能是互补决定区接触残基、链间接触残基或是隐蔽残基，具体见本文详细论述。在某些实施方案中，兔抗体重链和轻链的FW1区可能被类似人抗体的对应FW1区所替代，也就是说，与亲本抗体序列相比，大多数实施方案中在人源化抗体序列上增加至少一个氨基酸(即：1个、2个、3个或更多个氨基酸)。在其它实施方案中，兔抗体重链可变区的全部D-E环可能被类似人抗体的对应环所替代，在许多实施方案中，其增加至少一个氨基酸(即：1个、2个、3个或更多个氨基酸)。在其它某些实施方案中，如果抗体轻链中存在cys 80的话，该氨基酸被相应氨基酸所替代，或是E-F环被类似人抗体的对应E-F环所替代。最后，相互接近的半胱氨酸对也可能被改变。

本方法可以用于对所有兔抗体进行人源化。但是，在特定的实施方案中，本方法只能用于对具有轻链互补决定区3的兔抗体进行人源化，互补决定区3是一个“长的”互补决定区3，与长度一般为6个残基的人和鼠轻链互补决定区3相比，它的长度通常为10、11、12、13、14或15个残基。

人源化兔抗体在经济上可以进行大批量生产和使用，例如，利用各种技术诊断和治疗各种人类和鼠类疾病。

图1是说明该方法某些实施方案的总体流程图。按照图1，在这些方法中，首先需要选择兔子2进行免疫和产生单克隆抗体。也许可以选择任何一只兔子4，或是在某些实施方案中，可以使用基因确定的兔子6。也可以根据抗体是否带有VK-CK二硫键S-S，或是否需要具备VH的D-E环，选择某些类型基因确定的兔子8。例如，可以使用bas兔子10制备没有VK-CK二硫键的抗体，可以使用b9/b9兔子12制备有cys108但没有cys80的抗体，或是可以用A2/A2兔子14制备一般不具有VH的D-E环缺失的抗体。在很多实施方案中，一旦确鉴定并制备了一种适当的单克隆抗体，编码该抗体可变区的核酸就被克隆16并测序20，并确定抗体可变区的氨基酸序列。识别互补决定区CDR，通常按Chothia(见上文)或Kabat(见上文)的方案对氨基酸进行编号20。然后，类似的人抗体被识别出，并按照如下步骤改变兔抗体的序列：a)将兔抗体重链和/或轻链可变区的N-末端替代为类似人抗体的对应部分24；b)将兔抗体的全部VH D-E环替换为类似人抗体的对应环26；c)将兔抗体轻链的cys80替换为类似人抗体的对应氨基酸，或是在其它实施方案中，将兔抗体的全部E-F环替换为类似人抗体的对应E-F环28；d)如果认为抗体中的半胱氨酸对紧密接近的话，去除抗体的半胱氨酸对30，以及e)不改变涉及互补决定区接触32、链间接触34，或是隐蔽残基36的任何残基。在人源化兔抗体的可变区序列进行设计之后22，通过两种替代性示例方法40制备编码可变区的核酸，这些方法对可变区的核酸进行重新合成42，或是改变兔亲本单克隆抗体可变区的核酸，从而对人源化可变区进行编码44。在制备过程之后，可以将可变区核酸克隆到适当的载体中，进行抗体的制备，在细胞中进行表达，对编码的抗体进行表征46。

兔免疫球蛋白VH和VL链序列

本方法的第一个步骤是取得兔单克隆抗体(“亲本”抗体)的氨基酸序列。在很多实施方案中，单克隆抗体的特异性是已知的，但是在某些实施方案中，其特异性是未知的。

兔抗体是通过以一种抗原或是抗原的混合物对兔子进行免疫处理产生的，对编码它们的核酸(尤其是cDNAs)进行测序，确定兔免疫球蛋白重链和轻链的可变区序列。在上面的讨论中，根据兔亲本抗体的预期序列特征，可以在本方法中使用多种兔的基因型。一般而言，可以采用任何兔，包括具有basilea(bas)和b9/b9基因型和A2/A2的兔。这些核酸可分离自任何产生抗体的细胞或细胞的混合物，例如来自免疫处理的兔的骨髓和脾脏等部位的细胞，或是产生兔抗体的杂交瘤细胞。在大多数实施方案中，采用标准分子生物学技术，从这些细胞分离编码抗体的核酸，这些技术包括聚合酶链反应(PCR)或逆转录PCR(RT-PCR)(Ausubel，et al，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。

在很多实施方案中，对兔亲本抗体VH和VL区编码的核酸分离自产生兔抗体的杂交瘤细胞。为了制备产生兔抗体的杂交瘤细胞系，需要用一种抗原对兔子进行免疫处理，一旦兔子产生某种特异性免疫反应，便将免疫兔子脾脏的细胞与浆细胞瘤细胞系，例如240E融合在一起(Spieker-Polet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.92：9348-9352，1995)。在融合之后，将细胞在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的培养基中培养，选择用于杂交瘤生长，在经过2到3个星期之后，开始出现杂交瘤细胞集落。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对这些杂交瘤细胞培养上清液进行筛选，筛选抗体分泌，按照标准程序，选择并继续培养能分泌对某种抗原具有特异性的单克隆抗体的阳性克隆(Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，First Edition(1988)Cold spring Harbor，N.Y.；andSpieker-Polet et al.，见上文)。

在其它实施方案中，编码兔亲本抗体的核酸通过任何已知方法从细胞分离。典型的方法包括：1)对从兔脾脏、骨髓、***或其它淋巴器官采集的细胞群体实施流式细胞计量术，之后进行单细胞选择性平皿培养，例如，通过用带标记的抗兔IgG对细胞进行温育，用FACSVantage SE细胞分类器(Becton-Dickinson，San Jose，CA)对标记的细胞进行分类；以及2)在多孔板上按有限稀释法对血浆细胞进行选择性平皿培养。细胞可以直接分类进入包含RT-PCR缓冲液的96孔或384孔平皿，然后采用对IgG重链和轻链具有特异性的嵌套引物进行RT-PCR。作为对细胞进行分类的另一种方法，为了获得单个B细胞，也可以采用有限稀释细胞平皿培养法。

尽管本发明的方法适用于修饰任何兔类抗体，但一般还是用于修饰“天然”抗体，在这种情况下，抗体的轻免疫球蛋白和重免疫球蛋白是通过兔子的免疫***自然选择的，这与例如通过噬菌体展示制备的“非天然”成对的抗体是相反的。此处所述的抗体一般不与病毒外壳蛋白序列等病毒序列连接，也即可操作连接。

序列比较

一旦确定兔亲本抗体VH和VL区的氨基酸序列之后，一般应采用适当的编号***对氨基酸进行编号，例如Chothia于1998年(见上文)或Kabat(见上文)提出的编号***，同时通常鉴别互补决定区和/或构架残基。然后，序列与人类免疫球蛋白序列数据库，一般是种系序列进行比较，从而鉴别类似的人抗体。这个类似的人抗体可以称为“供体”抗体，因为氨基酸一般是从人抗体转移到兔子的亲本抗体。一般情况下，利用适当的比较程序对兔的亲本抗体VH或VL序列与数据库，例如BLASTP和FASTP，以默认设置进行比较，类似的人抗体被确定为在氨基酸序列同一性方面(通过同一性百分比或P值)具有与亲本抗体可变区序列最相近的10个(或者，在某些实施方案中3个之一或最高的一个)类似可变区(VL或VH)之一。被选择的供体抗体可变区一般在构架区内至少约55％，至少约65％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％的氨基酸序列与亲本构架区一致。在某些实施方案中，将序列与未保存在数据库中的氨基酸序列，例如与新测序抗体的序列进行比较。

在大多数实施方案中，可以采用同一个人抗体的重链和轻链作为供体。

可以对各抗体数据库进行调查，以鉴别针对给定兔免疫球蛋白序列的类似人抗体免疫球蛋白(一般是种系抗体序列)。除了国家生物技术信息中心(NCBI)数据库之外，其它几个常用的数据库如下：

V BASE-人类抗体基因数据库：该数据库由英国剑桥的医疗研究理事会(MRC)维护，并通过医疗研究理事会的全球互联网公布，网址为mrc-cpe.cam.ac.uk。该数据库是综合性目录，全部为依靠一千多个已公开序列编译得到的人类种系可变区序列，其中包括美国国家生物技术情报中心(Genbank)和欧洲分子生物学实验室(EMBL)数据文库目前公布的基因序列。

具有免疫学重要性的蛋白质序列的Kabat数据库(Johnson，G和Wu，TT(2001)，Kabat数据库及其应用：未来的方向。核酸研究，29：205-206)，见芝加哥西北大学网址(immuno.bme.nwu.edu)。kabat数据库还可以获自国家健康协会/美国国家生物技术信息中心(nih/ncbi)的网址。

Immunogenetics数据库：由欧洲生物信息学会维护，并刊载于该学会的网址：www.ebi.ac.uk。该数据库是一个专业数据库，它包括了在免疫***的功能中重要基因的核苷酸序列信息。该数据库收集并解释了属于免疫球蛋白超家族、与免疫识别有关的序列。

ABG：鼠类种系基因的目录——鼠类VH和VK种系区段的目录，墨西哥国立大学生物技术学会抗体组的部分网页。

可以通过内置搜索引擎搜寻在氨基酸序列同源性方面类似的基因序列。在本发明的方法中，采用缺省参数运行BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)，包括BLOSUM62矩阵的选择，预期临界值为10，低复杂性过滤器设置为关闭，允许间隙，字号为3。

兔单克隆抗体的人源化

本发明提供了一种可以对兔抗体进行人源化的方法。在这种方法中，可以修饰兔抗体VH和VL域的构架区，使之与上述确定的类似人抗体更为接近。总之，这些方法在总体上与其它对兔抗体进行人源化的方法(例如互补决定区嫁接、抗体再涂层等方法)相互兼容(即：在实施其它方法的时候可以同时采用)。

一般情况下，这种方法包括将亲本抗体的VH和VL区的序列与供体抗体的VH和VL区进行排列比对，改变亲本抗体VH和VL构架区的序列，使之与供体抗体的序列更为接近。总体上看，它涉及将兔抗体序列的特定氨基酸氨基酸替换为供体抗体对应的氨基酸(即：按照上述的编号方案，在相同的位置上替换)。换句话说，“对应”的含义是，在对两个序列进行比对，将供体序列上的氨基酸残基放置在亲本序列上的残基的对应处。当然，本领域已知(例如，Roguska et al，P.N.A.S.91：969-973，1994；Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest，DHHS，Washington，DC)，有的时候，应该在一个或两个序列上产生1、2或3个缺口，或是***1、2、3或4或更多个氨基酸从而完成排列比对。这样，在很多实施方案中，在一个兔亲本抗体序列中***空隙，或缺失氨基酸，从而完成兔亲本序列和人序列之间的排列比对。

在其它实施方案中，本方法涉及到兔抗体的一个区替换为供体抗体对应的一个区。与亲本抗体序列相比，被替换的区可以增加或缺失氨基酸。在大多数实施方案中，被替换的氨基酸并非是相邻的，可能由一组亲本抗体和供体抗体之间不同的非相邻氨基酸组成。因此，在某些实施方案中，按照下面所讨论的限制条件，在人源化方法中，将供体人抗体构架区替换为人亲本抗体的构架区，从而对兔抗体进行人源化。如果与兔抗体序列相比的话，人抗体序列多出一个氨基酸，那么，一般需要在兔抗体序列中增加一个氨基酸，同样，如果与兔抗体序列相比的话，人抗体序列缺少一个氨基酸，那么，在人源化过程中，一般需要在兔抗体序列中缺失一个氨基酸。

可变区的N-末端：与人VH链的N-末端相比，兔子的全部三个主要VH1同种异型(A1，A2，A3)的抗体VH区都具有预计缺少一个残基的N-末端(即：这些抗体的FR1区)。但是，由于VH基因在兔中比VH1基因使用的频率低，因此，并非所有的兔抗体重链都有一个长度较短的N-末端。实际上，在我们所克隆的可变κ链中，大约有一半比其它兔的VK和比所有人的VK在其N-末端缺少一个残基(见图2)。

总之，除了下面提到的某些氨基酸之外，兔抗体的全部FR1区(即：抗体重链的N-末端区，这个抗体又是第一个互补决定区(CDR1)的第一个氨基酸的N-末端，包括A链、A’链和B链的一部分)被供体抗体的全部FR1区所替代，这样，人源化兔抗体重链和轻链的前三个N-末端残基(1，2和3)与供体人抗体重链和轻链的前三个N-末端残基完全匹配。在本发明的大多数实施方案中，残基VK22，VH24，VH27，VH28，VH29和VH30不应该变化，因为它们非常接近于互补决定区。可以对残基VK11，VK13，VK19，VH9，VH12和VH18进行保守的氨基酸替换。

VH的D-E环：图5说明D-E环相对于抗体重链的CDR的位置。三个主要VH1同种异型的两个(A1，A3)具有D-E环区，在一般情况下，与人和兔的A2同种异型VH链相比，它们分别缺少一到两个残基。在亲和力成熟期间，这个区的氨基酸残基数是可以改变的，但一般很少出现变化。按照本发明，通过将从72一直到77位置的六个相邻的兔残基替换为被选择供体抗体序列的对应残基，对D-E环进行人源化。在某些实施方案中，可以采用如下的序列替代兔抗体序列的72到77残基：可以采用DTSKNQ(SEQ ID NO：24)，DNSKNT(SEQ ID NO：25)、DNAKNS(SEQ ID NO：26)，或是在某些实施方案中：DDSKNS(SEQ IDNO：27)，DDSKNT(SEQ ID NO：28)，DESTST(SEQ ID NO：29)，DGSKSI(SEQID NO：30)、DKSIST(SEQ ID NO：31)，DKSKNQ(SEQ ID NO：32)、DKSTST(SEQ ID NO：33)、DMSTST(SEQ ID NO：34)，DNAKNT(SEQ ID NO：35)，DNSKNS(SEQ ID NO：36)、DRSKNQ(SEQ ID NO：37)，DRSMST(SEQ IDNO：38)，DTSAST(SEQ ID NO：39)、DTSIST(SEQ ID NO：40)，DTSKSQ(SEQ ID NO：41)，DTSTDT(SEQ ID NO：42)、DTSTST(SEQ ID NO：43)，DTSVST(SEQ ID NO：44)，ENAKNS(SEQ ID NO：45)或NTSIST(SEQ IDNO：46)。

在可选择的实施方案中，可以从对A2同种异型纯合的兔获得具有正确长度D-E环的兔抗体。

VK C80/E-F环：兔抗体的κ链，例如属于κ-1 b4、b5以及b6同种异型的κ链，在位点80处有一个半胱氨酸残基(cys80)，它在κ恒定区与一个半胱氨酸残基形成二硫键(见图4)。如果存在于兔抗体中的话，应该将cys80突变为非半胱氨酸残基。一般情况下，虽然可以用任何其它氨基酸替代cys80，但是，pro、ala或ser(P，A，S)是最经常使用的。在其它实施方案中，可以使用被选择供体抗体相应位置(即：VK80)上的残基。

在可选择的实施方案中，可以采用兔制备在位置80处不包含半胱氨酸残基的兔抗体，在所述的兔中，产生缺少包含cys80的VK-CK二硫键的κ链。尤其是，basilea(ba s)兔只能产生VK κ-2同型和λ链，两者都没有所述二硫键。此外，还可以采用来自b9/b9纯合兔的抗体，因为它们不需要利用Cys 80。但是，在来自b9/b9兔的抗体中，cys 108却形成了二硫键。

在另一种用于替代兔抗体Cys80的实施方案中，如果兔亲本抗体轻链存在一个E-F环(VK77到VK83之间的残基)的话，E-F环被其它序列，如来自所选择供体抗体的序列所替代。这7个氨基酸一般被替换成以下的氨基酸序列：SLQPEDF(SEQ ID NO：47)或RVEAEDV(SEQID NO：48)；或NIESEDA(SEQ ID NO：49)、RLEPEDF(SEQ ID NO：50)、SLEAEDA(SEQ ID NO：51)、SLEPEDF(SEQ ID NO：52)、SLQAEDV(SEQID NO：53)、SLQPDDF(SEQ ID NO：54)、SLQPEDI(SEQ ID NO：55)、SLQPEDV(SEQ ID NO：56)或SLQSEDF(SEQ ID NO：57)。在某些实施方案中，在任何人抗体中发现的任何不包含半胱氨酸残基的对应序列都可以使用，包括被选择供体抗体中的序列。

在这7个残基中，处于位置82的残基必须总是D(asp)。如在兔中发现的，如果对应的人残基具有明显不同的尺寸、电荷或疏水性，处于位置78和83的残基应当保留，因为这些残基经常处于隐蔽状态。在大多数情况下，无论是兔还是人VKs，处于位置78的兔残基都是保守的(V，L，I或M)，但这却不适用于处于位置83的残基，因为它的电荷和大小在兔和人VKs之间存在着显著的差异。因此，在很多实施方案中，残基83保持完整，而所有的E-F环氨基酸都可以按照上述的序列之一加以改变。

其它半胱氨酸对：对于在位置108上拥有一个半胱氨酸残基的兔κ链，例如κ-1b9同种异型的那些抗体，半胱氨酸残基可以改变为其它任何其它残基，但一般是见于人抗体相同位置上的残基，例如所选择的供体抗体。

除了VK cys80或cys108之外，兔抗体的可变区经常具有其它人抗体中不存在的其它半胱氨酸。通过模型分析，或是与一种已知结构进行比较，抗体的相互接近的其它半胱氨酸对——即足够接近以通过二硫键键合，应该予以改变。在某些实施方案中，一对结合半胱氨酸残基中的一个半胱氨酸残基被改变，而在其它实施方案中，结合成对的两个半胱氨酸残基都被改变。因此，在很多实施方案中，本过程包括确定一对彼此极为接近的半胱氨酸(例如，在大约4，5，6或大约7埃之内)，并将两个半胱氨酸残基都改变为其它氨基酸。这些半胱氨酸残基可以改变为任何其它氨基酸，一般为另一个抗体，例如被选择的供体抗体，相应位置上的非半胱氨酸氨基酸。

在特定的实施方案中，兔的VH半胱氨酸对cys21/cys79可以改变为：S21/Y79、T21/S79或是在其它实施方案中，变为S21/H79和T21/V79。

一般情况下，不应该改变包含在互补决定区之一内的假定半胱氨酸对。但是确实存在某些例外情况。其中一个例外情况是存在于互补决定区内的VH35-VH50半胱氨酸(按Kabat的定义，1991，见上文)。按照结构模型，这两个半胱氨酸的侧链都处于隐蔽状态，此外，这两个半胱氨酸占据的位置都在β链上。因此，在这种情况下，任选地将半胱氨酸改变为对应的人残基。

对于上述的抗体修饰，无论是单独进行还是与其它任何方法同时进行，都不得修饰表1所示的氨基酸，或是在其它实施方案中，可以对处于隐蔽的氨基酸进行保守的改变。这些氨基酸还将在下面详细加以介绍，它们预计将变成与互补决定区紧密接近的氨基酸，形成不同的链或是隐蔽的氨基酸。

互补决定区接触：互补决定区H3一般不能有把握地建模，不管采用何种产生抗体的动物物种都如此。尤其兔抗体包含有一个比人或小鼠长(例如，长2、3、4、5、6、7或更多个氨基酸)的互补决定区时，更难以建模。因此，一般单独根据蛋白质序列不能把确定的已知的规范结构运用于兔的CDR。然而，按照本发明，我们仍然可以预测到大多数可能与互补决定区紧密接近的构架残基，因为随着互补决定区变长，例如互补决定区H3和互补决定区L3就是这种情况，或是当它们采取不同的构象时，它们就越有可能在仅接触抗原或其它互补决定区的环区、而不是构架残基上发生变化。因此，即使是粗糙的兔抗体模型，也足以预测出与互补决定区接触的残基。

链间接触。表1所列出的很多氨基酸参与链间接触(例如，在VK/VH交界面上)，这样，在人源化期间不应该对它们进行改变。

隐蔽残基。隐蔽残基(即，预测不处于抗体表面的氨基酸)在人源化期间不应进行改变，或是在一些实施方案中，可以用具有类似大小和疏水性的氨基酸进行替代，以对氨基酸序列进行保守的改变(见表1)。

在很多实施方案中，在每个可变区内，最多可以有2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16或约20个氨基酸被修饰。

表1：由于形成互补决定区接触(CDR)、链间接触(INT)或成为隐蔽(BUR)而可能在结构上较为重要的构架残基。注：属于一个以上类别的残基仅列入一个类别(氨基酸的列示顺序INT＞CDR＞BUR)。

在很多实施方案中，本方法采用以计算机或计算机***的算术方法进行。在这些实施方案中，用户至少可以把兔抗体一个构架区或一个可变区的氨基酸序列输入到计算机中，使用例如用户的界面，由计算机运行上述方法，通过这种算法，输出一个人源化的兔构架或修饰的可变区氨基酸序列，甚至是一个编码修饰的兔构架或修饰的可变区的核苷酸序列。该领域的技术人员很熟悉这个程序。

按本发明进行的编程可以记录在计算机的可读介质上，例如计算机可以直接阅读和存取的所有介质。上述介质包括但不限于磁性存储介质，如软盘、硬盘储存介质以及磁带；光学存储介质，如CD-ROM；电子存储介质，如RAM和ROM；这些介质的混合，如磁性/光学存储介质。本领域技术人员可很容易地知道如何利用目前已知的任何计算机可读介质生产产品，包括对实施上述方法所采用的程序或算法加以记录。

人源化兔单克隆抗体

本发明提供了一种按上述方法进行人源化的兔抗体。

一般情况下，人源化兔抗体保留亲本抗体识别抗原的特异性，这种人源化兔抗体具有相当高的亲合力(例如，至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1或至少在10⁹M^-1到10¹⁰M^-1，甚至更高)，与兔亲本抗体相比，在人宿主内一般产生较低的免疫原性。如上所述，在很多实施方案中，修饰的兔抗体包含至少一套来自人抗体的连续或非连续氨基酸。

与兔亲本抗体在人宿主内的免疫原性水平相比，人源化兔抗体在人体宿主内的免疫原性水平可以通过多种方式加以确定，其中包括给一个人宿主施用等摩尔量的两种分离的抗体，以及测量人宿主对每一种抗体的免疫反应。可选择地，将亲本抗体和修饰的抗体分别施用于不同的人宿主，然后测量宿主的免疫反应。测量非兔宿主针对每一种抗体的免疫反应的一种比较恰当的方法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)(见：Ausubel，et al，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995，UNIT 11-4)，按照这种方法，将适当的等量每一种抗体滴在微量滴定板上的孔内，然后采用来自人宿主的多克隆抗血清进行测定。在大多数实施方案中，与未修饰的兔亲本抗体相比，试验用人源化兔抗体产生的免疫原性大约低10％，20％，30％，40％，50％，60％，80％，90％或甚至约95％。

根据所采用的是恒定区还是其它区，用本方法可以制备几种类型的本领域已知的抗体。用本方法也可以制备全长抗体以及抗体的抗原结合片段。这些片段包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fd、单链Fvs(scFv)，单链免疫球蛋白(例如，其中重链或重链的一部分，以及轻链或轻链的一部分进行了融合)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、二价抗体、三价抗体、四价抗体、scFv微型抗体、Fab微型抗体以及二聚scFv和其它所有在构象中包含一个VL和一个VH区、从而形成特异性抗原结合区的片段。包括单链抗体在内的抗体片段，可以仅包含可变区，或可以与以下各区的全部或部分组合构成：重链上的重链恒定区或其部分，例如CH1、CH2、CH3、跨膜和/或胞质区，以及轻链上的轻链恒定区，例如C_κ区或C_λ区，或其部分。此外，本发明还包括所有可变区与CH1、CH2、CH3、C_κ区、C_λ区、跨膜及胞质区的组合。术语“抗体”是指任何类型的抗体，其中包括上面所列的那些抗体，我们已经在前面解释过，它们的重链和轻链是自然配对的，即：不包括所谓的“噬菌体展示”抗体。

当然，人源化兔抗体也可以容纳一定程度的氨基酸变异，例如，保守性氨基酸替换，只要它们保持特异性，具有相当高的亲和力，与亲本抗体相比，一般会降低非兔宿主的免疫原性。

编码兔单克隆抗体的核酸

本发明还提供了包含编码修饰的试验兔抗体的核苷酸序列的核酸，及其部分，包括重链或轻链、重链或轻链可变区或重链或轻链可变区的构架区。试验核酸是通过一种试验方法产生的。在很多实施方案中，核酸还包含一个针对恒定区的编码序列，例如所有人抗体的恒定区。编码人免疫球蛋白前导肽(例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC，SEQ IDNO：58)的核酸可以通过生物工程技术，实现抗体链的分泌。

由于操纵核酸的遗传密码和重组技术是已知的，并且可以通过上述方法获得目标抗体的氨基酸序列，因此，编码人源化兔抗体的核酸的设计和制备完全在技术人员的技能之内。在某些实施方案中，一般采用的是标准重组DNA技术(Ausubel，et al，Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook，etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。例如，可以采取任何一种或多种重组方法的组合从生成抗体的细胞中分离出抗体编码序列，这些重组方法就不必在本文中加以赘述了。随后，可以利用标准重组DNA技术，对编码蛋白质的核酸序列中的核苷酸进行替换、缺失和/或添加。

例如，可以采用定点诱变技术和亚克隆技术在编码抗体的多核苷酸中导入、缺失或替换核酸残基。在其它实施方案中，则可以采用PCR。可以通过对寡核苷酸进行化学合成完整地制备编码感兴趣多肽的核酸(例如，Cello et al.，Science(2002)297：1016-8)。

在某些实施方案中，可以对编码感兴趣多肽的核酸密码子进行优化，从而在特定物种的细胞中加以表达，尤其在哺乳动物的细胞，例如人的细胞中。

本发明还提供了包含目标核酸的载体(也被称为“构建体”)。在本发明的许多实施方案中，在使目标核酸序列与表达控制序列，例如包括启动子可操作地连接之后，在宿主体内表达目标核酸序列。一般情况下，还把目标核酸***表达载体中，表达载体可以作为游离体或宿主染色体DNA的组成部分在宿主细胞内进行复制。通常，表达载体将包含有选择标记，例如四环素或新霉素，从而可以检测目标DNA序列转化的细胞(见：美国专利No.4,704,362，其引入这里作为参考)。包括单表达盒载体和双表达盒载体在内的载体是本领域已知的(Ausubel，et al，Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。合适的载体包括病毒载体、质粒、粘粒、人工染色体(人造染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体等等)、微型染色体及其它此类载体。也可以采用逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒的载体。

为了在细胞中制备感兴趣多肽的目的，多种表达载体都是本领域技术人员能得到的。一种用于某些实施方案的合适载体是猪巨细胞病毒(pCMV)。按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，这种载体于1998年10月13日存入美国典型培养物保藏中心(ATCC)。该DNA经过美国典型培养物保藏中心(ATCC)的检验，并确认为是存活的。美国典型培养物保藏中心(ATCC)已经给pCMV指定了如下的保藏编号：ATCC#203351。

目标核酸一般包含编码目标抗体的单开放阅读框架，但是在某些实施方案中，由于用于表达感兴趣多肽的宿主细胞可能是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人类细胞，单开放阅读框架可能会被内含子打断。目标核酸一般是转录单元的一部分，该转录单元除包含目标核酸之外还可以包含3’和5’的非翻译区(UTRs)，该非翻译区可以指导RNA的稳定性和翻译的效率等。目标核酸还可以是表达盒的一部分，该表达盒除包含目标核酸之外还包含一个启动子和一个转录终止子，该启动子指导多肽的转录和表达。

真核生物的启动子可以是任何在真核细胞或任何其它宿主细胞中发挥作用的启动子，包括病毒启动子或源自真核基因或原核基因的启动子。典型的真核生物启动子包括，但不限于如下启动子：鼠类金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer et a1.，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288，1982)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355-365，1982)；SV40早期启动子(Benoist et al.，Nature(London)290：304-310，1981)；酵母gall基因序列的启动子(Johnston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6971-6975，1982)；Silver etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：5951-59SS，1984)；CMV启动子；EF-1启动子；蜕皮激素反应性启动子；四环素反应性启动子等等。病毒启动子可能具有特殊的意义，因为它们常常是特别强的启动子。在某些实施方案中，所采用的启动子是目标病原体的启动子。用于本发明的启动子的选择原则是它们能在所要导入的细胞(和/或动物)中发挥作用。在某些实施方案中，启动子是CMV启动子。

在某些实施方案中，目标载体还可以提供可选择标记的表达。合适的载体和可选择标记是本领域熟知的，而且已经在很多相关文献中进行了阐述和讨论，其中包括Ausubel等人(Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995)以及Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.)。人们已经采用了众多的不同基因作为可选择标记，在本目标载体中作为可选择标记而采用的特定基因主要是依据便利性而选择的。目前已知的可选择标记基因包括：胸苷激酶基因；二氢叶酸还原酶基因；黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因；CAD；腺苷脱氨酶基因；天冬酰胺合成酶基因；抗生素抗性基因，例如四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)、氯霉素抗性基因(Cmr或cat)、卡那霉素或新霉素抗性基因(kanr或neor)(氨基糖苷磷酸转移酶基因)、潮霉素B磷酸转移酶基因等等。

目标核酸还可以包含限制性酶切位点、多克隆位点、引物结合位点、可连接末端、重组位点等，以便于构建编码人源化兔抗体的核酸。

一般而言，用于制备编码抗体的核酸的几种方法是本领域已知的，其中包括美国专利6,180,370、5,693,762、4,816,397、5,693,761和5,530,101。有一种PCR方法采用了“重叠延伸PCR”(Hayashi etal.，Biotechniques.1994：312，314-5)，用于构建编码轻链和重链核酸的表达盒。按照这种方法，采用从抗体产生细胞获得的cDNA产物以及其它适当的核酸作为模板，通过多重重叠PCR反应产生表达盒。

制备人源化兔单克隆抗体的方法

在大多数实施方案中，编码人源化单克隆抗体的目标核酸被直接导入宿主细胞，细胞在适当的条件下进行培养，从而诱导编码抗体的表达。

任何适用于表达盒进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如：酵母、昆虫、植物等的细胞。在很多实施方案中，一般采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，其实例如下：猴的肾脏细胞(COS细胞)；由SV40转化的猴的肾脏CVI细胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人的胚肾细胞(HEK-293，Graham et al.J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠的肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠的卵巢细胞(CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216，(1980)；小鼠的塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴的肾脏细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人的子***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬的肾脏细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠的肝脏细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人的肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人的肝脏细胞(hep G2，HB 8065)；小鼠的乳腺癌细胞；(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci 383：44-68(1982))；NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)；小鼠L细胞(ATCC CCL-1)。其它细胞系是本领域普通技术人员显而易见的。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可以获得多种细胞系，地址：American Type CultureCollection，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209。

将核酸导入细胞的方法是本领域熟知的。合适的方法包括电穿孔技术、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。具体方法的选择一般取决于被转化的细胞类型，以及进行转化所处的具体环境(即：在体外、离体还是在活体内进行)。有关这些方法的一般性介绍可以参考：Ausubel，et al，Short Protocolsin Molecular Biology，3rded.，Wiley & Sons，1995。在一些实施方案中，可以采用脂质转染胺(Lipofectamine)和钙介导的基因转移技术。

在将目标核酸导入到细胞中之后，一般对细胞进行温育，正常温育温度为37℃，某些时候温度是可以选择的，温育时间为大约1到24个小时，从而充分地实现抗体表达。在大多数实施方案中，抗体一般分泌到培养细胞的培养基的上清液中。

在哺乳动物的宿主细胞中，可以利用许多以病毒为基础的表达***表达目标抗体。在采用腺病毒作为表达载体的情况下，感兴趣的抗体编码序列可以连接到一个腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如晚期启动子和三联前导序列。之后，可以采用体外或活体内重组的方法，将这个嵌合基因***腺病毒基因组。如果***病毒基因组非必需区(例如，E1或E3区)的话，将会得到重组病毒，其是活的并且能在被感染的宿主内表达抗体分子。(例如见：Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。通过包含适当的转录增强元件和转录终止子等，可以提高表达的效率(见：Bittner et al.，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。

为了长期和高产量的生产重组抗体，可以使用稳定的表达***。例如，通过生物工程技术构建稳定表达抗体分子的细胞系。而不是使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用免疫球蛋白表达盒以及可选择标记对宿主细胞进行转化。在导入外源的DNA之后，工程化细胞可以在滋养培养基中生长一到两天，之后，将滋养培养基换成选择培养基。在重组质粒中的可选择标记提供选择抗性，使得细胞将重组质粒稳定整合入染色体中并使细胞生长形成转化灶，该转化灶反过来可以被克隆，并进一步生长成为细胞系。这种工程化细胞系尤其适用于对直接或间接与抗体分子相互作用的化合物进行筛选和评价。

一旦制备出本发明所述的抗体分子，就可以采用本领域已知的用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法，对这个抗体分子进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换，亲和层析，尤其是使用蛋白质A的针对特异性抗原的亲和层析，以及分子筛柱层析)、离心分离法、液相分离法(differential solubility)以及对蛋白质进行提纯的其它标准技术。在很多实施方案中，细胞分泌的抗体进入培养基，并从培养基收获该抗体。

人源化兔抗体结合亲和力的测定

在制备修饰的抗体之后，一般采用已知的方法对它的亲和力进行测定，例如这些测定方法包括：1)采用标记(用放射性标记或荧光标记)兔亲本抗体、修饰的抗体以及由亲本抗体识别的抗原的竞争结合分析法；2)采用如BIACore仪器进行的表面细胞质基因组共振分析，提供抗体的结合特征。采用这种方法，把抗原固定在固相基质芯片上，并以实时方式测量液相中抗体的结合力；以及3)流式细胞计量术，例如，采用荧光激活的细胞分类(FACS)分析法，研究抗体与细胞表面抗原的结合力；4)酶联免疫吸附测定法(ELISA)；5)平衡透析或FACS。在这种FACS法中，表达抗原的转染细胞和天然细胞可用于研究抗体的结合力。测定抗体亲和力的方法一般采用Harlow等人介绍的方法：《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual，First Edition(1988)Cold Spring Harbor，N.Y.；Ausubel，et al，Short Protocolsin Molecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995)。

如果亲和力分析表明修饰的抗体的结合力与亲本抗体相比有所下降的话，可以对构架进行“微调”，从而达到增加亲和力的目的。微调构架的方法之一是采用定点诱变技术，有***地将每个修饰的残基变为原始的状态。通过对这些回复突变的抗体进行表达和分析，我们可以预测除非不降低亲和力否则无法进行修饰的关键残基。

另一种预测需要回复突变残基的方法是分子建模。通过对原始抗体、人源化抗体或鼠源化抗体结构的三维模型进行比较，来自与互补决定区残基太接近(例如：距离低于大约5埃)的表面残基的任何残基都应该回复突变为兔的残基或两个物种的共同残基。

功用

本发明的人源化兔抗体可以用于临床诊断、抗体成像以及治疗对基于单克隆抗体的疗法敏感的疾病。尤其，人源化兔抗体可以用于被动免疫或除去不需要的细胞或抗原，如通过补体介导的细胞溶解或抗体介导的细胞毒性(ADCC)，所有通过这些方法得到的抗体都不会产生与许多以前抗体有关的各种免疫反应(例如，过敏性休克)。例如，本发明的抗体可以用于治疗因多余细胞表面特异性表达被该抗体识别的蛋白质(例如HER2)而诱发的疾病，或是该抗体可以用于对多余的毒素、刺激物或病原体进行中和。人源化兔免疫球蛋白尤其适用于治疗多种类型的癌症，例如结肠癌、肺癌、乳腺癌、***癌等等，这些癌症都与特定的细胞标志物表达有关。由于绝大多数(如果不是所有)与疾病有关的细胞和病原体都具有成为抗体的潜在目标的分子标记，许多疾病可以是人源化抗体药物的可能指示。这些疾病包括由特定类型免疫细胞攻击自我抗原的自体免疫性疾病，例如胰岛素依赖性糖尿病、***性红斑狼疮、恶性贫血、过敏症和类风湿性关节炎；和器官移植有关的免疫激活性疾病，例如移植排斥、移植物抗宿主疾病；其它免疫***疾病，例如败血症性休克；传染性疾病，例如病毒性感染和细菌性感染；心血管疾病，例如血栓症以及神经性疾病，例如阿尔茨海默氏病。

试剂盒

根据上面的介绍，本发明还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。该试剂盒至少包括一种或多种如下试剂：编码至少一种人源化兔抗体构架序列的核酸，具体见前文所述，包含上述核酸的载体以及对该核酸进行扩增的寡核苷酸引物。试剂盒中其它可以选用的成分还包括：限制性内切酶、对照引物和质粒、缓冲液等。试剂盒中的核酸可能还有限制性酶切位点、多克隆位点、引物位点等等，以便于实现它们与非兔抗体互补决定区编码核酸的连接。试剂盒的各成分既可以存在于分开的容器中，也可以根据需要，把某些相容的成分预先混合放于一个独立的容器内。

除了上述的成分之外，试剂盒一般还包括为实施本发明方法而使用试剂盒中的成分的使用说明。实施本发明方法的使用说明一般记录于适当的记录介质上。例如，可以把使用说明印在纸、塑料或其它材质的基质上。这样，这些使用说明可以作为包装***物放在试剂盒中，存在于试剂盒或其成分的容器的标签上(即：与包装或小包装相关)，等等。在其它实施方案中，这些使用说明可以采取电子储存数据文件的形式，储存在适当的计算机可读储存介质上，如CD-ROM、磁盘等。在其它的实施方案中，实际的使用说明并不包括在试剂盒中，而是提供以远程通讯形式获取这些使用说明的方式，例如通过互联网获取。这种实施方案的一个具体例子就是在试剂盒上标注了网址，此时，使用者可以在线阅读这些使用说明，也可以通过网络下载这些使用说明。对于这样的使用说明，这种获取这些使用说明的方式记录在适当基质上。

本发明还提供至少包括一种计算机可读的介质的试剂盒，该介质储存着上述的程序和使用说明。使用说明可能还包括安装或设置说明书。使用说明还有可能包括使用上述个别方案或各种方案组合的本发明的用法说明。在某些实施方案中，使用说明同时包括两类信息。

同时提供软件和使用说明的试剂盒，可以用于多种用途。也可以将该组合包装并作为一种工具购买，用于制备在非兔宿主中产生免疫原性低于亲本抗体的兔抗体或其核苷酸序列。

使用说明一般记录于适当的记录介质上。例如，可以把使用说明印在纸、塑料或其它材质的基质上。这样，这些使用说明可以作为包装***物放在试剂盒中，存在于试剂盒或其成分的容器的标签上(即：与包装或小包装相关)，等等。在其它实施方案中，这些说明可以采取电子储存数据文件的形式，储存在适当的计算机可读储存介质上，如CD-ROM、磁盘等，包括存放程序的相同介质。

具体实施方式

如下实施例的目的是为本领域的普通技术人员提供如何进行和使用本发明的完整描述和说明，而不是为限制发明人所认为的发明的范围，也不是为了说明以下实验是进行的所有或仅有的实验。尽管发明人已经采取了尽可能的措施，以确保这些实验所采用数字的准确性(例如数量、温度等等)，但仍然需要考虑到实验误差和偏差。除另有说明之外，份数是重量份，分子量是指重均分子量，温度采用摄氏度单位，压力为大气压或接近于大气压。

实施例1

兔单克隆抗体

图2描述了对由各种兔单克隆抗体克隆的可变重链和κ链进行序列比对的过程，该兔单克隆抗体由Epitomics公司开发。它显示出，兔链的结构特征明显不同于人和鼠类抗体。绝大部分VK链和一半的VH链在N-末端上缺少一个残基(与其它兔抗体序列相对于人抗体序列相比)。绝大部分重链在D-E环区也缺少一个或两个残基。所有分离的κ链在位置80处有一个半胱氨酸残基。很多κ链的CDR3序列比以前所知道的人或鼠类抗体的相应序列长。少数κ链在它们的第三个互补决定区内有一对额外的半胱氨酸残基。额外的一对半胱氨酸也存在于某些VH区内。最后，由于这一事实在图中没有清楚地显示，使得无法把以前所知道的典型的结构赋予某些互补决定区。

实施例2

兔单克隆抗体B1的人源化

兔抗整联蛋白β-6单克隆抗体B1的可变区κ链和重链是按下面的聚合酶链反应(PCR)程序克隆获得的。对几种独立的PCR产物进行了测序，用一套引物进行的聚合酶链反应(PCR)一般情况下就足够了。

制备杂交瘤细胞的悬浮液

-1毫升的生长的B1细胞，1100转/分钟离心5分钟

-用1×PBS进行冲洗

-检查细胞的数量，调整到每毫升400,000个细胞

制备RNA

-把1ul细胞加入9ul缓冲液A，放置在冰块上

-加5ul冷的缓冲液B

-加热到65℃，保持1分钟

-在基因扩增仪上逐渐冷却

55℃ 45℃ 35℃ 23℃ 冰点

30秒 30秒 30秒 2分钟

-加冷却缓冲液C每管5ul

-在42℃的温度下温育42分钟

-放回到冰块中

缓冲液A，B，C

缓冲液A

-2ul二硫苏糖醇(DTT)(0.1M)

-2ul 5×第一链合成缓冲液

-5ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水

缓冲液B

-1.0ul 0.1％NP40

-1.0ul第一链合成缓冲液

-1.0ul oligo(dT)

-0.5ul RNaseOut核酸酶抑制剂40U/ml

-1.5ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水

缓冲液C

-1ul 10mM dNTP混合物

-1ul 5×第一链合成缓冲液(Invitrogen)

-1ul Superscript RT II(Invitrogen)

-2ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水

聚合酶链反应(PCR)

引物浓度：3pmole/ul

2.50ul 10×缓冲液

0.75ul 50mM MgCl₂

3.00ul引物1

3.00ul引物2

0.50ul 10mM dNTP混合物

0.25ul Taq或其它聚合酶

10.00ul水

5.00ul模板

-----------

25.00ul

94℃ 2分钟

68℃ 10分钟

第一轮：用于H链：引物1+引物10

用于L链：引物12+引物19

嵌套聚合酶链反应：仅用于H链：引物2+引物8

>引物1TCGCACTCAACACAGACGCTCACC(SEQ ID NO：59)

>引物2ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTT(SEQ ID NO：60)

>引物8GCTCAGCGAGTAGAGGCCTGAGGAC(SEQ ID NO：61)

>引物10TTGGGGGGAAGATGAAGACAGACGG(SEQ ID NO：62)

>引物12CAGTGCAGGCAGGACCCAGCATGG(SEQ ID NO：63)

>引物19GCCCTGGCAGGCGTCTCRCTCTA(SEQ ID NO：64)

互补决定区和残基数量的设置与Chothia(1998，见上文)和Kaba(见上文)介绍的编号方法保持一致。图3总结了计划用于对抗整联蛋白β-6兔单克隆抗体B1进行人源化的序列。详细情况见以下章节。在VK和VH区内，分别有总共15个和17个构架残基从兔型变异为人型。两个残基分别***到VH的位置1和73。在VK和VH区内，相对于可能进行改变的最大数量而言，分别有4个和7个构架残基保持不变。在VK和VH构架内的ID百分比分别从76％增加到95％和从72％增加到94％。

下面的很多人源化步骤都要求详细了解抗体的可变区结构。获取此类知识最可靠也是最简便的方法是阅读各类有关抗体结构方面的文献(例如：Chothia 1998，见上文)。然而，对公众可在pdb数据库得到的几百个抗体结构以及准备进行人源化的特定兔抗体的结构，进行模型化处理也许会更加便于使用。

为了建立兔抗体模型，需要将兔序列与pdb数据库进行比照，在数据库中寻找适当的结构用于同源建模(homology modeling)。一般情况下，我们可以寻找其蛋白质序列与兔抗体的蛋白质序列最为接近的成对VH/VL链的结构。当然，两个序列之间类似性越相近，最终得到的模型就越好。

我们可以利用几种程序通过同源性建立模型。有些程序可以在市场上购买，有些也可以通过互联网得到。例如，Swiss Pdb Viewer，也被称为“Deep View”，可以用于对同源蛋白质进行建模。相对于模板结构的环而言，如果在兔抗体的环中存在间隙或***，则可以利用其它结构进行建模。互补决定区如果属于已知的规范结构，建模可能较为容易。例如，互补决定区L2一般就是这种情况。但是在正常的情况下，我们几乎不可能把已知的规范结构直接用于兔的互补决定区，这样，也许就很难找到良好的模板结构对它们进行建模。特别需要指出的是，我们在为互补决定区L3和H3寻找适当的模板结构时会很困难。同样，D-E环的建模也不会简单。但是，在对互补决定区环和D-E环建模时没有必要做到完美无缺。

程序pdb阅读器可以用于确定哪些构架残基有可能与互补决定区进行接触。另外，我们可以采用多种程序语言，例如PERL编写脚本，甚至可以采用Microsoft Excel，其可以直接采用来自pdb文件的坐标，确定哪些残基与任何互补决定区残基的接触距离在5埃或更近的距离之内。由于不能期望兔抗体的模型十全十美，因此，我们建议采取保守的做法，对于在距离互补决定区6埃或甚至7埃之内的残基实际进行计算，然后，用图形加以表述，从而确定它们是否有可能接触到互补决定区。同样的方法也可以用于寻找哪些残基可能涉及到链间接触，尽管在这种情况下，我们最好采用pdb阅读器对几个结构进行观察。最后，我们可以使用pdb阅读器的脚本语言计算相对表面接近程度，从而确定哪些残基处于隐蔽状态。

兔单克隆抗体B1具有预测的二硫键，因此，除非半胱氨酸80被一个非半胱氨酸的人残基所替代，否则，就不可能实施人源化。根据本发明，cys 80和位置77到83的相邻残基从DLECADA(SEQ ID NO：65)被改变为SLQPDDA(SEQ ID NO：66)。除位置83上的最后一个残基没有从A改变为F之外，人源化序列与上述序列中之一——SLQPDDF(SEQ IDNO：67)几乎完全一致。这是因为，同样是按照本发明，残基应在替换的侧链中保持完整是相当不同的。这个残基经常处于隐蔽状态，如果从A改变为F就意味着，需要把一个大的甲基-苯基放置在原来只有一个甲基的位置上。

两个链的N-末端分别被完全人源化为VK的残基21和VH的残基27。残基VK22、VH28和VH29都没有发生变化，因为它们过于接近互补决定区，或是已经接触互补决定区。

图5描绘了兔VH区的模型化结构，这个VH区说明了三个互补决定区和D-E环的位置。后者靠近互补决定区。兔单克隆抗体B1的这个区通过采纳这三个可能出现的最佳人抗体序列中的一个：包括多余残基的DNSKNT(位置72-77)，实现了人源化，因而在人源化兔抗体中变成一个大环。

由于两个残基预计将处于隐蔽状态，并同时成为互补决定区的一部分，因此，兔B1抗体的VH区中存在的cys35-cys50对没有改变。

除以下残基外，所有其它残基都发生了变化，从而和人的目标序列相匹配：

-VK43和VH 91，因为它们都接近于VK/VH界面，或是处于VK/VH界面处。

-VK83，因为它有可能被隐蔽，改变(从A到F)将会导致其大小出现显著的变化。

-VK67、VH48、VH49、VH71和VH78，因为它们都接近互补决定区或与CDR接触。

在这种情况下，B1抗体两个计划中的可变区被合成，并克隆到表达载体中，该表达载体编码人的κ链和IgG1的恒定区。然后，载体被暧时表达于HEK293细胞中，把培养液的上清液用于细胞的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，从而显示出，人源化兔抗体紧密地与抗原结合。

在其它情况下，我们可以进行点突变，而不是对可变区基因进行合成。我们也可以表达抗体的片段，而不是整个IgG。

上面的实验结果和讨论显然可以说明，本发明为实现兔抗体的人源化提供了一种新的重要手段。因此，本发明方法和***具有多种用途，包括研究、农业、治疗以及其它应用。所以，本发明对该领域的发展做出了巨大的贡献。

虽然本发明已经根据其特定实施方案进行了描述，本领域技术人员应当理解，可以进行各种改变和等同替换，而不背离本发明的实际精神和范围。此外，为适应于某些具体情况、材料、物质的组成、过程、过程中的各个步骤以及本发明的目的、宗旨和范围，可以进行很多改进。所有这些改进都落在本发明附加权利要求书的范围之内。

序列表

<110>Couto，Joseph

<120>兔单克隆抗体的人源化方法

<130>EPIT-009WO

<140>未指定

<141>与此一起提交

<160>67

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn

20 25 30

Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Gly Gly Gly

85 90 95

Met Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210>2

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>2

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Val Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Gly Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Glu Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Gly Gly Gly

85 90 95

Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210>3

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>3

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Asn

20 25 30

Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Phe Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Phe Phe Cys Ser

85 90 95

Ser Gly Asp Cys Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>4

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>4

Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Arg Asn

20 25 30

Asn Leu Ala Trp Phe Gln Arg Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Ser Cys Ser

85 90 95

Ser Ala Asp Cys Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>5

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>5

Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn Ile

20 25 30

Trp Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Trp Ser Gly Glu

85 90 95

Ile Tyr Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210>6

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<221>变体

<222>7

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>6

Gln Val Leu Thr Gln Thr Xaa Tyr Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Val Asn Cys Gln Ala Ser Lys Ser Val Trp Asn Lys Asn

20 25 30

Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Leu Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Glu Cys Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Val Ile Lys

100 105 110

<210>7

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>7

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Lys

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Tyr Ser Tyr Tyr Ser Pro

85 90 95

Ser Ser Ser Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>8

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Lys

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ala Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Tyr Ser Tyr Phe Ser Pro

85 90 95

Ser Ser Ser Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>9

<211>111

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>9

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Thr Gly Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Ile Arg Asn

85 90 95

Ser Tyr Glu Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>10

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>10

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr His Tyr Ser Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Val Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>11

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>11

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn Asn Tyr Ser

20 25 30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ala Ile Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Ile Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gly

85 90 95

Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210>12

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>12

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr

20 25 30

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

His Ile Glu Thr Pro Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Asp

85 90 95

Val Ala Ser Tyr Asn Ala Ala Tyr Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>13

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>13

Gln Ser Leu Glu Glu SerGly Gl y Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Leu Ser Phe

20 25 30

Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ala Thr Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Thr Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Thr Thr Phe His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>14

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>14

Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Gly

20 25 30

Val Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Phe Ile Tyr Thr Gly Ser Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asn Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Asp Val Ala Gly Gly Ala Tyr Leu Phe Gly Leu Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>15

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>15

Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Arg Asp

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Asn Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Val Tyr Ile Ser Gly Arg Met Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Thr Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys Ala

85 90 95

Arg Ser His Ser Ile Asp Asn Ser Leu Tyr Ile Trp Gly Pro Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>16

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>16

Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Cys Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Thr Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Val Asn Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Asp Gln Ser Thr Gly

65 70 75 80

Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Val Pro Gly Gly Phe Tyr Tyr Tyr Asn Ile Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>17

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>17

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr His Tyr Ser Lys Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Val Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210>18

<211>63

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>18

Asp Ile Met Thr Gln Pro SerSer Ala Val Gly Val Thr Ile Cys Gln

1 5 10 15

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Gly Val

20 25 30

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

35 40 45

Ser Leu Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Val Lys

50 55 60

<210>19

<211>96

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>19

Asp Ile Met Thr Gln Pro Ser Ser Ala Val Gly Val Thr Ile Lys Cys

1 5 10 15

Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

20 25 30

Pro Gly Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Asp Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Gly Thr Glu Phe Thr Leu

50 55 60

Thr Ile Ser Leu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr His Tyr

65 70 75 80

Ser Lys Ser Ser Thr Tyr Val Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Val Lys

85 90 95

<210>20

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>20

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Leu Ser Phe

20 25 30

Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ala Thr Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Thr Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Thr Thr Phe His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>21

<211>61

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>21

Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Gly Ser Leu Leu Cys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Arg

20 25 30

Phe Thr Ile Ser Ser Thr Leu Gln Met Leu Ala Asp Thr Ala Tyr Cys

35 40 45

Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<210>22

<211>105

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>22

Glu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Gly Ser Leu Leu Cys Ala

1 5 10 15

Ser Gly Phe Ser Phe Ser Leu Ser Phe Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln

20 25 30

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser

35 40 45

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Lys Ser Thr Val Leu Gln Met Leu Ala Asp Thr Ala Tyr Phe Cys

65 70 75 80

Ala Arg Ser Ala Ser Ser Thr Thr Phe His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210>23

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<221>变体

<222>3

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>23

Gly Gly Xaa Gly Gly

1 5

<210>24

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>24

Asp Thr Ser Lys Asn Gln

1 5

<210>25

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>25

Asp Asn Ser Lys Asn Thr

1 5

<210>26

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>26

Asp Asn Ala Lys Asn Ser

1 5

<210>27

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>27

Asp Asp Ser Lys Asn Ser

1 5

<210>28

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>28

Asp Asp Ser Lys Asn Thr

1 5

<210>29

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>29

Asp Glu Ser Thr Ser Thr

1 5

<210>30

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>30

Asp Gly Ser Lys Ser Ile

1 5

<210>31

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>31

Asp Lys Ser Ile Ser Thr

1 5

<210>32

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>32

Asp Lys Ser Lys Asn Gln

1 5

<210>33

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>33

Asp Lys Ser Thr Ser Thr

1 5

<210>34

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>34

Asp Met Ser Thr Ser Thr

1 5

<210>35

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>35

Asp Asn Ala Lys Asn Thr

1 5

<210>36

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>36

Asp Asn Ser Lys Asn Ser

1 5

<210>37

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>37

Asp Arg Ser Lys Asn Gln

1 5

<210>38

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400> 38

Asp Arg Ser Met Ser Thr

1 5

<210>39

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>39

Asp Thr Ser Ala Ser Thr

1 5

<210>40

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>40

Asp Thr Ser Ile Ser Thr

1 5

<210>41

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>41

Asp Thr Ser Lys Ser Gln

1 5

<210>42

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>42

Asp Thr Ser Thr Asp Thr

1 5

<210>43

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>43

Asp Thr Ser Thr Ser Thr

1 5

<210>44

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>44

Asp Thr Ser Val Ser Thr

1 5

<210>45

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>45

Glu Asn Ala Lys Asn Ser

1 5

<210>46

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>46

Asn Thr Ser Ile Ser Thr

1 5

<210>47

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>47

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

1 5

<210>48

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>48

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

1 5

<210>49

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>49

Asn Ile Glu Ser Glu Asp Ala

1 5

<210>50

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>50

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe

1 5

<210>51

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>51

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala

1 5

<210>52

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>52

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe

1 5

<210>53

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>53

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val

1 5

<210>54

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>54

Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe

1 5

<210>55

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>55

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile

1 5

<210>56

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>56

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val

1 5

<210>57

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>57

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe

1 5

<210>58

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>58

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala I le Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210>59

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>59

tcgcactcaa cacagacgct cacc 24

<210>60

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>60

atggagactg ggctgcgctg gctt 24

<210>61

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>61

gctcagcgag tagaggcctg aggac 25

<210>62

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>62

ttggggggaa gatgaagaca gacgg 25

<210>63

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>63

cagtgcaggc aggacccagc atgg 24

<210>64

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>64

gccctggcag gcgtctcrct cta 23

<210>65

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>65

Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala

1 5

<210>66

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>66

Ser Leu Gln Pro Asp Asp Ala

1 5

<210>67

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>67

Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe

1 5

Claims

1. 一种对兔单克隆抗体进行人源化的方法，所述方法包括：

(a)对兔亲本抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列与类似人类抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列进行比较；和

(b)在构架区内改变所述兔抗体的所述重链和轻链可变区的氨基酸，使改变后的构架区在序列上更接近于所述类似人抗体的对应构架区；

其中所述改变的氨基酸不涉及互补决定区CDR接触、链间接触或是带有实质上不同的侧链的隐蔽残基。

2. 权利要求1的方法，其中所述亲本单克隆抗体的所述轻链包含一个互补决定区CDR3，该互补决定区比所述人抗体的互补决定区CDR3多至少一个氨基酸。

3. 权利要求1的方法，其中所述兔亲本抗体的特异性和亲和力与所述改变的兔抗体的特异性和亲和力基本相同。

4. 权利要求1的方法，其中所述改变的兔抗体在人宿主内的免疫原性低于所述兔亲本抗体。

5. 权利要求1的方法，其中所述亲本兔单克隆抗体的构架区1被所述人抗体的构架区1所替代，从而使所述亲本兔单克隆抗体的长度延长一个或多个氨基酸。

6. 权利要求1的方法，其中所述亲本兔单克隆抗体VH区的D-E环被所述人抗体的D-E环所替代，从而使所述亲本兔单克隆抗体的D-E环的长度延长一个或多个氨基酸。

7. 权利要求1的方法，其中所述亲本兔单克隆抗***置80上的任何VK半胱氨酸残基被所述人抗***置80上发现的氨基酸所替代。

8. 权利要求1的方法，其中所述亲本兔单克隆抗体的VK E-F环被所述人抗体的E-F环所替代。

9. 权利要求1的方法，其中所述亲本单克隆抗体中位置相互接近的半胱氨酸对被所述人抗体中相同位置上发现的氨基酸所替代。

10. 按照权利要求1所述的方法进行人源化的兔单克隆抗体。

11. 权利要求10的兔单克隆抗体，其中所述抗体针对抗原可测量的结合亲合力为2×10⁷M^-1或更高，所述兔亲本抗体对该抗原结合亲合力为10⁸M^-1或更高。

12. 根据权利要求10的兔单克隆抗体，其中所述抗体不与病毒多肽的片段连接。

13. 根据权利要求10的兔单克隆抗体，其中所述抗体为抗体片段。

14. 编码权利要求10所述单克隆抗体的重链或轻链可变区的核酸。

15. 包含权利要求14的核酸的载体。

16. 包含权利要求15的载体的宿主细胞。

17. 制备人源化兔抗体的方法，所述方法包括：

在足以制备所述抗体的条件下温育权利要求16的宿主细胞；和

收获所述抗体。

18. 试剂盒，其包含：

按照权利要求1的方法进行人源化的单克隆抗体；和

使用该单克隆抗体治疗疾病的使用说明。