CN100404079C - 一种仿生骨组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种仿生骨组织工程支架及其制备方法，该仿生骨组织工程支架具有三层结构：最外层为一层致密的可降解生物材料膜，第二层为孔径较小的多孔结构来增加机械强度，最内层是孔径较大的多孔结构满足营养运输与成骨需要。其中第二层和最内层的成分为原位生成的纳米相钙磷盐与可降解生物材料组成的复合物。此仿生支架模拟正常骨的结构，兼顾多孔性和机械强度。原位合成的纳米相钙磷盐进一步提高了生物相容性和骨生物活性。细胞实验和动物实验都表明：材料具有良好的生物相容性和诱导成骨性，并具有良好的降解性能。该支架从结构和成分两个角度上模拟了正常骨，并且在制备工艺中所用材料均为无毒副作用的可降解材料，可以在骨修复中用作组织工程支架材料。

Description

一种仿生骨组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种仿生骨组织工程支架及其制备方法，属于生物医用材料及组织工程技术领域。

背景技术

骨缺损的治疗是临床中常见问题之一，骨的缺损对病人的生活带来极大的不便，严重影响了日常生活。临床常用的治疗方法如自体骨移植，异体骨移植存在着供体有限，免疫排斥和疾病传染的危险。利用组织工程的方法制备骨替代物来促进骨的再生成为骨缺损治疗的新方法。组织工程的主要方法是将在体外培养的正常组织细胞吸附接种于一种生物相容性良好并且可以被机体降解吸收的多孔支架材料上，然后将细胞材料复合物植入到机体损伤部位，细胞在生物材料被降解吸收的同时，生长繁殖分化，逐渐形成形态和功能上与受损组织和器官相一致的替代物，从而达到修复和重建的目的。

选择支架材料是组织工程的第一步，针对骨组织工程的支架材料一般需要满足以下几个要求：①.生物相容性好；②.易成型，可以根据需要加工成各种形状和大小；③.良好的降解性，降解产物对人体无害；④.具有骨传导性；⑤.适合的孔径大小和孔隙率，保证新生骨组织的长入和营养物质的运输供应；⑥.一定的机械强度，对抗周围组织对缺损部位的压迫以及防止纤维组织的长入。目前应用的支架材料主要分为磷酸钙类陶瓷和聚合物两种。磷酸钙类材料具有与正常骨相似的无机组成，有良好的生物相容性和骨传导性，但是由于其脆性大，机械性能较差，并且不易塑型，限制了它的应用。聚合物类材料又分不可降解和可降解两种，不可降解材料需二次手术取出，并且缺乏相应的生物活性。可降解材料可以在体内降解，不需二次手术，但是同样存在着缺乏生物活性的问题。

因此，将磷酸钙类材料与可降解聚合物复合，制备复合生物材料是能够综合二者优点的一种方法。目前常常应用的是磷酸钙类材料的粉末与聚合物物理混和，再以热致相分离法制备出均一的多孔结构(Zhang R，Ma PX.Poly(alpha-hydroxyl acids)/hydroxyapatite porouscomposites for bone-tissue engineering.I.Preparation and morphology.J Biomed MaterRes 1999；44(4)：446-55；Liao SS，Cui FZ，Zhang W，Feng QL.Hierarchically biomimeticbone scaffold materials：nano-HA/collagen/PLA composite.J Biomed Mater Res B ApplBiomater 2004；69(2)：158-65.)。但是由于是物理混和，不易得到很均匀的磷酸钙类材料的分布，并且在热致相分离的降温过程中，固体颗粒会有所沉降，也会造成颗粒分布的不均匀。

骨组织工程所需要的支架材料除了因需要承载细胞而保证一定大的孔隙率，孔径大小和连通性外，还需要一定的机械强度。而对于多孔支架来说，孔隙率和孔径越大，其机械性能越小。正常骨的骨质按照骨板排列形式和空间结构的疏密不同，分为松质骨和密质骨两种。密质骨致密坚硬，抗压抗扭曲能力强，分布于骨的表面，主要满足其机械性能的需要；内层松质骨结构疏松，骨小梁交错排列，形成疏松蜂窝状结构，骨髓即填充于骨松质的网眼中。

发明内容

本发明的目的是提供一种仿生骨组织工程支架及其制备方法，即模拟天然骨的结构，制备出兼顾孔隙率、孔径和机械性能的骨组织工程用支架，并且从成分上通过原位生成钙磷盐，特别是羟基磷灰石而提高生物材料的生物相容性和骨生物活性，制备出成分均匀，结构不均一的仿生骨组织工程支架。

本发明的技术方案是：一种仿生骨组织工程支架，其特征在于：该支架具有三层结构，最外层为致密的壳聚糖膜；中间层和最内层均由原位生成的纳米相钙磷盐与下列几种物质中的任一种构成的多孔结构：

a.壳聚糖，

b.壳聚糖和胶原的混合物，

c.壳聚糖和明胶的混合物。

本发明所述的仿生骨组织工程支架，其中间层和最内层的成分中原位生成的纳米相钙磷盐的钙磷比为Ca∶P＝1∶1～2∶1。所述的中间层多孔结构孔径大小为15～40μm；所述最内层多孔结构的孔径大小为40～300μm范围内，最优是在70～300μm范围内。

本发明提供了一种仿生组织工程支架的制备方法，该方法按如下步骤进行：

a)在搅拌下将钙盐水溶液和磷酸盐水溶液按照Ca∶P＝1∶1～2∶1的分子摩尔比依次逐滴滴入到酸溶的壳聚糖溶液、壳聚糖与胶原或壳聚糖与明胶的混和溶液中，充分搅拌均匀并脱气；

b)将混和溶液加入到带有芯棒的管状模具中，脱气，-20℃～-196℃冷冻12～48小时，取出脱掉模具外层，置冷冻干燥机中冻干；

c)冻干的材料连同芯棒一起浸入NaOH溶液中24～48小时，取出后用去离子水漂洗至中性，pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液平衡10～30分钟，干燥，得到多孔管状支架；

d)将步骤c)中得到的多孔管状支架浸入到壳聚糖乙酸溶液中5～10分钟，使之外层均匀涂覆一层壳聚糖溶液，置烘箱中干燥后再在NaOH溶液中浸泡15～25分钟脱酸，去离子水洗涤，pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液平衡，干燥，抽出芯棒，得到外层为壳聚糖膜的多孔管状支架；

e)封住管状支架的一端，将步骤a)中所得混和溶液灌入该管状支架的管腔中，-10℃～-20℃冷冻，冻干机中冻干；

f)冻干的材料浸入NaOH溶液中24～48小时，取出，去离子水漂洗至中性，pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液平衡10～30分钟，冻干机中冻干，制得具有多层结构的仿生骨组织工程支架。

本发明所述方法的步骤a)中的钙盐水溶液采用硝酸钙，氯化钙或碳酸钙中的一种；磷酸盐水溶液采用磷酸氢二铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的一种。

本发明的技术特征还在于：在纳米相钙磷盐的生成体系中钙磷的分子摩尔比最优为Ca∶P＝1.67∶1。

本发明与现有技术相比，具有以下优点即突出性相关：按照上述方法制备的仿生骨组织工程支架，模拟了骨的结构，通过对不同层的孔径结构的控制，达到提高机械强度又保证新生组织长入和营养物质运输的目的，并且最外层的壳聚糖膜除了进一步提高机械强度外，防止了纤维组织的长入影响缺损位点的修复。成分上原位生成的纳米相钙磷盐，提高了材料的生物相容性和骨传导性，并且在成分分布上更加均匀。

附图说明

图1为制备仿生骨组织工程支架的专用模具结构示意图。

1-顶部封盖；2-底部封盖；3-不锈钢外管；4-模具空腔；5-芯棒；6-聚四氟乙烯套管；7-气孔。

图2为仿生骨组织工程支架扫描电镜照片。

图3为仿生骨组织工程支架与均一孔结构支架的机械强度比较图。UPS(T)：均一结构支架横向机械性能；UPS(L)：均一结构支架纵向机械性能；RMLS(T)：仿生骨组织工程支架横向机械性能；RMLS(L)：仿生骨组织工程支架纵向机械性能；

具体实施方式

图1为本发明为制备仿生骨组织工程支架的专用模具结构示意图。该专用模具由顶部封盖1，底部封盖2，不锈钢外管3，芯棒5和聚四氟乙烯套管6组成。并在顶部封盖1上设有气孔7。

下面举出几个具体实施例对本发明所提供的方法作进一步的说明。

实施例1：

a)称取2g壳聚糖，溶于50ml 1.2％乙酸水溶液中，充分搅拌至完全溶解。分别取12ml的0.1mol/l Ca(NO₃)₂溶液和12ml的0.06mol/l(NH₄)₂HPO₄溶液，在强烈搅拌下，依次逐滴加入到壳聚糖溶液中，以保证每次加入少量溶液之后能够尽快均匀分散，避免局部浓度过高引起的pH值升高所导致的壳聚糖的析出。充分搅拌，使之成为完全均一溶液。4℃静置过夜或者真空泵脱气。

b)将步骤a)中所的溶液用注射器加入到模具空腔4中，注意缓缓加入以避免产生气泡。盖上模具封盖1，将其垂直缓缓放入液氮中，冷冻12小时后拿出，稍稍解冻后去掉顶部封盖1、底部封盖2和不锈钢外管3，-20℃继续冷冻30分钟，冻干机中冻干。

c)带着芯模的冻干材料慢慢浸入10％NaOH溶液中48小时，脱酸的同时在碱性条件下原位生成并继续陈化成为纳米级羟基磷灰石。

d)去离子水漂洗至中性，pH7.4的磷酸盐缓冲液中平衡30分钟，滤纸吸去残余水分，烘箱烘干。

e)配制1％的壳聚糖溶液，将d)中所得带芯棒的材料浸入其中，缓慢旋转，使其表面均匀涂覆一层壳聚糖溶液。垂直立于烘箱中烘干后再在2％NaOH溶液中浸泡25分钟脱酸，如上所述去离子水洗至中性，磷酸盐缓冲液平衡，干燥后抽取芯棒，即得壳聚糖纳米羟基磷灰石复合物管状支架。

f)封住e)中所得支架的一端，垂直放置，小心向其中心空隙灌入a)中所得溶液，-20℃冷冻12小时，冻干机中冻干。

g)冻干的材料浸入10％NaOH溶液中48小时，脱酸的同时在碱性条件下原位生成并继续陈化成为纳米级羟基磷灰石。

h)去离子水漂洗至中性，-20℃冷冻过夜，冻干机冻干，即得具有多层结构的仿生骨组织工程支架。

I)扫描电镜检测形貌，如图3所示

实施例2

a)称取1g壳聚糖，1g胶原，溶于50ml 1.2％乙酸水溶液中，充分搅拌至完全溶解。分别取12ml的0.1mol/l Ca(NO₃)₂溶液和12ml的0.1mol/l(NH₄)₂HPO₄溶液，在强烈搅拌下，依次逐滴加入到壳聚糖胶原混合溶液中，以保证每次加入少量溶液之后能够尽快均匀分散，避免局部浓度过高引起的pH值升高所导致的壳聚糖的析出。充分搅拌，使之成为完全均一溶液。4℃静置过夜或者真空泵脱气。

b)将a)中所得的溶液用注射器加入到模具空腔4中，注意缓缓加入以避免产生气泡。盖上模具封盖1，将其垂直放置于-20℃，冷冻24小时后拿出，稍稍解冻后去掉顶部封盖1、底部封盖2和不锈钢外管3，-20℃继续冷冻30分钟，冻干机中冻干。

c)带着芯模的冻干材料慢慢浸入10％NaOH溶液中48小时，脱酸的同时在碱性条件下原位生成并继续陈化成为纳米级钙磷盐。

d)去离子水漂洗至中性，pH7.2的磷酸盐缓冲液中平衡10分钟，滤纸吸去残余水分，烘箱烘干。

e)配制1％的壳聚糖溶液，将d)中所得带芯棒的材料浸入其中，缓慢旋转，使其表面均匀涂覆一层壳聚糖溶液。垂直立于烘箱中烘干后再在2％NaOH溶液中浸泡25分钟脱酸，如上所述去离子水洗至中性，磷酸盐缓冲液平衡，干燥后抽取芯棒，即得壳聚糖胶原纳米相钙磷盐复合物管状支架。

f)封住步骤e)中所得支架的一端，垂直放置，小心向其中心空隙灌入a)中所得溶液，-20℃冷冻48小时，冻干机中冻干。

g)冻干的材料浸入10％NaOH溶液中24小时，脱酸的同时在碱性条件下原位生成并继续陈化成为纳米级钙磷盐。

h)去离子水漂洗至中性，-20℃冷冻过夜，冻干机冻干，即得具有多层结构的仿生骨组织工程支架。

实施例3

a)称取1g壳聚糖，溶于50ml 1.2％乙酸水溶液中，充分搅拌至完全溶解。适量2％的明胶水溶液加入到壳聚糖溶液中，50℃下搅拌2小时混匀，分别取12ml的0.1mol/l Ca(NO₃)₂溶液和12ml的0.05mol/l(NH₄)₂HPO₄溶液，在强烈搅拌下，依次逐滴加入到壳聚糖溶液中，以保证每次加入少量溶液之后能够尽快均匀分散，避免局部浓度过高引起的pH值升高所导致的壳聚糖的析出。充分搅拌，使之成为完全均一溶液。4℃静置过夜或者真空泵脱气。

b)将a)中所得的溶液用注射器加入到模具空腔4中，注意缓缓加入以避免产生气泡。盖上模具封盖1，将其垂直慢慢进入液氮中，冷冻24小时后拿出，稍稍解冻后去掉顶部封盖1、底部封盖2和不锈钢外管3-20℃继续冷冻30分钟，冻干机中冻干。

c)带着芯模的冻干材料慢慢浸入10％NaOH溶液中24小时，脱酸的同时在碱性条件下原位生成并继续陈化成为纳米级钙磷盐。

d)去离子水漂洗至中性，pH7.4的磷酸盐缓冲液中平衡10分钟，滤纸吸去残余水分，烘箱烘干。

e)配制1％的壳聚糖溶液，将步骤d)中所得带芯棒的材料浸入其中，缓慢旋转，使其表面均匀涂覆一层壳聚糖溶液。垂直立于烘箱中烘干后再在2％NaOH溶液中浸泡25分钟脱酸，如上所述去离子水洗至中性，磷酸盐缓冲液平衡，干燥后抽取芯棒，即得壳聚糖明胶纳米级钙磷盐复合物管状支架。

f)封住e)中所得支架的一端，垂直放置，小心向其中心空隙灌入a)中所得溶液，-8℃冷冻48小时，冻干机中冻干。

g)冻干的材料浸入5％NaOH溶液中48小时，脱酸的同时在碱性条件下原位生成并继续陈化成为纳米相钙磷盐。

h)去离子水漂洗至中性，-20℃冷冻过夜，冻干机冻干，即得具有多层结构的仿生骨组织工程支架。

实验结果：

将所得仿生骨组织工程支架在材料试验机上检测其力学性能，该支架表现出机械强度的各向异性，并且与单纯多孔材料相比机械强度得到了显著提高。(图3)

将制备的具有多层结构的仿生骨组织工程复合支架移植入新西兰大白兔腓骨缺损模型的骨缺损处，检测其体内生物相容性以及骨修复活性。实验表明该材料植入缺损后表现出良好的生物相容性，基本没有炎症反应，并且由于多核巨细胞的吞噬作用，其降解速度快于体外模型。成骨性良好，主要表现为软骨内成骨和爬行替代两种成骨方式，并且在两个月后有髓样组织出现。植入材料的缺损修复部位血运丰富，生成大量新生血管来保证营养的供给。这些动物实验的结果表明该仿生材料有良好的生物相容性和成骨活性，适合做骨修复材料。

Claims (7)

1.一种仿生骨组织工程支架，其特征在于：该支架具有三层结构，最外层为致密的壳聚糖膜；中间层和最内层均由原位生成的纳米相钙磷盐与下列几种物质中的任一种构成的多孔结构：

a.壳聚糖，

b.壳聚糖和胶原的混合物，

c.壳聚糖和明胶的混合物。

2.按照权利要求1所述的仿生骨组织工程支架，其特征在于：所述的中间层和最内层的成分中原位生成的纳米相钙磷盐的钙磷比为Ca∶P＝1∶1～2∶1。

3.按照权利要求1或2所述的仿生骨组织工程支架，其特征在于：所述的中间层多孔结构孔径大小为15～40μm；所述最内层多孔结构的孔径大小在40～300μm范围内。

4.按照权利要求3所述的仿生骨组织工程支架，其特征在于：所述最内层多孔结构的孔径大小在70～300μm范围内。

5.一种制备如权利要求1～4任一权利要求所述的仿生骨组织工程支架的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

a)在搅拌下将钙盐水溶液和磷酸盐水溶液按照Ca∶P＝1∶1～2∶1的分子摩尔比依次逐滴滴入到酸溶的壳聚糖溶液、壳聚糖与胶原或壳聚糖与明胶的混和溶液中，充分搅拌均匀并脱气；

b)将步骤a)制备的混和溶液加入到带有芯棒的管状模具中，脱气，-20℃～-196℃冷冻12～48小时，取出脱掉模具外层，置冷冻干燥机中冻干；

c)冻干的材料连同芯棒一起浸入NaOH溶液中24～48小时，取出后用去离子水漂洗至中性，pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液平衡10～30分钟，干燥，得到多孔管状支架；

d))将步骤c)中得到的多孔管状支架浸入到壳聚糖乙酸溶液中5～10分钟，使之外层均匀涂覆一层壳聚糖溶液，置烘箱中干燥后再在NaOH溶液中浸泡15～25分钟脱酸，去离子水洗涤，pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液平衡，干燥，抽出芯棒，得到外层为壳聚糖膜的多孔管状支架；

e)封住多孔管状支架的一端，将步骤a)中所得混和溶液灌入该多孔管状支架的管腔中，-10℃～-20℃冷冻，冻干机中冻干；

f)冻干的材料浸入NaOH溶液中24～48小时，取出，去离子水漂洗至中性，pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液平衡10～30分钟，-20℃冷冻，冻干机中冻干，制得具有多层结构的仿生骨组织工程支架。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述的钙盐水溶液采用硝酸钙，氯化钙或碳酸钙中的一种；磷酸盐水溶液采用磷酸氢二铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的一种。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：在纳米相钙磷盐的生成体系中钙磷的分子摩尔比为Ca∶P＝1.67∶1。

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