CN100403028C - Bt-cry毒素的迅速检测 - Google Patents

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Abstract

本发明基于使用1)抗两种Cry毒素的2个多克隆IgG，2)从鳞翅目幼虫分离的Cry毒素受体以及3)制造免疫层析带的手工剥离方法，该层析带用于检测多种分析物。免疫层析带促进迅速检测分析物，如果用单克隆抗体产生带则费用贵且印度农民和推广人员不能承受。本发明的主要目的是简化检测Cry(Bt)毒素的免疫层析检测方法，使用特异于分析物的亲和纯化多克隆抗体，也提供一种在印度社会中适用于制造“Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab毒素”检测带的费用可接受且有力而简便的方法。抗Bt(抗Cry1 Ac或抗Cry2 Aa/Ab或两者)抗体或Cry受体蛋白通过手工剥离固定于硝酸纤维素膜。用酪蛋白或BSA和防腐剂封闭膜。抗Bt(抗Cry1 Ac或抗Cry2 Aa/Ab或两者)抗体用金标记并吸收在玻璃纤维膜上，此膜置于硝酸纤维素膜底部以重叠2mm。由于使用两种不同动物(山羊和兔)中培养的抗原亲和和蛋白A亲和纯化多克隆IgG，测定的特异性和精确性大为提高。Cry毒素检测侧向流动带的原理图示于所附图。因而产生的带代表迅速、敏感的装置和方法，用于检测Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab和结晶毒素的存在，它们来自转基因植物或在Bt-发酵产物中。方法和装置有高敏感性用于同时检测单一带上的一种或两种Cry毒素。使用本发明提供测定***，***含最少数量的步骤，即使由未经训练的人使用也产生可靠结果。

Description

BT-CRY毒素的迅速检测
技术领域
本发明涉及使用多克隆抗体的快速免疫层析测定，用于检测侧向流动带上种子或植物组织中的结晶毒素Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab。它特定关注从天然苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)分离的结晶毒素和用多克隆抗体的方法，培养抗体抗所述结晶毒素。发明更特定涉及用手工剥离方法的简化发展和特异性与精确性大为提高的测定，提高是通过使用两种不同动物-山羊和兔中培养的抗原亲和及蛋白A亲和纯化多克隆IgG。发明包括使用来自鳞翅目昆虫的结晶毒素受体作为捕获配基以检测结晶毒素。发明也促进同时检测单一带上的两种结晶毒素。
背景技术
土壤细菌苏云金芽孢杆菌生成一些蛋白晶体，对害虫有毒但对宿主植物和环境无害。用分离自细菌的基因遗传转化宿主植物使它们能合成所述毒素并抗击害虫。分离自苏云金芽孢杆菌的基因(通常也称为Bt-基因)用于在虫害抗性程序杂交中转化棉花(Gossypium hirsutum)和一些其它作物植物，基因如Cry1 Ac、cry 1Ab、Cry2 Aa和Cry2 Ab是这种遗传转化最常用的基因。
确认植物的遗传转化对杂交程序必须且有一些这样做的方法。此外，毒素在转化植物中的表达关键，因为这对毒素对害虫靶种类的效果有意义。如果虫害控制必须有效，转基因植物中的Cry1 Ac表达是最重要的特征，因此检测其表达也同样重要。一般用标准ELISA方法定量毒素表达，此外，随着检测转基因表达的免疫层析方法的出现，迅速测试变得可能。然而，当产生过程包括使用单克隆抗体和一些仪器时，免疫层析带昂贵。
发明内容
必须评估商业Bt-转基因作物的纯度以及效率(质量毒素表达)，评估是在不同阶段和水平-研究、技术发展和确认、环境影响、种子质量控制、培养领域、生产的商业份额等。任何迅速检测Bt-转基因技术的方法有用，此外，便宜的方法有价值。另一种选择可以是使用多克隆抗体代替单克隆抗体以发展免疫层析带而不影响检测种子或植物组织中cry表达的效率，因此它是本研究的一个目标。另一个目标是用最少仪器发展所述带，包括费用和价格更低。另外一个目标是发展用多克隆抗体检测所述表达的方法，培养抗体抗分离自天然苏云金芽孢杆菌菌株的结晶毒素。方法旨在提供有力且简便的方法，方法适用于发展免疫层析测定以检测Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab。
定量快速免疫诊断测试(Huang等(1988)一步免疫层析装置美国专利号5,712,172)普遍用于检测侧向流动测定中的抗原作为正或负对照。这种测定的例子包括怀孕检测试剂盒、AIDS检测和许多尿分析物类型。发展了以免疫层析检测方法为基础的Cry1 Ac检测试剂盒并分别由两个美国公司‘Agdia，USA’和‘StrategicDiagnostic Inc，USA’在2001年7月和2001年10月商品化。两家公司都在推广宣传文献中声称试剂盒是以单克隆抗体的组合为基础。因此，发展本发明方法的另一个目标是简化检测Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab的免疫层析检测方法，使用的多克隆抗体特异于分析物以及完整结晶毒素。
原理：来自动物如兔或山羊、包被金的多克隆免疫球蛋白(IgG)捕获Cry1Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab并通过毛细管作用沿膜携带它，直到Cry1 Ac/Cry1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab的游离末端结合捕获抗体线(来自动物如兔或山羊的多克隆免疫球蛋白(IgG))或N-氨基肽酶或钙粘着蛋白线，跨膜中间剥离线。金中包被的IgG积聚于捕获IgG线且产生指示Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab毒素存在的可见信号。样品中缺乏Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab时，金包被的IgG沿膜行进，结合山羊/兔抗兔/山羊抗体，积聚和产生可见信号。
制备N-氨基肽酶或钙粘着蛋白：根据发明的一个方面，从鳞翅目幼虫内脏中制备刷状缘膜泡，使用差别沉淀和离心方法，用甘露醇、乙二醇-二(β-氨基***)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和氯化镁(MgCl2)，依照Wolfersberger等(1987)《转运来自纹白蝶幼虫(Pierris brassicae)中肠的刷状缘膜泡的氨基酸制备和部分特征确定》(Preparation and partial characterization of amino acidtransporting brush border memebrane vescicles from the larval midgut ofthe cabbage butterfly(Pierris brassicae)).Comp.Biochem.Physiol.86A，301-308。含Cry蛋白N-氨基肽酶/钙粘着蛋白受体的小球用于剥离作为抗原捕获蛋白。
抗原：根据发明的第二个方面，分离出天然苏云金芽孢杆菌菌株‘x＞(theInstitute of Microbial Technology(IMTECH)，Chandigarh确定特性且通过抗生素抗性分布、菌落形态和生长特征来确定独特性质。生成晶体蛋白的基因cry1Ac/cry2A来自菌株质粒，用特异引物PCR扩增该基因，克隆到pUC18和pRK223-3表达载体中。通过差别离心、层析和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳从克隆中纯化结晶毒素。纯化毒素和培养抗血清抗特定毒素。
培养抗体：纯化的结晶毒素混合弗氏完全佐剂并注入兔/山羊。以每月间隔给予强化剂量，使用弗氏不完全佐剂中的溶解毒素，收集血清。用硫酸铵和IgG沉淀血清，纯化IgG用DEAE纤维素、蛋白A/蛋白G柱和/或必要时最终用Cry1Ac/Cry2A抗原亲和柱层析。
制备胶态金和IgG的缀合物。制备胶态金是通过在有色颗粒缀合物合成中柠檬酸还原金氯化物，标准方法和工程原理以前解释于Horisberger，(1979)《评估作为传送和扫描电镜的细胞色素标记的胶态金》(Evaluation of Colloidal Gold asa Cytochromic Marker for Transmission and Scanning Electron Microscopy)，Biol.Cellulaire，36，253-258；Leuvering等，(1980)《溶液颗粒免疫测定》(SolParticle Immunoassay)，J Immunoassay，1(1)：77-91和Frens(1973)《调节单分散金悬浮液中颗粒大小的控制成核》(Controlled Nucleation for the Regulationof the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions)，Nature，PhysicalScience，241：20-22。根据上述这些出版物所述操作中发表的方法将来自一种动物的亲和纯化抗体IgG缀合金并应用于30cm×1cm缀合物释放玻璃纤维垫。
制备侧向流动集合。聚酯塑料片(30×6cm)包被丙烯酸粘合剂且2.5×30cm尼龙/硝化纤维/硝酸纤维素膜带(S&S/Whatman/Millipore/Pall-Gelman)粘在塑料衬背上。对于2条毒素检测带和结晶毒素特异IgG或结晶毒素受体，手工剥离结晶毒素特异IgG作为在膜中间1.25cm和离膜底部1cm的30cm×0.1cm的线，对于单一毒素检测带，仅离膜两端1.25cm。手工剥离山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG，其为离膜顶端0.5cm的30cm×0.1cm的线。膜用缓冲液封闭，磷酸缓冲盐水洗涤两次，缓冲液含2％酪蛋白/BSA和3％脱脂奶粉，脱脂奶粉含糖和防腐剂。完全干燥膜后，干组合包被玻璃纤维垫置于膜下端以在其上面重叠2mm。30cm×1×0.1cm的厚纤维垫置于缀合物释放垫下端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背有效区域上。另一个30cm×1×0.1cm的纤维垫置于膜上端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背的膜有效区域上。用冷层叠片(cold-lamination sheet)使集合层叠并切成6cm×0.5cm带。
症状：在阳性样品中(用于单一毒素检测带)，出现2条线-指示带有功能的对照线和指示样品阳性的样品线。而在缺乏Cry1 Ac/Cry 1Ab/Cry2 Aa/Cry2 Ab的样品中，仅出现1条指示带有功能的线；样品检测为毒素阴性。设计在相同带上同时检测两种毒素(Cry1A和Cry2A)的带在对两种毒素都为阳性的样品中有3条线，或在对任一毒素为阳性的样品中仅有2条线，或如果样品对两种毒素都为阴性则仅有1条线(对照线)。
实施例(1)：制备快速免疫层析测定/带以检测Cry1Ac
1.从克隆中分离Cry1Ac，这是通过超声波降解细菌克隆培养物，沉淀去除细胞碎片和不溶毒素。毒素溶于碱性缓冲液并离心提取。通过25％饱和的硫酸铵沉淀和聚丙烯酰胺电泳完成毒素纯化。
2.通过分别注射纯化毒素在兔或山羊中培养抗Cry1Ac毒素的抗血清。
3.培养抗血清的方法是最初注射与弗氏完全佐剂混合的抗原(Cry1Ac)和与弗氏不完全佐剂混合的重复强化剂量，然后收集血清，此普通技术可获自免疫学教材(《抗体-实验室手册》(Antibodies-Alaboratory Manual)-Harlow Ed和DavidLane；Cold Spring Harbor Laboratory，USA，1988)且不在这里详细描述。
4.从抗血清中纯化免疫球蛋白IgG，这是通过硫酸铵沉淀，沉淀物溶于缓冲液和使其连续经过DEAE纤维素、蛋白A和抗原(Cry1Ac毒素)亲和柱。本文所用方法详细描述于《抗体-实验室手册》(Harlow Ed和David Lane；Cold Spring HarborLaboratory，USA，1988)。
5.获自抗原亲和纯化的纯化IgG用0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2透析。
6.剥离兔/山羊中培养的抗Cry1Ac-IgG，作为2.5×30cm尼龙/硝化纤维/硝酸纤维素膜带(S&S/Whatman/Millipore/Pall-Gelman)一侧上离顶和底端1.25cm距离的中心线，厚1mm长30cm，使用手持式紫貂毛刷(编号0,00,000，1、2、3、4或5)，沿30cm尺支撑。
7.抗兔IgG/抗山羊IgG(可商业获自一些公司，包括Sigma Chemical Company，USA)溶于0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2并手工剥离，其为离膜顶端0.5cm的30cm×0.1cm的线。
8.膜在干燥吹风机下50℃干燥10-15分钟。
9.随后用缓冲液封闭膜，缓冲液含2％酪蛋白/BSA和3％脱脂奶粉，脱脂奶粉含1-5％蔗糖和叠氮化钠防腐剂，用0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2洗涤两次。
10.膜在干燥吹风机下50℃干燥10-15分钟。
11.聚酯塑料片(30×6cm)包被丙烯酸粘合剂且膜粘于薄片中间，离顶和底端等距。
12.胶态金可商业获自Sigma Chemical Company，USA。亲和纯化的抗Cry1Ac-IgG在pH8.5到9.0的硼酸缓冲液中稀释到2mg/ml，搅拌加入胶态金(pH调至9.0)。通过加入10％BSA(牛血清白蛋白)到混合物来稳定缀合物。
13.缀合物以12,000g 4℃离心30分钟以获得松沉淀。沉淀溶于100ml溶液，溶液含0.01M Tris、5％BSA、2％蔗糖、0.87％NaCl和0.1M叠氮化钠。
14.胶态金缀合溶液应用于30cm×1cm缀合物释放玻璃纤维垫且在干燥吹风机下燥10-15分钟。
15.干缀合物包被的玻璃纤维垫置于步骤10所述膜下端以在上面重叠2mm。
16.30×1×0.1cm的厚纤维垫置于缀合物释放垫下端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背有效区域上。这里所指末端是底端。
17.另一个30×1×0.1cm的纤维垫置于膜上端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背的膜有效区域上。这里所指末端是顶端。
18.用冷层叠片使集合层叠并切成6cm×0.5cm带。
19.植物组织(ca.50mg)如叶、茎、根、花、种子等在1.5ml微量离心塑料瓶内的0.5ml 0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2中碾碎，使用Teflon研杵。
20.带底端浸入含碾碎叶/种子的小瓶。溶液向上流动到玻璃纤维垫中且通过毛细管作用沿膜上升。
21.约10到15分钟内，溶液到达带顶端。膜区域顶端下1cm的上面部分出现一条清楚的紫色线，指示膜有功能。这称为对照线。如果测试样品对Cry1Ac阳性，在膜中央部分出现另一条紫色线。
22.因此在Cry1Ac阳性样品中出现2条线-指示带有功能的对照线和指示样品阳性的样品线。而在缺乏Cry1Ac的样品中，仅出现1条指示带有功能的线；样品检测为毒素阴性。
实施例(2)：制备快速免疫层析测定/带以检测Cry1Ac/Cry2Ab，使用Cry-毒素受体蛋白作为捕获配基。
1.从克隆中分离Cry1Ac和Cry2Aa/Cry2Ab，这是通过超声波降解细菌克隆培养物，沉淀去除细胞碎片和不溶毒素。毒素溶于碱性缓冲液并离心提取。通过25％饱和的硫酸铵沉淀和聚丙烯酰胺电泳完成毒素纯化。
2.通过分别注射纯化毒素在兔或山羊中培养抗Cry1Ac/Cry2Aa/Cry2Ab毒素的抗血清。
3.培养抗血清的方法是最初注射与弗氏完全佐剂混合的抗原(Cry1Ac/Cry2Aa/Cry2Ab)和与弗氏不完全佐剂混合的重复强化剂量，然后收集血清，此普通技术可获自免疫学教材(《抗体-实验室手册》-Harlow Ed和David Lane；Cold Spring Harbor Laboratory，USA，1988)且不在这里详细描述。
4.从抗血清中纯化免疫球蛋白IgG，这是通过硫酸铵沉淀，沉淀物溶于缓冲液和使其连续经过DEAE纤维素、蛋白A和抗原(Cry1Ac/Cry2Aa/Cry2Ab毒素)亲和柱。本文所用方法详细描述于《抗体-实验室手册》(Harlow Ed和David Lane；ColdSpring Harbor Laboratory，USA，1988)。
5.获自抗原亲和纯化的纯化IgG用0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2透析。
6.从鳞翅目幼虫内脏中制备刷状缘膜泡(BBMVs)，使用差别沉淀和离心方法，用甘露醇、乙二醇-二(β-氨基***)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和氯化镁(MgCl2)，依照Wolfersberger等(1987)所述操作。从BBMVs中纯化Cry蛋白受体，使用硫酸铵和标准旋转柱层析方法。
7.剥离cry-毒素受体蛋白，作为2.5×30cm尼龙/硝化纤维/硝酸纤维素膜带(S&S/Whatman/Millipore/Pall-Gelman)一侧上离顶和底端1.25cm距离的中心线，厚1mm长30cm，使用手持式紫貂毛刷(号0,00,000，1、2、3、4或5)，沿30cm尺支撑。
8.抗兔IgG/抗山羊IgG(可商业获自一些公司，包括Sigma Chemical Company，USA)溶于0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2并手工剥离，作为离膜顶端0.5cm的30cm×0.1cm的线。
9.膜在干燥吹风机下50℃干燥10-15分钟。
10.随后用缓冲液封闭膜，缓冲液含2％酪蛋白/BSA和3％脱脂奶粉，脱脂奶粉含1-5％蔗糖和叠氮化钠防腐剂，用0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2洗涤两次。
11.膜在干燥吹风机下50℃干燥10-15分钟。
12.聚酯塑料片(30×6cm)包被丙烯酸粘合剂且膜粘于薄片中间，离顶和底端等距。
13.胶态金可商业获自Sigma Chemical Company，USA。亲和纯化的抗Cry1Ac-IgG或抗Cry2Ab-IgG在pH8.5到9.0的硼酸缓冲液中稀释到2mg/ml，搅拌加入胶态金(pH调至9.0)。通过加入10％BSA(牛血清白蛋白)到混合物来稳定缀合物。
14.缀合物以12,000g 4℃离心30分钟以获得松沉淀。沉淀溶于100ml溶液，溶液含0.01M Tris、5％BSA、2％蔗糖、0.87％NaCl和0.1M叠氮化钠。
15.胶态金缀合溶液应用于30cm×1cm缀合物释放玻璃纤维垫且在干燥吹风机下燥10-15分钟。
16.干缀合物包被的玻璃纤维垫置于步骤10所述膜下端以在上面重叠2mm。
17.30×1×0.1cm的厚纤维垫置于缀合物释放垫下端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背有效区域上。这里所指末端是底端。
18.另一个30×1×0.1cm的纤维垫置于膜上端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背的膜有效区域上。这里所指末端是顶端。
19.用冷层叠片使集合层叠并切成6cm×0.5cm带。
20.植物组织(ca.50mg)如叶、茎、根、花、种子等在1.5ml微量离心塑料瓶内的0.5ml 0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2中碾碎，使用Teflon研杵。
21.带底端浸入含碾碎叶/种子的小瓶。溶液向上流动到玻璃纤维垫中且通过毛细管作用沿膜上升。
22.约10到15分钟内，溶液到达带顶端。膜区域顶端下1cm的上面部分出现一条清楚的紫色线，指示膜有功能。这称为对照线。如果测试样品对Cry1Ac或Cry2Aa/Cry2Ab阳性，这取决于所用缀合抗体，则在膜中央部分出现另一条紫色线。
23.因此在Cry1Ac或Cry2Aa/Cry2Ab阳性样品中出现2条线-指示带有功能的对照线和指示样品阳性的样品线。而在缺乏任何这2个毒素组的样品中，仅出现1条指示带有功能的线；样品检测为毒素阴性。
实施例(3)：制备快速免疫层析测定/带以同时检测Cry1Ac和Cry2Ab。
1.从克隆中分离Cry1Ac和Cry2Aa/Cry2Ab，这是通过超声波降解细菌克隆培养物，沉淀去除细胞碎片和不溶毒素。毒素溶于碱性缓冲液并离心提取。通过25％饱和的硫酸铵沉淀和聚丙烯酰胺电泳完成毒素纯化。
2.通过分别注射纯化毒素在兔或山羊中培养抗Cry1Ac/Cry2Aa/Cry2Ab毒素的抗血清。
3.培养抗血清的方法是最初注射与弗氏完全佐剂混合的抗原(Cry1Ac/Cry2Aa/Cry2Ab)和与弗氏不完全佐剂混合的重复强化剂量，然后收集血清，此普通技术可获自免疫学教材(《抗体-实验室手册》-Harlow Ed和David Lane；Cold Spring Harbor Laboratory，USA，1988)且不在这里详细描述。
4.从抗血清中纯化免疫球蛋白IgG，这是通过硫酸铵沉淀，沉淀物溶于缓冲液和使其连续经过DEAE纤维素、蛋白A和抗原(Cry1Ac/Cry2Aa/Cry2Ab毒素)亲和柱。本文所用方法详细描述于《抗体-实验室手册》(Harlow Ed和David Lane；ColdSpring Harbor Laboratory，USA，1988)。
5.获自抗原亲和纯化的纯化IgG用0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2透析。
6.剥离兔/山羊中培养的抗Cry1Ac-IgG，作为2.5×30cm尼龙/硝化纤维/硝酸纤维素膜带(S&S/Whatman/Millipore/Pall-Gelman)一侧上离顶和底端1.25cm距离的中心线，厚1mm长30cm，使用手持式紫貂毛刷(号0,00,000，1、2、3、4或5)，沿30cm尺支撑。
7.剥离兔/山羊中培养的抗Cry2Aa/Cry2Ab-IgG，作为2.5×30cm尼龙/硝化纤维/硝酸纤维素膜带(S&S/Whatman/Millipore/Pall-Gelman)一侧上离顶和底端1.0cm距离的中心线，厚1mm长30cm，使用手持式紫貂毛刷(号0,00,000，1、2、3、4或5)，沿30cm尺支撑。
8.抗兔IgG/抗山羊IgG(可商业获自一些公司，包括Sigma Chemical Company，USA)溶于0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2并手工剥离，其为离膜顶端0.5cm的30cm×0.1cm的线。如果缀合物垫IgG来自山羊，抗山羊IgG用作对照线。类似的，如果缀合物垫IgG来自兔，抗兔IgG用作对照线。
9.膜在干燥吹风机下50℃干燥10-15分钟。
10.随后用缓冲液封闭膜，缓冲液含2％酪蛋白/BSA和3％脱脂奶粉，脱脂奶粉含1-5％蔗糖和叠氮化钠防腐剂，用0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2洗涤两次。
11.膜在干燥吹风机下50℃干燥10-15分钟。
12.聚酯塑料片(30×6cm)包被丙烯酸粘合剂且膜粘于薄片中间，离顶和底端等距。
13.胶态金可商业获自Sigma Chemical Company，USA。亲和纯化的抗Cry1Ac-IgG在pH8.5到9.0的硼酸缓冲液中稀释到2mg/ml，搅拌加入胶态金(pH调至9.0)。通过加入10％BSA(牛血清白蛋白)到混合物来稳定缀合物。
14.胶态金可商业获自Sigma Chemical Company，USA。亲和纯化的抗Cry2Aa/Cry2Ab-IgG在pH8.5到9.0的硼酸缓冲液中稀释到2mg/ml，搅拌加入胶态金(pH调至9.0)。通过加入10％BSA(牛血清白蛋白)到混合物来稳定缀合物。
15.缀合物以12,000g 4℃离心30分钟以获得松沉淀。沉淀溶于100ml溶液，溶液含0.01M Tris、5％BSA、2％蔗糖、0.87％NaCl和0.1M叠氮化钠。
16.Cry1Ac和Cry2Aa/Cry2Ab的胶态金缀合溶液等量混合并应用于30cm×1cm缀合物释放玻璃纤维垫且在干燥吹风机下燥10-15分钟。
17.干缀合物包被的玻璃纤维垫置于步骤10所述膜下端以在上面重叠2mm。
18.30×1×0.1cm的厚纤维垫置于缀合物释放垫下端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背有效区域上。这里所指末端是底端。
19.另一个30×1×0.1cm的纤维垫置于膜上端以重叠2mm并用丙烯酸粘合剂粘在塑料衬背的膜有效区域上。这里所指末端是顶端。
20.用冷层叠片使集合层叠并切成6cm×0.5cm带。
21.植物组织(ca.50mg)如叶、茎、根、花、种子等在1.5ml微量离心塑料瓶内的0.5ml 0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.2中碾碎，使用Teflon研杵。
22.带底端浸入含碾碎叶/种子的小瓶。溶液向上流动到玻璃纤维垫中且通过毛细管作用沿膜上升。
23.约10到15分钟内，溶液到达带顶端。膜区域顶端下1cm的上面部分出现一条清楚的紫色线，指示膜有功能。这称为对照线。如果测试样品对Cry1Ac/1Ab或Cry2Aa/Cry2Ab都为阳性，膜中央部分出现2条紫色线。对于Cry1Ac/1Ab，在对应于离膜底部1.25cm的中央部分仅出现1条线，或对于Cry2Aa/Cry2Ab，在对应于离膜底部1.0cm的中央部分仅出现1条线。
24.因此在Cry1Ac/1Ab或Cry2Aa/Cry2Ab阳性样品中仅出现2条线-指示带有功能的对照线和指示样品对Cry1Ac/1Ab或Cry2Aa/Cry2Ab阳性的样品线。而在缺乏Cry1Ac/1Ab或Cry2Aa/Cry2Ab的样品中，仅出现1条指示带有功能的线；样品检测为毒素阴性。如果出现3条带(包括对照带)，表明样品对Cry1Ac/1Ab和Cry2Aa/Cry2Ab都为阳性。
优势
1.本文所述方法使用多克隆抗体和手工剥离方法，实行简单且不需商业生产类似带种类中所用的昂贵‘单克隆抗体或单克隆技术和花费≥20,000美元的剥离设备’。
2.本发明的方法使用亲和纯化的在两种不同动物中培养的免疫球蛋白(IgG)，因而提高检测敏感性。
3.发明能同时检测单一带上的两种或更多毒素，因此降低用于相同目的的2条或更多带成本。
4.在带中使用‘Cry毒素受体’能高敏感检测对所关注鳞翅目昆虫有毒的任意Cry毒素，受体从此昆虫中分离。
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Claims (9)

1.一种用提取自昆虫的Bt-Cry-毒素-受体-蛋白制备快速免疫层析侧向流动带的方法，所述侧向流动带用于检测种子或植物组织中的苏云金芽孢杆菌Cry毒素，所述方法包括步骤：
(i)用标准方法从对Cry毒素高度易感的鳞翅目昆虫中提取Bt-Cry受体蛋白，从鳞翅目幼虫内脏分离刷状缘膜泡，并用30-80％硫酸铵通过蛋白沉淀方法纯化N-氨基肽酶和钙粘着蛋白；
(ii)用手持式紫貂毛刷，使用手工画线法，在5到12微米的硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜上固定30cm×0.1cm的捕获线，所述捕获线含有步骤(i)中所述受体蛋白，所述捕获线距离各侧向流动带中膜的顶端1.25cm；
(iii)用手持式紫貂毛刷，使用手工画线法，在5到12微米的硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜上固定30cm×0.1cm的对照线，所述对照线含有山羊抗兔IgG，所述对照线距离各侧向流动带中膜的顶端0.5cm；
(iv)膜用含有蛋白质、糖和防腐剂的封闭缓冲液封闭，并用磷酸缓冲盐水洗涤两次并干燥30分钟，然后组装；
(v)用胶态金20-40nm标记步骤(i)中所述受体蛋白；
(vi)用胶态金20-40nm标记兔IgG；
(vii)将等量的步骤(v)和步骤(vi)中所述金标记的蛋白质混合；
(viii)用微量移液管在玻璃纤维垫上固定步骤(vi)的金-抗体缀合物；
(ix)将步骤(viii)中所述浸透了金-缀合物的玻璃纤维叠放在步骤(iv)中所述的膜上，重叠2mm；
(x)将1-2mm厚的样品释放滤纸垫置于步骤(ix)所得组件的底端以与玻璃纤维重叠2mm，将第二个样品吸收垫置于步骤(iv)所述膜的顶端以重叠2mm，由此完成组装；
(xi)冷层完成的组合件；
(xii)步骤(iii)的山羊抗兔IgG线捕获金标记的兔抗体，作为对照线以指示所述带功能正常；
(xiii)步骤(xii)所述线会变成粉色/紫色，无论测试样品是阳性或阴性；
(xiv)采用步骤(ii)中所述受体蛋白捕获线与金标记的受体蛋白的组合，cry毒素被夹在中间并在步骤(ii)所述配体捕获线位置形成一条累积金标记受体蛋白线，由此以可见线形式表明捕获了毒素；
(xv)包括步骤i至xiv的上述方法不需要培养抗Cry毒素的抗体，可检测多种毒素。
2.如权利要求1所述的方法，所述鳞翅目昆虫选自稻螟蛉(semilooper Anomisflava)，红铃虫(bollworm)和棉铃虫(helicoverpa armigera)。
3.如权利要求1所述的方法，所述毒素选自Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2Aa和Cry2Ab。
4.将提取自鳞翅目昆虫内脏的Cry-毒素受体作为配体捕获蛋白与金标记的抗Cry多克隆抗体联合用于制备快速免疫层析侧向流动带的方法，所述侧向流动带用于检测种子或植物组织中的各特定苏云金芽孢杆菌Cry毒素，所述方法包括步骤：
(i)用标准方法自对Cry毒素高度易感的鳞翅目昆虫中提取Bt-Cry受体蛋白，从鳞翅目幼虫内脏分离刷状缘膜泡，并用30-80％硫酸铵蛋白通过沉淀方法纯化N-氨基肽酶和钙粘着蛋白；
(ii)用手持式紫貂毛刷，使用手工画线法，在5到12微米的硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜上固定30cm×0.1cm的捕获线，所述捕获线含有步骤(i)中所述受体蛋白，所述捕获线距离各侧向流动带中膜的顶端1.25cm；
(iii)用手持式紫貂毛刷，使用手工画线法，在5到12微米的硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜上固定30cm×0.1cm的对照线，所述对照线含山羊抗兔IgG，所述对照线距离各侧向流动带中膜的顶端0.5cm；
(iv)膜用含有蛋白质、糖和防腐剂的封闭缓冲液封闭，并用磷酸缓冲盐水洗涤两次并干燥30分钟，然后组装；
(v)鉴定独特的天然苏云金芽孢杆菌菌株，通过抗生素抗性分布、菌落形态和生长特征来确定所述菌株特征，用特异引物从所述菌株的质粒扩增生成晶体蛋白的基因并克隆到特定的表达载体中；
(vi)使用包括层析和电泳在内的多种方法纯化Cry1Ac和Cry2Aa至明显均匀；
(vii)通过给兔周期性注射强化剂量的与佐剂混合的结晶毒素在兔中培养步骤(vi)中所述毒素的多克隆抗体，收集血清，沉淀血清，纯化抗体；
(viii)用包含蛋白A和Cry1Ac/Cry2Aa抗原的亲和层析法从步骤(vii)中所述抗血清中纯化IgG；
(ix)用胶态金20-40nm标记步骤(viii)中所述多克隆IgG抗体；
(x)在玻璃纤维垫上固定步骤(ix)中所述金-抗体缀合物；
(xi)将步骤(x)中所述浸透了金-缀合物的玻璃纤维叠放在步骤(iv)所述的膜上，重叠2mm；
(xii)将1-2mm厚的样品释放滤纸垫置于步骤(xi)所得组件的底端并在玻璃纤维上重叠2mm，将第二个样品吸收垫置于步骤(iv)所述膜的顶端以重叠2mm，由此完成组装；
(xiii)冷层完成的组合件；
(xiv)所述步骤(iii)的山羊抗兔IgG线捕获金标记的兔抗体，作为对照线以指示所述带功能正常；
(xvi)步骤(xiv)所述线会变成粉色/紫色，无论测试样品是阳性或阴性；
(xvii)用在步骤(ii)中所述受体蛋白捕获线与步骤(ix)和(x)中所述金标记的抗Cry抗兔IgG构成的组合，cry毒素被夹在中间，并在步骤(ii)所述配体捕获线位置形成一条累积金标记受体蛋白线，由此以可见线形式表明捕获了毒素；
(xviii)对针对各特定毒素培养的IgG进行金标记，上述方法可特异性检测多种特定毒素。
5.如权利要求4所述的方法，所述鳞翅目昆虫选自稻螟蛉(semilooper Anomisflava)，红铃虫(bollworm)和棉铃虫(helicoverpa armigera)。
6.如权利要求4所述的方法，所述毒素选自Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2Aa和Cry2Ab。
7.用多克隆抗体作为配体捕获线与金标记的受体蛋白组合用于制备快速免疫层析测序流动带的方法，所述侧向流动带用于同时检测种子或植物组织中两种或两种以上苏云金芽孢杆菌Cry毒素，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)如权利要求4步骤(v)所述生成Cry1Ac和Cry2Aa毒素；
(ii)如权利要求4步骤(vi)所述使用包括层析和电泳在内的多种方法纯化Cry1Ac和Cry2Aa到明显均匀；
(iii)如权利要求4步骤(vii)所述在兔中培养毒素的多克隆抗体，得到抗血清；
(iv)如权利要求4步骤(viii)所述，用包含蛋白A和Cry1Ac/Cry2Aa抗原的亲和层析法从抗血清中纯化IgG；
(v)使用步骤(iv)所述的抗Cry多克隆IgG，固定于5到12微米的硝酸纤维素、硝化纤维或尼龙膜上，使用手工画线，用手持式紫貂毛刷；
(vi)将两条捕获线固定于中央部分，各自距离步骤(v)所述2.5cm宽的膜的两端1cm，彼此分开0.5cm，所述捕获线包含步骤(iii)和(iv)中所述兔抗Cry1Ac多克隆IgG和步骤(iv)中所述兔抗Cry2Aa IgG；
(vii)手工画30cm×0.1cm的山羊抗兔IgG线，距离各带中膜顶端0.5cm；
(viii)膜用含有蛋白质、糖和防腐剂的封闭缓冲液封闭，并用磷酸缓冲盐水洗涤两次并干燥30分钟，然后组装；
(ix)用胶态金20-40nm标记权利要求2步骤(i)中所述受体蛋白；
(x)用胶态金20-40nm标记兔IgG；
(xi)将等量的步骤(ix)和步骤(x)中的金标记的蛋白质混合；
(xii)用微量移液管在玻璃纤维垫上固定步骤(xi)的金-抗体缀合物；
(xiii)将步骤(xii)中所述的浸透了金-辍合物的玻璃纤维叠放在步骤(viii)所述的膜上，重叠2mm；
(xiv)将1-2mm厚的样品释放滤纸垫置于步骤(xiii)所述组件上，与其玻璃纤维底端重叠2mm，第二个样品吸收垫置于步骤(xiii)所述膜顶端，重叠2mm；
(xv)冷层完成的组合件；
(xvi)步骤(vii)所述山羊抗兔IgG将捕获金标记的兔抗体，作为对照线表明所述侧向流动带功能正常；
(xvii)步骤(xvi)所述线会变成粉色或紫色，不论样品是阳性还是阴性；
(xviii)通过采用由步骤(iv)中所述固定为配体捕获线-1的Cry毒素特异性IgG和固定为配体捕获线-2的第二Crg毒素特异性IgG，与金标记的受体蛋白构成的组合，相应的Cry毒素被夹在其中，并在步骤(ii)中所述配体捕获线的位置形成累积金标记受体蛋白线，由此以可见线形式指示检测到毒素；
(xix)上述包括步骤1至xviii的方法能够在一张膜上一次检测一种以上特定毒素，根据获得的特异性IgG，可在一条侧向流动带上准确检测出数种毒素；
(xx)使用步骤(xix)中所述的的侧向流动带可以同时检测Cry1Ac/Cry1Ab和Cry2Aa/Cry2Ab，如果测试样品对两种毒素为阳性则有两条线，如果测试样品对任一毒素为阳性则为单一样品线，如果测试样品为阴性则带上的样品线位置没有显示；
(xxi)所述样品线位置将被固定为Cry1Aa/Cry1Ac线在下，Cry2Aa/Cry2Ab线在上，或相反即Cry1Aa/Cry1Ac线在上；
(xxii)出现所述样品线是由于金标记的受体蛋白积聚，所述受体蛋白结合毒素，经毛细管作用沿膜移动，直到遇到样品捕获线，一旦金标记的抗Cry毒素抗体-毒素缀合物接触样品捕获线，则毒素被结合，因此形成三明治样，并导致金缀合物沿线积聚，聚集的金缀合物呈现为可见线。
8.如权利要求7所述的方法，步骤(xix)中所述毒素选自Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2Aa和Cry2Ab。
9.如权利要求7所述的方法，步骤(xxii)中，所述受体蛋白结合毒素Cry1Ac/Cry1Ab或Cry2Aa或Cry2Ab。
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