CN100393814C - 一种得自海洋无脊椎动物的天然荧光染料和含有此染料的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取、纯化和鉴定一种从海产棘皮动物Holothuriascabra中得到的荧光染料的方法，及含有此染料的组合物和此染料的各种用途。

Description

一种得自海洋无脊椎动物的天然荧光染料和含有此染料的组合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种从海产无脊椎动物，Holothuria scabra得到的新的荧光染料。本发明也提供了一种提取、纯化和鉴定此新染料的方法，该染料是从海产无脊椎动物特别是海参中得到的天然染料。海参是棘皮动物，属于棘皮动物类群的成员，棘皮动物也包括海星和海胆。它们具有以下分类学位置。

背景技术

所述海参有以下分类学位置：

亚界：后生动物

  门：棘皮动物门Echinodermata

    亚门：Eleutherozoa

        纲：海参纲

          亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)，

                枝手亚纲(Dendrochirotacea)，

                无足亚纲(Apodacea)

            目：枝手目(Dendrochirota)，

                  盾手目(Aspidochirota)，

                  平足目(Elasipoda)，

                  芋参目(Molpadonia)和

                  无足目(Apoda)

在这些目中，海参Holothuria scabra属于：

目：盾手目(Aspidochirota)

    科：海参科

        属：海参属

            种：scabra

棘皮动物是腔肠无脊椎动物，仅产于海中，从未有陆生，成年的形态是未分节的，呈五基数的放射状辐射对称，没有头或脑，与所有其它动物的区别在于骨骼和体腔的结构特点。海参纲有身体两侧对称的动物，通常沿口面-远口面的轴延长，在一端或接近一端的地方有口，在另一端或接近另一端的地方有***。其体表是粗糙的，内骨骼缩小成细的针状或片状，深入体壁中，附着于水的维管***的一副触须环绕口周围；通常有吸足或管状足并且是运动的；消化道为长的并是盘绕的，并且泄殖腔通常有呼吸树；性别通常是分开的，并且生殖腺为单一或成对丛生的细管。它们是定栖型，通过前端或后端的放射突出体或者附着于硬的基层上，或者穴居于软的沉积物内。它们出现在所有海域内，主要在浅水，少数几种在超过1000米的深水。有人也将Holo thuriasca bra这一种称为糙海参(Metriatyla scabraJaegea)，它广泛分布于东非、红海、盂加拉湾、东印度、澳大利亚、日本、南太平洋、菲律宾、印度洋和其它印度洋-太平洋区域。在沙巴洲、马来西亚和印度尼西亚和其他印度洋-太平洋国家它被用作人/动物的消费品(consumption)。

色素属于无机和有机类。前者是无机化合物，用于各种装饰和绘画等的目的。有机色素如有机染料要追溯到古代。即使在圣经时代(Biblicaltimes)之前，近东和远东国家报道了由植物如巴西木(Brazil wood)、log-wood、Persian berry indigo和茜草得到的染料的用途(George L.Clark，1966，《化学百科全书》(“Encyclopaedia of chemistry”)，第2版，833-835页)。Debra K.Hobson和David S.Wales描述了“绿色染料”，它是作为一些活的生物体如真菌、蓝绿藻类、海胆、海星类节肢动物和珊瑚礁类腔肠动物的第二代谢产物而产生的(Journal of the Socicty ofDyers and Colourists(JSDC)，114，42-44，1998)。这些是蒽醌化合物，历史上它们在染料工业中非常重要。着色剂档案-染料A卷(Stainsfile-Dyes A)给出264种染料的染料索引(Dye Index)。它们之中仅6种是从所有种类的生物体得到的天然染料。

http：//members.pgonline.com/～bryand/dyes/dyts.htm

最近，已公开了一些关于天然染料的专利，但它们主要是从植物中得到的。Wrolstad等，描述了从马铃薯提取物中得到的天然着色剂(美国专利No.6,180,154，公布于2001年1月30日)。Shrikhande，Anil J在1984年6月5日公开的美国专利No.4,452,822中报告了从葡萄果渣和其他物质中提取和浓集(intensification)花色素苷。Lenoble等在1999年6月1日发布的美国专利No.5,908,650中记载了一种增强花色素甙色素的红色的新组合物。

两个美国专利公开了产生类胡萝卜素的细菌，它们是：公开于1999年8月10日的美国专利5,935,808，发明人Hirschberg等；和公开于1999年1月12日的5,858,761，发明人Tsubokura等，Collin。Peter Donald在他的公开于2000年5月2日的美国专利6,055,936中公开了海参类胡萝卜素脂质成分及方法。

然而所有这些着色剂和染料并不是荧光性的。荧光染料公开于一些美国专利和国际申请中，其中多数是合成的。这些已用于各种应用中。在此领域中专利的数量显示了这些染料的重要性。

发现在λ(em)420nm发射荧光的合成对羟基联苯黄酮(parazoanthoxanthin)A(熔点214.2)，是胆碱酯酶的一种纯的竞争性抑制剂，Sepeie K，Turk T，Macek P(Toxicon，36(6)：937-940，1998)。Welch；David Emanuel(1999年11月23日发布的美国专利5,989,135)，公开了一种发光的高尔夫球。White等(2000年8月29的美国专利No.6,110,566和WO9920688)记载了显示持久荧光颜色的柔性的聚氯乙烯膜。

Dipietro Thomas C(国际申请WO9938916)公开了荧光聚合物色素在各种涂料、墨水和纺织品中的用途。Cramer Randall J(1986年12月30日公开的专利No.EP0206718)记载了一种用于含有荧光染料的组合物漂白和增亮聚合物。

泄漏检测是一些人公开的另一种用途(Leighley；Kenneth C.2000年5月2日的美国专利6,056,162)。Cooper等在公开于2000年12月26日的美国专利6,165,384中公开了一种用于同样目的的全光谱的荧光染料组合物。

Lichtwardt等1999年5月11日的美国专利US P.5,902749在自动化学计量***中使用了荧光染料。

几乎没有关于海洋动物的报告。Shimomura，O，Johnson，F.H.和Saiga，Y描述了从太平洋海蛰(pacific jellyfish)Aequora aequora中得到的绿色荧光蛋白GFP-一种新的报道基因(细胞和比较生理学杂志(Journal ofcellular and comparative physiology)，59，223-239，1962)。GPF的特征是有许多荧光色素细胞。纯化的GFP吸收在395nm最大并在470nm有一个次级峰的蓝光，并发射绿光。Sepcic K，Turk T，Macek P报道了一种荧光六放珊瑚(zoanthid)色素，对羟基联苯黄酮(parazoanthoxanthin)A。Toxicon，36(6)：937-940，1998。

海产染料本身或作为组合物的一部分具有多种用途。

一些作者已公开了用于多种目的的荧光染料混合物(Burns等，在1999年7月6日公开的美国专利No.5,920,429中；Burns；David M和PavelkaLee A，(国际申请AU704112)。海产染料组合物已用于多种用途中以标记坠毁飞机、救生筏和军事装备例如火箭的位置。这些通常已尝试过的染料是荧光素，为水溶性的合成染料。对为在稀释形式下得到荧光的更好效果和更长持续时间的不同的染料组合物进行试验(Swinton；Robert J，美国专利No.5,405,416，公开于1995年4月11日，国际专利申请WO9010044，公开于1990年7月7日)。Hyosu等(1977年4月5日，美国专利4,016,133)已制备了荧光染色的树脂颗粒。

Crosby David A和Ekstrom Philip A在1994年6月14日公开的美国专利No.5,321,268中报道了海产染料作为海底探测器的另一用途。此探测器装置包括含有荧光染料的中央光学纤维，该荧光染料被装入透明的或半透明的保护性的和防污垢的鞘中。这种探测器可以附着到海产动物上用来收集数据，例如海产动物穿行的区域的光强度和温度。

一些作者已经将UVA用于治疗皮肤癌的光化学疗法。Kowalzick L；OttA；Waldmann T；Suckow M；Ponnighaus J，M.Vogt landklinikum Plauen公开了淋巴瘤样的***瘤(lymphomatoid papulosis)(一种皮肤癌)的PUVA-浴光化学疗法，其中UVA治疗已显示出改善的效果(Elsevier Science B.V，2000)。牛皮癣病人广泛使用UVA日光床。

Sabatelli，Anthony D.(美国专利5,210,27，公布日1993年5月11日)公开了防止晒伤的色素细胞防晒组合物。色素细胞有能力吸收UVA和UVB波长的射线。

荧光染料在标记用于荧光显微镜检查的分子探针方面非常有用。荧光显微镜检查也称为反射光荧光显微镜法或外部荧光显微镜法，它对于非放射性原位杂交有很大的价值，因为它的高灵敏度和能激发3种不同的产生各自的光谱发射的免疫荧光团(immunofluorophore)的能力。它使多功能检测成为可能(第二章，非放射性原位杂交应用手册(Nonradioactive InSitu Hybridization Application Manual)，Boehringer Mannheim GmbH，Biochemica，德国印刷，1992)。其后的原理是：用对应于Stoke′s定律的激发波长照射样品时，此定律说明荧光射线的波长总长于激发波长(“荧光”，George L.Clark，1966，化学百科全书，第二版，435-436页)。原位杂交应用手册，第五章，Boehringer Mannheim GmbH，生物化学，德国印刷，1992，23-62页和奥林帕斯光学有限公司(日本，东京)的商品目录“Instructions BX-FLA Reflected Light Fluorescence attachment”16页，1999描述了在这些染料中使用的各种无放射活性荧光染料着色剂。

荧光显微镜的不同的激发立方晶格使用不同的着色剂。例如在用330-385激发立方晶格(cubes)时看DAPI(DNA染色，发射蓝色)、荧光素-dUTP、Hoechest33258，33342；在用450-480激发立方晶格时看FITC、吖啶橙(用于DNA，RNA激发绿色/黄色色调)、金胺；用510-550激发立方晶格时看罗丹明、RITC和碘化甲锭(Propidium Iodide)(DNA，激发橙色色调)。

Rosenblum Barnett B和Spurgeon Sandra L；Lee Linda G；Benson Scottc：Graham Ronald J在2000年10月5日公开的国际申请WO 0058406中使用了一套用于荧光染料的4，7-二氯罗丹明化合物作为分子探针。

LaClair；James J.(美国专利No.6,140,041，公开于2000年10月31日，和WO 9938919)公开了一种荧光染料的合成及其在蛋白质标记、DNA标记、单分子分光术和荧光方面的应用。

发明内容

这些应用采用了不同的方法；本发明报道的染料是天然染料而非合成的。它来源于海产动物而非来源于植物或微生物。部分纯化的染料是从无脊椎动物皮肤细胞中直接提取得到的。对于从海产动物中得到作为一种荧光染料的天然染料，这是第一次报道。海产动物来源于海参属，被称为Holothuria scobra的海参是一个新的来源。不同于多数其他已知的荧光合成染料，我们的染料不需要为在不同波长得到的不同的荧光色彩而与其他染料混合。它在3个不同激发波长发射3种不同颜色的荧光，可以具有多重用途。另外即使在已知的天然荧光染料中，例如最普遍的从海蛰中得到的绿色荧光蛋白(GFP)，我们的染料的性质是非蛋白质的，在室温更稳定达数月，并且不被微生物污染。它也有生物表面活性剂的性质。此染料的另一重要特点是在波长的低UV光谱范围(UVB)激发后，它发射在UVA波长范围的荧光。吸收和发射范围均可以输入选择性的应用程序中，据此可以优选在一特定位置的UV光谱。

本染料的一个重要方面是制备用于分子探针的非放射标记和复染色的组合物和试剂盒。在不同波长的激发给出等同于DAPI、FITC和PI的颜色效果。虽然它是一种单一染料，但集3种效果于一身。实际上，此单一的染料包括市场上已知的123种荧光染料的波谱的颜色(见因特网上的Bi tplane产品(荧光染料)

http://www.bitplane.ch/public/standard/Fluorochrome.htm.

然而另一方面是它在外部荧光显微镜法(epiflourescencemicroscopy)中作为荧光染料着色剂的用途，本文首次报道海产的天然染料的此方面用途。本申请提供了一种简单而快速的检查用于多种用途-如用荧光的原位杂交技术的分子诊断，快速诊断组织培养物、工业制剂中的生物污染物，实验室和野外条件下的水质检查-的细胞遗传学制剂的方法。

然而染料的另一方面是它作为非放射性标记试剂盒的组分，用于先进的分子生物学用途。

本发明的主要目的是提供一种从海参Holothuria scabra中得到的新的荧光染料。

本发明的另一目的是提供一种提取、部分纯化和鉴定从海产动物Holothuria scabra得到的所述天然染料/色素的方法。

本发明的另一目的是提供采用从Holothuria scabra的组织得到的染料的组合物。

本发明的另一目的是观察它作为杀昆虫剂和杀虫剂的效果。

本发明的另一目的是它作为外科药物的用途。

本发明还有另一目的是提供一种染料，它在特定激发波长发射在紫外、可见光谱的3个不同波长范围内的荧光。

本发明的另一目的是观察荧光和可见光谱分析和发射波长的范围。

本发明还有另一目的是观察染料在外部荧光显微镜立方晶格的紫外和可见范围的3种不同的有荧光颜色的发射。

本发明还有另一目的是观察用本发明的染料对筛选染色体、细胞和组织使用的细胞遗传载物片的荧光染色效果。

本发明还有另一目的是生物表面活性剂性质分析。

本发明还有另一目的是生成含有荧光染料作为分子探针的非放射性标记的试剂药箱。

相应地，本发明提供了一种从海参Holothuria scabra得到的新的荧光染料。本发明也提供了提取、分离个鉴定所述染料的方法。另外，本发明提供了含有此染料的组合物。

经过许多研究后，本申请已鉴定出一种从海产动物，特别是从无脊椎动物，更特别地从海参Holothuria scabra得到的新的荧光染料。

亚界：后生动物

门：棘皮动物门Echinodermata

  亚门：Eleutherozoa

      纲：海参纲

        亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)，

               枝手亚纲(Dendrochirotacea)，

               无足亚纲(Apodacea)

          目：枝手目(Dendrochirota)，

                盾手目(Aspidochirota)，

                平足目(Elasipoda)，

                芋参目(Molpadonia)和

                   无足目(Apoda)

在这些目中，海参Holothuria scabra属于：

   目：盾手目(Aspidochirota)

    科：海参科

     属：海参属

       种：scabra

本发明还提供了一种得自动物皮肤的新的荧光染料。本发明还描述了此染料的物理和化学性质及其在直射光、高和低温度下的稳定性。此染料在紫外和可见光谱的3个不同激发波长处有3种颜色的荧光发射。本发明也涉及在荧光显微镜下筛选细胞以快速检查污物和进行细胞遗传筛选。本发明也涉及到使用本染料作为蛋白、DNA和RNA分子探针的非放射性标记，用于先进的分子诊断及染色体、细胞和组织的单和双着色的外部荧光显微镜法，用于荧光原位杂交应用、生物表面活性剂、检查生物污染和泄漏、光-化学疗法、新的远程测向装置、水下探测器、救生设备，及标记坠毁飞机、救生筏和军事装备如火箭的位置，还有在低于0℃温度的条件下荧光的各种应用及许多更多的应用。

在这些用途中，目前使用藻胆蛋白质，与其不同，染料经冷冻不损失荧光。

在通常的透射光显微镜的100倍油镜下观察，蛋黄的蛋白质、活跃***细胞的核原生质和染色质显示着色的不同颜色，前者为棕黄色，后者为黄色，最后的细胞组分为深蓝色，这对可以在细胞的各种组织化学组分上看到的效果进行快速生物测定是有用的。

本发明描述了从海产动物得到的荧光染料，它们吸收阳光完成生理功能或暴露于阳光下更长的时间并显示有不同波长处的荧光进化的机制。如浮游植物、浮游微生物(picoplankton)和光合细菌吸收阳光以完成其光合功能，在化学途径中使用光谱的必需波长，而遵循Stoke定律发射额外的光。

无脊椎动物没有另外的外甲，如壳和显著的防卫器官，它有硬和多刺的皮肤，有由小骨形成的强的内骨骼，它们是定栖的或缓慢移动，长时间暴露于直射阳光下，生活在沙中或裂缝中，可以显现荧光。

本发明通过提供高效和高选择性的提取、纯化和鉴定由海产无脊椎动物得到的染料的方法，及其在制备使用非放射性标记的分子诊断的试剂盒、分子标记、外部荧光显微镜法、光化学疗法、新的土地测试设备和水下探测器的组成部分、化妆品工业、食品工业和军队等方面的多种用途，以克服在先技术的缺点。

所述的海洋无脊椎动物是棘皮动物，分类学上称为Holothuria scabra，属于海参纲。本发明的产品是一种首次报道的新染料。在落潮时从印度西海岸中部收集动物，带到实验室并保存在有海水的玻璃缸中，海水的盐度为30-32％/par。动物为成年动物并处于性成熟期。如上所述确定分类学位置。实际上，大多数可得到的染料实质上是合成的。仅有6类天然染料。包括从所有活的生物体得到的染料。本发明报道的荧光染料是它所属的一类仅有的一种从海产生物体中得到的。

此处所用的术语染料用于指不被还原剂退色的色素。所述的染料使纤维、纤维素等染色。它称为天然染料，因为来源于通常发现在自然界中沿地球的海岸分布的海产动物，而不是合成色素。荧光染料在从高到低电子状态的非常短时间内的跃迁过程中，在特定波长激发从而发光。

多颜色的荧光意味着当在不同波长范围被激发时发射不同颜色的光。它在通过紫外和可见光的不同光谱激发时，发射蓝、黄和橙色的荧光色彩。生物表面活性剂意味着一种染料溶液，如果摇动会产生肥皂样的泡沫，并显示抗微生物的性质。此处所用的分子诊断意味着使用染料作为分子探针的非放射性标记，用于分子细胞遗传学中的荧光原位杂交应用，并作为微阵列的标记物和用于分子生物学研究中。此处的外部荧光显微镜法属于对细胞遗传标本的载物片进行显微研究，通过用本发明的染料作为着色剂，并在用已知荧光染料激发而发射特定颜色的发射光的不同的立体构型下观察时，记录不同颜色的荧光。荧光染料立方晶格WUB、WB、WG是用于不同波长的Olympus BX-FLA反射光荧光附件指定的滤光器立方晶格构型。

相应地，本发明提供了一种提取、纯化和鉴定天然荧光染料的方法，该方法包括：

(i)从野外采集材料并保存在实验室条件下，

(ii)从棘皮动物海参Holothuria scabra的皮肤中提取色素，并

(iii)部分纯化此染料。从海产的海参Holothuria scabra中提取得到本发明的生物活性提取物。此提取物作为天然荧光染料并有以下特性：

i.不被还原剂脱色，

ii.不是合成化合物，

iii.染料的粗提物是黄绿色的，

iv.裸眼在日光下观察时，部分纯化的染料是微红棕色的粉末，

v.在管灯下，发出一些绿色的色彩，

vi.性质是无定形的，

vii.溶于水，

viii.不溶于有机溶剂，如乙醇、甲醇和丙酮，

ix.带负电荷，

x.pH为6.5，

xi.有酚性基团，

xii.没有醌型的环，

xiii.没有芳香胺基团，

xiv.性质上是非蛋白质的(non-proteinaceous)，

xv.没有还原糖，

xvi.染料有生物表面活性剂的性质，

xvii.染料还显示抗菌的性质，并进行抗菌测定时，显示抑制区带，

xviii.附有染料的色素是荧光染料，当用分光光度计的紫外和可见光谱范围的不同波长激发时发射荧光

xix.进行300nm-700nm的紫外、可见分光光谱测定，在379nm和439nm波长处标记有峰，

xx.进行250nm-350nm的紫外、可见分光光谱测定，在272nm和299nm波长有峰，

xxi.在紫外和可见光谱范围内进行荧光光谱测定，当用紫外270nm波长激发时，发射在324nm-380nm范围的荧光，它出现在日光的紫外线的UVA波长范围，

xxii.用荧光分光光度法的激发波长450nm，在500nm-580nm有最大强度的荧光发射，

xxiii.用荧光分光光度法的激发波长540nm，在500nm-620nm有最大强度的荧光发射，

xxiv.用荧光分光光度法的激发波长555nm，在575nm-620nm有最大强度的荧光发射，

xxv.在使用260nm-280nm范围的UV灯泡的紫外透照器和Cel文档***时，对浸渍有浓度为1∶40000稀释度的染料的1号Whatman滤纸进行物理学检查，发射蓝绿色荧光，

xxvi.在外部荧光显微镜的荧光立方晶格(cubes)的紫外和可见范围的3个不同波长处，发射3种不同颜色的荧光，

xxvii.当在远紫立方晶格WU-330nm-385nm的激发范围激发时，在UVA的380nm-400nm范围发射蓝色荧光，

xxviii.当在WB立方晶格的450nm-480nm的激发范围激发时，在500nm-570nm范围发射黄色荧光，

xxix.当在WG立方晶格的510nm-550nm的激发范围激发时，在570nm-650nm范围发射橙色荧光，

xxx.在10倍物镜下观察时，在通常的外部荧光显微镜的透射光灯泡下，染料发射灰色色调，

xxxi.甚至在稀释范围为1∶40000倍(即1gm染料粉末溶解在40升超纯水中)时，染料仍发射这些荧光颜色，

xxxii.甚至在室温放置至少1年后，提取物的荧光仍存在，

xxxiii.染料的荧光是高度耐光的，并且长时间暴露于直射光下时不被破坏，并且

xxxiv.即使在零下20℃(-20℃)冷冻，染料的荧光也不改变，在此温度下分子不能象在从发光生物体得到的提取物中那样获得活化所必需的能量。

可以用以下步骤评定染料的物理和其他特性：

(i)染料的结构分析，

(ii)生物表面活性剂分析，

(iii)抗菌试验，

(iv)染料的可见光谱，

(v)染料的荧光光谱，

(vi)在UV透照器260-280nm范围进行发射的物理检查，

(vii)用风干法制备细胞遗传载物片，

(viii)用染料使载物片着色，

(ix)在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微镜筛选细胞遗传载物片，

(x)在没有任何细胞遗传物质的载物片区域内对发射的荧光进行显微照相，

(xi)在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内对所发射的荧光进行显微照相，并且

(xii)检查发射的荧光色彩的波长范围和荧光染料立方晶格的激发范围的波长范围。

因此本发明提供来源于海产动物的天然荧光染料，当用外部荧光显微镜的紫外和可见光谱立方晶格的3种不同范围的波长激发时，它发射蓝、黄和橙3种不同色彩的荧光。本发明还涉及通过分别记录荧光分光光度计和可见光分光光度计的读数，记录接近激发波长的同样范围的发射峰。本发明还涉及用此染料作为外部荧光显微镜法的着色剂，在空气干燥标本上进行的细胞遗传材料的外部荧光显微镜法。可以用此染料制备非放射性标记试剂盒，在各种分子、生物医学和工程科学中通过荧光原位杂交用于分子诊断。

在本发明的一个实施例中，染料的来源是无脊椎海产动物，属于后生动物亚界，棘皮动物门，Eleutherozoa亚门，海参纲，名称为Holothuriascabra。

在另一实施例中，Holothuria scabra选自海参并广泛分布于全世界特别是印度洋的海滨、浅水、深水域。已知与海参有最接近的亲缘关系的是海胆和海星。

另一种从海参Holothuria scabra中提取天然荧光染料的方法，包括用渗透振动从海参Holothuria scabra的皮肤中提取染料的步骤，优选第一次在超纯水中加入50％乙醇，并重复此步骤至少4次以得到此染料。

在另一实施例中，分离Holothuria scabra的皮肤并称重。在15gm湿重的皮肤中加入250ml 50％乙醇，并在真空下用200rpm速率的蠕动泵过滤。

在另一实施例中，将提取物保持在80℃水浴中蒸发干燥至原体积的1/3，即从250ml浓缩至80ml。蒸发时间约需要3小时。

在另一实施例中，将100ml浓度为99.5％的乙醇加入80ml提取物的浓缩液中，并使之沉淀过夜。

在另一实施例中，将有沉淀的浓缩液以1500rpm转速离心4-5分钟，倾去上层。在80℃水浴中将沉淀蒸发5分钟至干，250ml 50％乙醇提取物经过蒸发得到2.5gm染料。在另一实施例中，用刮铲取出部分纯化的染料并储存在室温的干燥玻璃瓶中。

在另一方面，记录了染料的物理性质。纯的干燥染料在日光下为微红棕色。在管灯下观察到绿色的色彩。该染料溶于水，不溶于有机溶剂，如纯的乙醇、甲醇、氯仿和丙酮。它是无定形的。在水溶液中其pH为6.5。

在另一方面，用化学方法进行结构分析。染料溶解在蒸馏水中，浓度为2mg/ml并检查化学性质。

在另一实施例中，加入中性的三氯化铁，观察到紫色。它证明有酚性基团存在。

在另一实施例中，加入β-巯基乙醇还原剂，不发生化合物的脱色，这证明没有醌型环，并且该色素是一种染料。

在另一实施例中，通过加入0.1N HCl和NaNO₂(亚硝酸钠)，并加入β-萘酚的碱性溶液进行重氮化反应。未观察到沉淀。这证明不存在胺基.

在另一实施例中，加热浓缩了的浓度为10mg/ml的染料溶液，未观察到沉淀或凝聚物。这证明化合物是非蛋白质性质。向该同一溶液中加入1滴浓HCL，并加入Fehling′s溶液。没有颜色变化，证明没有还原糖。

在另一实施例中，向水中加入此染料并摇动将产生泡沫，从而观察到其生物表面活性剂的性质。

在另一实施例中，进行抗微生物试验并观察到抑制区带。

申请人研究了染料的性质并发现在不同激发波长产生多种颜色的发射，它能够与已进入市场的荧光染料显微着色剂相比。本染料的蓝色荧光可以与DAPI荧光染料在同样激发波长发射的同样颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记试剂盒的组分。本染料在可见范围的黄色荧光可以与金胺(碱性槐黄)的同样颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂的组分。本染料在可见范围的黄色荧光可以与FITC同样颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂的组分。本染料的橙色荧光发射可以与碘化甲锭(Propidium Iodide)荧光染料的橙色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂的组分。所述染料中，其中橙色荧光的发射能够与TRITC荧光染料的橙色荧光颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂的组分。该染料在室温是稳定的，并有长的搁置寿命。本染料的分子和非放射性试剂盒可以在室温下出口。该染料有至少123种市场已有的不同荧光染料的特性，这些市售荧光燃料确切地DAPI、Hoechest33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、金胺、罗丹明、TRITC和碘化甲锭(propidium iodide)。染料在显微镜的通常的光下，灰色的色彩产生相差效果，这对快速筛选细胞遗传学、细胞学和组织化学载物片是有用的，并可以节省额外的补充显微镜相位差的成分的费用。荧光颜色的发射服从Stoke′s定律。用Kodak胶卷的显微照相术显示相邻颜色发射波长的色彩，例如在显微照相术中的外部荧光显微镜下的蓝色荧光产生绿色色彩。用Kodak胶卷的显微照相术显示相邻颜色发射波长的色彩，例如当在显微照相术中的外部荧光显微镜下观察黄色荧光时，也产生绿色。在显微照相术中的外部荧光显微镜下观察橙色荧光时，也产生红色。观察荧光的细胞遗传学载物片由仅有染料而没有样品的背景产生了细胞的复染效果。

在另一方面，制作了在300nm-700nm波长的UV可见光谱(图3)，在379nm和439nm波长标记有峰。

在另一实施例，制作了250nm-350nm波长的UV光谱(图4)，在272nm和299nm波长标记有峰。

再另一方面中的荧光光谱，有270nm的激发波长，发生在324nm-380nm的荧光有最大强度(图5)。

在另一实施例中的荧光光谱，有450nm的激发波长，发生在500nm-580nm的荧光有最大强度(图6)。

在另一实施例中的荧光光谱，有540nm的激发波长，发生在500nm-620nm的荧光有最大强度(图7)。

在另一实施例中的荧光光谱有555nm的激发波长，发生在575nm-620nm的荧光有最大强度(图8)。

在另一实施例中，Whatman 1号滤纸在染料的提取物中浸湿，并在有260nm-280nm波长范围的紫外灯的紫外透照器下观察。它发出蓝色荧光。

在另一方面，用此染料的1∶10000(1gm/10升)的稀释液作为着色剂进行外部荧光显微法研究，并记录当用不同立方晶格激发时光的发射，并与已知荧光染料比较颜色色调。

不同的着色剂用于荧光显微镜的不同的激发立方晶格。例如在330nm-385nm激发立方晶格的激发下看DAPI(DNA染色，发射蓝色)、荧光-dUTP、Hoechest 33258、33342；在用450nm-480nm激发立方晶格时看FITC、吖啶橙(用于DNA、RNA发射绿色/黄色色彩)、金胺；在用510nm-550nm激发立方晶格时看罗丹明、TRITC和碘化甲锭(DNA，发射橙色色彩)。

在一个筛选细胞遗传载物片的外部荧光显微法的实施例中，筛选是在载物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为330-385nm波长的WU滤光器激发。

在另一个筛选细胞遗传载物片的外部荧光显微法的实施例中，筛选是在载物片上滴一滴提取物，用光谱范围为450-480nm波长的WB滤光器激发。

在另一个筛选细胞遗传载物片的外部荧光显微法的实施例中，筛选是在载物片上滴一滴提取物，用有光谱范围为510-550nm波长的WG滤光器激发。

在另一个筛选细胞遗传载物片的外部荧光显微法的实施例中，使用此染料，在Bright Field物镜下通过透射光观察。

在另一个筛选此染料着色的细胞遗传载物片的外部荧光显微法的实施例中，观察各自的激发所发射的荧光颜色的色彩。

在另一个实施例中，WU 330nm-385nm范围的激发发射的荧光在380nm-400nm范围。

在另一个实施例中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发发射的荧光在550nm-570nm范围。

在另一个实施例中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发发射的荧光在600nm-650nm范围。

在另一个在Bright Field物镜下筛选细胞遗传载物片的外部荧光显微法的实施例中，使用透射光，这种透射光根据细胞成分的密度所发射的光在可见光谱的整个白光范围内，从而产生相差效果。

在本发明的另一实施例中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速Kodak胶片，在WU 330nm-385nm范围，在没有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出蓝色荧光色彩。

在本发明的另一实施例中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速Kodak胶片，在WB 450nm-480nm范围，在没有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出黄色荧光色彩。

在本发明的另一实施例中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速Kodak胶片，在WG 510nm-550nm范围，在没有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出橙色荧光色彩。

在另一实施例中，在亮区域下(Bright field)，在没有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术。发出灰色色彩。

在另一实施例中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速Kodak胶片，在WU 330nm-385nm范围，在有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出蓝色荧光色彩。

在另一实施例中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速Kodak胶片，在WB 450nm-480nm范围，在有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出黄色荧光色彩。

在另一实施例中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速Kodak胶片，在WG 510nm-550nm范围，在有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出橙色荧光色彩。

在另一实施例中，在亮区域下(Bright field)，在有细胞的载物片区域进行发射荧光的显微照相术，发出灰色荧光色彩。

在本发明的另一方面，在蒸馏水中制备1∶10000倍稀释的染料，并作为着色剂，在外部荧光显微法的紫外和可见区域发生有色的荧光发射。

在另一实施例中，用水将染料稀释1∶40,000倍，在3个不同波长产生3种颜色的荧光。

在另一实施例中，本发明提供了一种生物活性组合物，其含有得自海参Holothuria scabra的提取物，在超纯水中的比例为1∶40000从得到的提取物，从而得到在3个不同波长的3种颜色的荧光，和在透射光下的相差效果。

本发明还提供了一种组合物，含有从海参Holothuria scabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂和用于制备显示荧光颜色的柔性聚氯乙烯膜。

在一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，用于制备包衣组合物和墨水。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，用于泄漏的检测。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，用在水下探测器中。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，用于皮肤癌的光化学治疗。

在另一实施例中，本发明提供了一种美容组合物，含有从海参Holothuria scabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，用作分子诊断中所用的原位杂交试剂盒中的荧光探针。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，用作生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射标记和检测试剂盒的组分。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，用于免疫荧光检测。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，用作DIG-标记的低聚核苷酸探针和抗DIG Fab-片段的复染剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，在流动血细胞计数中用于单一和多细胞荧光定量。

在另一实施例中，本发明提供了含有从海产海参Holothuria scabra得到的生物活性提取物，可以用在需要在处于0℃以下的田间条件下使用荧光染料的各种用途的实验中。在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuria scabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，用作外部荧光显微镜法的荧光着色剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，用于在健康食品工业、化妆品工业、药物和化学工业中快速检查生物污染。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，用于快速测定实验室培养物中的生物污染。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，用于快速测定田间条件下的生物污染物。

在本发明的另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuria scabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，作为胆碱酯酶的竞争性抑制剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及常规的添加剂，作为抗微生物组合物。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，作为盥洗用品组合物中的生物表面活性剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种组合物，含有从海参Holothuriascabra得到的生物活性提取物及通常的添加剂，作为天然着色剂。

在另一实施例中，本发明提供了一种皮肤护理组合物，含有染料及生理学和化妆品可以接受的赋形剂，如稀释剂、分散剂或载体。

对图表的描述

表1.(a)和(b)用化学方法分析染料结构中有或无醌型环、酚性和胺基团。

表2.用化学方法分析染料结构中有或无醌型环、蛋白质或非蛋白质性质和有或无还原糖。

表3.用Olympus外部荧光显微镜的不同波长的立方晶格激发时，作为着色剂的染料的不同着色荧光的颜色。

附图说明

图1：提取染料之前从野外得到的新鲜海参Holothuria scabra。

图2：第4次提取染料后的海参Holothuria scabra。

图3：在紫外可见范围的扫描。

图4：在紫外范围的扫描。

图5：激发波长为270nm的荧光光谱。

图6：激发波长为450nm的荧光光谱。

图7：激发波长为540nm的荧光光谱。

图8：激发波长为270nm的荧光光谱。

图9：Whatman滤纸1裁成圆形，在顶部滴加稀释的染料粗提物并在GelDoc的紫外线下观察。上部显示通过紫外滤光器拍摄的荧光，较低的部分是没有染料的对照试验。

图10：Whatman滤纸，用于过滤提取物并在紫外透照器下观察(260hm-280nm波长范围的灯泡)。可以看到荧光。下部滤纸是没有提取物的对照试验。

图11-14：用激发范围为330hm-385nm的WU立方晶格的外部荧光显微镜的蓝色荧光发射。图11是没有任何样品的染料的荧光。图12是在有细胞的情况下，在10倍物镜下的观察。图13：在40倍物镜下的同样观察。图14在100倍油镜下观察到的细胞。

图15-18：用激发范围为450nm-480nm的WB立方晶格的外部荧光显微镜的绿黄色荧光发射。图15是没有任何样品的染料的荧光。图16是在有细胞的情况下，在40倍物镜下观察。图17和图18：在100倍油镜下的同样观察。

图19-22：用激发范围为510nm-550nm的WG立方晶格的外部荧光显微镜的橙色荧光发射。图19是没有任何样品的染料的荧光。图20是在有细胞的情况下，在10倍物镜下观察到的荧光。图21：在40倍物镜下观察到的同样的荧光。和图22：在100倍油镜下观察到的细胞。

图23：通过亮区域(bright field)在10倍物镜下观察到的细胞。灰色调是观察到的相位差效果。

图24：通过亮区域(bright field)在100倍油镜下观察到的同样的细胞。

具体实施方式

本发明涉及提取、纯化和鉴定一种新的色素的方法，此色素是一种沿世界上沿印度和印度洋-太平洋区域的中西海岸广泛分布的棘皮动物(海参纲：Holothuria scabra)得到的天然染料。

本发明还提供了从动物的皮肤色素中得到的一种新的有荧光的纯染料，通过储存在-20℃的条件下，可以从同一个样品中重复提取3-4次，因而避免了对自然资源的过度开采。

本发明发现，此染料在紫外和可见光谱范围的3个不同的激发波长下，有3种不同颜色的荧光发射，等同于目前市售的用于荧光显微镜的3种不同的荧光染料(DAPI、FITC和PI)产生的发射。

因此，此染料可以在商业上作为外部荧光显微镜的3合1荧光染料，按简单程序用于染色体、细胞和组织的单和双重着色。

本发明也涉及染料在非放射性标记蛋白、DNA和RNA探针方面的用途，用于分子生物学的荧光原位杂交应用中。

因此在用途的优选方式中，该染料可以是分子标记和检测试剂盒的一种组分，它们多数是进口的并且售价很高。。

曾广泛探寻这些标记试剂盒，用于采用快速分子细胞遗传和微观分析技术的分子诊断中。

在用途的另一优选方式中，该染料在制备能够吸收日光中的UVB化妆品组合物方面是有益的。

然而，该染料的另一优势是即使在非常稀的溶液中(1∶40000)，其荧光也是可见的。

可以在救生设备中利用此性质，作为救生夹克的一个组分，以标识坠毁的飞机、救生筏和军事装备例如火箭的位置，还可以用于工业泄漏检查。

本发明对于单和多细胞所用的流动血细胞计数器的荧光定量测定将是有用的。

本发明在快速测定自然和控制环境中，例如组织培养物中、污染物中，及卫生、食品和化妆品工业的工业污染物中的生物污染物方面具有优势。

当用紫外线的较低波长激发时，染料发射UVA范围的荧光的能力，对皮肤癌的选择性光化学疗法中是有用的。

在另一优选方式中，染料可以作为化妆品工业中的防晒组合物的组分。

还有另一用途是此染料是生物表面活性剂，并可以用于抗微生物的盥洗用品和组合物中。

在另一用途的优选方式中，经用荧光分光光度分析法检查，本染料在室温有长的搁置寿命。

在另一应用的优选方式中，本荧光染料将使化妆品产生天然的颜色，节省在颜料添加剂方面的费用。

本荧光染料的另一用途是作为新的远程测向装置和水下探测器的组成部分，其中要求了以光波长灵敏度为基础的数据。

用以下实施例说明本发明，但在任何方式上不能解释为是对本发明的发明范围的限制：

实施例

以下公开了提取、部分纯化、鉴定染料的方法，和用分光光度分析法及外部荧光显微镜法检查染料的荧光效果而进行的实验的细节：

例1

采集原料

亚界：后生动物

门：棘皮动物门Echinodermata

  亚门：Eleutherozoa

      纲：海参纲

        亚纲：枝手亚纲(Dendrochirotacea)，

          目：枝手目(Dendrochirota)，

            属：海参属

              种：scabra

动物采集自落潮时的印度中西海岸。将其带到实验室中，进行分类学鉴定和下一步使用前保持在盛有盐度为30-32/par(30％)海水的玻璃缸中。动物是成年和性成熟的。

例2

提取色素

试验了2种方法：

1)在我们最初的试验中，动物在采集后置于-20℃冷冻，并在解冻时，部分色素进入托盘中。进行此操作，按此方法，从同一个动物可以提取3-4次色素。图1和2显示新鲜的动物和进行了4次提取的动物。

2)在第2种方法中，首先用自来水洗，然后用超纯水(MQ水)洗涤动物。用利剪切开动物体，将体壁与内脏分离。用锋利的剃刀从体壁剥离皮肤，如果不立即进行进一步的加工，储存在-20℃的冰箱中。然后将其置于烧杯中，按以下比例加入50％vol/vol乙醇和MQ水混合物：

15gm动物皮肤：250ml 50％乙醇

例3

过滤色素溶液

进行此步骤以除去细胞碎片和一些悬浮物，并沉淀杂质。将其离心以制备澄清溶液，并沉淀掉所有悬浮物。

将有色的溶液倾出，并借助蠕动泵用微滤单元(Vensil make)的玻璃滤器过滤。滤液置于轨道震动器上并以200rpm的速度震动半小时。

例4

浓缩色素

然后将有色溶液置于80℃水浴上，浓缩至其1/3体积，这样也同时蒸发除去了其中的乙醇。再次用同样的滤器将浓缩物过滤。

例5

纯化染料

色素溶液将含有杂质，如NaCl、MgCl₂、MgSO₄和其他水溶性化合物。如果在色素的浓缩溶液中加入极性有机溶剂如乙醇(脱水的)、丙酮，可以看到色素将快速沉淀。

这样就可以从海水盐中将色素分离。这样纯化色素以进行分光光度法分析。

将上述例5制备的浓缩溶液置于一分离用的500ml分液漏斗中，向其中加入乙醇(80ml浓缩的上清液+100ml 99.5％乙醇)。倾斜分液漏斗以轻轻混合其中的内容物，过夜后收集沉淀。有沉淀的浓缩物在1500rpm离心4-5分钟，倾出上层。再次将沉淀溶解在5ml MQ水中，再次加入100％乙醇直至沉淀完全。再次离心并收集沉淀。重复此步骤3-4次以纯化色素。

在80℃的水浴上将沉淀蒸发5分钟至干。用刮铲刮出纯的染料并在室温下储存于干燥玻璃瓶中。

从例2得到的250ml 50％乙醇的粗提取物通过蒸发得到2.5gm粉末状的部分纯化的染料。

例6

化合物的物理特征

粗提取物为黄绿色。在日光下裸眼观察纯的干燥染料的物理性质是红棕色。在管灯下，观察到绿色的色彩。染料溶于水而不溶于有机溶剂如纯的乙醇、甲醇和丙酮。它是无定形的。其pH为6.5，并带负电荷。

例7

用化学方法进行染料的结构分析

实验1：进行染料的CHNS元素分析，结果示于表1(a)和(b)。

实验2：

染料溶解在MQ水中，浓度为2mg/ml，检查其化学性质。检测有或无某些基团，结果示于表2，其中一个实验显示阴性，用更高浓度的染料并再次进行实验。

例如向染料的2mg/ml溶液中加入β-巯基乙醇(还原剂)，溶液不发生退色。这证明没有醌环，并且色素是一种染料。

在实验3中，将浓度为10mg/ml的浓缩的染料溶液加热，未观察到沉淀或凝聚。这证明化合物为非蛋白质性质。

在实验4中，向同样的溶液中加入一滴浓盐酸，并加入Fehling′s溶液。没有颜色变化，证明没有还原糖。

例8

检查染料的电荷：

用凝胶电泳检查化合物的电荷。

将染料样品(10ml)加样于用0.5x TBE制备的1％琼脂糖凝胶上。在65伏电压下将凝胶展开1小时。从凝胶浇铸***中除去染料，用肉眼观察，并在紫外透照器下观察。发现染料向带正电荷的电极移动，所以染料本身是带负电荷的化合物。因此它被吸引向带正电荷的电极。

例9

生物表面活性剂分析：

将染料加入水中并振摇，产生泡沫，从而观察到它的生物表面活性剂的性质。该溶液产生肥皂样的感觉。

例10

抗微生物试验：

由于海产染料是酚性化合物，而酚性化合物通常有抗微生物活性，用此化合物进行了抗微生物的测定，并观察到抑制区带。

在圆锥烧瓶(100ml)中使大肠杆菌(野生类)培养物在50ml MacConkey′s肉汤中生长过夜。制备抗菌试验的琼脂介质并灭菌。然后置于50℃的温度下，向其中加入1ml大肠杆菌(野生种类)培育物。将培育物与抗菌试验的琼脂介质混合并使其固化。制备10mg/ml样品并在滤纸盘中浸湿。然后置于所述的接种了大肠杆菌的抗菌试验琼脂介质上。

然后在37℃的培养箱中孵育24小时。观察到围绕滤纸片的抑制区带。这证明所述染料有对抗格兰氏阳性菌如大肠杆菌的抗微生物活性。

例11

染料的紫外/可见光谱

使用的仪器：Genesys 2UV分光光度计。

在容量瓶中制备2mg/10ml溶液，在石英比色杯中加入2ml溶液，在紫外可见范围读取其标示读数。对照品为超纯水。

测定300nm-700nm波长范围的UV、可见光谱(图3&4)。在波长379nm和439nm处标记有峰。

测定250nm-350nm波长的紫外可见光谱(图3&4)。在波长272nm和299nm处标记有峰。

例12

染料的荧光光谱

所用仪器：Hitachi荧光分光光度计。

在可见和紫外光谱的不同波长范围进行了荧光分光光度测定，并记录发射范围。发现激发波长为270nm。发生在324-380nm的荧光有最大强度(图5)。

在荧光分光光度法中，用激发波长450nm，发生在500-580nm的荧光有最大强度(图6)，

在荧光分光光度法中，用激发波长540nm，发生在500-620nm的荧光有最大强度(图7)，激发波长为555nm的荧光光谱，发生在575-620nm的荧光有最大强度(图8)。

例13

在紫外透照器和Cel文档***下对发射的物理检查

裁下Whatman 1号滤纸并浸在稀释的粗提物中，在Gel doc UV光下观察。清楚地看到随着染料的浸透，荧光区域进一步扩大(图9)。

在另一个试验中，在有260-280nm紫外范围灯泡的紫外透照器下观察用于过滤的滤纸。注意到了蓝绿色的荧光色彩(图10)。

例14

外部荧光显微镜法

用此染料的1∶40000稀释液作为着色剂进行外部荧光显微镜法，并记录用不同的立方晶格激发时产生的光的发射，与已知荧光染料的色彩进行比较。制备固定组织的细胞遗传学空气干燥标本。向其上加入一滴着色剂并盖上盖物片。用Olympus反射光的WU、WB和WG的立方晶格发出的紫外和可见光谱的激发进行扫描。

WU立方晶格的波长范围为330nm-385nm。

WB立方晶格的波长范围为450nm-480nm。

WG立方晶格的波长范围为510nm-550nm。

例15

找出在不同激发范围的发射范围。看到：

WU 330nm-385nm范围的激发发射在380nm-400nm范围的荧光。用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光片产生的激发发射500nm-570nm范围的荧光。用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光片产生的激发发射570nm-650nm范围的荧光。

在BrightField用透射光的对细胞遗传载物片进行外部荧光显微法扫描，其发射在可见光谱的全部白光范围内的光，根据细胞成分的密度产生灰色相位差样效果。

例16

发射的荧光颜色

在仅有染料的区域和有一些样品的区域观察所发射颜色的色调。激发光谱的区域和发射的荧光严格遵守Stoke′s定律(表3)。

例17

用染料作为外部荧光显微镜法的着色剂而对载物片进行显微照相

用曝光范围为50-60秒的400ASA Kodak胶片，在WU 330nm-385nm范围、WB 450nm-480nm范围、WG 510nm-550nm范围和亮区(Brightfield)，对在无细胞和有细胞样品的区域发射的荧光进行显微照相。

结果示于图11-24。

例18

稳定性检查

所研究的染料在室温稳定并保持活性，并且在高达120℃时仍保持此性质，并证明经过此处理后不改变光谱性质。化合物可以保持其稳定性约1年而没有任何污染或化学衰变。所述的海产染料在光处理后不发生光解。所以此海产染料不需要稳定剂。

例19

杀虫效果

化合物对于昆虫有毒。它对昆虫例如蚂蚁显示毒性。浸透染料的滤纸置于工作台上不加看管。第二天发现布满死蚂蚁。

例20

在细胞链上试验此染料并观察活性。

例21

用染料染色

将不同来源的用冰醋酸和甲醇固定的组织置于载物片上，将染料溶液加在其上而不经预处理。观察到细胞的不同部分获取染料不同。细胞核由于核内存在的富含精氨酸和lusine的蛋白质的染色而着色(例如组蛋白)。其他细胞器管也被着色。由于随后的海产染料使染色体的蛋白质着色，它在研究细胞的染色质组型方面更提升了价值。

例22

染料的生物活性提取物置于microfuge管中并保持-20℃，在冷冻状态下在UV光下观察。在另一实验中，浸在染料溶液中的后者置于-20℃并在紫外透照器下观察。

例23

提取物作为兽药杀狗的壁虱/跳蚤。粗提物的1∶200倍的稀释液在少于40秒的时间内能杀壁虱和跳蚤。

表1(a)

用化学方法对染料有/无醌环、酚、胺基团进行结构分析。

实验	观察	推论
			2mg/ml水样品+β-巯基乙醇	不退色	无醌环
2mg/ml水样品+中性FeCl3	紫色	有酚环
			2mg/ml水样品+0.1NHCl+NaNO2，冷的条件下加入β-萘酚的碱性溶液中(重氮化反应，然后β-萘酚加成)	无沉淀形成	无芳香胺基团

注：用更高浓度的溶液重复产生阴性结果的试验。

表1(b)

荧光染料的元素分析：

1	碳％	8.3629
			2	氢％	1.7430
3	氮％	0.8368
			4	硫％	9.4521

表2

用化学方法进行结构分析，检查其蛋白质/非蛋白质性质和有/无还原糖。

实验	观察	推论
			加热浓溶液(5-10mg/ml)	无沉淀或凝聚物	非蛋白质产品
2mg/ml水溶液样品β-巯基乙醇	无颜色变化	无醌环

注：用更高浓度的溶液重复产生阴性结果的试验。

表3

当用Olympus外部荧光显微镜的不同波长立方晶格激发时，作为着色剂的染料的不同颜色的荧光的颜色。

目录中给出的荧光立方晶格的名称	立方晶格的激发范围	荧光的发射范围	荧光的颜色
				WU	330-385nm	380-400nm	蓝
WB	450-480nm	550-570hm	黄
				WG	510-550nm	600-650nm	橙
Bright Field	透射光	可见光	灰

*注：这些颜色的显微照相给出了相邻光谱的色调。例如蓝色显示出绿的色调，黄色显示出绿黄色，橙色显示出红橙色。然而在观察时，颜色为清晰的蓝色、黄色和橙色。

与现有的市售染料相比的优点

1.此染料是非放射性的，因为它是从天然来源得到的染料而非合成的。

2.此染料的单一形式等同于3种不同的合成荧光染料，产生荧光颜色的同样的发射。

3.此染料可以作为产生相位差效果的快速显微着色剂，而不需要任何另外的显微镜相位差辅剂方面的费用和样品的冗长的固定和防腐过程。特别适用于现场快速检查活的样品。

4.长时间内荧光的性质不降低，在出口时不需要冷藏。现有市售的荧光染料在出口时在-20℃的温度下冷藏。

5.不同于以前知道的从海产的海蛰中得到的绿色荧光蛋白(GFP)，我们的染料不是报道基因。结果是直接产生的。GFP吸收在395nm的和在470nm有一较小峰的蓝光，发射绿光。我们的染料发射在3个不同荧光波长处的3种荧光颜色。此染料可溶于水，所以可以用在需要水溶性染料的组分中。此染料不溶于有机溶剂，如乙醇、甲醇和丙酮。

6.此染料带负电荷。

7.此染料的pH为6.5，它几乎是中性的，因此不强烈地影响最终的组合物的pH。

8.染料的性质是非蛋白质的，所以在自然条件下不降解。

9.染料具有生物表面活性剂的性质，所以可以用在肥皂和盥洗用组合物中。

10.染料具有抗微生物的性质。

11.此染料甚至在1∶40000倍的稀释范围下也发射这些荧光颜色(即1gm染料粉末溶解在40升超纯水中)。提取物的荧光甚至在室温放置至少1年后仍存在。染料在不同波长的激发下产生的多种颜色的发射可以与市场已有的荧光染料显微着色剂相比。

12.本染料的蓝色荧光能与DAPI荧光染料在同样波长的激发下产生的同样颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记试剂盒的组分。

13.本染料的蓝色荧光能与Hoechest 33258的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

14.本染料的蓝色荧光能与Hoechest 33342荧光染料在同样波长的激发下产生的颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

15.本染料的黄色荧光能与吖啶橙的同样颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

16.本染料在可见范围的黄色荧光可以与金色胺的同样颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

17.本染料在可见范围的黄色荧光可以与FITC的同样颜色的发射相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

18.橙色荧光发射可以与碘化甲锭(propidium Iodide)荧光染料的橙色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

19.橙色荧光发射可以与罗丹明(Rhodamine)荧光染料的橙色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

20.橙色荧光发射可以与TRITC荧光染料的橙色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。

21.不同于用于同样目的的合成的市售染料，本染料在室温稳定并有长的搁置寿命(shelf life)。本染料的分子非放射性试剂盒可以在室温条件下出口。

22.所述单一染料有至少123种市场现有的不同的荧光染料的特点(DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、金胺、罗丹明、TRITC和碘化甲锭(propid Iumiodide)等)。在显微镜通常的光下，灰色的色调产生相位差效果，这对于快速筛选细胞遗传、细胞学和组织化学载物片是有用的，并可以节省在额外的显微镜相位差辅剂成分方面的花费。荧光颜色的发射遵守荧光的Stoke定律。

23.用Kodak胶卷进行的显微照相显示相邻的颜色发射波长的色调。如在显微照相中，在外部荧光显微镜下看蓝色荧光时，也出现绿色色调。

24.用Kodak胶卷进行的显微照相显示相邻的颜色发射波长的色调。如在显微照相中，在外部荧光显微镜下看黄色荧光时，也出现绿色色调。当显微照相时在外部荧光显微镜下看橙色荧光时，也出现红色色调。

25.在所有荧光下观察的细胞遗传载物片，产生与仅有染料而无样品的背景形成对比的细胞复染色的效果。

26.可以用此染料制备显示荧光颜色的聚乙烯膜，此染料液也可用于各种涂料、墨水、纺织品荧光色中。

27.可以将此染料用在荧光染料的组合物中，用以漂白和增亮聚合物。在用全光谱荧光染料进行的泄漏检查中可以使用此染料。它也可以用于自动化学计量***中。也可以用它标记坠毁飞机、救生船和一些设备如火箭的位置。另外也可以将它用于海底探测器中。此染料也可以用在皮肤癌的光化学治疗中。

28.可以用此染料作为美容霜和洗液的色素细胞防晒成分。

29.此染料可以与水混溶的性质使其易于混合在增湿剂中。它也可以作为用于分子诊断的荧光原位杂交应用试剂盒的组分。它也可以作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分，以标记DNA、RNA、蛋白质和酶，还可以作为免疫荧光检测、DIG-标记的寡核苷酸探针和抗-DIG Fab-片段的复染色、流动血细胞计数中的单和多细胞荧光定量、外部荧光显微法中的荧光染料着色剂的组分。

30.此染料可以用于快速检查健康食品工业、化妆品工业、药物和化学工业中的生物污染，以快速测定实验室培养物中的生物污染，快速检查田间条件下的生物污染。也可以作为胆碱酯酶的竞争性抑制剂。

31.可以将此染料用在抗微生物组合物中。

32.可以用此染料作为盥洗用组合物中的生物表面活性剂。

33.海产染料的天然着色剂A生物活性组合物可以按在超纯水中1∶40000的比例使用此染料，以得到在3个不同波长的3种颜色的荧光和在透射光下的相差效果。

34.可以将此染料纯化处理：将250ml 50％乙醇粗提物在80℃水浴上蒸发5分钟以纯化，得到2.5gm粉末状的纯化染料。将2mg/10ml溶液组合物用于分光光度法。采用化学方法，用10mg/ml的浓度对染料进行结构分析。按1∶40,000倍比例稀释的染料的生物活性组合物，用水作粘结剂，产生在3个不同波长的3种颜色的荧光。

Claims (29)

1.一种从海参Holothuria scabra中得到的天然荧光染料，其通过包括以下步骤的方法制备：

a)采集海参并将其保存在含有海水的实验室的缸中，不经过任何机械换气过夜；

b)将海参在-20℃冷冻；

c)融化海参得到染料；并

d)重复步骤(b)和(c)3-4次以取得染料，或

e)用50％体积比的乙醇和纯水提取海参的皮肤，重复该步骤至少4次；

f)过滤并浓缩由步骤e)得到的提取物得到染料；

所述染料具有以下特征：

i.不被还原剂脱色，

ii.不是合成化合物，

iii.染料的粗提物是黄绿色的，

iv.裸眼在日光下观察时，纯化的染料是微红棕色的粉末，

v.在管灯下，发出一些绿色的色彩，

vi.性质是无定形的，

vii.溶于水，

viii.不溶于有机溶剂：乙醇、甲醇和丙酮，

ix.带负电荷，

x.pH为6.5，

xi.有酚性基团，

xii.没有醌型的环，

xiii.没有芳香胺基团，

xiv.非蛋白质性质，

xv.没有还原糖，

xvi.染料有表面活性剂的性质，

xvii.染料还显示抗菌的性质，并且进行抗菌测定时，显示抑制区带，

xviii.当用分光光度计的紫外和可见光谱范围的不同波长激发时发射荧光，

xix.经300nm-700nm的紫外、可见光谱测定，在379nm和439nm波长标记有峰，

xx.经250nm-350nm的紫外、可见光谱测定，在272nm和299nm波长标记有峰，

xxi.在紫外和可见光谱范围内进行荧光光谱测定，当用紫外270nm波长激发时，发射在324nm-380nm范围的荧光，它出现在日光的紫外线UVA波长范围，

xxii.用荧光光谱450nm的波长激发，在500nm-580nm有最大强度的荧光发射，

xxiii.用荧光光谱540nm的波长激发，在500nm-620nm有最大强度的荧光发射，

xxiv.用荧光光谱555nm的波长激发，在575nm-620nm有最大强度的荧光发射，

xxv.在具有260nm-280nm范围的紫外灯泡的紫外透照器和GelDocumentation***下，对用浓度为1∶40000稀释度的染料浸渍的Whatman1号滤纸进行物理学检查，发射蓝绿色荧光，

xxvi.在外部荧光显微镜的荧光立方晶格的紫外和可见范围的3个不同波长处，发射3种不同颜色的荧光，

xxvii.在10倍物镜下观察时，在通常的外部荧光显微镜的透射光灯泡下，染料发射灰色色彩，

xxviii.甚至在稀释范围为1∶40000倍时，染料仍发射这些荧光颜色，

xxix.甚至在室温放置至少1年后，提取物的荧光仍存在，

xxx.染料的荧光是高度耐光的，并且长时间暴露于直射光下时不被破坏，以及

xxxi.即使在零下20℃冷冻，染料的荧光也不改变，在此温度下分子不能象在从发光生物体得到的提取物中那样获得活化所必需的能量。

2.权利要求1所述的染料，其中当在远紫立方晶格WU 330nm-385nm的激发范围激发时，在UVA的380nm-400nm范围发射蓝色荧光；当在WB立方晶格的450nm-480nm的激发范围激发时，在500nm-570nm范围发射黄色荧光；当在WG立方晶格的510nm-550nm的激发范围激发时，在570nm-650nm范围发射橙色荧光。

3.权利要求2所述的染料，其中所述染料的蓝色荧光可与DAPI荧光染料在同样激发波长发射的同样颜色相比。

4.权利要求2所述的染料，其中所述染料在可见范围的黄色荧光可与金胺的同样颜色的发射相比。

5.权利要求2所述的染料，其中所述染料在可见范围的黄色荧光可与FITC的同样颜色的发射相比。

6.权利要求2所述的染料，其中橙色荧光发射可与碘化甲锭荧光染料的橙色荧光相比。

7.权利要求2所述的染料，其中橙色荧光发射可以与罗丹明荧光染料的橙色荧光相比。

8.权利要求2所述的染料，其中橙色荧光发射可以与TRITC荧光染料的橙色荧光相比。

9.权利要求1所述的染料，其中该染料在室温稳定并有长的搁置寿命。

10.权利要求1所述的染料，其中所述染料可在室温下出口。

11.权利要求1所述的染料，其中该单一染料有至少123种不同的市场现有的明确荧光染料的特点。

12.权利要求11所述的染料，其中不同的市场现有的明确荧光染料是DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、金胺、罗丹明、TRITC和碘化甲锭。

13.权利要求1所述的染料，其中该染料经冷冻不损失荧光。

14.权利要求1所述的染料，其中在荧光显微镜的亮区域下，当在10倍物镜下观察时，灰色色调产生相差效果，这对于快速筛选细胞遗传、细胞学和组织化学载物片是有用的。

15.权利要求1所述的染料，其中在通常的透射光显微镜的100倍油镜下观察，蛋黄的蛋白质、活跃***细胞的核原生质和染色质显示着色的不同颜色，前者为棕黄色，后者为黄色，最后的细胞组分为深蓝色，这对可以在细胞的各种组织化学组分上看到的效果进行快速生物测定是有用的。

16.权利要求1所述的染料，其中荧光颜色的发射服从荧光的Stoke定律。

17.权利要求1所述的染料，其中用Kodak胶卷的显微照相显示相邻的颜色发射波长的色调，在外部荧光显微镜下的蓝色荧光产生绿色色调。

18.权利要求1所述的染料，其中用Kodak胶卷进行的显微照相显示相邻的颜色发射波长的色调，在外部荧光显微镜下的黄色荧光产生绿色色调。

19.权利要求1所述的染料，其中在显微照相中，在外部荧光显微镜下的橙色荧光产生红色色调。

20.权利要求1所述的染料，其中在所有荧光下看的细胞遗传载物片产生细胞和细胞组分与并无样品而仅有染料的背景颜色对比的复染色效果。

21.权利要求1所述的染料，其中染料用水稀释1∶10,000倍，并可产生所述3个不同波长的3种颜色。

22.权利要求1所述的染料，其中染料用水稀释1∶40,000倍，并可产生在3个不同波长的3种颜色。

23.权利要求1所述的染料，用于：

(a)制备显示荧光颜色的柔性聚氯乙稀膜；

(b)用于各种涂料、墨水、纺织品中的荧光色；

(c)一种荧光染料组合物，用于漂白和增亮聚合物；

(d)用全光谱的荧光染料进行泄漏检测；

(e)用于自动化学计量***中；

(f)标记坠毁飞机、救生筏或军事装备的位置；

(g)海底探测器；

(h)UVA用于皮肤癌的光化学治疗中；

(i)作为美容霜和洗液中色素细胞的防晒组分；

(j)染料可以与水混溶的性质使其易于混溶在增湿剂中；

(k)用于分子诊断的荧光原位杂交应用试剂盒组分；

(l)作为标记DNA、RNA、蛋白质和酶的生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分；

(m)免疫荧光检测；

(n)DIG-标记的低聚核苷酸探针和抗DIG Fab-片段的复染剂；和

(o)单一和多重流动血细胞计数的应用；

(p)外部荧光显微镜的荧光染料着色剂；

(q)快速检查健康食品工业、化妆品工业中的生物污染物；

(r)药物和化学工业中的生物污染；

(s)快速测定实验室培养基中的生物污染物；

(t)在田间条件下快速检查生物污染物；

(u)胆碱酯酶的竞争性抑制剂；

(v)在抗微生物组合物中；

(w)作为化妆品组合物的生物表面活性剂；

(x)天然着色剂；

(Y)在0℃以下区域完成的各种荧光用途中所用的染料。

24.权利要求1所述的染料，其用于：

在超纯水中比例为1∶40000的海产染料的生物活性组合物；和

在透射光下得到在3个不同波长的3种颜色的荧光和相差效果；

25.一种从海参Holothuria scabra中提取天然荧光染料的方法，包括以下步骤：

a)从海边采集海参，换海水并保存在实验室的缸中，不经过任何机械换气过夜，

b)将海参冷冻在-20℃；

c)融化海参得到染料；并

d)重复步骤(b)和(c)3-4次以取得染料。

26.权利要求25所述的方法，其中染料用水稀释1∶40,000倍，它产生在3个不同波长的3种颜色的荧光。

27.权利要求25所述的方法，其中的染料用水稀释1∶10,000倍，它产生在3个不同波长的3种颜色的荧光。

28.一种从海参Holothuria scabra中提取天然荧光染料的方法，包括用渗透振动从海参Holothuria scabra的皮肤中提取染料的步骤，第一次在超纯水中加入50％乙醇，并重复此步骤至少4次以得到此染料。

29.权利要求28所述的方法，其中将50％乙醇粗提取物，在80℃水浴中蒸发5分钟以纯化，基于250ml 50％乙醇粗提取物，得到2.5mg粉末状部分纯化的染料。

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