CN100379867C - 丁炔醇ⅰ酯酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自颖壳假单胞菌的具有酯酶活性，特别是具有丁炔醇I酯酶活性的新蛋白，涉及编码此蛋白的核酸序列，表达盒，载体和重组微生物；本发明还涉及制备所述蛋白质的方法和此蛋白在进行有机酯的酶促，特别是对映体选择性的酶促酯水解或转酯反应中的用途。
Description
本发明涉及来自颖壳假单胞菌(Pseudomones glumae)的具有酯酶活性，特别是具有丁炔醇I酯酶活性的新蛋白，涉及编码此蛋白的核苷酸序列，表达盒，载体和重组微生物；本发明还涉及制备上述蛋白质的方法和此蛋白在有机酯的酶促酯水解或转酯反应，特别是对映体选择性(enantioselective)酶促酯水解或转酯反应中的用途。
酯酶和脂肪酶是水解酶，它们能够用于工业生产过程中以合成旋光性的有机化合物，它们的特点是具有高底物特异性。它们通过与丝氨酸蛋白酶相似的作用机理，能够将酰基转移到亲核基团，例如羰基上或水解断裂酯键。酯酶，脂肪酶和丝氨酸蛋白酶具有共同的催化三联体，一个由丝氨酸，组氨酸和天冬氨酸构成的序列基序，其中羰基碳原子受到活性丝氨酸的亲核攻击，在另两个氨基酸参与下导致电荷分配。酯酶和脂肪酶还可以将酰基转移到其他亲核基团，如硫醚的硫基或活化胺上。
脂肪酶水解长链甘油酯，其特征在于表面活化作用，即只有在脂质底物存在时活性位点才可接近。脂肪酶在非水的有机溶剂中是稳定的，并被应用于许多工业生产过程中进行动力学外消旋体拆分，即一个对映体的转化要远远快于另一个对映体的转化。然后，根据不同的理化性质可以从反应溶液中得到所述对映体。
Nakamura(Nakamura，K.等，四面体；不对称(Tetrahedron：Asymmetry)9，(1999)，4429-4439)描述了利用商品化的脂肪酶(Amano AK，AH和PS；Amano医药有限公司)在疏水溶剂中经转酯作用进行的1-炔-3-醇的外消旋体拆分。在这个反应中，对映体选择性随酰基供体的链长增加而增大，而空间大的残基(氯乙酸酯，苯甲酸乙烯酯)对反应具有不利影响。Yang(Yang，H等，J.Org.Chem.64，(1999)，1709-1712)描述了以来自Candida antarctica的脂肪酶B作为催化剂，经转酯作用从乙烯基酯对映体选择性地制备旋光性酸。在这一情况中，乙酯会导致明显较低的反应速率和选择性。应用从Burkholderiaplantarii(Pseudomonas plantarii或颖壳假单胞菌)DSM 6535分离出来的一种脂肪酶，借助甲氧基乙酸乙酯可以对外消旋胺进行对映体选择性的酰化(Balkenhohl，F.等，J.prakt.Chem.339，(1997)，381-384)。
酯酶以对映体选择性方式催化酯键的形成和断裂(正反应和逆反应)。在转酯作用中优选利用乙烯基酯来得到旋光性醇，这是因为转化之后由于互变异构作用醇转变成醛或酮，酯中的醇官能团不再存在，所以可以避免逆反应的发生。与脂肪酶不同，酯酶不具有表面活化的性质，而且其转化相对短链的有机化合物，人们已经从多种生物体中分离出不同底物特异性的酯酶。
这样，Pseudocardia thermophila FERM-BP-6275的酯酶被用于水解旋光性的苯并二氢吡喃乙酸酯(EP-A-0892044)。
酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)中的一种酯酶能够以低的对映体选择性从窄范围的底物出发水解酯(Manco，G.等，生物化学杂志(Biochem.J.)，332，(1998)，203-212)。
可以利用曲霉菌的酰基转移酶1在有机非极性溶剂中经转酯作用从乙烯基酯得到二级醇，优选转化具有较小侧链的二级醇(Faraldos，J.等，Synlett4，(1997)，367-370)。已经对荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)DSM 50106的膜结合内酯特异性酯酶(Khalameyzer，v.等，应用和环境微生物(Appl.And Environ.Microbiol)，65(2)，(1999)，477-482)，和大肠杆菌(E.coli)malQ突变株的乙酰酯酶(Peist，R.等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，179，(1997)，7679-7686)进行了克隆。然而，对这两种酯酶的对映体选择性和底物特异性还没有更详细的研究。红球菌属(Rhodococcus)种NCBM 11216能够表达4种酯酶，RR1到RR4，它们具有不同的特异性。对于利用萘酚和酸合成酯，RR1和RR2优选具有短碳链的酸，RR3和RR4则特异性地转化具有相对较长碳链和空间相对较大残基的酸(Gudelj，M.等，J.Mol.Cat.B，Enzymatic5，(1998)，261-266)。
然而，目前尚没有底物范围大、对映体选择性高、并且能够应用于工业生产过程的酯酶可用于制备小的有机分子，如具有短碳链的旋光性醇，酸或酯。本发明的目的是提供具有至少一种如上所述性质的酯酶。
我们已经惊奇地发现，可以通过提供具有丁炔醇I酯酶活性的蛋白质及其具有丁炔醇I酯酶活性的功能等价物来完成这个目的，其中所述蛋白质中包括至少一个根据SEQ ID NO：3，4，5或6的部分氨基酸序列：
a)FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER(SEQ ID NO：3)，
b)IALIAPLTHTETEP(SEQ ID NO：4)，
c)GGGMMGLRPEAFYAASSDLV(SEQ ID NO：5)
d)AIDAIFAPEPV(SEQ ID NO：6)
(每一个蛋白质序列均以氨基酸单字母密码的形式给出，所有情形中第一个氨基酸都相应于各序列的氨基末端)。
具体地，本发明的这一目的通过提供包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的丁炔醇I酯酶及所述蛋白质的功能等价物来完成。
为简单起见，上文所提及的这些蛋白质在以下都称作丁炔醇I酯酶。
针对本发明的目的，本文具体公开的多肽或蛋白质的“功能等价物”或类似物是这样的多肽或蛋白质，它们同本文具体公开的多肽或蛋白质不同，但是仍具有所需要的生物学活性，特别是酶活性。
本发明中“功能等价物”特别是指这样的突变体，在上述序列的至少一个位点上它具有与具体提及的此位点的氨基酸不同的氨基酸，但是它仍具有至少一种本发明的生物学活性。因此，“功能等价物”包括可通过一个或多个氨基酸的***，替代，缺失和/或倒位得到的突变体，上述的修饰可以在序列上任一位点发生，只要这些修饰所导致的突变体具有本发明的性质谱即可。尤其是，当突变体和未经修饰的多肽之间在反应模式上具有性质上的一致性，即，例如转化相同底物的速率存在差异时，也存在功能等价。
“功能等价物”自然也包括可从其它生物体获得的多肽，和自然发生的变异体。例如，可以通过序列比较找到同源序列区域，然后可以根据本发明的特殊要求确立等价酶。
“功能等价物”同样包括具有，例如，所需要的生物学活性的本发明多肽的片断，优选单结构域或序列基序。
″功能等价物″还可以是融合蛋白，它们包含上述一个多肽序列或来源于其的功能等价物以及至少一段功能不同的别的异源序列，两个序列之间为功能性的N-或C-端连接(即，融合蛋白各部分间的相互功能消减可以忽略不计)。这样的异源序列的非限制性实例有，例如信号肽，酶，免疫球蛋白，表面抗原，受体或受体配体。
根据本发明，“功能等价物”包括本发明具体公开的多肽或蛋白质的同系物。它们与本发明具体公开的一个序列具有至少60％的同源性，优选具有至少75％的同源性，尤其是具有至少85％的同源性，如举例来说，具有90％，95％或99％的同源性，这是通过Pearson和Lipman的算法(Proc.Natl.Acad，Sci.(美国)85(8)，1998，2444-2448.)计算的同源性。
本发明的蛋白质或多肽的同系物可以通过诱变，如通过点突变或蛋白质截短产生，这里所用的术语“同系物”涉及蛋白质的变体形式，它可以作为蛋白活性的拮抗剂或激动剂。
可以通过筛选突变体，如截短突变体的组合文库鉴定本发明蛋白质的同系物。可以例如通过核酸水平上的组合诱变，如，通过合成寡核苷酸混合物的酶促连接，产生一个多样化的蛋白质变体文库。有大量方法可以用于从简并寡核苷酸序列制备潜在同系物文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪上进行，然后可以将合成的基因连接到适当的表达载体中。利用一组简并基因可以在一个混合物中提供编码一组期望的可能蛋白质序列的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员所熟知的方法(参见如Narang，S.A.(1983)四面体39：3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，(1984)科学(science)198：1056；Ike等，(1983)核酸研究(Nucleic Acid Res.11：477)。
另外，可以利用蛋白质密码子的片断文库产生一个多样化的蛋白质片断群，用于筛选及随后挑选出本发明蛋白质的同系物。在一个实施方案中，编码序列片断的文库可以通过如下方法产生：在每个分子只能产生大约一个切口的条件下，用核酸酶处理编码序列的双链PCR片断，使双链DNA变性，使DNA复性形成双链DNA，其中可能包括了由带不同切口的产物形成的正义/反义对，然后用S1核酸酶处理，从新形成的双链体中去除单链部分，并将得到的片断文库连接到表达载体中。利用此方法可以得到编码不同长度的本发明蛋白质的N-末端，C-末端和中间片断的表达文库。
对于从由点突变或截短产生的组合文库中筛选出基因产物，以及从cDNA文库中筛选出具有所选特性的基因产物，有几种技术是众所周知的现有技术。可以对这些技术进行适应性修改以便从组合诱变产生的基因文库中快速筛选出本发明的同系物。用于通过高通量分析筛选大量基因文库的最常用技术包括，将基因文库克隆到可复制的表达载体中，利用得到的载体文库转化适当的细胞，并在一定条件下表达组合基因，在所述表达条件下检测所需的活性能够有助于分离出如下载体，此载体编码其产物已经被检测出来的基因。循环综合诱变(recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一种能够增加文库中功能性突变体频率的技术，此技术可以与筛选试验结合用于鉴定同系物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89：7811-7815；Delgrave等，(1993)蛋白质工程(Protein Engineering)6(3)：327-331)。
本发明优选的功能等价物是在至少一个位点上与SEQ ID NO：2不同的一段序列，其中所述序列中的所述改变优选对酯酶活性仅造成不显著的改变，即活性变化不超过约±90％，尤其是±50％或不超过±30％。可以利用参照底物，如，丁酸丁炔醇酯在标化条件下(例如，20mM底物，10mM磷酸缓冲液，pH 7.4，T＝20℃)测定此变化。
本发明特别涉及那些功能等价物，它们包含至少一个由SEQ ID NO：2所示序列中至少10个连续氨基酸组成的部分序列，并且对参照底物具有上述活性。
这类部分序列的非限制性实例来源于上述根据SEQ ID NO：3，4，5和6的部分序列。
因此，进而本发明酯酶的优选功能等价物包括，如，至少一个来源于SEQ ID NO：3，4，5或6的部分序列，同本文具体陈述的部分序列进行比较，其具有一个或多个氨基酸替代，缺失，倒位或***，并且其酯酶活性同原蛋白质(SEQ ID NO：2)的酯酶活性相差不超过约±90％或±50％，优选不超过±30％。
本发明丁炔醇I酯酶优选具有大约40到42kDa，尤其是大约41.3kDa的分子量，所述分子量是利用SDS凝胶电泳进行测定的。它们尤其可以从保藏号为DSM 13176的颖壳假单胞菌(Pseudomonas glumae)Lu 2023中得到。得到其它的菌株变种是容易的，例如可以利用颖壳假单胞菌(Pseudomonas glumae)Lu 8093作为起始菌株，通过筛选，如在苯基乙酸乙酯为唯一碳源的基本培养基平板上进行培养而得到。
本发明还包括编码丁炔醇I酯酶的多核苷酸，并包括SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其衍生序列。
本发明特别涉及编码一种上述多肽或蛋白质的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如，cDNA和mRNA)，及其能够通过如利用人工核苷酸类似物得到的功能等价物。
本发明既涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性部分的分离的核酸分子，也涉及能用作如杂交探针或引物鉴定或扩增本发明的编码核酸的核酸片断。
另外，本发明的核酸分子可以包含来自基因编码区3′和/或5′末端的非翻译序列。
“分离的”核酸分子是指该核酸分子与其天然来源中存在的其它核酸分子分离，而且如果此分子是经重组技术产生的，则它还可以基本上不含有其它细胞物质或培养基，或者如果此分子是经化学合成的，则它还可以基本上不含有化学前体或其它化学药品。
本发明的核酸分子可以通过利用分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息进行分离。例如，可以利用本文具体公开的一个完整序列或其部分作为杂交探针并且使用标准的杂交技术(技术描述参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)从适当的cDNA文库中分离出cDNA。此外，对含有一个本文所公开序列或其部分的核酸分子来说，还可以利用根据此序列构建的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应来分离。可以将由此扩增得到的核酸克隆到适当的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。本发明的寡核苷酸也可以通过标准的合成方法，如，利用自动DNA合成仪进行合成。
本发明还包括与本文具体公开的核苷酸序列或其部分互补的核酸分子。
利用本发明的核苷酸序列可以制备能用于鉴定和/或克隆其它细胞类型和生物体中的同源序列的探针和引物。这样的探针和引物通常包含一个核苷酸序列区域，在严紧条件下所述区域能够与本发明的一个核酸序列的有义链或者相对应的反义链上的至少约12个连续核苷酸，优选至少约25个，如40、50或75个连续核苷酸杂交。
本发明的其它核酸序列是从如SEQ ID NO：1所示序列衍生得到的，它们经过一个或多个核苷酸的添加，替代，***或缺失而与SEQ ID NO：1不同，但是它们仍旧能编码具有所需性质谱的多肽，所述性质谱是指例如，特别是限于上述的酶活力变化范围之内的本发明的酯酶活性。
本发明还包括与具体提及的序列比较而言，根据特定来源或宿主生物的密码子使用而包含所谓的沉默突变或者经过修饰的核酸序列，及其自然发生的变体如剪接变体或等位基因变体。本发明还涉及由保守核苷酸替代(即，有关氨基酸被具有相同电荷，大小，极性和/或溶解性的氨基酸替代)可得到的序列。
本发明也涉及从本文具体公开的核酸出发经序列多态性衍生得到的分子。这些遗传多态性可由种群内部个体之间的自然变异引起，这些自然变异通常会导致基因中1％到5％的核苷酸序列发生变异。
本发明还包括能够与上述的编码序列杂交或与之互补的核酸序列，可以通过筛选染色体或cDNA文库得到这些多核苷酸，而且适当的情况下，可以通过PCR技术利用适当的引物对这些多核苷酸进行扩增，然后以适宜的探针对其进行分离。另一个可能方法是以本发明的多核苷酸或载体转化适当的微生物，增殖微生物并由此扩增多核苷酸，然后对其进行分离。另外可以经过化学途径合成本发明的多核苷酸。
能够“杂交”到多核苷酸上这一性质是指多核苷酸或寡核苷酸在严紧条件下结合到几乎完全互补的序列上的能力，而不互补的多核苷酸对之间在此条件下没有非特异性的结合。为此，这些序列应具有70-100％，优选90-100％的互补性。互补序列能够特异性地相互结合的性质可以被用于如Northern或Southern印迹技术中或PCR或RT-PCR技术中进行引物结合。为此通常使用长度为30个或更多个碱基对的寡核苷酸。严紧条件是指，例如在Northern印迹技术中采用温度为50-70℃，优选60-65℃的洗涤溶液，例如含有0.1％SDS(20×SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)的0.1×SSC缓冲液洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核苷酸。在此情况下，如上所述，只有高度互补的核酸才能保持相互结合。严紧条件的设立是本领域技术人员所熟知的，参见如Ausubel等，分子生物学的现行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
本发明还涉及表达盒，其包括至少一个可操作地连接到调节核酸序列上的本发明多核苷酸。优选的是将启动子序列定位在本发明多核苷酸的5’上游，这样该启动子序列将有助于调控丁炔醇I酯酶的表达。尤其优选的是，将终止序列以及，如果适当的话，其它通用的调节元件定位在本发明多核苷酸的3’下游，而且使它们均可操作地与编码丁炔醇I酯酶的序列连接。可操作地连接是指启动子，编码序列，终止子以及，如果适当的话，其它的调节元件依次排列，以致每一个调节元件都能够如所预期的那样在编码序列表达之前，之中和之后行使其功能。其它的能可操作连接的序列的实例有引导序列以及翻译扩增子，增强子，聚腺苷酸化信号等等。其它有用的调节元件包括选择标记，报道基因，扩增信号，复制起点等。
除了人工调节序列，天然的调节序列仍可以位于实际结构基因之前。通过遗传修饰，在适当的情况下，可以关闭上述的天然调节和增强或减弱基因的表达。然而，表达盒的构建也可以更简单，即在结构基因之前不***附加的调节信号，并且保留天然启动子及其调节作用。相反，可以使天然的调节序列发生突变，以便其调节作用不再存在，基因表达得到增强或减弱。在表达盒中可以存在一个或多个拷贝的这些核酸序列。
有用的启动子的实例有：cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL启动子(它们可以有利地用于革兰氏阴性细菌)；以及***启动子amy和SP02，酵母启动子ADC1，Mfa，AC，P-60，CYC1，GAPDH，或植物启动子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或者遍在蛋白启动子或云扁豆蛋白启动子。尤其优选利用诱导型启动子，例如，光以及特别是温度诱导型启动子如PrP1启动子。
原则上，所有天然启动子以及它们的调节序列都可以使用。另外，还可以有利地使用人工合成的启动子。
所述调节序列应有助于核酸序列的特异表达和蛋白质表达。根据宿主生物体的不同，这可能意味着，例如，基因只能在诱导之后进行表达或过表达，或是基因立即进行表达或过表达。
在此上下文中，调节序列或因子可以正面地影响并由此增强或减弱表达。这样，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子，可以有利地在转录水平上增强调节元件的作用。然而，除此之外，也可以如通过提高mRNA的稳定性来增加翻译。
本发明的表达盒是通过将适当的启动子和能够编码丁炔醇I酯酶的适当多核苷酸以及终止子或聚腺苷酸化信号融合得到的。为此可以使用常规的重组和克隆技术，见如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验(Experimentswith Gene Fusions)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)，Ausubel，F.M.等，分子生物学的现行方法，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)。
本发明还涉及用于转化真核和原核宿主的重组载体，其中该载体携带有本发明的多核苷酸或者本发明的表达盒。所述载体使得丁炔醇I酯酶可以在适当的宿主生物体中表达。这些载体是本领域技术人员非常熟悉的并可以在如“克隆载体”(clong vectors)(Pouwels P.H.等，编.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)一书中查到。除了质粒之外，载体也指本领域技术人员已知的所有其它载体，例如：噬菌体，病毒如SV40，CMV，杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，噬菌粒，粘粒，线状或环状DNA。这些载体能在宿主中以自主方式复制或以染色体方式复制。
借助本发明的载体，可以产生这样的重组微生物，它们被例如至少一个本发明的载体所转化并且可用于生产重组酯酶。有利的是，将如上描述的本发明重组表达盒作为表达载体的一部分引入适当的宿主***并使其表达。为了在特定表达***中表达上述核酸，本发明优选使用本领域技术人员所熟知的常见克隆和转染方法。适宜的***可参见如分子生物学的现行方法，F.Ausubel等，编，Wiley Interscience，纽约1997。
适合接受本发明载体转化的宿主生物原则上包括能够有助于本发明多核苷酸及其等位基因变体，功能等价物或衍生物进行表达的所有生物。宿主生物是指，例如，细菌，真菌，酵母，植物或动物细胞。优选的生物有：细菌例如埃希氏菌属(Escherichia)中的细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，链霉菌(Streptomyces)，芽孢杆菌(Bacillus)或假单胞菌(Pseudomonas)；真核微生物如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，曲霉菌(Aspergillus)；来自动物或植物的高等真核细胞如Sf9或CHO细胞。通过包含在载体或表达盒中的标记基因可挑选出成功转化的生物体。标记基因的实例有引起抗生素抗性的基因，以及所编码的酶能够催化染色反应使转化细胞着色的基因。然后，可以利用自动化细胞分拣筛选出所述细胞。经载体成功转化并携带有适当的抗生素抗性基因的生物体可以在含有适当抗生素的培养基或底物上进行筛选。位于细胞表面的标记蛋白可以借助亲和色谱用于筛选。
因此，本发明还涉及携带有本发明载体的微生物，并涉及能够内源性地表达丁炔醇I酯酶的颖壳假单胞菌(Pseudomonas glumae)突变体Lu2023，该微生物保藏于德意志微生物保藏中心(DSM)，保藏号DSM13176。
本发明的丁炔醇I酯酶尤其能够催化至少一个如下反应：
a)对映体选择性地水解具有旋光性的式I的酯
R1-COO-R2 (I)，
其中R1是直链的或支链的，未取代的或单取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10链烯基，C2-C10炔基，R2是直链的或支链的，未取代的或单取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10链烯基，C2-C10炔基，C7-C15芳烷基或单环的或多环的，未取代的或单取代的或多取代的芳族基团，R1和/或R2包含至少一个不对称碳，
其中尤其优选R1中与酯键碳结合的碳或者R2中与酯键氧结合的碳是不对称碳；和
b)利用具有旋光性的式II的醇对式I所示的酯进行对映体选择性的酯转换
R2-OH (II)，
其中R2具有以上其中一种含义，并在适当的情况下，还具有至少一个不对称碳，
其中尤其优选携带OH基团的碳是不对称碳。
本发明还涉及利用丁炔醇I酯酶进行对映体选择性的酯水解的方法，该方法中将丁炔醇I酯酶与具有旋光性的式I的酯的立体异构体混合物进行接触，然后可从反应介质中得到由于立体选择性地水解两种立体异构体中任一种所产生的旋光性化合物和/或未水解的酯对映异构体。然而，也可以利用丁炔醇I酯酶水解不具有旋光活性的那些式I的酯。
本发明还涉及对映体选择性的转酯方法，其中在丁炔醇I酯酶存在下，将具有旋光性的式II的醇的立体异构体混合物与式I所示的酯接触，然后可以从反应介质中得到未反应的醇立体异构体，或者在丁炔醇I酯酶存在下，将旋光性的式I的酯的立体异构体混合物与式II所示的醇接触，然后可以从反应介质中得到包含在酯中的旋光性醇的立体异构体。在转酯反应中优选使用乙烯基酯作为旋光性醇的酰化剂。其有利之处在于，转化之后，由于互变异构现象，不再存在可用于逆反应的乙烯基酯中的醇官能团。丁炔醇I酯酶也能够催化酯和醇都不具有旋光活性的转酯反应。
酯水解中，优选的底物是由乙醇，丙醇，丁醇形成的酯，尤其优选的是与羧酸如，乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，己酸，庚酸，辛酸，乳酸，2-乙基己酸，3-甲基丁酸，甲氧基乙酸，2-甲基丙酸，2-丁烯酸，3-氯丙酸和2-甲基戊酸形成的丁炔酯(丁炔醇的酯，1-甲基丙-2炔醇的酯)。尤其优选丁酸丁炔酯和甲基丁酸丁炔酯。
在转酯反应中优选的醇是乙醇，丙醇和丁醇，尤其优选的是丁炔醇。
在转酯反应中优选的酯是乙烯酯，例如，乙酸乙烯酯，丙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯。
上述方法所采用的反应介质是有机溶剂，例如，烷烃，醚，甲苯，二氧杂六环，甲基异丁基酮，甲基叔丁基醚(MTBE)等。在酯水解反应中，也可以使用由所用的缓冲溶液和有机溶剂如，MTBE和庚烷或甲苯形成的混合物。
本发明还涉及利用丁炔醇I酯酶通过上述方法制备的旋光性醇，羧酸或酯。
外消旋物的拆分，即对映体选择性和反应速率能够受到酸部分的大小和疏水性的影响。反应优选在室温，pH值6到9，尤其优选pH值7.0到7.4的条件下进行。酯酶的应用形式可以是分离或纯化的酶，表达酯酶的微生物的细胞，所述微生物的培养物上清液，细胞裂解物或提取物，或者固定化的酯酶。可以通过本领域技术人员已知的化学或物理分离方法从反应溶液中分离出反应产物。可以通过膜过滤从反应混合物中分离得到丁炔醇I酯酶。
可以借助聚丙烯酰胺，藻酸，角叉菜聚糖对酯酶进行固定化，也可以通过已知的方法使酯酶共价结合或吸附到适当的载体上，优选通过在硅藻土上冻干或硫酸铵沉淀对丁炔醇I酯酶进行固定。
如上所述，丁炔醇I酯酶可以从颖壳假单胞菌(Pseudomonas glumae)Lu 2023中获得。然而，也可以通过已知的肽合成方法进行制备。
此外，丁炔醇I酯酶还可以从真核或原核生物中获得，只要所述生物能够表达丁炔醇I酯酶即可，举例来说如，带有本发明载体的微生物。
因此，本发明还涉及制备丁炔醇I酯酶的方法，该方法包括对能够产生丁炔醇I酯酶的微生物或用本发明载体转化的微生物进行培养，适当时诱导丁炔醇I酯酶的表达，然后从培养物中分离出丁炔醇I酯酶。可以利用已知的方法对微生物进行培养和发酵，例如，可以在TB或LB培养基中，20至40℃以及pH 6到9的条件下增殖细菌。适当的培养条件的描述详见如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)。
培养之后，裂解细胞，通过蛋白分离方法从裂解物中分离出丁炔醇I酯酶。可以按照需要使细胞裂解，这可以通过高频超声波，或通过高压如置于弗氏压碎器中，通过渗透作用，通过去污剂、裂解酶或有机溶剂的作用，通过匀浆器，优选玻璃珠磨来进行，也可以联合使用所述这些方法中的一种或多种来进行。离心以后，蛋白质和其它可溶性分子保留在上清液中。利用氯化锰沉淀DNA可以产生一种明显不太粘稠的溶液。通过利用如，硫酸铵或磷酸钾进行盐析，可以选择性地沉淀蛋白质。沉淀也可以通过pH或温度的变化，或者使用有机溶剂如甲醇，乙醇或丙酮来实现。盐沉淀之后，可以通过透析的方法去除所述的盐。
可以利用已知的色谱方法对丁炔醇I酯酶作进一步纯化，如分子筛色谱法(凝胶过滤)，Q-Sepharose色谱法，离子交换色谱法和疏水色谱法，也可以使用其它常规方法如超过滤，结晶和天然凝胶电泳。
利用下列非限制性实施例并参照附图对本发明进行更详细说明，其中：
附图1描述了对本发明的丁炔醇I酯酶的部分氨基酸序列与来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的内酯特异性酯酶的部分序列进行的序列比对。Query：本发明的克隆LU2898的部分序列。Sbjct：荧光假单胞菌酶(登录号：087637)的部分序列。
实施例1
筛选能够表达丁炔醇I酯酶的颖壳假单胞菌突变体
筛选的起始点是能产生脂肪酶的菌株颖壳假单胞菌(Pseudomonas(Burkholderia)glumae)Lu8093。所述菌株产生的脂肪酶使得能够进行大量有意义的反应(Balkenhonl，F.等，J.prakt.Chem.339，(1997)，381-384)。然而，乳酸酯，甲基丁酸酯和苯乙酸酯不是此脂肪酶作用的底物，也不能被此菌株通过任何其它的途径进行水解。
然而，它们的水解产物可以用作碳源，为此，人们寻找到能够水解所述的酯，并且能够以其水解产物作为碳源进行生长的Lu8093突变体。所以带有新的酯酶活性的突变体应该能够通过在所述酯类上的生长来显示自己。
筛选条件：将Lu8093在培养基上培养16h，离心收获细胞。用盐水冲洗细胞两次，将106个细胞铺在含有0.5或1.0g/l苯乙酸乙酯为唯一碳源的基本培养基平板上。然而，刚开始没有生长，4到6天之后，才可以看到单个菌落。随后几天，菌落数进一步增加。
从由此方法获得的酯酶阳性突变体中挑选出突变体Lu2023。令人惊奇的是，新的酯酶活性也适用于选择性水解相对较小的有机分子。举例来说，其表现出对丁炔醇酯的选择性水解。
实施例2
颖壳假单胞菌Lu 2023的发酵
为获得丁炔醇I酯酶，将颖壳假单胞菌Lu 2023以14升的规模培养然后收获活性生物质。
在实验室中，将颖壳假单胞菌Lu 2023在含有M12无机盐培养基和1g/lEPA的琼脂平板上划线接种，并在28℃培养36到48小时。这些平板可以在4℃贮藏四周。
菌株发酵是在Infors xxy 14-1发酵罐中进行的，对于预培养，在250ml的培养基中用铂接种环接种2至3环，并在200rpm，28℃下培养24小时。主培养按照下列条件进行：
温度28℃
空气供给7升/分钟
搅拌600rpm
发酵运行时间约24h
内在pH和pO2测量
用于预培养和主培养的培养基：
15g/l Springer酵母自溶物65％
1.6g/l硫酸锰×7水
0.02g/l氯化钙×2水
3.5g/l磷酸二氢钾
3.5g/l磷酸氢二钾
5g/l磷酸氢二铵
6ml Pluriol P2000消泡剂
将上述组分溶解于去离子水中，所得溶液用25％强氨溶液调节pH到6.5，分别对5m/l的微量元素溶液和2g/l的葡萄糖进行无菌过滤。
灭菌之后补全培养基，向发酵罐中加入0.5g/l的苯乙酸乙酯。加入Pluriol P2000以抑制发酵中泡沫的出现。当发酵罐中的pO2重新增加到85％时，停止发酵。在低于15℃的温度下，以大约9000到10000g对发酵罐中的物质进行离心，然后丢弃澄清的流出物。将所得细胞物质在-16℃下冰冻。
实施例3
从颖壳假单胞菌Lu 2023中纯化丁炔醇I酯酶
将颖壳假单胞菌(Lu 2023)细胞(100ml，湿重：50g)置于玻璃珠研磨器(100ml玻璃珠，直径：0.5mm)中，在4℃，3000rpm下进行裂解。离心(10000rpm，30min)及冲洗玻璃珠之后，上清液(300ml)用氯化锰(pH7到7.5；终浓度：50mM)进行沉淀。再次进行离心之后，将上清液的pH值调节到7.8并加入浓度50mM的EDTA。以Q-Sepharose(300ml)色谱法对这一体积进行纯化。样品上样之后，以50mM Tris/HCl洗涤柱子。收集感兴趣的组分并通过超滤作用(100kDa)进行浓缩。利用分子筛色谱(直径：5cm，高：90cm。材料：S-300)将丁炔醇I酯酶与非特异性的酯酶分离。得到的活性组分是浑浊的，再次对其进行浓缩。很明显，该酯酶与膜相结合。所以首先利用蛋白酶(胰蛋白酶，重量比：1∶50到1∶100)消化此膜组分。这一操作使除了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的几条带之外的其余所有蛋白质从膜组分中消失。活性仍得以保持。利用天然凝胶电泳(0.04％SDS)使上述各条带彼此分离，并通过活性测定试验鉴定上述天然凝胶中的酯酶。从凝胶中洗脱出所述酯酶，其在变性的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现出一条纯净的带。
通过印迹法将由此方法纯化的蛋白质转移到PVDF膜上并对其进行序列分析，或者，经过胰蛋白酶进行裂解之后，利用反相HPLC分离肽并进行序列分析。由于蛋白的氨基末端被封闭，只得到胰蛋白酶裂解产生的肽。这些不同的氨基酸序列表现出与来自鲁氏不动杆菌(Acinetobacteriwoffii)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的己二烯二酸环异构酶(EC 5.5.1.1)以及来自荧光假单胞菌的内酯酯酶具有很少的同源性。具有AIDAIFAPEGV序列的肽显示出与果胶酯酶(EC 3.1.1.11)同源。
附图1描述了对本发明的部分氨基酸序列与来自荧光假单胞菌的内酯特异性酯酶的部分序列进行的序列比对。
实施例4
丁炔醇I酯酶的固定化
应用不同的方法进行固定化。
1.在硅藻土存在下通过丙酮沉淀使丁炔醇I酯酶基本上失活。将25mg的蛋白质与3.5g的硅藻土(Merck)混合，再加入1.4升丙酮(-20℃)反应10分钟。然后经G3玻璃吸滤器分离负荷支持物，过滤残余物以冷丙酮进行洗涤并干燥。
2.丁炔醇I酯酶不与Accurel(Akzo)结合。
3.可以利用冻干法将丁炔醇I酯酶(2.3单位/g，EPA试验)固定到硅藻土上。为此，将酶溶液与硅藻土混合并在-80℃下冰冻。随后，将得到的固态物质进行冻干。
4.通过硫酸铵沉淀对丁炔醇I酯酶(454毫单位/g，EPA试验)进行固定化。为此，在硅藻土存在下以80％的饱和硫酸铵沉淀酶。
实施例5
利用来自颖壳假单胞菌Lu 2023的丁炔醇I酯酶进行外消旋体拆分
操作程序(标准混合物)
在磷酸缓冲液(200ml，10mM，pH 7.4)中，搅拌下使100单位的丁炔醇I酯酶与20mmol的丁酸丁炔醇酯(丁酸1-甲基丙-2-炔基酯)进行反应。对pH进行连续监测并通过添加氢氧化钠溶液使pH值保持在大约7.4。在如附表1中所指示的时间取样，并利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取两次，通过GC(Chiraldex GTA)对得到的有机相进行分析。通过膜过滤将丁炔醇I酯酶从反应混合物中分离出来。
随着浓度的增加，较不优选的酯对映体越来越多地被转化出来。大约45分钟之后，这一现象引起反应混合物中S-丁炔醇的ee的下降。在大约30至40分钟之后，产物的ee达到最大值84％(83-97.9％)。底物的ee在90分钟的反应过程之后增高到99％以上。对映体过剩(ee)被定义为优选被转化的对映体的量的百分数减去较不被优选转化的对映体的量的百分数。多数情况下，这与旋光纯度相符。在30分钟前pH值呈线性下降。从大约100分钟以后，pH的变化可忽略不计。
经过萃取后，水相中的残留酯酶活性仍大约在50％左右。
表1
| 时间 | 产物(S)-丁炔醇的ee | 底物(R)-丁炔醇酯的ee | 酯转化率％(校正的) |
| 0min | nd | 5.20 | nd |
| 7min | nd | 10.20 | nd |
| 13min | 75.50 | 20.40 | 12 |
| 20min | 81.80 | 29.10 | 16 |
| 26min | 83.90 | 42.00 | 22 |
| 32min | 84.60 | 53.70 | 27 |
| 45min | 84.00 | 78.80 | 36 |
| 70min | 70.80 | 97.10 | 47 |
| 90min | 69.60 | 99.10 | 52 |
| 121min | 63.10 | 99.40 | 56 |
| 150min | 52.00 | 99.50 | 67 |
附表1表明利用丁炔醇I酯酶转化丁酸丁炔醇酯时对映体过剩随时间的变化。根据Cahn，Prelog和Ingold的R/S约定，R和S构型定义了手性分子的两个对映体。转化率是指反应混合物中被转化的酯的比例。
实施例6
丁炔醇I酯酶的特异性与酯中酸部分的大小和疏水性/电荷的关系
标准方法
在磷酸缓冲液(200ml，10mM，pH7.4)中，通过搅拌，使100单位的丁炔醇I酯酶与20mmol的丁炔醇酯进行反应。对pH进行连续监测并通过连续滴定使pH值保持在7.0。利用甲基叔丁基醚对所取样品萃取两次，通过GC(Chiraldex GTA)对所得有机相进行分析。
结果
外消旋体拆分的质量和反应速率取决于酸部分的大小和疏水性。丁炔醇I酯酶的最佳底物是丁酸丁炔醇酯和甲基丁酸丁炔醇酯。脂肪酶对这些底物没有活性。对于长链的酯如正癸酸丁炔醇酯也是如此。
表2
| 酸部分 | ee[％] | 转化率[％] | E |
| 乙酸酯 | 73(S) | 48 | 12 |
| 丁酸酯 | 95(S) | 36 | 67 |
| 戊酸酯 | 74(S) | 47 | 13 |
| 己酸酯 | 66(S) | 44 | 8 |
| 辛酸酯 | 64(S) | 43 | 8 |
| 2-乙基己酸酯 | 无转化 | ||
| 苯乙酸酯 | 51(S) | 12 | 3 |
| 3-苯基丙酸酯 | 73(S) | 44 | 11 |
| 3-环己基丙酸酯 | 22(S) | 18 | 2 |
表2表明利用丁炔醇I酯酶转化酯时对映体过剩对被转化酯的酸部份的依赖性。
实施例7
利用丁炔醇I酯酶在有机介质中进行转酯反应
将10mmol的外消旋丁炔醇与5mmol的丁酸乙烯酯溶解于50ml的甲基叔丁基醚(MTBE)中，并与固定在硅藻土上的9单位的丁炔醇I酯酶(3.3g)进行混合，在室温下摇动混合物24h。过滤之后，除去溶剂并利用GC对产物混合物进行表征。
转化率47％时，得到(R)-丁炔醇(18％ee)和(S)-丁炔醇的丁酸酯(45％ee)。
在甲基异丁基酮中，转化率43％时得到16％ee的(R)-丁炔醇和52％ee的丁酸(S)-丁炔醇酯.
表3表明利用丁炔醇I酯酶转化酯时对映体过剩对被转化酯的酸部分的依赖性。
表3
| 混合物号 | 底物 | pH | 温度[℃] | 缓冲***溶液[mmol/l] | 添加物 | ee<sup>1)</sup> |
| 8 | 正癸酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 54.37 |
| 14 | 正戊酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 80.40 |
| 15 | 2-乙基己酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 81.77 |
| 16 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 83.90 |
| 17 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 0.5％Triton | 80.83 |
| 18 | 正己酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 0.5％Triton | 78.63 |
| 19 | 正辛酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 0.5％Triton | 74.70 |
| 20 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 10％正丙醇 | 87.47 |
| 21 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 1M NaCl | 85.70 |
| 23 | 正戊酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 0.5％Triton | 84.40 |
| 24 | 丁酸丁炔酯 | 6.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 85.37 |
| 25 | 丁酸丁炔酯 | 8.0 | RT | Tris 10 | 无 | 85.33 |
| 26 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | 10 | 磷酸盐10 | 无 | 85.90 |
| 27 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | 37 | 磷酸盐10 | 无 | 75.67 |
| 28 | 3-甲基丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 90.50 |
| 混合物号 | 底物 | PH | 温度[℃] | 缓冲***溶液[mmol/l] | 添加物 | ee<sup>1)</sup> |
| 29 | 甲氧基乙酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 76.33 |
| 31 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 85.00 |
| 32 | 丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 2相*** | 84.93 |
| 33 | 3-甲基丁酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 2相*** | 92.70 |
| 34 | 2-甲基丙酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 89.17 |
| 35 | 2-丁烯酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 76.03 |
| 36 | 3-氯丙酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 71.13 |
| 40 | 2-甲基戊酸丁炔酯 | 7.0 | RT | 磷酸盐10 | 无 | 85.93 |
1)三个最佳的S-丁基醇ee值的平均值
序列表
<110>巴斯福股份有限公司(BASF Aktiengesellschaft)
<120>丁炔醇I酯酶
<130>M/42107Butinol I Esterase
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1530
<212>DNA
<213>颖壳假单孢菌(Pseudomonas glumae)LU 2023
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1530)
<400>1
atg atc gtc caa ctg atc gcc atc gtg gtc gcc ctc tac gcc gtg ctg 48
Met Ile Val Gln Leu Ile Ala Ile Val Val Ala Leu Tyr Ala Val Leu
1 5 10 15
ttc gcg ttc acg ctg ttc acc gcg cat cag gtg cgc cgc cgc ttt ccg 96
Phe Ala Phe Thr Leu Phe Thr Ala His Gln Val Arg Arg Arg Phe Pro
20 25 30
ccc gag ggc aag ttc gtc gag atc gac ggc gac cgc ctg cat tat gtc 144
Pro Glu Gly Lys Phe Val Glu Ile Asp Gly Asp Arg Leu His Tyr Val
35 40 45
gac tac ggc agc ggg ccg ccg atc gtg atg gtg cat ggc ctg tgc ggg 192
Asp Tyr Gly Ser Gly Pro Pro Ile Val Met Val His Gly Leu Cys Gly
50 55 60
cag ctg ctg aac ttc gcc tac ctc gat ctg gcg cgg ctc gcg cag tcg 240
Gln Leu Leu Asn Phe Ala Tyr Leu Asp Leu Ala Arg Leu Ala Gln Ser
65 70 75 80
cat cgc gtg atc ctc gtc gat cgg gcc ggc tcg gga cgc tcg acg cgc 288
His Arg Val Ile Leu Val Asp Arg Ala Gly Ser Gly Arg Ser Thr Arg
85 90 95
ggc ccc gcc tcg cgc gcg aac gtc tat gcg cag gcg cgc ggc atc gcc 336
Gly Pro Ala Ser Arg Ala Asn Val Tyr Ala Gln Ala Arg Gly Ile Ala
100 105 110
cgc ttc atc gag acg ctc ggc ctg gag cgg ccg gtg ctg gtg ggc cat 384
Arg Phe Ile Glu Thr Leu Gly Leu Glu Arg Pro Val Leu Val Gly His
115 120 125
tcg ctc ggc ggc gcg atc gcg ctc gcg gtc ggc ctg gac tac ccc gag 432
Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Tyr Pro Glu
130 135 140
cgc gtg agc cgc atc gcg ctg atc gcg ccg ctc acg cac acc gag acc 480
Arg Val Ser Arg Ile Ala Leu Ile Ala Pro Leu Thr His Thr Glu Thr
145 150 155 160
gag ccg ccc aag gcg ttc cgc ggg ctc gcg ctg cgc ccg gcg gcg ctg 528
Glu Pro Pro Lys Ala Phe Arg Gly Leu Ala Leu Arg Pro Ala Ala Leu
165 170 175
cgc cgc ttc gcg tcg ctg acg atg ggc atc ccg atc atg att ctg caa 576
Arg Arg Phe Ala Ser Leu Thr Met Gly Ile Pro Ile Met Ile Leu Gln
180 185 190
agc cgc aag gcg atc gac gcg atc ttc gcg ccg gag ccg gtg ccg cgc 624
Ser Arg Lys Ala Ile Asp Ala Ile Phe Ala Pro Glu Pro Val Pro Arg
195 200 205
gat ttc ccg ctg aag ggc ggc ggc atg atg ggg ctg cgg ccc gag gcg 672
Asp Phe Pro Leu Lys Gly Gly Gly Met Met Gly Leu Arg Pro Glu Ala
210 215 220
ttc tac gcg gcg tcg tcg gac ctg gtc gcc gcg ccc gag gac ctg ccc 720
Phe Tyr Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Ala Ala Pro Glu Asp Leu Pro
225 230 235 240
gac atg gag cgc cgc tac ccg acg ctg ggc gtg ccg gtc agc atg ctg 768
Asp Met Glu Arg Arg Tyr Pro Thr Leu Gly Val Pro Val Ser Met Leu
245 250 255
tac ggg cgc cag gac gcg atc ctc gat ttc cac aag cat ggc gag ggg 816
Tyr Gly Arg Gln Asp Ala Ile Leu Asp Phe His Lys His Gly Glu Gly
260 265 270
ctc aag cgc aag ctc gac ggc gtc gag ctg agc gcc gtc gag ggc ggg 864
Leu Lys Arg Lys Leu Asp Gly Val Glu Leu Ser Ala Val Glu Gly Gly
275 280 285
cac atg ctg ccc gtg acg cag ccg gcc gcc acc acc gac tgg ctc ctc 912
His Met Leu Pro Val Thr Gln Pro Ala Ala Thr Thr Asp Trp Leu Leu
290 295 300
gcg gtg gcc gcg gcg gcg aac gcg gcg gcg cag cac gat gcg gcg cgg 960
Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Ala Ala Gln His Asp Ala Ala Arg
305 310 315 320
ccg gat ccg gca ccg tcc gag gtc acg cag gcc ggc gcg ctg cag cat 1008
Pro Asp Pro Ala Pro Ser Glu Val Thr Gln Ala Gly Ala Leu Gln His
325 330 335
ctg aag gtc ggc gac aac gtg ctg atc ggc aag aag ccc acc ggc acg 1056
Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Leu Ile Gly Lys Lys Pro Thr Gly Thr
340 345 350
ctg gtg gcc gac aac ctg ctg ccg ggc aag acc ctg tgg ctg ctg tcg 1104
Leu Val Ala Asp Asn Leu Leu Pro Gly Lys Thr Leu Trp Leu Leu Ser
355 360 365
acc ggc acg ggt ctc gcg ccg ttc atg tcg atc atc cgc gat ccg gac 1152
Thr Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Met Ser Ile Ile Arg Asp Pro Asp
370 375 380
atc tac gaa cgc tac gag aag gtg gtg ctc acg cac acc tgc cgc ctg 1200
Ile Tyr Glu Arg Tyr Glu Lys Val Val Leu Thr His Thr Cys Arg Leu
385 390 395 400
aag ggc gag ctc gcg tac atg gac ttc atc aag cac gac ctg ccg ggc 1248
Lys Gly Glu Leu Ala Tyr Met Asp Phe Ile Lys His Asp Leu Pro Gly
405 410 415
cat gag tac ctc ggc gac atc atc aag gaa aag ctg atc tac tac ccg 1296
His Glu Tyr Leu Gly Asp Ile Ile Lys Glu Lys Leu Ile Tyr Tyr Pro
420 425 430
acc gtc acg cgc gaa gcg ttc gac aac gag ggg cgg atc acc gac ctg 1344
Thr Val Thr Arg Glu Ala Phe Asp Asn Glu Gly Arg Ile Thr Asp Leu
435 440 445
atc tcg acg ggc aag ctg ttc acc gat ctc gac gtc ccg ccg ttc tcg 1392
Ile Ser Thr Gly Lys Leu Phe Thr Asp Leu Asp Val Pro Pro Phe Ser
450 455 460
ccc gag aac gac cgc gtg atg ctg tgc ggc agc acc gcg atg ctg aag 1440
Pro Glu Asn Asp Arg Val Met Leu Cys Gly Ser Thr Ala Met Leu Lys
465 470 475 480
gac acc acc gac ctg ctc aag cag gcc ggc ctc gtc gaa ggc aag aac 1488
Asp Thr Thr Asp Leu Leu Lys Gln Ala Gly Leu Val Glu Gly Lys Asn
485 490 495
agc gcg ccg ggc cac tat gtg atc gaa cgc gca ttt gtc gac 1530
Ser Ala Pro Gly His Tyr Val Ile Glu Arg Ala Phe Val Asp
500 505 510
<210>2
<211>510
<212>PRT
<213>颖壳假单孢菌LU 2023
<400>2
Met Ile Val Gln Leu Ile Ala Ile Val Val Ala Leu Tyr Ala Val Leu
1 5 10 15
Phe Ala Phe Thr Leu Phe Thr Ala His Gln Val Arg Arg Arg Phe Pro
20 25 30
Pro Glu Gly Lys Phe Val Glu Ile Asp Gly Asp Arg Leu His Tyr Val
35 40 45
Asp Tyr Gly Ser Gly Pro Pro Ile Val Met Val His Gly Leu Cys Gly
50 55 60
Gln Leu Leu Asn Phe Ala Tyr Leu Asp Leu Ala Arg Leu Ala Gln Ser
65 70 75 80
His Arg Val Ile Leu Val Asp Arg Ala Gly Ser Gly Arg Ser Thr Arg
85 90 95
Gly Pro Ala Ser Arg Ala Asn Val Tyr Ala Gln Ala Arg Gly Ile Ala
100 105 110
Arg Phe Ile Glu Thr Leu Gly Leu Glu Arg Pro Val Leu Val Gly His
115 120 125
Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Tyr Pro Glu
130 135 140
Arg Val Ser Arg Ile Ala Leu Ile Ala Pro Leu Thr His Thr Glu Thr
145 150 155 160
Glu Pro Pro Lys Ala Phe Arg Gly Leu Ala Leu Arg Pro Ala Ala Leu
165 170 175
Arg Arg Phe Ala Ser Leu Thr Met Gly Ile Pro Ile Met Ile Leu Gln
180 185 190
Ser Arg Lys Ala Ile Asp Ala Ile Phe Ala Pro Glu Pro Val Pro Arg
195 200 205
Asp Phe Pro Leu Lys Gly Gly Gly Met Met Gly Leu Arg Pro Glu Ala
210 215 220
Phe Tyr Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Ala Ala Pro Glu Asp Leu Pro
225 230 235 240
Asp Met Glu Arg Arg Tyr Pro Thr Leu Gly Val Pro Val Ser Met Leu
245 250 255
Tyr Gly Arg Gln Asp Ala Ile Leu Asp Phe His Lys His Gly Glu Gly
260 265 270
Leu Lys Arg Lys Leu Asp Gly Val Glu Leu Ser Ala Val Glu Gly Gly
275 280 285
His Met Leu Pro Val Thr Gln Pro Ala Ala Thr Thr Asp Trp Leu Leu
290 295 300
Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Ala Ala Gln His Asp Ala Ala Arg
305 310 315 320
Pro Asp Pro Ala Pro Ser Glu Val Thr Gln Ala Gly Ala Leu Gln His
325 330 335
Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Leu Ile Gly Lys Lys Pro Thr Gly Thr
340 345 350
Leu Val Ala Asp Asn Leu Leu Pro Gly Lys Thr Leu Trp Leu Leu Ser
355 360 365
Thr Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Met Ser Ile Ile Arg Asp Pro Asp
370 375 380
Ile Tyr Glu Arg Tyr Glu Lys Val Val Leu Thr His Thr Cys Arg Leu
385 390 395 400
Lys Gly Glu Leu Ala Tyr Met Asp Phe Ile Lys His Asp Leu Pro Gly
405 410 415
His Glu Tyr Leu Gly Asp Ile Ile Lys Glu Lys Leu Ile Tyr Tyr Pro
420 425 430
Thr Val Thr Arg Glu Ala Phe Asp Asn Glu Gly Arg Ile Thr Asp Leu
435 440 445
Ile Ser Thr Gly Lys Leu Phe Thr Asp Leu Asp Val Pro Pro Phe Ser
450 455 460
Pro Glu Asn Asp Arg Val Met Leu Cys Gly Ser Thr Ala Met Leu Lys
465 470 475 480
Asp Thr Thr Asp Leu Leu Lys Gln Ala Gly Leu Val Glu Gly Lys Asn
485 490 495
Ser Ala Pro Gly His Tyr Val Ile Glu Arg Ala Phe Val Asp
500 505 510
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>颖壳假单孢菌Lu2023
<400>3
Phe Ile Glu Thr Leu Gly Leu Glu Arg Pro Val Leu Val Gly His Ser
1 5 10 15
Leu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Tyr Pro Glu Arg
20 25 30
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>颖壳假单孢菌Lu2023
<400>4
Ile Ala Leu Ile Ala Pro Leu Thr His Thr Glu Thr Glu Pro
1 5 10
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>颖壳假单孢菌Lu2023
<400>5
Gly Gly Gly Met Met Gly Leu Arg Pro Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ser Asp Leu Val
20
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>颖壳假单孢菌Lu2023
<400>6
Ala Ile Asp Ala Ile Phe Ala Pro Glu Pro Val
1 5 10
Claims (17)
1.具有丁炔醇I酯酶活性的蛋白质，其由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的具有丁炔醇I酯酶活性的蛋白质，所述蛋白质的特征在于其分子量为41300Da。
3.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述的蛋白质可从保藏号为DSM13176的颖壳假单胞菌Lu 2023中获得。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的蛋白质，其中所述的蛋白质能够催化至少一种下列反应：
a)对映体选择性的水解具有旋光性的式I的酯
R1-COO-R2(I)，
其中R1是直链的或支链的，未取代的或单取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10链烯基，C2-C10炔基，R2是直链的或支链的，未取代的或单取代的或多取代的C1-C10烷基，C2-C10链烯基，C2-C10炔基，C7-C15芳烷基或单环的或多环的，未取代的或单取代的或多取代的芳族基团，R1和/或R2包含至少一个不对称碳；和
b)利用具有旋光性的式II的醇对式I的酯进行对映体选择性的酯交换
R2-OH (II)，
其中R2具有如上一种含义，并且在适当的情况下，具有至少一个不对称碳。
5.根据权利要求4的蛋白质，其特征在于底物的R2是丁炔基。
6.编码权利要求1-3中任意一项所述的蛋白质的多核苷酸，与其互补的多核苷酸和可与其在严紧杂交条件下杂交的核酸序列。
7.寡核苷酸探针，其包含由SEQ ID NO.：1的核酸序列中的至少30个连续核苷酸残基组成的核苷酸序列。
8.表达盒，其包含至少一段如权利要求6所述的多核苷酸，并且该多核苷酸与至少一段调节核酸序列可操作地连接。
9.用于转化真核或原核宿主的重组载体，其包含如权利要求6所述的多核苷酸，或者如权利要求8所述的表达盒。
10.用于制备如权利要求1至5之任一项所述的蛋白质的方法，其中，对能够内源性生产该蛋白质的微生物或用如权利要求9所述的载体转化的微生物进行培养，并从培养物中分离出该蛋白质。
11.如权利要求10所述的方法，其中微生物是颖壳假单胞菌Lu 2023，保藏号DSM 13176。
12.保藏号为DSM 13176的颖壳假单胞菌Lu 2023。
13.微生物，其包含如权利要求9所述的载体。
14.利用如权利要求1至5之任一项所述的蛋白质进行对映体选择性酯水解的方法，其中
a)使此蛋白质与具有旋光性的式I的酯的立体异构体混合物接触；并
b)从反应介质中得到由立体选择性的水解任一种立体异构体所产生的旋光性化合物和/或未水解的酯对映异构体。
15.用于进行对映体选择性转酯反应的方法，其中
a)在如权利要求1至5之任一项所述的蛋白质存在下，将具有旋光性的式II的醇的立体异构体混合物与式I的酯接触，然后从反应介质中得到未反应的醇立体异构体；或者
b)在如权利要求1至5之任一项所述的蛋白质存在下，将具有旋光性的式I的酯的立体异构体混合物与式II的醇接触，然后从反应介质中得到包含在酯中的旋光性醇的立体异构体。
16.如权利要求15所述的方法，其中利用乙烯基酯作为转酯反应中旋光性醇的酰化剂。
17.如权利要求14，15和16之任一项所述的方法，其中所用的反应介质是有机溶剂。
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