CN100379853C - 包含rre和cte的遗传构建体和组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了包含HIV-1Rev的编码序列和所需蛋白的编码序列的遗传构建体。公开了包含至少两个核酸分子的组合物，其中至少一个核酸分子包含HIV-1Rev的编码序列，且至少一个核酸分子包含所需蛋白的编码序列。在此遗传构建体和包含核酸分子的组合物中，所需蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。也公开了在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法，向个体送递蛋白的方法和生产蛋白的方法。

Description

包含RRE和CTE的遗传构建体和组合物及其用途
发明领域
本发明涉及改进的遗传构建体。具体而言，本发明涉及核酸分子，该核酸分子可用于产生由所述核酸分子的核酸序列编码的蛋白的高水平表达。本发明也涉及改进的DNA疫苗和基因治疗剂。
发明背景
HIV-1 Rev-RRE是众所周知的，但并未完全被理解。已知编码HIV结构蛋白的基因，即HIV基因gag、pol和env均含有由HIV蛋白Rev识别的RRE。已知这些序列与HIV蛋白Rev相互作用。细胞中含有RRE的核酸分子与存在于细胞中的Rev结合并运输到细胞质中。该运输导致与在类似的构建体中不存在RRE或Rev时所观察到的情况相比更高水平的基因表达。美国专利No.5,554,528和5,604,114公开了HIV RRE序列，其在此引入作为参考。美国专利No.5,650,309和5,665,577公开了包含HIV RRE序列的载体，其在此引入作为参考。
CTE***是众所周知的，并描述于美国专利No.5,585,263和5,880,276，其均在此引入作为参考。根据该***，宿主蛋白识别mRNA上的CTE序列，并将其从核转运到细胞质中。该转运导致与在类似的构建体中不存在RRE或Rev时所观察到的情况相比更高水平的基因表达。CTE***也描述于以下文献中：Bray，M.，S.Prasad，J.W.Dubay，E.Hunter，K.-T.Jeang，D.Rekosh和M.-L.Hammarskjold(1994)。来自梅森-普菲策尔猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus)基因组的小元件使得1型人免疫缺陷病毒表达和复制不依赖于Rev。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1256-1260；Saavedra，C.，B.Felber和E.Izaurralde.1997。与HIV-1 RRE不同，猿猴逆转录病毒-1组成型运输元件利用细胞mRNA输出所需的因子。Curr.Biol.619-628，ErnstRK，Bray M，Rekosh D，Hammarskjold ML.(1997)Secondarystructure and mutational analysis of the Mason-Pfizer monkey virusRNA constitutive transport element.RNA.3(2)：210-22；和Kang Y，Bogerd HP，Cullen BR.(2000).Analysis of cellular factors that mediatenuclear export of RNAs bearing the Mason-Pfizer monkey virusconstitutive transport element.J Virol.74(13)：5863-71，其各自均在此处引入作为参考。
需要提供用于增强核酸分子的编码序列表达的改进的***。需要提供显示核酸分子的编码序列高水平表达的改进的疫苗、免疫方法和基因治疗方法以及组合物。
发明概述
本发明涉及包含HIV-1 Rev的编码序列和所需蛋白的编码序列的遗传构建体。在此遗传构建体中，所需蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。
本发明也涉及包含至少两个核酸分子的组合物，其中至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，且至少一个核酸分子包含所需蛋白的编码序列。所需蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。所需蛋白通常是不同于HIV-1 Rev的蛋白。
本发明进一步涉及在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法。本发明的一些方法包含如下步骤，即向个体施用包含HIV-1 Rev的编码序列和免疫原的编码序列的遗传构建体。所述免疫原的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。本发明的一些方法包含如下步骤，即向个体施用包含至少两个核酸分子的组合物。至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，且至少一个核酸分子包含免疫原的编码序列。所述免疫原的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。
本发明进一步涉及向个体送递蛋白的方法。本发明的一些方法包含如下步骤，即向个体施用包含HIV-1 Rev的编码序列和蛋白的编码序列的遗传构建体。所述蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。本发明的一些方法包含如下步骤，即向个体施用包含至少两个核酸分子的组合物。至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，且至少一个核酸分子包含所需蛋白的编码序列。所述蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。
本发明进一步涉及在细胞中生产蛋白的方法。本发明的一些方法包含培养包含遗传构建体的细胞的步骤，所述遗传构建体包含HIV-1Rev的编码序列和蛋白的编码序列。所述蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。本发明的一些方法包含培养包含至少两个核酸分子的细胞的步骤。至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，且至少一个核酸分子包含所需蛋白的编码序列。所述蛋白的编码序列包含包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分和至少一个CTE。
附图简述
图1-5显示了来自施用3个质粒之一后针对HIV-1 Env的免疫应答的比较的数据，这3个质粒的每一个都编码Env，其中Env编码序列含有RRE。这些数据在下面的实施例中进行描述。
发明详述
根据本发明，核酸分子是用两种运输元件提供的，当这两种元件在mRNA上存在的时候，导致mRNA从细胞核到细胞质的往返以及细胞内蛋白的生产加快。这两种运输元件均可相互独立地发挥作用，并且共同使用时产生的对蛋白生产的增强作用比简单的加性效应更高。
所使用的每种运输***均已明确。其一是HIV-1 Rev-Rev应答元件(RRE)***。另一种是从梅森-普菲策尔猴病毒分离的CTE***。根据本发明，遗传构建体不仅包含RRE而且包含至少一个CTE。此外，还向该构建体提供了HIV-1 Rev编码序列，以给细胞提供参与RRE和影响运输的Rev蛋白。
如此处用到的，“遗传构建体”这一术语是指包含编码一种蛋白的核酸序列(编码序列)的核酸分子，该核酸序列可操作地连接到所述编码序列表达所必需的元件上。在一些实施方案中，遗传构建体为DNA，优选是质粒或病毒载体的基因组。在一些实施方案中，遗传构建体为RNA，优选是逆转录病毒载体的基因组。
根据本发明，所提供的遗传构建体包含Rev的编码序列和所需蛋白的编码序列。如此处用到的，“所需蛋白”这一术语系指任何蛋白，包括具有生理活性或免疫原性活性序列的蛋白，前提是所述蛋白包含HIV结构蛋白的至少部分编码序列，该部分编码序列包括RRE，且包括所述蛋白编码序列的mRNA包含至少一个CTE。在一些实施方案中，所需蛋白是HIV结构蛋白，且包含HIV结构蛋白编码序列的mRNA包含至少一个CTE。在一些实施方案中，所需蛋白是融合蛋白，该融合蛋白包含HIV结构蛋白的至少一部分和非HIV部分。在一些实施方案中，非HIV部分可以是有免疫原性或生理活性的蛋白或其免疫原性或生理活性的片段，所述蛋白或其片段进而包含HIV结构蛋白或其中包含RRE的片段。如果所需蛋白不是HIV结构蛋白，即它为一种融合蛋白，那么非HIV序列的性质将决定该遗传构建体是疫苗还是基因治疗剂。也就是说，如果作为所需蛋白的融合蛋白是免疫原，则该构建体可被用作疫苗来诱导免疫应答，或用作生产蛋白的起始原料。如果融合蛋白有生物活性而无免疫原性，则该构建体可被用作基因治疗剂或产生蛋白的起始原料。
本发明也提供一种组合物，其包含至少两个核酸分子，至少其中一个包含HIV-1 Rev的编码序列，且至少其中一个包含所需蛋白的编码序列。在一些实施方案中，核酸分子是DNA分子，优选质粒。
本发明的遗传构建体以及本发明组合物的核酸分子包括选自gag、pol、env及其包含RRE的一个片段的编码序列。也就是说，本发明可用于使gag、pol或env编码的HIV蛋白高水平表达，或者可选择地，也可用于使含有RRE的gag、pol或env基因产物部分的融合蛋白高水平表达。此遗传构建体也包含编码HIV-1 Rev蛋白的编码序列，此编码序列可操作地连接到调控元件上，以使Rev蛋白得以产生。此组合物含有一个核酸分子，它含有可编码HIV-1 Rev蛋白的编码序列，此编码序列可操作地连接到调控元件上，以使Rev蛋白得以产生。
根据本发明，在要生产的蛋白序列的组合物的遗传构建体或核酸分子中含有上述CTE序列或多个CTE序列。在优选实施方案中，CTE序列包括于多腺苷酸化尾的3’的位点。在某些实施方案中，该遗传构建体可以含有多于一个CTE序列。在某些实施方案中，它可以含有2、3、4或5个CTE序列。
本发明进一步提供了在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法，向个体送递蛋白的方法和生产蛋白的方法。
在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法以及向个体送递蛋白的方法包括向个体施用上述的遗传构建体或组合物的步骤。在诱导免疫应答的方法中，所需蛋白是免疫原性的。如果所需蛋白是一种HIV结构蛋白，那么此遗传构建体即为疫苗，而且所需蛋白是为了用作免疫原而表达的。类似地，如果所需蛋白是一种免疫原性蛋白，那么此遗传构建体或组合物可用作疫苗，并且所需蛋白是为了用作免疫原而表达的。诱导免疫应答可提供保护性或治疗性效应，或者产生针对所述免疫原特异性的抗体以及抗原特异性免疫***细胞。此抗体和细胞可被收集和利用。
能用本发明编码的免疫原的实例包括HIV结构蛋白Gag、Pol、Env及其片段。此外，疫苗可根据1997年1月14日授权的美国专利No.5,593,972所述进行制备，其中免疫原是靶蛋白，所述专利在此处引入作为参考。此种免疫原可以是病原蛋白、与过度增殖性疾病相关的蛋白或者与自身免疫病相关的蛋白以及变应原。对于所有的非HIV结构蛋白的免疫原，所述免疫原性蛋白必须以融合蛋白的形式被呈递，所述融合蛋白由嵌合基因编码，此嵌合基因的编码序列中包括至少一部分作为RRE的HIV结构蛋白编码序列。在免疫应答被送递的本发明实施方案中，本发明可与佐剂、免疫调制蛋白以及编码诸如细胞因子、趋化因子和生长因子的免疫调制蛋白的遗传序列联合应用。
向个体送递蛋白的方法包括向个体施用如前所述的遗传构建体或组合物的步骤。在一些实施方案中，所需蛋白为细胞因子、生长因子、趋化因子、共刺激分子、抗体、可溶性受体、酶、凝血因子或它们的片段。在一些实施方案用中，所需蛋白为病原体抗原、癌基因翻译产物或者其他癌相关抗原、自身免疫病相关蛋白、变应原或它们的片段。在一些实施方案中，所需蛋白为胰岛素、IL-1、IL-2、IL-5、IL-12、IL-15、VEGF、EGF、EP0、GMCSF、GCSF、它们的受体、CD28、CD80、CD86、CD40、CD40L、mAbs、Fabs、F(ab)2s、嵌合的、人源化的、灵长类化的、人mAbs、Fabs、F(ab)2s、DNA酶(DNAse)、tPA、凝血因子I-XII或它们的活性片段。在一些实施方案中，所需蛋白是美国专利No.5,593,972所提出的一种抗原，其在此处引入作为参考。
在细胞中生产蛋白的方法包括培养细胞的步骤，该细胞含有上述的遗传构建体或组合物的至少两个核酸分子。在此方法中，细胞可以是RRE***和CTE***同时具有活性的任何细胞。在某些实施方案中，此细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，此细胞为人的细胞。
在优选实施方案中，此遗传构建体是可以直接向患者施用的质粒。有许多方法可用于向患者直接送递DNA。除了美国专利No.5,593,972中所描述的那些方法外(其在此处引入作为参考)，其他方法包括美国专利No.5,739,118(其在此处引入作为参考)和美国专利No.5,981,505(其在此处引入作为参考)中所述的方法。另外，可以利用本文所述的改进采用在<www.dnavaccine.com>公开的专利和出版物中描述的方法，所述专利和出版物均在此引入作为参考。例如，此发明可与任何质粒送递***相容，如lipofectins、阳离子脂质、阴离子脂质、脂质体、转染剂和细胞靶向剂。
在优选实施方案中，质粒DNA经肌内注射向个体施用。除质粒DNA外，可注射的组合物中任选包含促进剂(facilitating)如布比卡因或相关组合物，包括在PCT申请系列号PCT/US94/00899中所描述的那些，其在此处引入作为参考。
除了在质粒中使用外，本发明的构建体也可用于其他遗传送递***中，其中编码需要表达的蛋白的DNA是在细胞核中转录的，如，逆转录病毒载体或其它病毒载体或非病毒载体。
实施例
在图1-5中所附的数据报道了施用3个质粒之一后针对HIV-1 Env的免疫应答的比较，这3个质粒的每一个都编码Env。Env编码序列含有上述RRE。所述数据清楚地显示包括CTE的Env和Rev的编码序列的组合产生了增强的免疫应答，与在施用仅含有Env和Rev的编码序列或具有CTE的Env的编码序列的遗传构建体后所观察到的情形形成对照。

Claims (23)

1.遗传构建体，其包含：
a)HIV-1 Rev的编码序列，和
b)所需蛋白的编码序列，其中所需蛋白的编码序列包含
i)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
ii)至少一个CTE。
2.权利要求1中的遗传构建体，其中所述的遗传构建体为DNA分子。
3.权利要求2中的遗传构建体，其中所述的遗传构建体为质粒。
4.权利要求1中的遗传构建体，其中所需蛋白是包括至少一个CTE的HIV结构蛋白。
5.权利要求1中的遗传构建体，其中所需蛋白是融合蛋白，该融合蛋白含有HIV结构蛋白的至少一部分和非HIV部分。
6.权利要求1中的遗传构建体，其中所需蛋白是融合蛋白，该融合蛋白含有HIV结构蛋白的至少一部分和免疫原性的非HIV部分。
7.权利要求1中的遗传构建体，其中所述的遗传构建体包含1到5个CTE。
8.组合物，其含有至少两个核酸分子：
a)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
b)至少一个核酸分子包含所需蛋白的编码序列，其中所需蛋白的编码序列包含
i)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
ii)至少一个CTE。
9.权利要求8中的组合物，其中所述的核酸分子为DNA分子。
10.权利要求9中的组合物，其中所述的DNA分子为质粒。
11.权利要求8中的组合物，其中所需蛋白是包含至少一个CTE的HIV结构蛋白。
12.权利要求9中的组合物，其中所需蛋白是融合蛋白，该融合蛋白含有HIV结构蛋白的至少一部分和非HIV部分。
13.权利要求8中的组合物，其中所需蛋白是融合蛋白，该融合蛋白含有HIV结构蛋白的至少一部分和免疫原性的非HIV部分。
14.权利要求8中的组合物，其中至少一个核酸分子包含所需蛋白的编码序列，其中所需蛋白的编码序列包含
i)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
ii)1到5个CTE。
15.以下组合物在制备在个体内诱导针对免疫原的免疫应答的药物中的用途：
a)含有遗传构建体的组合物，该遗传构建体包含
i)HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)所述免疫原的编码序列，其中所述免疫原的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，
和
2)至少一个CTE；或
b)含有至少两个核酸分子的组合物：
i)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)至少一个核酸分子包含免疫原的编码序列，其中所述免疫原的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
16.权利要求15的用途，其中遗传构建体包含
i)HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)所述免疫原的编码序列，其中所述免疫原的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
17.权利要求15的用途，其中所述组合物含有至少两个核酸分子：
i)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)至少一个核酸分子包含免疫原的编码序列，其中所述免疫原的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
18.以下组合物在制备用于向个体送递蛋白的药物中的用途：
a)含有遗传构建体的组合物，该遗传构建体包含
i)HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE；或
b)含有至少两个核酸分子的组合物：
i)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)至少一个核酸分子包含所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
19.权利要求18的用途，其中遗传构建体包含
i)HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
20.权利要求18的用途，其中所述组合物含有至少两个核酸分子：
i)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)至少一个核酸分子包含所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
21.在细胞内生产蛋白的方法，包括细胞培养的步骤，所述细胞包含
a)遗传构建体，其包含
i)HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE；或
b)至少两个核酸分子，其中：
i)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)至少一个核酸分子包含所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
22.权利要求21的方法，包含培养含有遗传构建体的细胞的步骤，该遗传构建体包含
i)HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
23.权利要求21的方法，包含培养含有遗传构建体的细胞的步骤，该遗传构建体含有至少两个核酸分子：
i)至少一个核酸分子包含HIV-1 Rev的编码序列，和
ii)至少一个核酸分子包含所述蛋白的编码序列，其中所述蛋白的编码序列包含
1)包括RRE的HIV结构蛋白编码序列的至少一部分，和
2)至少一个CTE。
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