CN100372557C - 一种能提高人体缺氧耐受力的口服液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能提高人体缺氧耐受力的口服液及其制备方法，是由重量份的13～17份黄芪、6～10份川芎和1～3份肉桂提取的挥发油，提取挥发油后的药渣与13～17份牡蛎、13～17份枸杞子、13～17份白芍、8～12份山药、8～12份白术和8～12份茯苓的共同水提取液，和3～7份复合氨基酸粉、18～22份麦芽糖混合而成。本发明的口服液能增强细胞免疫、体液免疫和增强单核——巨噬细胞吞噬功能；扩张血管，增加冠脉血流量，减少心肌耗量，提高缺氧耐受力的保健功能。

Description

一种能提高人体缺氧耐受力的口服液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种保健品，尤其是指用于免疫力低下、处于缺氧环境人群使用的一种能提高人体缺氧耐受力的口服液，本发明还涉及该口服液的制备方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对各种保健品的需求也逐年增加，保健品对提高人们的生活质量，减少病痛都具有十分重要的作用。目前，市面上的各种保健口服液种类繁多，功能与作用也各不相同。但很多保健品存在添加化学药物、长期服用对人体有害的不足。本申请的发明人经过多年研究，发现利用天然中药原料提取的口服液，对增强人体的免疫力、提高人体缺氧耐受力均具有显著的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种可增强人体免疫力、提高缺氧耐受力的一种能提高人体缺氧耐受力的口服液。

本发明的另一目的是提供一种制备上述口服液的制备方法。

本发明的前一目的是这样实现的：一种能提高人体缺氧耐受力的口服液，是由13～17份黄芪、6～10份川芎和1～3份肉桂提取的挥发油，上述黄芪、川芎和肉桂提取挥发油后的药渣与13～17份牡蛎、13～17份枸杞子、13～17份白芍、8～12份山药、8～12份白术和8～12份茯苓的共同水提取液，和3～7份复合氨基酸粉、18～22份麦芽糖混合而成，上述份量为重量份。

本发明的后一目的是这样实现的：一种能提高人体缺氧耐受力的口服液的制备方法，包括下述步骤：(1)黄芪、川芎、肉桂提取挥发油(A)，蒸馏后的水溶液(B)另器收集；(2)将提取挥发油的黄芪、川芎、肉桂药渣与牡蛎、枸杞子、白芍、山药、白术、茯苓等6味中药加水煎煮二次，合并煮液，过滤得滤液(C)；(3)将滤液(C)与水溶液(B)合并后真空浓缩，冷却至室温，加入95％食用乙醇，使含醇量为60％，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，在60℃以下真空浓缩至相对密度为1.20的浓缩液(D)；(4)将浓缩液(D)与挥发油(A)、复合氨基酸粉、麦芽糖加水适量混合均匀，过滤后经灌瓶、灭菌、检验后入库。

上述一种能提高人体缺氧耐受力的口服液的制备方法步骤(2)中牡蛎先煎煮1小时为佳。

上述一种能提高人体缺氧耐受力的口服液的制备方法步骤(2)第一次煎煮时加水过药面3寸，煎煮2小时，第二次煎煮时加水过药面2寸，煎煮1.5小时。

上述一种能提高人体缺氧耐受力的口服液的制备方法步骤(2)、步骤(4)中的过滤条件为0.2MPa压力下通过0.5NM滤芯过滤。

上述一种能提高人体缺氧耐受力的口服液的制备方法步骤(4)中的灭菌条件为：蒸汽压力0.1Mpa、温度125℃，保持20分钟以上。

本发明的口服液，根据中医理论气血两虚，脾胃虚弱，肝肾亏损所致之面色苍白，气短心悸，体倦乏力，头晕自汗，健忘失眠等症，治宜益气养血，健脾和胃，温补肝肾，宁心安神。方中山药、白术、茯苓分健脾气、祛湿利水，增强脾胃运化，以促进气血生成；辅以枸杞子、白芍滋补肝肾，益精明目；配川芎、肉桂行气活血，温化阳气并鼓舞气血生成；更用黄芪补气生血，补气摄血，升举阳气，固表止汗；牡蛎重镇安神，平肝补阴，以助肺津；麦芽糖起滋润补中，改善口感作用。诸药合用，共奏益气养血，健脾补肾，宁心安神之功效。

本发明的口服液经药理实验表明：黄芪能补气固表、益气活血，对人体免疫功能有明显的促进作用(细胞免疫、体液免疫、巨噬细胞吞噬功能，并能增强病毒诱生干扰素的能力)；能提高机体抗疲劳、耐缺氧等抗应激能力；有提高机体抗氧化酶和抗氧化剂、降低血清脂合质含量而显抗衰老作用。枸杞子能滋补肝肾、益精明目，具有增加外周血液的细胞总数及嗜中性粒细胞数(P<0.01)，增强特异性免疫、促进细胞免疫与部分体液免疫的作用。白芍养血柔肝，敛阴止汗，能延长小鼠常压和低压缺氧的存活时间，能对抗异丙肾上腺素对动物造成的心肌耗氧量增加。白术健俾益气，有强壮作用，能提高小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，使细胞变大，吞噬增多，细胞核变小；能升高脾组织cCMP的含量。茯苓健脾利水，茯苓多糖能增强体内巨噬细胞的吞噬功能，能激活T细胞***和B细胞***，具增强免疫功能的作用。川芎行气活血，能直接扩张周围血管，增加冠脉血流量，减少心肌耗氧量。复合氨基酸参与体内蛋白质的新陈代谢，及时补充各组织器官新的蛋白质合成，使体质尽快恢复正常。

综上所述，本发明的口服液能增强细胞免疫、体液免疫和增强单核——巨噬细胞吞噬功能；扩张血管，增加冠脉血流量，减少心肌耗氧量，提高缺氧耐受力。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

图1是本发明的工艺流程示意图。

具体实施方式

本发明的一种能提高人体缺氧耐受力的口服液，原料组方为：

黄芪13～17份、川芎6～10份、肉桂1～3份、牡蛎13～17份、枸杞子13～17份、白芍13～17份、山药8～12份、白术8～12份、茯苓8～12份、复合氨基酸粉3～7份、麦芽糖18～22份。

制备方法参阅附图1所示，将黄芪、川芎、肉桂提取挥发油(A)，蒸馏后的水溶液(B)另器收集；药渣与牡蛎(先煎煮1小时)、枸杞子、白芍、山药、白术、茯苓等6味中药加水煎煮二次，第一次加水过药面3寸，煎煮2小时，第二次加水过药面2寸，煎煮1.5小时.合并煮液，在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤得滤液(C)，滤液(C)与上述水溶液(B)合并，真空浓缩，待冷却至室温，加入95％食品级乙醇，使含醇量为60％，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，在60℃以下真空浓缩至相对密度为1.20(热测)得浓缩液(D)，浓缩液(D)加入黄芪、川芎、肉桂挥发油(A)、复合氨基酸粉、麦芽糖，加水适量，置搅拌罐中起动搅拌机5～10分钟，使药液均匀，药液在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤，滤液进入GY型自动灌封机将药液灌装进药用管制口服液玻璃瓶，自动锁盖，灌装好的产品进入灭菌器后，开通蒸汽，使灭菌内蒸汽压力达到0.1MPa、温度达到125℃，保持20分钟以上，关闭蒸汽，放凉后灯检，包装，即得。

实施例1

组方：黄芪130g、川芎60g、肉桂10g、牡蛎130g、枸杞子130g、白芍130g、山药80g、白术80g、茯苓80g、复合氨基酸粉30g、麦芽糖180g。

制备方法：将130g黄芪、60g川芎、10g肉桂提取挥发油(A)，蒸馏后的水溶液(B)另器收集；药渣与130g牡蛎(先煎煮1小时)、130g枸杞子、130g白芍、80g山药、80g白术、80g茯苓加水煎煮二次，第一次加水过药面3寸，煎煮2小时，第二次加水过药面2寸，煎煮1.5小时，合并煮液，在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤得滤液(C)，滤液(C)与上述水溶液(B)合并，真空浓缩，待冷却至室温，加入95％食品级乙醇，使含醇量为60％，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，在60℃以下真空浓缩至相对密度为1.20(热测)得浓缩液(D)，浓缩液(D)中加入挥发油(A)、30g复合氨基酸粉、180g麦芽糖，加水调节至1000ml，置搅拌罐中起动搅拌机5～10分钟，使药液均匀，药液在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤，滤液进入GY型自动灌封机将药液灌装进药用管制10ml口服液玻璃瓶，自动锁盖，灌装好的产品进入灭菌器后，开通蒸汽，使灭菌内蒸汽压力达到0.1MPa、温度125℃，保持30分钟，关闭蒸汽，放凉后灯检，包装，即得100瓶，10ml/每瓶口服液。

实施例2

组方：黄芪170g、川芎100g、肉桂30g、牡蛎170g、枸杞子170g、白芍170g、山药120g、白术120g、茯苓120g、复合氨基酸粉70g、麦芽糖220g。

制备方法：将170g黄芪、100g川芎、30g肉桂提取挥发油(A)，蒸馏后的水溶液(B)另器收集；药渣与170g牡蛎(先煎煮1小时)、170g枸杞子、170g g白芍、120g山药、120g白术、120g茯苓加水煎煮二次，第一次加水过药面3寸，煎煮2小时，第二次加水过药面2寸，煎煮1.5小时，合并煮液，在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤得滤液(C)，滤液(C)与上述水溶液(B)合并，真空浓缩，待冷却至室温，加入95％食品级乙醇，使含醇量为60％，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，在60℃以下真空浓缩至相对密度为1.20(热测)得浓缩液(D)，浓缩液(D)中加入挥发油(A)、70g复合氨基酸粉、220g麦芽糖，加水调节至1000ml，置搅拌罐中起动搅拌机5～10分钟，使药液均匀，药液在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤，滤液进入GY型自动灌封机将药液灌装进药用管制10ml口服液玻璃瓶，自动锁盖，灌装好的产品进入灭菌器后，开通蒸汽，使灭菌内蒸汽压力达到0.1MPa、温度125℃，保持30分钟，关闭蒸汽，放凉后灯检，包装，即得100瓶，10ml/每瓶口服液。

实施例3

组方：黄芪150g、川芎80g、肉桂20g、牡蛎150g、枸杞子150g、白芍150g、山药100g、白术100g、茯苓100g、复合氨基酸粉50g、麦芽糖200g。

制备方法：将150g黄芪、80g川芎、20g肉桂提取挥发油(A)，蒸馏后的水溶液(B)另器收集；药渣与150g牡蛎(先煎煮1小时)、150g枸杞子、150g白芍、120g山药、120g白术、120g茯苓加水煎煮二次，第一次加水过药面3寸，煎煮2小时，第二次加水过药面2寸，煎煮1.5小时，合并煮液，在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤得滤液(C)，滤液(C)与上述水溶液(B)合并，真空浓缩，待冷却至室温，加入95％食品级乙醇，使含醇量为60％，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，在60℃以下真空浓缩至相对密度为1.20(热测)得浓缩液(D)，浓缩液(D)中加入挥发油(A)、50g复合氨基酸粉、200g麦芽糖，加水调节至1000ml，置搅拌罐中起动搅拌机5～10分钟，使药液均匀，药液在0.2MPa压力下通过0.5nM滤芯过滤，滤液进入GY型自动灌封机将药液灌装进药用管制10ml口服液玻璃瓶，自动锁盖，灌装好的产品进入灭菌器后，开通蒸汽，使灭菌内蒸汽压力达到0.1MPa、温度125℃，保持30分钟，关闭蒸汽，放凉后灯检，包装，即得100瓶，10ml/每瓶口服液。

实验例1  急性毒性试验

1.材料

1.1试验材料：本发明的口服液，推荐量为每天三次，每次10ml，以60kg成人体重计，该样品的推荐量为0.5ml/kg.b.w。试验采用浓缩5.34倍不含麦芽糖的本发明浓缩液，用纯净水配制成各实验组所需浓度。

1.2实验动物：第一军医大学实验动物中心提供的NIH种健康SPF级小白鼠，合格证号2002A035，本中心SPF动物实验室合格证号：粤检证字2003C008号。

2.方法与结果：

2.1小鼠急性毒性试验

NIH种小白鼠40只，18-22g，雌雄各半，采用Hom’s法随机分为4个剂量组，禁食不禁水16小时后，灌胃一次，灌胃量0.20ml/10g.b.w，观察一周，结果见表1。

表1  急性毒性试验结果

	剂量(g/kg.b.w)浓缩液	动物数(只)	始体重(g)	终体重(g)	动物死亡数(只)
						雄性	21.510.04.642.15	5555	19.23±1.5219.49±1.4219.47±0.8818.92±0.6	25.42±1.3426.13±0.9525.96±0.6725.68±0.78	0000
雄性	21.510.04.642.15	5555	19.26±0.9019.14±0.7419.28±0.9519.29±0.65	24.18±0.6924.12±0.9424.43±1.3524.48±0.83	0000

结果：未观察到动物有任何不良反应，得雌雄小鼠LD50>21.50g/kg.b.w，相当于受试物推荐量的229.6倍，受试物佳德牌新能量浓缩液属无毒级物质。

实验例2  长期毒性试验

1.材料

1.1受试物：本发明的口服液浓缩液，浓缩液为市售品的5.34倍浓缩液，10ml/瓶，玻璃瓶装，棕褐色液体，人体推荐日服量为每天三次，每次10ml，以成人体重60kg计，推荐量为0 50ml/kg b.w。

1.2剂量设计：设低、中、高三个剂量组，剂量为2.34、4.68、9.36ml/kg b.w的受试浓缩液，相当于市售产品12.5、25.0、50.0ml/kg b.w(分别为人体推荐量的25、50、100倍)，另设纯净水对照组。

1.3实验动物和实验室：第一军医大学实验动物中心提供的SPF级SD种健康大白鼠(动物合格证号：2002A040)，体重53.0±8.0g，颗粒饲料亦由第一军医大学实验动物中心提供；动物实验室为SPF级，合格证号：粤检证字2003C008号，室温22上2℃，湿度60—80％。

2.试验方法：80只大鼠在实验室条件下检疫一周后，随机分成四组，分别为受试物低。中、高三个剂量组和对照组，每组20只；雌雄各半，分笼饲养。给样方法为灌胃，灌胃量为每天1.0/100g，对照组每天给以1.0ml/100g纯净水，依据每周体重调整受试物量。连续30天。每鼠保证有充足饮水和饲料供应。实验开始及实验期每周称量并记录动物体重和饲料摄食量。

3.结果：本发明的口服液对SD种健康大鼠每天给子2.34、4.68、9.36ml/kg b.w浓缩5.34倍(不含麦芽糖)的本发明浓缩口服液，相当于市售产品的12.5、25.0、50.0ml/kgb.w，分别为推荐量的25、50、100倍，试验时间共30天。结果表明：大鼠一般生理体征、行为、大小便、皮毛等均无异常，体重和食物利用率指标正常，血常规和血清生化指标在正常范围内，各脏器系数指标正常，心、肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺等器官的大体检查和肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺的组织病理学检查，未见与受试物有关的组织病理学改变。

实验例3  缺氧耐受力动物实验

1.材料

1.1受试物：本发明的口服液，棕褐色液体，玻璃瓶装，10ml/瓶，推荐日服三次，每次10ml。按60公斤体重成人计算，推荐日服量为0.5ml/kgb.w.。以纯净水调配成各剂量组(低、中、高)所需浓度。

1.2剂量设计：本实验设高、中、低三个剂量组及纯净水对照组，剂量如下：纯水对照组：纯净水

低剂量组：2.5ml/kg b.w.  (5倍推荐日服量)

中剂量组：5.0ml/kg b.w.  (10倍推荐日服量)

高剂量组：15.0ml/kg b.w.(30倍推荐日服量)

1.3动物：SPF级NIH雌性小鼠，6-8周龄、体重18-22g，由广州第一军医大实验动物中心提供(动物合格证号：2002A040)。颗粒饲料由广州第一军医大实验动物中心提供。

1.4动物实验室条件：动物实验室为SPF级，合格证为粤检证字2003C008号，室温22±2℃，湿度60～80％

1.5仪器：250ml磨口瓶、秒表、动物电子天平、断头器。

1.6试剂：凡士林、钠石灰、亚硝酸钠。

1.7给受试物途径：每天按0.2ml/10g b.w灌胃给予样品。

2方法

2.1试验方法：

2.1.1常压耐缺氧实验：各剂量组织经口连续四周给予不同浓度佳德牌新能量浓缩液，对照组纵队予同等容量溶剂，于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250ml磨口瓶内(每瓶1只)用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，观察记录小鼠因缺氧而死亡的时间。

2.1.2亚硝酸钠中毒存活实验：各剂量组织经口连续四周给予不同浓度佳德牌新能量浓缩液，对照组纵队予同等容量溶剂，于末次灌胃后1小时，各组动物按220ml/kg b.w.剂量腹腔注射亚硝酸钠(注射量为0.1ml/10g)，立即计时，记录动物存活时间。

2.1.3各剂量组织经口连续四周给予不同浓度佳德牌新能量浓缩液，对照组纵队予同等容量溶剂，于末次灌胃后1小时，各组动物(在***浅麻醉下)自颈部逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间。

2.2所有数据用SPSS11.0软件包进行方差分析统计。

3试验结果：

1.本发明的口服液对试验小鼠常压耐缺氧存活时间的影响：从表2可见，低剂量组与纯水对照组比较，常压耐缺氧存活时间明显延长，差异有显著性意义(P<0.05)，高剂量组与纯水对照组比较，常压耐缺氧存活时间明显延长，差异有非常显著性意义(P<0.01)。试验结果为阳性。

表2小鼠常压耐缺氧存活时间的影响

	剂量度(ml/kg b.w.)	动物数(只)	始重(g)	终重(g)	存活时间(秒)
纯水对照组	0.00	12							19.88±1.26	35.18±3.12	1364.8±141.9
			低剂量组	2.50	12	19.30±1.19	35.75±2.30	1514.8＋1 59.1<sup>*</sup>
中剂量组	5.00	12							19.36±1.32	33.75±2.80	1466.0±191.1
			高剂量组	15.00	12	19.27±1.68	34.46±1.79	1599.7±152.9<sup>**</sup>
F值									0.533	1.395	4.38
			P值			>0.05	>0.05	>0.05

注：^*与纯水对照组比较，P<0.05(q检验)

^**与纯水对照组比较，P<0.01(q检验)

2.本发明的口服液对试验小鼠亚硝酸钠中毒缺氧存活时间的影响：从表3可见，低剂量组怀纯水对照组比较，亚硝酸中毒缺氧的存活时间明显延长，差异有显著性意义(P<0.05)，中、高剂量组与纯水对照组比较，亚硝酸钠中毒缺氧存活时间明显延长，差异有非常显著性意义(P<0.01)。试验结果为阳性。

表3小鼠亚硝酸钠中毒缺氧存活时间的影响

组别	剂量(ml/kg b.w.)	动物数(只)	始重(g)	终重(g)	存活时间(秒)
						纯水对照组	0.00	12	18.87±0.97	35.24±2.22	856.67±84.57
低剂量组	2.50	12	1907±1.02	35.48±3.38	962.50±87.19<sup>*</sup>
						±中剂量组	5.00	12	18.80±1.30	34.84±2.60	1040.00±105.74<sup>**</sup>
高剂量组	15.00	12	18.74±1.01	34.01±2.75	1195.00±157.10**
						F值			0.207	0.653	19.23
P值			＞0.05	>0.05	>0.01

注：^*与纯水对照组比较，P<0.05(q检验)

^**与纯水对照组比较，P<0.01(q检验)

3.本发明的口服液对试验小鼠急性脑缺血性缺氧喘气时间的影响：表4可见，低剂量组与纯水对照组比较，急性脑缺血性缺氧喘气时间明显延长，差异有显著意义(P<0.05)，中、高剂量组与纯水对照组比较，急性脑缺氧的喘气时间明显延长，差异有非常显著意义P<0.01。试验结果为阳性。

表4小鼠急性脑缺血性缺氧喘气时间的影响

组别	剂量(ml/kg b.w.)	动物数(只)	始重(g)	终重(g)	存活时间(秒)
						纯水对照组	0.00	12	18.82±0.96	34.78±2.29	16.84±4.71
低剂量组	2.50	11	18.19±1.66	33.47±2.97	22.18±1.62
						±中剂量组	5.00	12	18.26±1.75	35.37±2.29	22.94±2.90
高剂量组	15.00	12	19.07±2.04	33.54±2.34	24.30±2.56
						F值			0.797	1.678	12.62
P值			>0.05	>0.05	>0.01

注：^*与纯水对照组比较，P<0.05(秩和检验)

^**与纯水对照组比较，P<0.01(秩和检验)

从表2、3、4可见，本发明的口服液的各剂量组与对照组比较，始重、终重的差别均无显著性意义(P>0.05)。本发明的口服液对NIH小鼠经口每日分别给予2.5、5.0、15.0ml/kgb.w.剂量的口服液共四周。试验结果：

1、本发明的口服液可延长小鼠常压耐缺氧存活的时间，试验结果为阳性。

2、本发明的口服液可延长小鼠亚硝酸钠中毒缺氧的存活时间，试验结果为阳性。

3、本发明的口服液可延长小鼠急性脑缺血性缺氧的喘气时间，试验结果为阳性。

依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》耐缺氧作用的标准判断，本发明的口服液具有耐缺氧作用。

实验例4增强免疫力动物实验

1.试验条件

1.1样品：本发明的口服液，棕褐色液体，10ml/瓶，推荐日服量为3次/天，10ml/次，按60公斤成人计为0.5ml/kg b.w，各实验剂量组所需浓度均用纯净水稀释样品配成。

1.2剂量：设纯净水对照组和低、中、高三个剂量组，剂量如下：

低剂量组2.5ml/kg b.w，相当于推荐日服量的5倍。

中剂量组5.0ml/kg b.w，相当于推荐日服量的10倍。

高剂量组15.0ml/kg b.w，相当于推荐日服量的30倍。

1.3动物：SPF级昆明种雌性小白鼠，6-8周龄(体重：18-22g)由第一军医大学实验动物中心提供，合格证号召002A036。颗粒饲料由第一军医大学实验动物中心提供。

1.4动物实验室：SPF级，合格证书粤检证字形003C008号。室温22±℃；湿度60-80％。

1.5给予受试物途径：每天按20ml/kg b.w灌胃给予受试物。

2.试验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，以下每个实验均为随机将48只鼠分成四组，每组成2只，每日灌胃给予受试物，给样量每周根据体重增减调整，实验时间为30天。

2.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)

脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用嵌子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬浮。经200目筛网过滤，Hanks液洗3次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml。

淋巴细胞增值反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔50ul ConA液(相当于5ug/ml)，另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃培养72h。培养结束前4小时，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml无血清RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50ul/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶溶解，分加于96孔培养板中，作2个孔的平行样，以570nm波长测定光密度值。

2.2小鼠迟发型***反应试验(足跖厚度增加法)

实验结束前的第4天免疫动物：用2％(v/v)绵羊红细胞腹腔注射0.2ml致敏动物，第5天测定左后足跖部厚度，接着于该处皮下注射20％(v/v)绵羊红细胞(20ul/每鼠)，注射后24小时测定左后足跖部厚度三次，得平均值。

2.3抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

脾细胞悬液制备：将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心(1000r/min)10min，Hanks液洗2遍，最后将细胞悬浮在5ml RPMI 1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/ml。也可将细胞悬浮在8mlHanks液，测定脾空斑形成数。

空斑的测定：将表层培养基(lg琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量PH7.2～7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50ul10％SRBC(v/v，用SA液配制)，20ul脾细胞悬液(5×10⁶个/ml)脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片平均放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。

2.4小鼠血清溶血素滴度测定(血凝法)

实验结束前的第4天免疫动物：每只腹腔注射2％的绵羊红细胞0.2ml，第5天摘除眼球采血，分离血清备用。凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释于微量反应板内，各50ul，加入0.5％的绵羊红细胞50ul，混匀，装入湿润饭盒内盖好，置于37℃温箱3小时后，观察抗体凝集反应程度。

2.5小鼠碳廓清试验

末次给药后用1∶4稀释的印度墨汗，按每鼠10g体重0。1ml尾静脉注射，立即计时，间隔2～10分钟分别从内眦静脉丛取血20ul，加入2ml Na₂CO₃溶液中，用721分光光度计于600nm波长处测OD值，用Na₂CO₃浴液做空白对照，处死小鼠，取肝、脾脏称量，计算吞噬指数。

2.6小鼠腹腔包噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)

鸡红细胞悬液制备，取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纷纷。用生理盐水洗涤2～3次，离心(2000r/min，10min)，去上清，用生理盐水配成2％(v/v)的鸡红细胞悬液。

吞噬功能测定：每鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液1ml。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，计算吞噬百分率和吞噬指数。

2.7 NK细胞活性的制备(效应细胞)：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，Hanks液洗3次，每次离10min(100r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养中，用台酚兰染色计数活细胞(应在95％以上)，最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/ml。

NK细胞活性检测：取浓度为4×10⁵个/ml的YAC-1靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100ul；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100ul置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100ul，反应3min，每孔加入1mol/L HCL30ul，在酶联仪490nm处测定光密度值。

2.8数据处理：用SPSS 11.0软件包进行统计分析。

3、实验结果：

3.1本发明的口服液对小鼠的体重的影响：迟发型***反应和血清溶血素试验组见表(5)淋巴细胞转化试验、NK细胞活性测定及抗体生成细胞试验组见表(6)，碳廓清实验组见表(7)，巨噬细胞鸡红细胞试验组见表(8)。各实验组各期体重与对照组相应时期体重比较，差异均无统计学意义，表明本发明口服液对小鼠体重无明显影响。

表5本发明口服液对小鼠体重的影响(N＝12，

)

组别	剂量(ml/kg b.w)	初始体重(g)	中期体重(g)	结束体重(g)	增重(g)
						对照组	0.0	20.13±1.17	28.45±2.86	32.96±3.02	12.82±3.32
低剂量组	2.5	20.26±1.09	27.92±2.66	31.30±3.34	11.04±3.71
						中剂量组	5.0	20.27±1.01	28.04±1.37	31.54±1.78	11.26±1.72
高剂量组	15.0	20.26±1.10	27.48±2.11	31.28±3.56	11.01±3.60
						F值		0.044	0.354	0.855	0.886
P值		>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

表6

组别	剂量(ml/kg b.w)	初始体重(g)	中期体重(g)	结束体重(g)	增重(g)
						对照组	0.0	20.38±0.92	28.59±1.83	32.36±2.95	11.97±2.97
低剂量组	2.5	20.54±0.89	27.32±1.51	31.54±3.16	11.01±2.76
						中剂量组	5.0	20.68±1.02	28.91±2.49	32.74±3.32	12.06±3.26
高剂量组	15.0	20.64±1.00	27.85±3.30	31.28±3.49	10.64±3.18
						F值		0.227	1.085	0.537	0.649
P值		>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

表7

组别	剂量(ml/kg b.w)	初始体重(g)	中期体重(g)	结束体重(g)	增重(g)
						对照组	0.0	20.16±1.19	26.03±2.18	30.21±3.02	10.06±2.92
低剂量组	2.5	20.31±1.16	26.67±2.15	29.88±2.70	9.57±3.21
						中剂量组	5.0	20.33±1.02	27.54±2.29	30.21±2.64	9.88±2.67
高剂量组	15.0	20.09±1.16	26.97±2.78	30.60±3.73	10.51±3.83
						F值		0.122	0.846	0.113	0.181
P值		>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

表8

组别	剂量(ml/kg b.w)	初始体重(g)	中期体重(g)	结束体重(g)	增重(g)
						对照组	0.0	20.25±1.16	27.81±2.79	31.90±3.02	11.65±3.31
低剂量组	2.5	20.35±1.27	26.64±2.05	31.22±3.34	10.87±2.04
						中剂量组	5.0	20.35±1.10	26.45±2.03	30.99±1.78	10.64±1.91
高剂量组	15.0	20.39±1.07	26.48±2.03	32.32±3.56	1193±2.69
						F值		0.033	1.004	0.663	0.701
P值		>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

3.2本发明的口服液对小鼠脾脏重量和胸腺重量的影响见表9。各实验组的脾重、胸腺/体重比值与对照组比较差异无统计学意义，表明本发明口服液对小鼠的脾脏重量及胸腺重量均无明显影响。

表9本发明口服液对小鼠胸腺、脾脏重量的影响(N＝12，

)

组别	剂量(ml/kg b.w)	脾脏/体重(mg/g)	P值	胸腺/体重(mg/g)	P值
						对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	4.67±0.575.15±0.975.30±1.085.31±1.001.260	>0.05>0.05>0.05	3.69±0.473.78±1.243.33±1.043.49±0.830.564	>0.05>0.05>0.05

3.3本发明口服液对小鼠的迟发型***反应试验结果见表10。中、高剂量组足跖增厚值与对照组比较，差异有统计学显著性意义，表明该试验结果为阳性。

表10本发明口服液对小鼠迟发型***反应试验结果(X±S)

组别	剂量(ml/kg b.w)	动物数(只)	足跖增厚(mm)	P值(与对照组比)
					对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	12121212	0.31±0.120.34±0.120.43±0.160.48±0.154.002	>0.05<0.05<0.01

3.4本发明口服液对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应试验结果见表11。各剂量组光密度差值与对照组相比无统计学显著性意义，表明本发明口服液的脾淋巴细胞转化试验为阴性结果。

表11本发明口服液对小鼠脾淋巴细胞转化反应试验结果(X±S)

组别	剂量(ml/kg b.w)	动物数(只)	光密度差值	P值(与对照组比)
					对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	12121212	0.184±0.0470.201±0.0630.197±0.0490.203±0.0530.308	>0.05>0.05>0.05

3.5本发明口服液抗体生成细胞检测结果见表12。高剂量组溶血空斑数与对照组比较，差异有统计学的意义，其余各剂量组溶血空斑数与对照组比较，差异无统计学的意义。表明本发明口服液的抗体生成细胞检测试验为阳性结果。

表12本发明口服液抗体生成细胞检测的结果(X±S)

组别	剂量(ml/kg b.w)	动物数(只)	溶血空斑数(PFC/10<sup>6</sup>脾细胞)	P值(与对照组比)
					对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	10101010	352.95±110.34396.85±105.25418.60±119.09505.60±93.703.564	>0.05>0.05<0.01

3.6本发明口服液对受试动物血清溶血素抗体滴度检测结果见表13。中、高剂量组的抗体积数高于对照组，差异比较有统计学显著性意义，表明本发明口服液对受试动物血清溶血素抗体滴度检测试验为阳性。

表13本发明口服液对小鼠血清溶血素抗体滴度检测结果(X±S)

组别	剂量(ml/kg b.w)	动物数(只)	抗体积数	P值(与对照组比)
					对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	12121212	63.67±17.6267.67±20.0282.50±27.3394.83±24.804.732	>0.05<0.05<0.01

3.7本发明口服液对小鼠碳廓清吞噬功能的影响见表14。中、高剂量组吞噬指数与对照组相比，差异有统计学显著性意义。表明本发明口服液的碳廓清试验为阳性结果。

表14本发明口服液对小鼠碳廓清试验的结果

组别	剂量(ml/kg b.w)	动物数(只)	碳廓清吞噬指数	P值(与对照组比)
					对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	12121212	4.80±1.245.36±1.586.13±1.696.83±1.623.980	>0.05<0.05<0.01

3.8本发明口服液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果见表15。高剂量组吞噬百分率高于对照组，其余各指标与对照组比较，差异无统计学显著性意义。表明佳德牌新能量浓缩液的巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验为阴性结果。

表1 5本发明口服液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果

组别	剂量(ml/kgb.w)	吞噬细胞数	吞噬百分率(％)	转换值<sup>*</sup>	P值	吞噬指数	P值
								对照量低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	1200120012001200	38.42±2.9439.17±3.7140.83±4.3042.25±2.862.881	0.67±0.030.68±0.040.69±0.040.71±0.032.883	>0.05>0.05<0.01	0.97±0.090.95±0.130.97±0.130.98±0.080.132	>0.05>0.05>0.05

注：^*表示转换值＝sin^-1(吞噬百分率^1/2)

3.9本发明口服液对受试动物NK细胞活性影响见表16。各剂量组的NK细胞活性与对照组比较，差异无统计学的意义，表明佳德牌新能量浓缩液对受试动物NK细胞活性检测试验为阴性结果。

表16本发明口服液对小鼠NK细胞活性的影响(X±S)

组别	剂量(ml/kg b.w)	动物数(只)	NK细胞活性(％)	转换值<sup>*</sup>	P值(与对照组比)
						对照组低剂量中剂量高剂量F值	0.02.55.015.0	12121212	8.82±1.599.57±2.467.15±2.727.25±3.052.694	0.30±0.030.31±0.040.27±0.060.27±0.062.962	>0.05>0.05>0.05

注：^*表示转换值＝sin^-1(NK细胞活性^1/2)

4.小结：

本发明口服液对绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型***反应试验结果阳性(足跖增厚法)，可增强细胞免疫功能；受试动物的抗体生成细胞数和血清溶血素抗体滴度水平明显增加，可增强体液免疫功能；受试动物碳廓清试验结果阳性，可增强单核——巨噬细胞吞噬功能。依据《保健食品检验与评价技术规范》判断标准判断，本发明口服液具有增强免疫力功能作用。

Claims (6)

1.一种能提高人体缺氧耐受力的口服液，其特征是由13～17份黄芪、6～10份川芎和1～3份肉桂提取的挥发油，上述黄芪、川芎和肉桂提取挥发油后的药渣与13～17份牡蛎、13～17份枸杞子、13～17份白芍、8～12份山药、8～12份白术和8～12份茯苓的共同水提取液，和3～7份复合氨基酸粉、18～22份麦芽糖混合而成，上述份量为重量份。

2.权利要求1所述一种能提高人体缺氧耐受力的口服液的制备方法，其特征是包括下述步骤：(1)黄芪、川芎、肉桂提取挥发油(A)，蒸馏后的水溶液(B)另器收集；(2)将提取挥发油的黄芪、川芎、肉桂药渣与牡蛎、枸杞子、白芍、山药、白术、茯苓等6味中药加水煎煮二次，合并煮液，过滤得滤液(C)；(3)将滤液(C)与水溶液(B)合并后真空浓缩，冷却至室温，加入95％食用乙醇，使含醇量为60％，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，在60℃以下真空浓缩至相对密度为1.20的浓缩液(D)；(4)将浓缩液(D)与挥发油(A)、复合氨基酸粉、麦芽糖加水适量混合均匀，过滤后经灌瓶、灭菌、检验后入库。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(2)中牡蛎先煎煮1小时。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(2)第一次煎煮时加水过药面3寸，煎煮2小时，第二次煎煮时加水过药面2寸，煎煮1.5小时。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(2)、步骤(4)中的过滤条件为0.2MPa压力下通过0.5NM滤芯过滤。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(4)中的灭菌条件为：蒸汽压力0.1Mpa、温度125℃，保持20分钟以上。

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