CN100365015C

CN100365015C - 一种十二肽、含有该十二肽的复合物，其制备方法及在制备肝癌治疗药物中的应用

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Publication number: CN100365015C
Application number: CNB2005100002737A
Authority: CN
Inventors: 姜永强; 郑玉玲; 李韩平; 王海荣; 郝淮杰; 宁保安; 马茹
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2005-01-10
Filing date: 2005-01-10
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2025-01-10
Also published as: CN1803832A

Abstract

本发明涉及一种十二肽以及含有该十二肽的导向复合物，还涉及其制备方法及其在制备肝癌治疗药物中的应用。该十二肽具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，该十二肽对于肝癌细胞具有特异的导向作用，含有该十二肽的肝癌导向治疗复合物由作为生物导向治疗的“导航***”的十二肽和作为生物导向治疗的“弹头”的超抗原或其它生物毒素分子或化疗药物两部分组成，这两部分采用化学交链或基因融合的方式结合。本发明的十二肽及含有该十二肽的导向复合物可以制备肝癌治疗药物，在肝癌的治疗方面具有重要意义。

Description

一种十二肽、含有该十二肽的复合物，其制备方法及在制备肝癌治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种多肽、含有该十二肽的复合物，还涉及其制备方法及其在制备肝癌导向治疗药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是最常见、也是最致命的恶性肿瘤之一，素有“癌王”之称，其特点是发病隐匿、转移早，病死率高。

肝癌的传统治疗以手术切除和化疗为主。手术彻底切除提供了最佳治愈机会，是目前治疗肝癌的首选方法，然而对于多数肿瘤来说，在检出时已经太大或太弥散，75％以上已无法切除。虽然放疗方面采用了“γ射线或电子直线加速器的X射线、高能射线等，化疗方面改进了传统给药途径，但对于无法切除的原发性肝癌不是很敏感，加之其对机体免疫***的破坏，治疗后患者平均生存仅4个月，很少超过9个月。

针对传统的化疗和放疗对于不能实行切除术的病人来说最主要的限制是全身性毒性和药物水平达不到有效浓度，导向治疗因其高选择性和高亲和性对于治疗不能手术的患者或广泛转移的肿瘤有很好的应用前景。目前肝癌导向治疗是利用一种对肝癌有特殊亲和力的抗体作载体，与有杀伤肿瘤作用的弹头(超抗原、化疗药物、生物毒素蛋白放射性核素)制成交连物，以达到较多杀伤肿瘤而减少损害正常组织的目的。陈志南等用¹³¹I标记的肝癌单抗Hepama-1通过肝内动脉注入23例患者，取得了较好的疗效，75％(12/16)的病人AFP值下降，78％(18/23)的病人瘤块缩小。II期临床研究结果表明：完全缓解率4.1％，部分完全缓解率为53.1％，两年以上生存率为46.2％。

尽管抗体导向治疗是最活跃的治癌策略之一，但存在的一些问题限制了它们的实际应用效果。目前针对肝癌的治疗抗体是鼠源性的，应用于人体，易出现人抗鼠抗体(HAMA)，在¹³¹I-Hepama-1的治疗过程中，43％(10/23)的病人产生了针对Hepama-1抗体。显然，HAMA限制了多次注射，长期治疗无法进行。此外抗体的分子量大，渗透力差，不易穿透肿瘤毛细血管也是导致肝癌导向治疗效果不佳的主要原因。小分子抗体具有免疫原性低、易于渗透目标组织、毒副作用小、易与效应分子相连构成新功能的抗体分子等优点，不断开展从单链抗体、单域抗体、独立性重链可变区、最小识别单位(MRU)等抗体片段的研究工作，但这些抗体片段与亲本抗体相比，抗原结合活性存在不同程度的下降，且分子量仍然较大，以单链抗体为例，分子量仍然达到30Kda左右，对实体肿瘤穿透能力较差。

由于噬菌体肽库中含有所有可能的氨基酸排列，因而库容量极大，易于筛选和扩增。通过亲合筛选，有可能得到较高特异性和亲和力的新型目的多肽，用于肝癌的导向治疗。目前未见采用多肽对肝癌实行导向治疗的文献报道。

发明内容

为克服当前肝癌治疗的不足，本发明目的是寻找一种与肝癌细胞特异结合并具有高亲合力的小分子多肽分子。

本发明通过噬菌体展示肽库筛选获得了一种能与肝癌细胞特异性结合的12肽，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

本发明还公开了编码上述十二肽的一种核苷酸序列，如序列表中序列2所示。

利用本发明的十二肽可以制备含有该十二肽的肝癌导向治疗复合物。其中十二肽作为生物导向治疗的“导航***”，“弹头”可采用化疗药物、超抗原或其它生物毒素分子或化疗药物，两者可通过化学交链或基因融合的方式结合。本发明提供的十二肽与超抗原通过基因融合的方式结合，可以方便制备十二肽与超抗原的融合蛋白。超抗原可以是来源于葡萄球菌和链球菌的超抗原，例如葡萄球菌中毒性休克毒素TSST-1、葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SED和SEE等，链球菌致热外毒素A、B、C等。其它生物毒素分子可以是绿脓杆菌外毒素PEA、白喉毒素DT等。在以上“弹头”分子中，优选葡萄球菌中毒性休克毒素TSST-1，因为在上述“弹头”分子中，TSST-1分子量最小，且具有较其它葡萄球菌毒素分子更强的超抗原活性，因而适合作为12肽靶向的“弹头”。

本发明的十二肽的肝癌导向治疗复合物可以通过基因工程方法或化学交链方法制备。通过基因工程方法制备时，一般需要经过以下步骤：PCR法制备12肽与“弹头”分子的融合基因；连入表达载体；融合蛋白表达及纯化。通过PCR扩增，将上述十二肽的核苷酸序列与“弹头”分子基因连接，然后进行表达。本发明将十二肽与中毒性休克毒素(TSST-1)基因通过PCR法融合，在上游引物中引入12肽序列，12肽序列与TSST-1之间采用连接肽Gly-Gly-Ser，构建含有十二肽的肝癌导向治疗复合物。然后与表达载体连接，构建重组表达质粒。经诱导、表达、纯化后，获得了特异的目的蛋白，为可溶性表达，表达蛋白经纯化后，经实验证实：含有该多肽的融合蛋白可与肝癌细胞特异结合，体外实验该融合蛋白可以抑制人肝癌细胞的增殖，小鼠肝癌移植瘤试验证实融合蛋白与单独TSST-1组相比，毒性降低，疗效提高，起到减毒增效作用，证实该多肽对肝癌细胞具有导向作用。该12肽序列与TSST-1的融合蛋白的分子量只有24Kda左右，是当前分子量最小的靶向超抗原分子。

本发明采用全新的导向治疗思路，公开了与肝癌细胞特异结合并具高亲和力的十二肽，可以作为“导航***”，该十二肽分子量小，与正常肝细胞不结合。体内外试验证实了该十二肽与含有该肽的融合蛋白的导向作用，为肝癌进一步的免疫治疗提供了理论依据，有可能成为潜在的肝癌导向治疗药物。

附图说明

图1：阳性转化子筛选鉴定结果，扩增片断大小约750bp

图2：重组质粒酶切鉴定结果，其中1、3为载体质粒酶切结果，2为未酶切的载体质粒对照

图3：12肽-TSST-1重组蛋白纯化图谱

图4：12肽-TSST-1重组蛋白产物表达与纯化产物SDS-PAGE分析

图5：12肽-TSST-1重组蛋白与Hab25SCFV-TSST-1的肝癌细胞结合活性比较

图6：12肽-TSST-1重组蛋白的肝癌细胞杀伤活性，起始浓度为10倍系列稀释。

图7：各组肿瘤体积变化趋势图。

具体实施方式

实施例一含有高亲和力短肽与中毒性休克毒素基因的原核表达质粒的构建和表达

一、材料

1.菌株：大肠杆菌DH5α，原核表达载体：PBV220由国内中国预防医学科学院病毒所构建。

2.主要试剂

限制性内切酶，异丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)，T4 DNA ligase购自大连宝生物公司；Taq聚合酶，dNTP等PCR试剂购自上海生工；胰蛋白胨(Bacto trypton)，酵母浸出粉(Bacto yeast-extract)购自Difco公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，丙烯酰胺，N，N-亚甲基双丙烯酰胺购自Amersham公司；琼脂糖购自Gibco公司；其他试剂均为分析纯；

3.主要溶液

3.1 LB液体和固体培养基

二、方法

1、引物的设计与合成

通过linker(Gly-Gly-Ser)，将通过噬菌体筛选获得的与肝癌特异结合的短肽核酸序列与TSST-1(中毒性休克毒素)相偶联：

含有线状12肽特异性短肽序列的上游引物序列参见序列表中序列3，含有EcoRI酶切位点；

下游引物见序列表中序列4，含有HindIII酶切位点，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

2、PCR反应

以金黄色葡萄球菌FRI 1169 DNA为模板(为产TSST-1标准株)，通过PCR反应构建12肽与TSST-1的融合基因。

PCR反应体系(50μL)：H₂O 39μl，10xPCR buffer 5μl，dNTP 2μl，引物2μl，Taq 1μl，模板1μl。

PCR反应参数：96℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10min。PCR反应产物的回收按照常规方法进行。

3、目的DNA与T载体的连接、转化

将回收的PCR反应产物与PMD-18 T vector进行连接，连接反应物组成为：P1 4μl，PMD-18 T载体1μl，Solution I 5μl。16℃连接2小时。

感受态细胞的制备，连接产物转化按常规方法进行。

挑取阳性菌落，进行PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖电泳观察，阳性克隆进行测序，并提取阳性克隆质粒。

4.重组表达质粒的构建

将筛选出的阳性克隆质粒经测序证实后用限制性内切酶进行酶切，与同种酶切的原核表达载体PBV220连接。酶切反应组成为10×buffer 2μl，EcoRI2μl，HindIII 2μl，Vector Plasmid 14μl。37℃消化4小时。酶切结束后，用常规方法进行连接转化。鉴定重组质粒，挑取单菌落，进行体积为25μL的PCR鉴定；并提取阳性菌落质粒做酶切鉴定。确认为阳性的进行诱导表达。

5.诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定

5.1对PBV220与目的片段的重组表达质粒进行温度诱导

挑取阳性克隆单菌落，过夜培养。次日以1∶100转接于5mL LB(含200mg/mL氨苄青霉素)，30℃，250rpm培养至对数期后，立即升温至42℃培养4小时。

取培养好的菌液1.5mL，以8000rpm室温离心5分钟集菌，弃上清，200μL纯水悬起沉淀，取25μL悬浮液加入25μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸10分钟，取20μL进行SDS-PAGE分析。

三、结果

1.多肽与野生型TSST-1基因的融合

通过Linker(Gly-Gly-Ser)，将特异性短肽核酸序列(线状12肽)与野生型TSST-1相耦联，经T载体蓝白斑筛选和酶切鉴定阳性克隆，然后均亚克隆入表达载体PBV220进行表达。PCR和酶切鉴定图谱见图1、2。

2.重组蛋白的非融合表达

采用温度诱导表达，即细菌30℃培养至对数期，立即升温至42℃，培养4小时，SDS-PAGE鉴定表达情况，12肽耦联TSST-1在大肠杆菌中获得了表达(见图4)。

实施例二十二肽与TSST-1基因融合蛋白的纯化鉴定及与活性检测

一、材料

细胞系：肝细胞癌SMMC7721，BEL-7402，正常肝细胞系HL-02。

工程菌：可高效表达12肽耦联TSST-1的大肠杆菌(实施例一构建)

ACTA FPLC蛋白纯化***、纯化柱CM-Sepharose FF系AMESHAM产品。anti-TSST-1抗体为SIGMA公司产品、HRP标记二抗(羊抗兔抗体)

二、方法：

1.表达蛋白的纯化

按前述条件，大量诱导工程菌，表达的蛋白均在破碎上清中，这就使蛋白纯化较为简便，进一步稀释后，上样，并收集穿透液；表达产物在上清中，其纯化采用CM柱纯化法，纯化图谱和纯化后SDS-PAGE鉴定图谱见图三和图四。纯化方法参见“姜永强等，葡萄球菌B型肠毒素的制备与抗肿瘤活性分析，细胞与分子免疫学杂志，2002，18(3)”

2.融合蛋白的ELISA及竞争ELISA鉴定：

2.1重组表达蛋白的ELISA鉴定

取封闭好的细胞培养板，于前一晚上进行封闭，次日弃封闭液，以0.5％PBST洗涤5次，每次间隔5分钟；加入梯度稀释的纯化蛋白溶液，室温静置1小时；弃未结合蛋白，以0.5％PBST洗涤5次，每次间隔5分钟；加入200μL anti-TSST-1抗体(1∶500稀释)，室温静置1小时；弃未结合抗体，以0.5％PBST洗涤5次，每次间隔5分钟；加入HRP标记二抗(羊抗兔抗体，以1∶1000稀释)，每孔200μL，室温静置1小时；弃二抗，以0.5％PBST洗涤5次，每次间隔5分钟；加入TMB显色液，待充分显色后，加入2N H₂SO₄终止反应，于450m读值。

2.2重组表达蛋白与dsFv-TSST-1的竞争ELISA鉴定

本室构建的单链抗体靶向TSST-1融合蛋白(ScFv-TSST-1)，与肝癌细胞有着较好的亲和性和特异性，通过重组表达蛋白与dsFv-TSST-1的竞争比较，可以反应12肽TSST-1重组蛋白的特异性和亲和力。将SCFv-TSST-1复性蛋白做梯度稀释，分别与重组蛋白混合，测A_450nm的变化。

3、重组表达蛋白的体外肿瘤细胞杀伤活性

重组表达蛋白细胞杀伤活性检测采用MTS assay kit(CellTiter 96TMAQUEOUS，Promega)进行测定。具体方法为，100μl含5×10³个SMMC-7721肝癌细胞(靶细胞)的RPMI1640完全培养基中加入80μl用不含血清的RPMI1640培养基稀释的人外周血淋巴细胞(效应细胞)，效靶比为20∶1，然后每孔加入20μl梯度稀释的样品，37℃含5％CO2的细胞孵箱培养48小时以上，然后弃去培养基，用不含血清RPMI1640培养基洗3次，加入100μl RPMI1640完全培养基和20μlMTS继续培养2h，490nm测OD值。

4、重组表达蛋白的体内肿瘤细胞杀伤活性

以雄性BABL/C小鼠(18-22g)为试验动物，H22肝癌细胞为接种瘤细胞，具体方法为：取H22肿瘤腹水，用生理盐水1∶4稀释，配置成瘤细胞悬液，细胞数为(2～3)*10⁵/ml，接种于BABL/C小鼠前肢腋皮下，雄性体重18～22g，每只小鼠注射0.1ml(含H22细胞2*10⁶～4*10⁶个)，每组8只动物。实验之0天，接种肿瘤。第1天，将动物称重并随机分为融合蛋白高剂量组(2.5mg/kg)、中剂量组(0.5mg/kg)、低剂量组(0.1mg/kg)、TSST-1对照组(0.47mg/kg)及生理盐水对照组，而后静脉给药，1次/2天，共三次。各组药液给药前配制。从第1天起隔天称体重，测瘤长(a)、宽(b)，按V＝0.5*a*b2计算瘤体积。至第9天，动物称体重，并剖取各组动物的肿瘤，称重并统计各组的抑瘤率。

二、结果

1、分离纯化后的表达蛋白具有较高的纯度，SDS-PAGE电泳结果见图4。

2、表达纯化蛋白的肝癌亲合性稀释实验(细胞ELISA结果)

将含有线状12肽与TSST-1序列的重组蛋白做系列梯度稀释后，进行细胞ELISA试验，ELISA结果见表1：

表1 ELISA法检测PBV220与目的片段的重组蛋白结果

稀释梯度	原液	10<sup>-1</sup>	10<sup>-2</sup>	10<sup>-3</sup>	10<sup>-4</sup>	10<sup>-5</sup>	10<sup>-6</sup>	10<sup>-7</sup>	阴性对照
稀释梯度	原液	10<sup>-1</sup>	10<sup>-2</sup>	10<sup>-3</sup>	10<sup>-4</sup>	10<sup>-5</sup>	10<sup>-6</sup>	10<sup>-7</sup>	阴性对照	样品	2.946	0.781	0.668	0.498	0.436	0.347	0.264	0.330	0.132

3、用固定封闭好的7402、7721 cell、HL-02 cell细胞做融合蛋白酶联检测，同时设阴性对照，融合蛋白与肝癌细胞结合的A值显著高于正常肝细胞，与正常肝细胞的结合的OD值很低，具有较好的特异性。结果见表2。

表2 12肽TSST-1融合蛋白与肝癌(7721、7402)和正常肝细胞(HL-02 cell)结合情况

细胞类型	-	-	1	2	3	4	5	6	7	8
细胞类型	-	-	1	2	3	4	5	6	7	8	7721	0.097	0.112	0.860	1.024	0.917	0.699	0.670	0.764	0.825	0.913
7402	0.098	0.132	0.824	0.707	1.262	0.580	0.618	0.684	0.652	0.790	7721	0.097	0.112	0.860	1.024	0.917	0.699	0.670	0.764	0.825	0.913
7402	0.098	0.132	0.824	0.707	1.262	0.580	0.618	0.684	0.652	0.790	HL-02	0.011	0.043	0.112	0.176	0.091	0.205	0.137	0.108	0.155	0.203

4、为了进一步评价重组蛋白的结合活性，我们做了12肽TSST-1融合蛋白与本室构建的HAb25 ScFv-TSST-1蛋白(其与SMMC-7721有很稳定的结合活性)同肝癌细胞SMMC-7721结合活性比较。结果如下：12肽-TSST-1融合蛋白与Hab25 ScFv-TSST-1的结合活性相当，说明12肽与TSST-1耦联后，其与肝癌细胞具有很高的亲和力。(图5)

5、表达出的12肽TSST-1融合蛋白与dsFV-TSST-1复性蛋白竞争结果

利用dsFV-TSST-1系列稀释梯度复性蛋白与上述表达出的蛋白作竞争实验。竞争抑制实验结果显示：随着dsFV-TSST-1复性蛋白稀释倍数的增加，抑制率也在增加，这就说明dsFV-TSST-1所构成的表位与筛选出的多肽的表位相同，即与肝癌细胞7721特异结合的位点相同。结果见表3。

表3 dsFV-TSST-1系列稀释梯度复性蛋白与表达蛋白竞争实验结果

编号/稀释倍数	阴性	原液	10<sup>1</sup>	10<sup>2</sup>	10<sup>3</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>-6</sup>
编号/稀释倍数	阴性	原液	10<sup>1</sup>	10<sup>2</sup>	10<sup>3</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>-6</sup>	12肽蛋白	0.089	1.397	0.652	0.829	0.914	0.938	0.941	0.952
抑制率(％)			53.3	40.7	34.6	32.9	32.6	31.9	12肽蛋白	0.089	1.397	0.652	0.829	0.914	0.938	0.941	0.952

5、12肽TSST-1融合蛋白的肿瘤细胞杀伤效果：12肽TSST-1融合蛋白对肝癌细胞有杀伤作用，剂量越高，杀伤效果越明显，具有明确的剂量效应曲线。具体杀伤效果见图6。

6、12肽TSST-1融合蛋白的体内肿瘤细胞杀伤效果：

(1)肿瘤体积变化

在实验的第1、3、5、7及9天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，按以下公式计算肿瘤体积，用药组的肿瘤生长明显慢于生理盐水对照组，具有明确的肿瘤抑制效果其变化趋势见图7。

(2)受试药物对瘤重的影响及抑制率

实验结束时脱椎处死小鼠，剥取肿瘤，称重并计算不同剂量的融合蛋白及TSST-1对肿瘤的抑制率。12肽TSST-1融合蛋白高中低三个剂量组的肿瘤抑制率均高于TSST-1对照组，且毒性有降低趋势，TSST-1对照组在实验过程中8只动物中有2只死亡，而12肽TSST-1融合蛋白中剂量组无小鼠死亡，且生长状态良好，显示出一定减毒增效作用。肿瘤抑制结果见表4。

表4.各组实验动物的瘤重量(均值±SD)及抑制率

组别	高剂量(2.50mg/kg)	中剂量(0.50mg/kg)	低剂量(0.10mg/kg)	TSST-1对照组(0.47mg/kg)	N.S对照组
组别	高剂量(2.50mg/kg)	中剂量(0.50mg/kg)	低剂量(0.10mg/kg)	TSST-1对照组(0.47mg/kg)	N.S对照组	瘤重(g)肿瘤抑制率	0.3249±0.193469.35％<sup>***</sup>	0.3615±0.181265.90.％<sup>***</sup>	0.4075±0.179861.55％<sup>***</sup>	0.4828±0.215254.45％<sup>**</sup>	1.0600±0.3566-

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种十二肽、含有该十二肽的复合物，其制备方法及在制备肝癌治疗药物中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>

<400>1

Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His

1 5 10

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>

<400>2

aagtctctta gtcggcatga tcatattcat catcat 36

<210>3

<211>78

<212>DNA

<213>

<400>3

gcagaattca tgaagtctct tagtcggcat gatcatattc atcatcatgg cggctctaca 60

aacgataata taaaggat 78

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>

<400>4

cacaagcttt taattaattt ctgcttctat ag 32

Claims

1.一种含有十二肽的肝癌导向治疗复合物，其中十二肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其特征在于由作为生物导向治疗的“导航***”的十二肽，和作为生物导向治疗的“弹头”的超抗原或化疗药物两部分组成，这两部分采用化学交链或基因融合的方式结合。

2.根据权利要求1的所述的含有十二肽的肝癌导向治疗复合物，其特征在于所述超抗原为葡萄球菌中毒性休克毒素TSST-1，十二肽与TSST-1通过基因融合连接，连接肽为Gly-Gly-Ser。

3.权利要求1或2所述含有十二肽的肝癌导向治疗复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)PCR法制备12肽与TSST-1的融合基因；

(2)连入表达载体pBV220；

(3)融合蛋白表达及纯化。

4.权利要求1或2所述的含有十二肽的肝癌导向治疗复合物在制备肝癌治疗药物中的应用。

5.其氨基酸序列如序列表中序列1所示的十二肽在制备肝癌治疗药物中的应用。