CN100360668C - 分泌肿瘤坏死因子－α的重组卡介苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗及其构建方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF-α，然后采用电转化技术将pMSTNF-α导入BCG构建重组卡介苗rBCGTNF-α，依靠pMSTNF-α在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌TNF-α。本发明得到的重组卡介苗rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的双重效果，能够有效预防和治疗浅表性***；利用重组卡介苗rBCGTNF-α在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用TNF-α的用量，可以克服BCG治疗的毒副作用。

Description

分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗及其构建方法，具体涉及一种包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片断和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的重组卡介苗及其构建方法，得到的重组卡介苗rBCGTNF-α用于预防和治疗浅表性***，属于基因工程技术领域。

背景技术

自从1976年Morales首次报告应用卡介苗(BCG)膀胱灌注治疗表浅性***以来，BCG作为一种有效的免疫佐剂已在防治***方面取得了良好效果，目前BCG膀胱灌注已被视为***最有效的辅助治疗之一。尽管BCG在预防和治疗表浅性***方面具有良好的疗效，但仍有许多问题需要解决。首先是进一步增强***对BCG灌注的免疫反应性。国内外文献表明，表浅性***切除术后，即使进行规范的BCG膀胱灌注治疗，仍有10％-20％的患者缺乏免疫反应而导致肿瘤复发[苟欣等“卡介苗和白细胞介素-2预防膀胱癌复发长期观察”，医药导报第21卷第9期(2000)]。其次是减少其副作用。在BCG膀胱灌注后，患者常有尿频、尿急、尿痛、血尿等膀胱炎症状，多数可自行缓解，但仍有少数患者会出现膀胱挛缩、BCG败血症等严重并发症。

国外研究认为BCG的抗瘤机制与局部细胞免疫、直接细胞毒性作用、细胞因子的细胞杀伤等密切相关，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子参与到免疫反应中并发挥重要的作用。体外实验研究表明，BCG联合TNF-α可通过抑制MMP-2的表达，明显增强对***细胞的杀伤作用。临床上也有人全身或局部应用TNF-α联合化疗药物治疗晚期实体肿瘤，经随机对照研究发现疗效明显好于单纯化疗组[李恩孝“重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性肿瘤的随机研究”，中国癌症杂志，13.4(2003)]。但TNF-α存在半衰期短、用量大及毒性强的缺点，同时高昂的治疗费用限制了其在临床上的推广。近年来国内外专家开始重视BCG转变为疫苗载体的分子生物学研究，并取得了明显的进展。目前，国内外已将重组BCG疫苗应用于日本血吸虫病、结核病的动物试验及临床中，并取得了良好的效果[甘燕等“多糖佐剂FQ2对日本血吸虫rBCG sj26GST疫苗增效作用及其机理的初步探讨”，中国***共患病杂志，19.2(2003)]。国外成功构建分泌鼠白介素-2的重组BCG，并对***动物模型的免疫刺激作用及对肿瘤细胞的杀伤作用进行研究[Yamada等“分泌小鼠白细胞介素-2的重组卡介苗增强单核细胞介导的***的杀伤作用”J Urol，164(2)：526(2000)]，发现重组卡介苗具有明显抗肿瘤活性及高效表达IL-2的作用，同时可以减少卡介苗的用量及毒副作用。但借助基因工程技术构建分泌TNF-α的重组卡介苗，以提高***疗效的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对传统卡介苗的不足，提出一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗rBCGTNF-α及其构建方法，得到的rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的双重效果，通过在膀胱腔内局部高效表达TNF-α，既可以协同加强BCG介导的细胞免疫反应，促进T-cell、NK-cell对***的杀伤作用，也可直接杀伤***细胞。

为实现这一目的，本发明利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF-α，然后采用电转化技术将pMSTNF-α导入BCG构建重组卡介苗rBCGTNF-α，Ag85B信号肽是BCG自身起分泌作用的抗原，可以协助外源基因分泌至细胞外。依靠pMSTNF-α在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌TNF-α。

本发明分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗rBCG TNF-α的构建方法通过下述步骤实现：

步骤1：卡介苗穿梭表达载体的构建与鉴定

根据GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽和TNF-α的基因序列，分别设计Ag85B信号肽和TNF-α的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI。分别经聚合酶链式反应(PCR)合成得到Ag85B信号肽和TNF-α的基因片段。先将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中得到pMS，再将TNF-α基因片段与pMS载体的信号肽连接，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF-α。

步骤2：卡介苗的培养

选取卡介苗BCG为上海丹麦株(H₃₇Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG专用液体培养基为含有10％的营养剂ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐温80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco产品)。将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期(OD₆₀₀值＝0.6)，制得感受态卡介苗。

本发明所用的液体培养基中还可以加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。

步骤3：电转化技术构建重组卡介苗rBCGTNF-α

制备好感受态卡介苗后，在一离心管中混匀400μl含1×10⁸cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达载体pMSTNF-α，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数：电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω。阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGTNF-α，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养。

电转化构建rBCGTNF-α采用含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基Middlebrook 7H10(Difco产品)进行抗性筛选，液体培养基为含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth。固体培养基及液体培养基还可加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。

步骤4：重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测

抗酸染色初步确定rBCGTNF-α为抗酸杆菌，抽提rBCGTNF-α质粒DNA后，PCR扩增得到TNF-α的基因片断，Western blotting检测rBCGTNF-α培养上清中和菌体中有TNF-α蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGTNF-α培养上清中有高含量的TNF-α。

本发明所用试剂均为市购，本发明所用电转化方法及检测方法为常规已知方法。

本发明构建的重组卡介苗rBCGTNF-α与传统卡介苗比较，在采用相同剂量(10⁶cfu/0.1ml)的情况下，能够在体外明显抑制***细胞，差别有显著性。分别应用于8只T739小鼠***模型(来自于该品系的***细胞种植于小鼠大腿内侧形成肿瘤)，采用肿瘤局部注射治疗的方法，发现重组卡介苗在肿瘤消退的小鼠数目(8/8 vs.2/8)、肿瘤消退时间(1W vs.3W)、无瘤生存时间(9Wvs.2W)及对该肿瘤细胞的免疫力方面，均优于传统卡介苗。本发明构建的rBCGTNF-α如果能够应用于临床，预防和治疗表浅性***，不仅可以提高传统BCG的药物疗效，减少患者肿瘤复发的风险；而且可以减少***患者的医疗支出，既有利于患者，也有利于减轻社会医疗费用负担，因而有良好的推广价值和临床应用趋向。

附图说明

图1为卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片断的PCR扩增电泳图。

图2为卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片断的测序图。

图3为TNF-α的PCR扩增电泳图。

图4为TNF-α的测序图。

图5为人卡介苗穿梭表达质粒pMSTNF-α的酶切电泳图。

图6为人卡介苗穿梭表达质粒pMSTNF-α的测序图。

图7为rBCGTNF-α的抗酸染色图。

图8为rBCGTNF-α抽提质粒DNA的PCR扩增电泳图。

图9为rBCGTNF-α的SDS-PAGE结果。

图10为rBCGTNF-α的Western Blotting结果。

图11为ELISA检测rBCGTNF-α的分泌结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1

步骤1卡介苗穿梭表达载体的构建与鉴定

1.合成扩增引物

根据GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽和TNF-α的基因序列，分别设计Ag85B信号肽和TNF-α的扩增引物，分别为

Ag85B sense：5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′

      antisense：5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′

TNF-αsense：5′-AGCGAATTCATGAGCACTGAAAGCATGAT-3′

      antisense：5′-AGCGTCGACTCACAGGGCAATGATCCCAA-3′

pMV261载体上的测序引物：5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′

2.Ag85B信号肽基因装载到pMV261载体中

合成信号肽基因并将其克隆到pUCm-T载体中

连接(TAKARA)体系：pUCm-T载体                1μl

                  信号肽片段(约50ng/μl)    4μl

                  SolμtionI                5μl

16℃，连接过夜。

次日将pUCm-TAg85B质粒转化感受态细菌DH5a，步骤如下：

(1).取出冻存的DH5a(200μl/Tube)，冰中溶解；

(2).取5μl连接液加入菌液中，轻轻混匀，冰浴30min；

(3).42℃热休克1min 30sec，冰浴2min；

(4).加入500μl LB液体培养基，于37℃摇床培养，100rpm×45min；

(5).取200μl涂布至含有氨苄抗性的培养板上(100μg/ml)；

(6).37℃倒置培养过夜，至菌落长出；

(7).挑取单克隆至3ml含有氨苄抗性的LB培养基中，于37℃摇床培养，250rpm培养过夜。

抽提pUCm-TAg85B质粒DNA(使用胶回收提取DNA试剂盒，购自上海申友生物制品公司)

挑选没有突变的菌落，抽提质粒。按照质粒抽提试剂盒实验步骤如下：

(1).将培养过夜的2ml菌液移至2ml离心管中，最高速离心30sec，弃尽上清；

(2).在细菌沉淀中加入250μl Solution 1液，振荡至彻底悬浮；

(3).加入250μl Solution 2溶液，立即温和地上下翻转离心管5-10次以混匀，使菌体充***解直至形成透亮的溶液，此步骤应在5min内完成；

(4).加入400μl 4℃预冷的Solution 3溶液，立即温和并充分地翻转离心管5-10次以混匀，室温静置2min，最高速离心10min；

(5).将上清倒入新的离心管中，再次最高速离心10min；

(6).小心吸取上清转移到DNA吸附柱中(吸附柱置于废液收集管中)，离心1min，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中；

(7).在吸附柱中加入500μl W1液，离心30sec，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中；

(8).在吸附柱中加入700μl W2液，离心30sec，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中，重复一次；

(9).最高速离心1min；

(10).将吸附柱移入新的干净的1.5ml离心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl预热到60℃的去离子水，室温静置1min，最高速离心1min，得到的即为质粒DNA溶液。

PCR扩增及电泳：

以抽提质粒DNA为模板，用合成的信号肽两端引物进行PCR扩增。

反应体系：去离子水        40.5μl

          buffer          5μl

          dNTPs           1μl

          Primer sig-F    1μl

          Primer sig-R    1μl

          Template        1μl

          Taq酶           0.5μl

反应条件：94℃    3min

          94℃    30sec

          54℃    1min

          72℃    30sec    30cycles

          72℃    10min

结果图1示：2-5为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约120bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。

对抽提的pUCm-TAg85B质粒DNA进行测序鉴定

测序结果见图2，通过NCBI网站BLAST对照，碱基序列与Ag85B信号肽基因完全一致。表明PCR扩增得到的Ag85B信号肽基因完全正确。将信号肽基因克隆到pMV261载体中

(1).分别酶切信号肽基因所在的T载体和pMV261载体酶切体系：

去离子水    2μl      去离子水  7μl

buffer      2μl      buffer    2μl

pUCm-TAg85B 15μl     pMV261    10μl

EcoRI       0.5μl    EcoRI     0.5μl

BamHI       0.5μl    BamHI     0.5μl

37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳。

(2).回收信号肽片段和切后的pMV261载体(申友凝胶回收试剂盒)，步骤如下：

①.在紫外灯切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎，计算凝胶重量；

②.加入三个凝胶体积的DE-A溶液，混匀后于75℃加热，期间混和几次，直至凝胶块完全溶化(约5min)；

③.加入1/2个DE-A体积的DE-B溶液，混和均匀；

④.吸取上述步骤中的混和液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，离心3600rpm×1min，弃滤液；

⑤.将制备管置回离心管，加500μl Wl溶液，离心3600rpm×30sec，弃滤液；

⑥.将制备管置回离心管，加700μl W2溶液，离心3600rpm×30sec，弃滤液；

以同样的方法再用W2溶液洗涤一次；

⑦.将制备管置回离心管中，最高速离心1min，净弃W2溶液；

⑧.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl预热到60℃的水，室温静置1min，最高速离心1min，得到DNA溶液。

(3).连接信号肽和pMV261

连接体系：连接buffer    1μl

          pMV261载体    3μl

          信号肽片段    5.5μl

          连接酶        0.5μl

16℃连接过夜，得到含有信号肽基因的质粒pMS。

(4).转化(化转，步骤同前，菌液的抗性为卡那霉素)

3.目的基因TNF-α电泳鉴定和DNA测序

以抽提的质粒DNA为模板，用合成的TNF-α基因的两端引物进行PCR扩增。

反应体系：去离子水     40.5μl

          buffer       5μl

          dNTPs        1μl

          Primer F     1μl

          Primer R     1μl

          Template     1μl

          Taq酶        0.5μl

反应条件：94℃         3min

          94℃         30sec

          54℃         1min

72℃    30sec    35cycles

72℃    10min

1％琼脂糖凝胶电泳，DNAMarker 正实。图3示IL为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约702bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。

DNA测序验证目的基因TNF-α

将TNF-α的PCR产物连接到pUCm-T载体中(步骤同信号肽克隆到pUCm-T载体)，得到质粒pUCm-TTNF-α，转化感受态细菌DH5a，分别抽提质粒DNA后，进行DNA测序，测序结果如图4，通过NCBI网站BLAST对照，碱基序列与TNF-α基因完全一致。表明PCR扩增得到的目的基因片段完全正确。目的基因TNF-α全长cDNA装载入穿梭质粒pMS中

回收TNF-α片断

酶切pMS和pUCm-TTNF-α

酶切体系：

water           2μl

buffer          2μl

pUCm-TTNF-α    10μl

EcoRI           0.5μl

SalI            0.5μl

37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker证实片断大小分别为4602bp和702bp。回收pMS载体、TNF-α片段。

连接反应

分别将pMS载体和TNF-α片段行体外连接，得到穿梭表达质粒pMSTNF-α

连接体系：连接buffer     1μl

          pMS载体        2μl

          外源基因片段   6.5μl

          连接酶         0.5μl

酶切验证穿梭表达质粒

酶切体系：

water           2μl

buffer          2μl

穿梭表达质粒    15μl

EcoRI           0.5μl

SalI            0.5μl

37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker证实。图5示IL为pMSTNF-α以EcoRI、SalI双酶切结果为4.6kb、702bp两条条带，同预期结果。测序验证构建的穿梭表达质粒

用pMV261载体上的测序引物对抽提的穿梭表达质粒pMSTNF-α进行测序验证。测序结果见图6，通过NCBI网站BLAST对照，碱基序列与TNF-α基因+Ag85B信号肽基因完全一致。

步骤2卡介苗的培养

选取卡介苗BCG为上海丹麦株(H₃₇Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG专用液体培养基为含有10％的营养剂ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐温80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco产品)。将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期(OD₆₀₀值＝0.6)，按照下列步骤制备感受态卡介苗：

◆BCG在Middlebrook 7H9培养基37℃摇床培养(转速为100-120rpm)

◆待培养液OD₆₀₀值约0.6时将BCG菌液加入离心管中，冰浴2hr；

◆将BCG菌液加入离心管中，在冰盒中预冷2hr；

◆4℃离心：8000g/min×15min，丢弃上清；用原始体积的1/10、预冷的浓度为10％甘油重悬菌体；

◆重复上述操作共五次；

◆弃上清，加入原始体积1/50的10％甘油重悬菌体即得到感受态细菌，放置室温下备用。

本发明所用的液体培养基中还可以加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。

步骤3电转化技术构建重组卡介苗rBCGTNF-α

◆在一离心管中混匀400μl感受态BCG(1×10⁸)和2μl穿梭表达质粒(0.4μg)；

◆冰浴10min后，转入预冷的0.2CM的电击转化杯中再冰浴10min，置于基因脉冲仪中进行电转化，电转参数：电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω；

◆质粒pMSTNF-α、pMV261及单纯BCG的作用时间分别为23.5、25、26毫秒；

◆电转完成后，迅速加入1000μl培养基(MADC2Tw)，37℃下培养3hr；

◆取100-200μl菌液涂抹于含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中，先正面朝上培养，3hr后翻转平皿，继续培养；

◆两周后挑选阳性克隆，在含2-3ml液体培养基的试管里摇床生长。

▲注：此处感受态BCG在转化时各做一阳性对照pBCG(BCG中只含有空白质粒pMV261)及阴性对照(BCG)。

电转化构建rBCGTNF-α后，采用含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基Middlebrook 7H10(Difco产品)进行抗性筛选，液体培养基为含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth，还可加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。

步骤4重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测

1.rBCGTNF-α的Z-N法抗酸染色(初步鉴定)

结果见图7：染色后光学显微镜镜检(目镜10×，油镜100×)。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色。

2.rBCGTNF-αDNA水平鉴定(PCR扩增、电泳鉴定)

rBCGTNF-α质粒DNA的提取

◆rBCG质粒DNA的提取：将在三角烧瓶内培养四周的rBCG分瓶至15ml试管中，再在试管里摇床培养2周后使OD₆₀₀约为1，收获前加入甘氨酸至20mg/ml以干扰胞壁的合成，继续培养一定时间后收集菌体；

◆菌体用生理盐水洗两次后悬浮在裂解液(2mg/ml溶菌酶，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-Cl(pH＝8.0)，25mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.2mg/ml溴甲酚绿)中温浴24-48hr后，加入碱性SDS(20mg/mlSDS，3mol/LNaOH)；

◆37℃水浴12-48hr直至液体清亮，加入3mol/L的NaAc(pH＝4.8)；

◆40℃水浴12hr，离心收集上清；

◆往溶解的菌体里加入600μl预冷的Nuclei Lysis Solution，轻微振荡10sec；

◆加入3μlRNase Solution混合均匀。37℃放置15-30min；

◆加入200μlProtein Precipitation Solution混合均匀，置于冰上5min；

◆离心13000rpm×4min；

◆将上清转入含有600μl的异丙醇里，上下混合均匀，离心13000rpm×1min；

◆弃上清，用70％乙醇洗涤一次，离心13000rpm×1min；

◆小心吸弃上清，室温干燥，加入TE溶解DNA。

PCR扩增反应及电泳鉴定：

PCR扩增反应的条件、方法同步骤1。电泳鉴定结果见图8示：1-9为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约702bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。

3.rBCGTNF-α蛋白水平鉴定

在液体培养基中培养至OD₆₀₀值约为1时，先诱导两种rBCG分泌表达细胞因子(45℃，30min)，4000g/min×10min，离心2次，收获菌体及上清后，菌体先用超声裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％溴甲酚绿，0.06M Tris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分别将样品用1×PBS洗涤三遍，以去除培养液中的白蛋白。收集第一遍洗涤液和最终的沉淀进行western blot鉴定。

SDS-PAGE分离rBCGTNF-α总蛋白

将洗涤液和2×SDS上样缓冲液按1∶1混合(10μl+10μl)，沸水中变性10min后直接上样。

制备凝胶板：按下列条件配制12％的分离胶和5％的浓缩胶：

                           12％分离胶(6ml)     5％浓缩胶(3ml)

30％丙烯酰胺溶液           2.4ml               0.5ml

1.5mmol/L Tris-HCl _PH8.8   1.55ml              /

0.5mmol/L Tris-HCl _PH6.8   /                   0.38ml

去离子水                   1.93ml              2.1ml

10％SDS                    60μl               30μl

10％APS                    60μl               30μl

TEMED                      2.4μl              3μl

电泳：浓缩胶用8V/cm，分离胶用15V/cm，恒压电泳2hr，待溴酚蓝到达底部时结束。染色观察。

结果见图9示：泳道1显示为TNF-α蛋白的条带(相对分子质量约26KD)，泳道2显示为IFN-α2a蛋白的条带(约19KD)，泳道3显示为IL-2蛋白的条带(约15.5KD)，泳道4及5在相应位置未见蛋白条带。

Western blotting检测TNF-α蛋白表达

◆常规蛋白电泳分离样品；

◆PVDF膜用甲醇浸湿，去离子水冲洗，再转移到Transferring buffer中平衡20min，电泳胶置Transferring buffer中平衡20min，裁4张与胶同样大小的Whatman 3mm滤纸，置Transferring buffer中平衡；

◆按下列顺序装好blot：负极-2层滤纸-电泳胶-PVDF膜-2层滤纸-正极，在这一步，要注意PAGE胶上的预染Marker是否清楚，为了避免在转膜之后膜上的Marker不清楚，可以在这一步，当胶和膜叠在一起时，对应胶上的Marker，用圆珠笔在膜的相应位置做上记号；

◆5％脱脂牛奶/PBST 20ml，水平摇床，室温封闭1hr；也可以先室温封闭若干时间，4℃过夜；

◆用PBST稀释一抗，5％BSA，稀释倍数：1000倍，将膜封在塑料袋中，不留气泡，用胶带固定在可垂直旋转的小摇床上，偏转角度70-80度，水平摇床，室温1hr；先用PBST短暂地洗2次，再用＞4ml/cm²(膜面积)的PBST，室温洗15min；

◆用PBST稀释二抗，5000倍或10000倍稀释5％BSA，水平摇床，室温1hr；先用PBST短暂地洗2次，再用＞4ml/cm²(膜面积)的PBST，室温洗15min；

◆将检测试剂(ECL plus)从4℃取出，在打开前平衡至室温，检测试剂的A液与B液以40∶1的比例混合，检测试剂的用量为0.1ml/cm²；

◆膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面，室温2min；

◆用镊子夹起PVDF膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂；

◆PVDF膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间10sec。

结果图10示：1-2分别为rBCGTNF-α中的菌体和培养上清，均可见26KD的TNF-α蛋白表达；3-4为pBCG的菌体和培养上清，未见蛋白表达；5-6为BCG的菌体和培养上清，未见蛋白表达。

3.rBCGTNF-α自分泌TNF-α的测定

rBCGTNF-α在试管中摇床培养10天，OD₆₀₀值约为0.5时，装入离心管中，离心2000rpm×10min，仔细吸取上清。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤检测培养上清中TNF-α的水平。以标准品浓度作横坐标，测得的标准品OD₆₂₀值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点绘制标准曲线；通过待测标本的OD₆₂₀值在标准曲线上查出浓度。结果见图11示，与rBCGIFN-α2a和rBCGIL-2相比，只在rBCGTNF-α培养上清中检测到高表达的TNF-α为665.21pg/ml；而pBCG和BCG的培养上清中均未检测到TNF-α的表达。

Claims (6)

1、一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括下述步骤：

1)卡介苗穿梭表达载体的构建：分别设计Ag85B和TNF-α的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI，经聚合酶链式反应分别合成Ag85B信号肽和TNF-α基因片段，将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中，得到pMS，再将TNF-α基因片段与pMS载体的信号肽连接，得到穿梭表达载体pMSTNF-α；

2)卡介苗的培养：选取卡介苗为上海丹麦株，将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，液体培养基含有10％的营养剂ADC、0.5％吐温80和0.2％甘油，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期，OD₆₀₀值＝0.6，制得感受态卡介苗；

3)电转化技术构建分泌人TNF-α的重组卡介苗rBCGTNF-α：在一离心管中混匀400μl含1×10⁸cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达质粒pMSTNF-α，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数：电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω，阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGTNF-α，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养；

4)重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测：进行Z-N法抗酸染色证实为抗酸杆菌，抽提rBCGTNF-α质粒DNA后，PCR扩增得到TNF-α基因片断，WesternBlot检测到rBCGTNF-α培养上清中和菌体中有TNF-α蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGTNF-α培养上清中有高含量的TNF-α。

2、根据权利要求1的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于所述的Ag85B和TNF-α的扩增引物分别为：

Ag85B sense：5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′

antisense：5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′

TNF-αsense：5′-AGCGAATTCATGAGCACTGAAAGCATGAT-3′

antisense：5′-AGCGTCGACTCACAGGGCAATGATCCCAA-3′。

3、根据权利要求1的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于所述pMV261载体上的测序引物为5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′。

4、根据权利要求1的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于所述液体和固体培养基中均含有100μg/ml青霉素和100μg/ml放线菌酮。

5、一种采用权利要求1或2的方法构建的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗，其特征在于重组卡介苗包含Ag85B信号肽和TNF-α基因片段。

6、一种权利要求5的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的应用，其特征在于用于制备预防和治疗人的***的药物。

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