CN100359010C

CN100359010C - 一种黄杆菌两次冷冻-解冻固定化微生物载体的制备方法

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Publication number: CN100359010C
Application number: CNB2004101004326A
Authority: CN
Inventors: 李海波; 李培军; 鞠京丽; 张轶; 许华夏
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2008-01-02
Anticipated expiration: 2024-12-22
Also published as: CN1796553A

Abstract

本发明涉及一种黄杆菌两次冷冻-解冻固定化微生物载体的制备方法，向预先混合的剂聚乙烯醇(PVA)-海藻酸钠(Na·Alg)凝胶液里添加适量活性炭、沸石粉和吐温80，将黄杆菌液体种子与凝胶液混匀，在35℃-48℃条件下，将混合液体按顺序均匀倾倒在预先铺设两层无纺布的培养皿中，于零下10℃-15℃冰箱中冷冻15h-18h，解冻；再次冷冻、解冻，然后在固定剂中加固，最后以无菌水浸泡，切割成任意形状，增殖培养，备用。本发明制备得到的载体弹性优良，扩散传质性能优异，固定的黄杆菌活性良好，菌体基本***露，载体机械强度大，长期液体培养Na·Alg不溶解，载体不发生破碎；载体的外形和大小可任意控制，再生简单，可长期重复使用。

Description

一种黄杆菌两次冷冻-解冻固定化微生物载体的制备方法

技术领域

本发明涉及细菌固定化生物制剂，具体地说是一种海藻酸钠(Na·Alg)—聚乙烯醇(PVA)—无纺布两次冷冻-解冻交联固定化微生物载体的制备方法。

背景技术

PVA和Na·Alg是两种性能优良的固定化载体，具有良好的生物相容性和成型可控性，对大多数微生物都具有较好的包埋效果，在食品、制药、环保、新能源开发及化学合成等领域得到了广泛应用。

传统的PVA和Na·Alg包埋固定方法有两种：化学交联法和物理交联法。化学交联固定化产品—般为规则的球形颗粒，但制粒过程化学反应激烈，微生物活性损失大，且需要严格控制操作参数，流程较长。物理交联一般通过冷冻实现，PVA和Na·Alg经过长时间的低温冷冻，载体易脆裂和失去弹性，虽然载体的外形可任意控制，流程短，反应温和，微生物活性损失小，但产品的扩散传质性能差、孔隙不均匀、机械强度低、弹性小，增殖培养后微生物密度较小，且容易流失，长期使用后固定化产品易破碎。

采用上述物理交联的方法固定黄杆菌Flavobacteriumsp.时，由于黄杆菌属菌落易滑行运动，因此常出现细菌流失现象，而且由于黄杆菌属代谢产物呈酸性，可以和Na·Alg发生反应，造成Na·Alg部分溶出，导致固定化失败。

发明内容

本发明的目的在于利用Na·Alg-PVA混合凝胶液两次冷冻-解冻技术(物理交联固定化载体制备技术)，同时向混合体系中适量添加吐温80和沸石粉末，以改善物理交联固定化载体的物理性质，并实现对黄杆菌Flavobacterium sp.的成功固定，制备性能优良的微生物菌剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

向预先混合的PVA-Na·Alg凝胶液(用自来水浸润24h)里添加适量活性炭、沸石粉和吐温80，按照20％的质量百分比将菌龄为16-20h的Flavobacterium sp.液体种子与凝胶液混匀，在40℃和pH自然条件下，将上述混合液体按顺序均匀倾倒在预先铺设两层无纺布的培养皿中，置于零下10℃-15℃冰箱中冷冻15-18h，常温无菌条件下解冻，再次置于零下10℃-15℃冰箱中冷冻15-18h，常温无菌条件下解冻，然后在Na₂SO₄固定剂中加固15-20h，最后以无菌水浸泡24h，将载体切割成任意形状，增殖培养，备用。

具体操作步骤如下：

1)凝胶液配制：按照质量百分比称取聚乙烯醇9.5％-10.5％，海藻酸钠0.2％-1.0％，活性炭4％-6％，沸石粉0.3％-1.5％，余量为水，灭菌冷却到35℃-48℃，加入水溶液质量0.5％-0.8％的无菌吐温80，并加入海藻酸钠的水溶液总质量15％-30％的黄杆菌液体种子，搅拌均匀；

2)加固剂配置：按质量百分比配制7.0％-10.0％的Na₂SO₄，pH自然，灭菌冷却，备用；

3)物理交联固定化微生物载体的制备：将配置好的凝胶液在无菌条件下倾注入培养皿，凝胶液厚度为2-4mm，然后在凝胶液上层铺设一层无纺布，倾注3-5mm厚的凝胶液于无纺布上，再于凝胶液上铺设一层无纺布，最后在第二层无纺布上倾注2-4mm厚的凝胶液；待凝胶液自然冷却后，置于零下10℃-15℃冰箱中冷冻15h-18h，常温无菌条件下解冻，再次置于零下10℃-15℃冰箱中冷冻15h-18h，常温无菌条件下解冻，然后在Na₂SO₄固定剂中加固15h-20h，最后以无菌水浸泡24h，将载体切割成任意形状，增殖培养，制得黄杆菌Flavobacterium sp.固定化载体产品。

凝胶液较好的质量百分比组成为：聚乙烯醇(PVA)：9.8％-10.2％，海藻酸钠(Na·Alg)：0.3％-0.8％，活性炭(AC)：4.5％-5.5％，沸石粉：0.5％-1.2％，以自来水浸润24h；最佳组成为：聚乙烯醇(PVA)：10％，海藻酸钠(Na·Alg)：0.5％，活性炭(AC)：5％，沸石粉：1％，以自来水浸润24h。使用前于111℃下湿热灭菌30min，无菌条件下冷却到40℃，200ml凝胶液中加入1ml无菌吐温80，备用。

加固剂较好的质量百分比浓度为：7.5％-9.5％的Na₂SO₄，pH自然；最佳为8.0％的Na₂SO₄，pH自然。

所述增殖培养为：将制备的固定化载体在无菌条件下切分成随机形状，按照4％的质量百分比加入到增殖培养基中，控制温度：30℃，摇床转速：135rpm-145rpm，培养时间：24h，之后更换培养基，共3次培养，备用。

本发明采用分段两次冷冻-解冻处理技术，并适量添加吐温80、沸石矿物粉末，以无纺布为骨架支撑体，针对黄杆菌Flavobacterium sp.制备了外形可任意控制的固定化载体，通过合理控制冷冻-解冻时间以及温度，获得了结构均匀、孔隙发达、机械强度高、弹性优异的固定化载体，且黄杆菌不易泄漏，活性稳定，连续培养180天后，载体产品可再生使用，细菌密度和载体物理性质可恢复到初次使用时的情形。其优点如下：

(1)通过优化两次冷冻时间和冷冻温度，以及优化凝胶液体系各组分含量，制备得到的载体弹性优良，扩散传质性能优异，固定的黄杆菌Flavobacteriium sp.活性良好，菌体基本***露。

(2)制得的载体机械强度大于15kg/cm²，长期液体培养Na·Alg不溶解，载体不发生破碎。

(3)载体的外形和大小可任意控制，再生简单，可长期重复使用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)黄杆菌Flavobacterium sp.斜面培养

在牛肉蛋白胨基础培养基(质量百分比：0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH＝7.0-7.2)的试管中接入黄杆菌Flavobacteriumsp.，置28℃-30℃恒温培养箱中培养24h。

(2)黄杆菌Flavobacterium sp.液体种子制备

用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(质量百分比：1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在摇床转速135rpm-145rpm、28℃-30℃条件下，培养16-20小时，制得液体种子。

(3)凝胶液配制

按照质量百分比称取10.5％PVA粉、1.0％Na·Alg、6.0％AC、1.5％沸石粉，混合均匀，以质量百分比为81％的自来水浸润24h，配制200ml凝胶液；于111℃下湿热灭菌30min，冷却到40℃，加入1ml无菌吐温80；并加入上述总质量20％的黄杆菌Flavobacterium sp.液体种子，搅拌均匀。

(4)加固剂配置

按质量百分比称取10.0％Na₂SO₄，以自来水定容，pH自然；于121℃下湿热灭菌20min。

(5)物理交联固定化载体制备

首先将配置好的凝胶液在无菌条件下倾注入培养皿，凝胶液厚度为3mm，然后在凝胶液上层铺设一层无纺布，倾注4mm厚的凝胶液于无纺布上，再于凝胶液上铺设一层无纺布，最后在第二层无纺布上倾注3mm厚的凝胶液；待凝胶液自然冷却后，转移至零下15℃的冰箱中冷冻18h，取出，在无菌条件下自然解冻，然后再次转移至零下15℃的冰箱中冷冻18h，取出，在无菌条件下自然解冻；将解冻的载体放入加固剂中浸泡20h，取出后，用无菌水洗涤，并浸泡24h；按随机形状分割切片，置于增殖培养基(3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH₄NO₃，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中增殖培养3次，制得黄杆菌Flavobacterium sp.固定化载体产品。

(6)机械强度和再生性

按照上述步骤制备得到的固定化载体机械强度为17.4Kg/cm²。载体产品在连续培养180天后，取出，在无菌条件下用生理盐水洗涤，于增殖培养基(质量百分比：3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH₄NO₃，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中增殖3次，细菌繁殖正常，载体机械强度为16.8kg/cm²。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

配制凝胶液时，按照质量百分比称取9.8％PVA粉、0.3％Na·Alg、4.5％AC、0.5％沸石粉，混合均匀，以质量百分比为84.9％的自来水浸润24h，配制200ml凝胶液；加固液的配制质量浓度为7.5％Na₂SO₄；制备载体时，第一次冷冻温度为零下10℃，冷冻15h，第二次冷冻温度为零下10℃，冷冻15h，在加固剂中浸泡15h。按照上述步骤制备得到的固定化载体机械强度为15.2kg/cm²。再生处理后，细菌繁殖正常，载体机械强度为15.0kg/cm²。

实施例3

与实施例1不同之处在于：

配制凝胶液时，按照质量百分比称取10.0％PVA粉、0.5％Na·Alg、5％AC、1％沸石粉，混合均匀，以质量百分比为84.5％的自来水浸润24h，配制200ml凝胶液；加固液的配制质量浓度为8.0％Na₂SO₄。制备载体时，第一次冷冻温度为零下13℃，冷冻16h，第二次冷冻温度为零下11℃，冷冻16h，在加固剂中浸泡18h。按照上述步骤制备得到的固定化载体机械强度为18.6kg/cm²。再生处理后，细菌繁殖正常，载体机械强度为18.4kg/cm²。

Claims

1、一种黄杆菌两次冷冻-解冻固定化微生物载体的制备方法，其特征在于：

1)凝胶液配制：按照质量百分比称取聚乙烯醇9.5％-10.5％，海藻酸钠0.2％-1.0％，活性炭4％-6％，沸石粉0.3％-1.5％，余量为水，灭菌冷却到35℃-48℃，加入水溶液质量0.5％-0.8％的无菌吐温80，并加入上述组份总质量15％-30％的黄杆菌液体种子，搅拌均匀；

2)加固剂配置：按质量百分比配制7.0％-10.0％的Na₂SO₄，灭菌冷却，备用；

3)物理交联固定化微生物载体的制备：将配置好的凝胶液在无菌条件下倾注入培养皿，凝胶液厚度为2-4mm，然后在凝胶液上层铺设一层无纺布，倾注3-5mm厚的凝胶液于无纺布上，再于凝胶液上铺设一层无纺布，最后在第二层无纺布上倾注2-4mm厚的凝胶液；待凝胶液自然冷却后，置于零下10℃-零下15℃冰箱中冷冻15h-18h，常温无菌条件下解冻，再次置于零下10℃-零下15℃冰箱中冷冻15h-18h，常温无菌条件下解冻，然后在Na₂SO₄固定剂中加固15h-20h，最后以无菌水浸泡24h，将载体切割成任意形状，增殖培养，制得黄杆菌Flavobacterium sp.固定化载体产品；

所述增殖培养为，将制备的固定化载体在无菌条件下切分成随机形状，按照4％的质量百分比加入到增殖培养基中，控制温度：30℃，摇床转速：135rpm-145rpm，培养时间：24小时，之后更换培养基，共3次培养，备用；

所述增殖培养基成份的质量百分比为：3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH₄NO₃，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2。

2、按照权利要求1所述的固定化微生物载体的制备方法，其特征在于：所述凝胶液的质量百分比组成为：聚乙烯醇9.8％-10.2％，海藻酸钠0.3％-0.8％，活性炭4.5％-5.5％，沸石粉0.5％-1.2％，余量为水。

3、按照权利要求1所述的固定化微生物载体的制备方法，其特征在于：所述凝胶液的质量百分比组成为：聚乙烯醇10％，海藻酸钠0.5％，活性炭5％，沸石粉：1％，余量为水。

4、按照权利要求1所述的固定化微生物载体的制备方法，其特征在于：所述Na₂SO₄的质量百分比浓度为7.5％-9.5％。

5、按照权利要求1所述的固定化微生物载体的制备方法，其特征在于：所述Na₂SO₄的质量百分比浓度为8.0％。