CN100347282C - 细胞分离装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种不损伤细胞样品、防止为分离细胞而施加电压的电极的消耗且长时间分离不引起流路阻塞的细胞分析分离装置。具体地,本发明涉及这样一种细胞分离装置,其包括从外部对细胞施加外力而使细胞在细胞分离空间中移动的部件和能分离和排出细胞的流路,以防止细胞样品的损伤并防止由于电解引起的电极消耗。作为施加外力的部件,优选可提到使用含电解质的凝胶电极将电场施加于细胞分离空间。此外,在该细胞分离装置中可将过滤器放置在将含待导入细胞分离空间的样品的液体导入的流路的上游部分,以便能捕获杂质从而防止流路阻塞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离装置(或细胞分选仪)。
背景技术
分离和回收培养液中的特定细胞是生物学和医学分析中的重要技术。当通过细胞比重的差异能将一种细胞与其它细胞分开时,就能通过速度沉降方法获得该细胞。但是,当细胞之间基本上没有差异,如在区别未敏化细胞和敏化细胞的情况下,必须根据通过荧光抗体染色细胞获得的信息或者通过人眼视觉获得的信息逐个分离细胞。
细胞分选仪是这项技术的一个实例。细胞分选仪是一种技术,其中荧光染料处理的细胞被分离为单个细胞单元并滴成荷电小滴,并根据小滴中的细胞上有无荧光及光散射量大小在滴落过程中在相对于滴落方向的任何倾斜的平面方向上将强电场施加于荷电小滴,从而控制滴落方向以将细胞分级并回收入放置在底部的多个容器中(Kamarck,M.E.,Methods Enzymol.Vol.151,pages 150-167(1987))。
但是,这一技术有许多缺陷,它昂贵并需要大的装置、强电场如几千伏和大量的样品,在制备小滴的过程中细胞可能被损伤,不能直接观察样品等等。在这些情况下,近来开发了一种新的细胞分选仪,其中在直接显微镜观察下将通过使用微处理技术切割的细流路的层流中的细粒分离(Micro Total Analysis,98,pp.77-80(Kluwer AcademicPublishers,1998);Analytical Chemistry,70,pp.1909-1915(1998))。但是,这种细胞分选仪有一个缺陷,当分离样品时对观察部件的反应速度慢。因此,需要开发一种不对样品引起任何损伤并能以更快的反应处理样品的细胞分选仪。
为了解决这些问题,本发明的发明人已经提交一关于细胞分析和分离装置的专利申请(专利申请2002-245902),其中根据样品的精细结构和样品中的荧光分布使用微处理技术分级样品从而能将细胞样品方便地分离和回收而不损伤细胞样品。
本发明解决的问题
本发明的目的是提供一种不损伤细胞样品,防止为分离细胞而对其施加电压的电极的消耗并且长时间分离细胞时不发生流路阻塞的细胞分析和分离装置。
当在常规的细胞分析和分离装置(例如专利申请2002-245902)中使用直接接触样品溶液的金属电极时,可能损伤细胞样品并且由于电解,尤其是当电压长时间施加于电极时,电极可能消耗。此外,当长时间连续进行细胞纯化时,必须防止样品溶液中的杂质如组织碎片、尘埃等引起的流路阻塞。因此需要一种没有这些缺陷的细胞分离装置。
解决问题的手段
本发明的细胞分离装置包括通过使用含电解质的凝胶电极对细胞分离空间施加电压以使细胞在细胞分离空间中移动的部件和能分离和排出细胞的流路,其防止细胞样品的损伤和由于其电解引起的电极消耗。此外,本发明的细胞分离装置可具有在将待导入细胞分离空间的含细胞液体导入的流路的上游侧捕获杂质而防止流路阻塞的部件。
也就是说,本发明提供一种细胞分离装置,其包括细胞分离空间、至少一个用于将含细胞液体注入细胞分离空间的流路、至少两个用于从细胞分离空间排出液体的流路和两个各自放置在细胞分离空间的相对侧壁上的凝胶电极,其中根据是否将给定的电压施加于两个凝胶电极,细胞选择性地从细胞分离空间排出进入该至少两个流路的不同流路。
根据这一细胞分离装置,用含有电解质的凝胶电极将电压施加于细胞分离空间。因此,电极不直接接触含细胞溶液,因此能防止细胞样品的损伤并也能防止由于其电解引起的电极消耗。
本文可用的电解质包括一般的凝胶如琼脂糖、氨基果胶、胶原等。
施加的电压可以取决于目标细胞而设定,不过优选根据实际流过细胞以使得能分离目标细胞而设定电压。例如,当使用电极间距离为10到15μM的琼脂糖凝胶的情况下,在大约40V的电压下能够分离白细胞(5μM的程度)。
此外,这一细胞分离装置可以在注入含细胞液体的流路内在注入点的下游和在细胞分离空间的上游安装一过滤器。
本发明提供如上所述的细胞分离装置,其中两个凝胶电极各自通过在细胞分离空间的侧壁上开的微小连通孔与含细胞液体接触,并且两个连通孔相对于液体下游方向以相对偏离的位置放置。
此外,该细胞分离装置可具有两个用于将液体注入细胞分离空间的流路。
此外,本发明涉及使用权利要求1-4任一项的细胞分离装置分离细胞的方法,所述方法包括将含细胞液体注入细胞分离空间,将给定的电压选择性地施加于两个各自放置在细胞分离空间的相对侧壁上的凝胶电极,并且根据是否将给定的电压施加于两个凝胶电极而选择性地将含在液体中的细胞排入与细胞分离空间相连的至少两个排出流路的不同流路。
仅当待回收的细胞流进细胞分离空间时,可将给定的电压施加于两个凝胶电极。
附图简述
图1是显示本发明的细胞分选仪的一个实施方案的透视图。
图2是显示本发明的细胞分选仪的流路的结构的一个实施方案的示意图。
图3是显示本发明的细胞分选仪的过滤器部分的结构的一个实施方案的示意图。
图4是显示本发明的细胞分选仪的一个实施方案的显微照片。
图5是显示本发明的细胞分选仪的细胞分选过程的一个实施方案的示意图。
图6是显示本发明的细胞分选步骤的显微照片,其中箭头指示细胞。
在这些图中,标记数字如下指示这些元件:
101:芯片
102、103、104、105、106、107、108、109:孔
201:含细胞溶液注入孔
202:无细胞溶液注入孔
206、207:电极孔
211、212:细胞移出孔
203:过滤器
204、205、401、402、501、502:微流路
208、209:电极(充满电解质的空间)
210:细胞分离空间
301、304:细胞
302、305:尘埃
303:柱状结构(过滤器)
403、404:凝胶电极
405、406:微小连通孔
本发明的实施方案
现在,将描述本发明的细胞分离装置的一个实施方案,但本发明并不以任何方式限于这一实施方案。
图1示意地显示本发明的细胞分离装置(细胞分选仪)的***结构的一个实施方案。该细胞分选仪以在芯片101内的流路形式构建。该芯片具有粘附地结合在其底部的玻璃基板110,在其上玻璃基板形成微流路。然后,玻璃基板的厚度尽可能的薄以便进行光学测量。例如,当使用数值孔径1.4、系数100的物镜时,希望玻璃基板的厚度为0.2nm或以下。在芯片101的上表面分别形成有用于将含细胞样品溶液导入微流路的孔102,用于将无细胞溶液导入微流路的孔103,用于将电极***凝胶电极的孔104、105、106和107,以及用于回收分离和纯化的细胞的孔108和109。
图2示意地显示图1例证的细胞分选仪的流路的结构的一个实施方案。导入孔201的含细胞溶液经过微流路204导入到细胞分离部分210。将过滤器203放置在微流路204的上游侧以防止微流路阻塞。该过滤器203以精细结构的形式直接加入芯片中。另一方面,如上文所述导入孔202的无细胞溶液经过流路205导入到细胞分离部分210。在流路204侧和流路205侧,细胞分离部分210分别与充满含电解质的凝胶的微结构(空间)208和209接触。因此,电场能通过***孔206和207的电极施加于细胞分离部分210。
在细胞分离部分210中,液流为层流。因此,当不受电场作用时,流自流路204的上游侧的细胞被转运到下游细胞储存孔211。另一方面,当受到电场作用时,细胞被转运到下游细胞储存孔212。然后,例如通过导入孔201、202、211和212的溶液的量,也就是说,通过溶液液体水平高度的差异,能控制溶液的流速。同样,如在该实施方案中,当将凝胶电极导入细胞分选仪的精细结构中时,就不需如对常规的金属电极一样花时间用它的沉积表面(deposited surface)调整金属电极。
图3a是显示以精细结构的形式直接装入到芯片中以防止图2例证的微流路的阻塞的过滤器部分的结构的一个实施方案的示意图。该过滤器部分包括周期性地放置并直接埋入细胞分选仪芯片中的细柱状结构303。因此,在流自于微流路上游侧的细胞301和尘埃302中,仅尘埃302被这些柱状结构303捕获以防止下游微流路阻塞。图3b是显示过滤器部分装入到细胞分选仪芯片中的一个实施方案的光学显微照片。该显微照片显示尘埃305被直接装入到芯片中的柱状结构304捕获。该过滤器部分是相对于微流路有足够宽度的结构。因此,即使尘埃被这些柱状结构捕获,流路的液流丝毫不受干扰。
图4是显示装入细胞分选仪的凝胶电极的结构的光学显微图像。图4a显示细胞分选仪细胞分离部分的放大观察。凝胶电极403和404分别相对于两个微流路401和402放置。图4b显示有荧光色素导入其中的凝胶电极的荧光显微观察。通过微小连通孔405和406凝胶电极与流路401和402相通。在该实施方案中,使用1%(w/v)的琼脂糖作为凝胶电极,且氯化钠作为溶解于琼脂糖中的电解质。此外,分别通过维持阴极侧的酸性pH(pH 6.0)和阳极侧的碱性pH(pH 8.4),可控制电极中气体的产生。
图5是示意地显示当实际施加电场时的细胞分选过程的图示。当如在图5a中没有电场施加时,通过流路501的细胞朝流路501的下游方向流动。另一方面,当如图5b中有电场施加时,通过流路501的细胞被传递到流路502。
图6是显示细胞选择性地流过细胞分选仪中的两个流路中任一个的情况的显微照片。关于图6的第1-3号连续照片,它们显示当没有电场施加时,细胞从上游侧到下游侧流过同一微流路。另一方面,图6的第4-6号照片显示当有电场施加时,细胞移动到另一微流路。
Claims (9)
1.一种细胞分离装置,所述装置包括细胞分离空间、至少一个用于将含细胞液体注入细胞分离空间的流路、至少两个用于从细胞分离空间排出液体的流路和两个各自放置在细胞分离空间的相对侧壁上的凝胶电极,所述两个凝胶电极各自通过在细胞分离空间的侧壁上开的微小连通孔与含细胞液体接触,并且两个连通孔相对于液体下游方向以相对偏离的位置放置,其中,根据是否有给定的电压施加于两个凝胶电极,细胞选择性地从细胞分离空间排出进入该至少两个流路的不同流路。
2.权利要求1的细胞分离装置,所述装置具有两个用于将含细胞液体注入细胞分离空间的流路。
3.权利要求1的细胞分离装置,其中在用于注入含细胞液体的流路中,在注入点的下游和细胞分离空间的上游放置一过滤器。
4.一种细胞分离方法,所述方法包括将含细胞液体注入细胞分离空间,将给定的电压选择性地施加于两个各自放置在细胞分离空间的相对侧壁上的凝胶电极,并且根据是否将给定的电压施加于两个凝胶电极而选择性地将含在液体中的细胞排入与细胞分离空间相连的至少两个排出流路的不同流路,其中所述两个凝胶电极各自通过在细胞分离空间的侧壁上开的微小连通孔与含细胞液体接触,并且两个连通孔相对于液体下游方向以相对偏离的位置放置。
5.一种使用权利要求1或3的细胞分离装置分离细胞的方法,所述方法包括将含细胞液体注入细胞分离空间,将给定的电压选择性地施加于两个各自放置在细胞分离空间的相对侧壁上的凝胶电极,并且根据是否将给定的电压施加于两个凝胶电极而选择性地将含在液体中的细胞排入与细胞分离空间相连的至少两个排出流路的不同流路。
6.权利要求4的分离方法,其中仅当待回收的细胞流进细胞分离空间时,将给定的电压施加于两个凝胶电极。
7.权利要求5的细胞分离方法,其中仅当待回收的细胞流进细胞分离空间时,将给定的电压施加于两个凝胶电极。
8.权利要求1的细胞分离装置,其中维持阴极侧的凝胶电极的pH为酸性,维持阳极侧的凝胶电极的pH为碱性。
9.权利要求5的细胞分离方法,其中维持阴极侧的凝胶电极的pH为酸性,维持阳极侧的凝胶电极的pH为碱性。
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